CN115109794A

CN115109794A - 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115109794A
Application number: CN202210780496.3A
Authority: CN
Inventors: 罗绍祥; 杨旭; 高霞; 杨洁
Original assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Current assignee: Wuhan Life Origin Biotech Joint Stock Co ltd
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2022-09-27

Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种噬菌粒载体改造及其制备方法和应用；所述噬菌粒载体包括第一启动子和第二启动子的双向启动子、异源二聚的结构域元件、抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因，第一启动子设于抗体重链可变区基因的5’端，第二启动子设于抗体轻链可变区基因的5’端；所述方法包括：第一酶切原始噬菌粒载体和第一启动子，再进行DNA回收；进行第一DNA连接，后测序分析和筛选，得到第一噬菌粒载体；对纯化的mRNA片段进行第三PCR扩增反应，得到扩增产物；进行第三酶切、第二DNA连接，得到第一连接产物；转化，后质粒提取，得到提取质粒；进行第三酶切、DNA连接，得到第二连接产物；进行测序分析和筛选，得到含双向启动子的噬菌粒载体；通过上述噬菌粒和抗体库构建方法，能保留抗体基因的天然配对。

Description

一种噬菌粒载体及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种噬菌粒载体及其制备方法和应用。

背景技术

随着噬菌体展示技术广泛用于构建各种多肽和蛋白质的文库，再结合体外筛选的方法从文库中选择最合适的克隆，易在体外产生抗体，利用噬菌体展示技术构建的各种噬菌体抗体库，如天然抗体库、免疫抗体库和合成抗体库，已广泛用于抗体药物开发，因此噬菌体展示技术逐步成为生命科学中药物发现的强大平台。目前，传统的通过噬菌体展示技术构建的体外抗体，是单链可变片段(scFv)抗体，它由可变重链(VH)和可变轻链(VL)通过一个柔性肽连接子连接在一起，在此基础上，衍生了几种抗体形式，如单链抗体、片段抗原结合(Fab)和来自骆驼科重链抗体的可变片段(VHH)。

噬菌体展示技术的主要优点是实现了基因型和表现型的统一，外源蛋白与噬菌体表面蛋白融合后，可以直接通过蛋白或者细胞进行筛选，在获得外源蛋白的基础上同时获得了对应的基因，同时由于噬菌体的颗粒较小，溶解度高，通常可以达到10¹³个/mL，因此可以构建库容达高达10¹¹的抗体库，并筛选出高亲和力的抗体克隆。并且噬菌体展示抗体库不需要动物免疫，对免疫原性较低的靶点或者有毒性的靶点仍然有效，因此，噬菌体展示技术为不能通过体内免疫或感染而自然产生的治疗性抗体提供了一种新的选择。

噬菌体展示的另一个关键属性是，与自然免疫反应相比，选择的速度要快得多，与杂交瘤技术几个月的制备周期相比，噬菌体展示技术可以在短至一周的时间内制备出单克隆抗体，与单个B细胞技术和高通量测序技术的结合技术相比，即使其减少了细胞融合和亚克隆的过程，抗体生产时间缩短至1-2个月，但是和噬菌体展示技术相比，仍然有一定差距。

噬菌体展示技术已用于构建天然库、免疫库及合成库的过程中，传统的建库方案是将B淋巴细胞裂解，释放出mRNA并逆转录为cDNA，扩增抗体重链可变区和轻链可变区，通过体外重组方式产生scfv或者Fab，但是在建库中抗体的重链和轻链将重组组合，会破坏抗体基因的天然配对，改变了抗体的亲和力和特异性，因此如何保留抗体基因的天然配对，以获得亲和力更高的克隆抗体，是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

本申请提供了一种噬菌粒载体改造方法和应用，以解决现有技术的噬菌体展示技术在建库过程中会破坏抗体基因的天然配对的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种噬菌粒载体，所述噬菌粒载体包括双向启动子、抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因，所述抗体重链可变区基因的5’端和所述抗体轻链可变区基因的5’端相对设置，所述双向启动子的一端连接所述抗体重链可变区基因的5’端，所述双向启动子的另一端连接所述抗体轻链可变区基因的5’端。

可选的，所述双向启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

可选的，所述噬菌粒载体还包括异源二聚的结构域元件。

可选的，所述异源二聚的结构域元件包括异源二聚的卷曲螺旋结构域、抗体重链恒定区CH1基因和抗体轻链CL基因中的至少一种。

可选的，所述结构域元件包括异源二聚的卷曲螺旋结构域，所述螺旋卷曲结构域包括第一螺旋卷曲结构域和第二螺旋卷曲结构域，所述第一螺旋卷曲结构域设于所述抗体重链可变区基因的3’端，所述第二螺旋卷曲结构域设于所述抗体轻链可变区基因的3’端，所述螺旋卷曲结构域的序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的噬菌粒载体的方法，所述方法包括：

分别对原始噬菌粒载体和所述异源二聚的螺旋卷曲结构域进行第一酶切，再进行DNA回收，分别得到第一目的基因片段和酶切载体；

对所述第一目的基因片段和所述酶切载体进行第一DNA连接，后进行测序分析和筛选，得到符合预期的第一噬菌粒载体；

对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段；

对纯化的所述mRNA片段进行逆转录，再进行第三PCR扩增反应，得到含抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因拼接序列的扩增产物；

分别对所述扩增产物和所述第一噬菌粒载体进行第三酶切，再进行第二DNA连接，得到第一连接产物；

对所述第一连接产物进行转化，后进行质粒提取，得到提取质粒；

分别对所述提取质粒和双向启动子进行第三酶切，再进行DNA连接，得到第二连接产物；

对所述第二连接产物进行测序分析和筛选，得到含双向启动子的噬菌粒载体。

可选的，所述方法还包括：

对所述螺旋卷曲结构域以第一PCR扩增反应进行预处理，得到扩增后的螺旋卷曲结构域的片段；

对所述双向启动子以第二PCR扩增反应进行预处理，得到扩增后的双向启动子的片段；

其中，所述第一PCR扩增反应所用的引物组包括第一引物和第二引物，所述第二PCR扩增反应所用的引物组包括第三引物和第四引物，所述第一引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第三引物的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第四引物的序列如SEQ ID NO.6所示。

可选的，所述第一酶切所用的酶体系包括Sapi酶和BamHI酶，所述第三酶切所用的酶体系包括Sac I酶和NcoI酶。

可选的，所述第三PCR扩增反应所用的引物组包括重链组扩增引物和轻链组引物；

所述重链组引物包括如SEQ ID NO.7所示的RbVH-F1，如SEQ ID NO.8所示的RbVH-F2，如SEQ ID NO.9所示的RbVH-F3，如SEQ ID NO.10所示的RbVH-F4和如SEQ ID NO.11所示的RbVH-R1；

所述轻链组引物包括如SEQ ID NO.12所示的RbVK-F1，如SEQ ID NO.13所示的RbVK-F2，如SEQ ID NO.14所示的RbVK-F3，如SEQ ID NO.15所示的RbVK-R1，如SEQ IDNO.16所示的RbVK-R2和如SEQ ID NO.17所示的RbVK-R3。

可选的，所述对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段，具体包括：

对B淋巴细胞和磁珠进行油相包裹，后进行磁珠捕获，得到mRNA混合物；

对所述mRNA混合物进行磁珠的分离，后进行洗涤和重悬，得到纯化的mRNA片段。

第三方面，本申请提供了一种噬菌粒载体的应用，所述应用包括：将第一方面所述的噬菌粒载体用于抗体库的构建中。

可选的，所述抗体库的构建方法包括：

分别对原始噬菌粒载体和所述螺旋卷曲结构域进行第一酶切，再进行DNA回收，分别得到第一目的基因片段和酶切载体；

对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段；

对纯化的所述mRNA片段进行逆转录，后进行第三PCR扩增反应，得到含抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因拼接序列的扩增产物；

向感受态细胞中加入所述第一连接产物进行转化，后进行培养和菌种收集，得到第一抗体库；

对所述第一抗体库的感受态细胞进行质粒提取，得到提取质粒；

分别对所述提取质粒和所述双向启动子进行第三酶切，再进行DNA连接，得到第二连接产物；

向感受态细胞中加入所述第二连接产物进行转化，后进行培养和菌种收集，得到第二抗体库；

对所述第二抗体库进行抗体筛选，得到抗体库。

可选的，所述对所述第二抗体库进行抗体筛选，得到抗体库，具体包括：

将所述第二抗体库以噬菌粒的形式进行保存，后拯救文库，得到噬菌体展示的抗体库；

对噬菌体展示的抗体库进行淘选，得到噬菌体展示抗体库。

可选的，所述应用还包括：将第一方面所述的噬菌粒载体用于单克隆抗体的制备中。

本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本申请实施例提供的一种噬菌粒载体，通过在原有的噬菌体展示载体上设置双向启动子、重链基因和轻链基因，控制重链基因和轻链基因的5’端相对设置，再控制双向启动子将重链基因的5’端和轻链基因的5’端相互连接，使得抗体中重链基因和轻链基因能够同时表达，并且由于重链基因和轻链基因在同一个噬菌体展示载体上，因此在单细胞内的抗体基因扩增和组装阶段，能保留抗体基因的天然配对，从而能获得亲和力更好的克隆抗体。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的pCantab 5E-danB-3噬菌粒载体的结构示意图；

图2为本申请实施例提供的pCantab 5E-vhh原始噬菌粒载体的结构示意图；

图3为本申请实施例提供的pCantab 5E-danB-1噬菌粒载体的结构示意图；

图4为本申请实施例提供的pCantab 5E-danB-2噬菌粒载体的结构示意图；

图5为本申请实施例提供的方法的流程示意图；

图6为本申请实施例提供的方法的详细流程示意图

图7为本申请实施例提供的抗体库的构建方法的流程示意图；

图8为本申请实施例所提供的YF39抗体的电泳检测结果示意图；

图9为本申请实施例提供的MMP3抗体对对24例诊断试剂盒赋值血清样本进行检测。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

在本申请一个实施例中，如图1所示，提供一种噬菌粒载体，所述噬菌粒载体包括双向启动子、抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因，所述抗体重链可变区基因的5’端和所述抗体轻链可变区基因的5’端相对设置，所述双向启动子的一端连接所述抗体重链可变区基因的5’端，所述双向启动子的另一端连接所述抗体轻链可变区基因的5’端。

在一些可选的实施方式中，所述双向启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

本申请实施例中，通过控制双向启动子的具体序列，使得双向启动子的一端能稳定在抗体重链可变区基因的5’端，而双向启动的另一端能稳定在抗体轻链可变区基因的5’端，促使单细胞内的抗体基因扩增和组装阶段，能保留抗体基因的天然配对。

在一些可选的实施方式中，所述噬菌粒载体还包括异源二聚的结构域元件。

在一些可选的实施方式中，所述异源二聚的结构域元件包括异源二聚的卷曲螺旋结构域、抗体重链恒定区CHI基因和抗体轻链CL基因中的至少一种。

本申请实施例中，通过控制异源二聚的结构域元件的种类，能通过卷曲螺旋结构域、抗体重链恒定区CH1基因或抗体轻链CL基因，方便准确的制备类Fab的抗体。

在一些可选的实施方式中，所述结构域元件包括异源二聚的卷曲螺旋结构域，所述螺旋卷曲结构域包括第一螺旋卷曲结构域和第二螺旋卷曲结构域，所述第一螺旋卷曲结构域设于所述噬菌粒载体的抗体重链可变区基因的3’端，所述第二螺旋卷曲结构域设于所述噬菌粒载体的抗体轻链可变区基因的3’端，所述螺旋卷曲结构域的序列如SEQ ID NO.1所示。

本申请实施例中，通过设置能表达类Fab的抗体的螺旋卷曲结构域，并且将螺旋卷曲结构域分为第一螺旋卷曲结构域和第二螺旋卷曲结构域，能实现抗体基因中抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因进行配对时，表达出类Fab抗体。

在一些可选的实施方式中，所述噬菌粒载体包括pCantab 5E型载体体系。

本申请实施例中，控制噬菌粒载体的具体种类，能保证噬菌粒载体中的双向启动子、抗体重链可变区基因、抗体轻链可变区基因和螺旋卷曲结构域能稳定存在，促使抗体中抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因能够同时表达。

在本申请的一个实施例中，如图5所示，提供一种噬菌粒载体的制备方法，所述方法包括：

S1.分别对原始噬菌粒载体和所述螺旋卷曲结构域进行第一酶切，再进行DNA回收，分别得到第一目的基因片段和酶切载体；

S2.对所述第一目的基因片段和所述酶切载体进行第一DNA连接，后进行测序分析和筛选，得到符合预期的第一噬菌粒载体；

S3.对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段；

S4.对纯化的所述mRNA片段进行逆转录，再进行第三PCR扩增反应，得到含抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因拼接序列的扩增产物；

S5.分别对所述扩增产物和所述第一噬菌粒载体进行第三酶切，再进行第二DNA连接，得到第一连接产物；

S6.对所述第一连接产物进行转化，后进行质粒提取，得到提取质粒；

S7.分别对所述提取质粒和所述双向启动子进行第三酶切，再进行DNA连接，得到第二连接产物；

S8.对所述第二连接产物进行测序分析和筛选，得到含双向启动子的噬菌粒载体。

本申请实施例中，先将螺旋卷曲结构域和原始噬菌粒载体相连接，再转入抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因的拼接序列，使得抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因在噬菌粒载体中同时存在，并且能表达出类Fab抗体，最后再将双向启动子转入到噬菌粒载体中，使得双向启动子能将抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因连接起来，进而能保留抗体基因的天然配对，使得抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因能够同时表达。

在一些可选的实施方式中，所述方法还包括：

S101.对所述螺旋卷曲结构域以第一PCR扩增反应进行预处理，得到扩增后的螺旋卷曲结构域的片段；

S102.对所述双向启动子以第二PCR扩增反应进行预处理，得到扩增后的双向启动子的片段；

本申请实施例中，通过控制螺旋卷曲结构域和双向启动子分别进行PCR扩增反应，从而能得到足够的螺旋卷曲结构域和双向启动子的数量，方便后续噬菌体展示库的构建。

在一些可选的实施方式中，所述第一酶切所用的酶体系包括Sapi酶和BamHI酶，所述第三酶切所用的酶体系包括Sac I酶和NcoI酶。

本申请实施例中，控制第一酶切和第三酶切的酶体系，由于第一酶切的目的是将螺旋卷曲结构域的序列和原始的噬菌体展示载体的质粒采用相同酶体系进行切除，保证后续经过DNA连接酶连接后能得到含有第一螺旋卷曲结构域和第二螺旋卷曲结构域的第一噬菌粒载体，再通过第三酶切，将含有第一螺旋卷曲结构域、第二螺旋卷曲结构域、抗体重链可变区基因和抗体重链可变区基因的提取质粒和双向启动子采用相同酶体系进行切除，方便后续的DNA连接酶进行连接，使得第一螺旋卷曲结构域、第二螺旋卷曲结构域、抗体重链可变区基因、抗体轻链可变区基因和双向启动子同时存在，并且双向启动子在抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因之间，使得后续的噬菌体展示体的扩增和组装中，五者都能稳定存在，保障了抗体基因的原始配对。

在一些可选的实施方式中，所述第三PCR扩增反应所用的引物组包括重链组扩增引物和轻链组引物；

本申请实施例中，控制重链组引物和轻链组的引物，使得对mRNA进行逆转录，使得最后对mRNA上的抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因转化为对应的DNA片段，再经过特定的重链引物组和轻链引物组进行扩增，从而得到重组的抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因的拼接片段，使得保证重链基因和轻链基因的原始配对。

在一些可选的实施方式中，如图6所示，所述对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段，具体包括：

S31.对B淋巴细胞和磁珠进行油相包裹，后进行磁珠捕获，得到mRNA混合物；

S32.对所述mRNA混合物进行磁珠的分离，后进行洗涤和重悬，得到纯化的mRNA片段。

本申请实施例中，对B淋巴细胞进行微液滴技术的前期处理，能得到带有抗体基因的mRNA混合物，再将mRNA混合物中磁珠进行分离，从而得到仅含有抗体基因的mRNA，方便后续的逆转录得到准确的重链基因和轻链基因。

在本申请的一个实施例中，提供一种噬菌粒载体的应用，所述应用包括：将所述噬菌粒载体用于抗体库的构建中。

在一些可选的实施方式中，如图7所示，所述抗体库的构建方法包括：

S3.对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段；

S4.对纯化的所述mRNA片段进行逆转录，后进行第三PCR扩增反应，得到含抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因拼接序列的扩增产物；

S6.向感受态细胞中加入所述第一连接产物进行转化，后进行培养和菌种收集，得到第一抗体库；

S7.对所述第一抗体库的感受态细胞进行质粒提取，得到提取质粒；

S8.分别对所述提取质粒和双向启动子进行第三酶切，再进行DNA连接，得到第二连接产物；

S9.向感受态细胞中加入所述第二连接产物进行转化，后进行培养和菌种收集，得到第二抗体库；

S10.对所述第二抗体库进行抗体筛选，得到抗体库。

本申请实施例中，在利用含双向启动子的噬菌体展示载体的基础上，通过分步建库的方法，分别将第一螺旋卷曲结构域、第二螺旋卷曲结构域、抗体基因和双向启动子进行抗体库的构建，逐步构建出完整的抗体库，而在此过程中由于采用的是分步的方式，因此能保留抗体基因中的抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因的原始配对。

在一些可选的实施方式中，所述对所述第二抗体库进行抗体筛选，得到抗体库，具体包括：

S101.将所述第二抗体库以噬菌粒的形式进行保存，后拯救文库，得到噬菌体展示的抗体库；

S102.对噬菌体展示的抗体库进行淘选，得到抗体库。

本申请实施例中，通过对构建的抗体库在淘选前进行文库的拯救，能准确的判断所得的抗体库是所需要的抗体库。

在一些可选的实施方式中，所述应用还包括：将所述噬菌粒载体用于单克隆抗体的制备中。

实施例1

噬菌体展示载体改造：

先合成螺旋卷曲结构域的序列，具体序列如SEQ ID NO.1所示，再用如如SEQ IDNO.3所示的第一引物和如如SEQ ID NO.3所示的第二引物进行第一PCR扩增反应，扩增反应体系为：0.5μL的模板、0.5μL的第一引物、0.5μL的第二引物、5μL的Tap酶10xbuffer、4μL的dNTP、0.5μL的PfuDNA聚合酶，余量以水补足至50μL，扩增反应程序：94℃30s，54℃30s，72℃30s扩增25个循环，得到第一扩增产物。

将第一扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下目的片段，用天根胶回收柱回收目的片段扩增产物，再用Sapi酶和BamHI酶对回收的扩增产物和如图2所示的原始pCantab5E-CT-vhh载体进行酶切，酶切体系：2μg的DNA、5μL的酶切10xbuffer、2μL的内切酶Sapi和2μL的内切酶BamHI，余量以水补足至50μL，酶切2h，酶切后的产物用1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用，分别得到第一目的基因片段和酶切载体。

将第一目的基因片段通过DNA连接酶和原始pCantab 5E-CT-vhh载体进行连接，连接体系：1μL的载体，7.8μL的第一目的基因片段，1μL的10x连接buffer，0.2μL的T4连接酶，连接的条件为在22℃条件下连接1h，得到第一连接产物。

将第一连接产物加入到100μL的氯化钙转化的感受态细胞溶液中，在42℃条件下热激90s后立即插入冰上放置5min，再加入800μL的LB培养基并在37℃条件下摇床复苏1h，涂平板在37℃培养箱倒置培养过夜，挑斑3-5个克隆送测序分析，得到如图3所示的pCantab5E-danB-1载体。

实施例2

将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：

基于微液滴技术的抗体基因扩增：

收集免疫后兔子的B淋巴细胞，用预冷的1xPBS洗涤B淋巴细胞3次，并在300g离心力、4℃的条件下离心5min后重悬，后在预冷1xPBS(5*10^5个/mL)冰上保存作为内层液体待用；Poly(dT)磁珠(直径10μm，New England Biosciences，Ipswich，MA，USA)用预冷的PBS洗涤3次，用Lysis Buffer重悬冰上保存作为中层液体(45μL磁珠/ml Lysis/BindingBuffer)；配置oil phase冰上保存作为最外层液体；先用中层液体包裹内层液体，再用最外层液体包裹中层液体，完成oil phase包裹细胞溶液及poly(dT)磁珠溶液，其中细胞流速为2500cell/min(500μL细胞溶液/min)，oil phase流速3mL/min；包裹结束后，室温裂解细胞3min，完成poly(dT)磁珠捕获mRNA步骤；用磁力架分离Poly(dT)磁珠-mRNA，再用Washbuffer洗涤三次后，用预冷的100uL的1x RT-PCR mix buffer洗涤两次后重悬在1xRT-PCRmix buffer，冰上保存，得到含抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因的目的基因片段；再用重链组引物和轻链组引物分别扩增VH和VL，并实现VH-VL拼接，得到扩增产物，再用等体积的预冷的异丙醇沉淀扩增产物(-20℃30min)，在4℃条件下，以12000rpm的转速离心15min后，弃掉上清，并用预冷的异丙醇洗涤沉淀2次，预冷后的产物以质量分数为75％乙醇洗涤沉淀3次后用RNase Free water溶解沉淀；后用巢式PCR扩增VH-VL，跑胶回收片段，再用同种限制性内切酶同时酶切上述片段和pCantab 5E-danB-1载体质粒，后用1％的琼脂糖在130V的电压条件下以30min进行电机，再切下目标片段并用DNA回收试剂盒回收(Qiangen)；

用DNA连接酶连接酶切目标片段和pCantab 5E-danB-1载体质粒，并用DNA回收试剂盒回收(Qiangen)回收连接产物；再将连接产物转化XL1-blue感受态细胞；在37℃条件下培养过夜，后使用试剂盒抽提质粒(碧云天质粒中提试剂盒)；用Sac I酶和NcoI酶对酶切该pCantab 5E-danB-1载体质粒及双向启动子的片段，并用1％的琼脂糖在130V的电压条件下电击30min后，再切下目标片段并用DNA回收试剂盒回收(Qiangen)；用DNA连接酶连接酶切目的片段和pCantab 5E-danB-1载体质粒，并用DNA回收试剂盒回收(Qiangen)连接产物，得到如图4所示的pCantab 5E-danB-2载体质粒；再将连接产物转化感受态细胞进行培养诱导表达以及后续检测。

实施例3

将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：

双向启动子的构建：

先合成双向启动子的序列，具体序列如SEQ ID NO.2所示，再用如SEQ ID NO.5所示的第三引物和如SEQ ID NO.6所示的第四引物进行第二PCR扩增反应，回收扩增产物，再用Sac I和NcoI酶切，酶切体系为：2μg的DNA、5μL的酶切10xbuffer、2μL的内切酶Sac I和2μL的内切酶NcoI，余量以水补足至50μL，酶切2h，酶切后的产物用1.5％的琼脂糖胶切胶，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用，分别得到第二目的基因片段和酶切载体。

将第二目的基因片段通过DNA连接酶和pCantab 5E-danB-2载体质粒进行连接，连接体系：1.5μg的载体，0.5μg的第二目的基因片段，10μL的10x连接buffer，2μL的T4连接酶，余量以水补足至100μL，连接的条件为在22℃条件下连接1h，得到含如图1所示的pCantab5E-danB-3载体质粒的第二连接产物。

抗体库的构建：

TG1细胞划线接种到Minimal培养板37℃培养过夜，接种TG1单菌落至5mL的2YT培养液中于37℃振荡培养过夜；次日将接种过夜培养的菌液5mL加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600达到0.4～0.5，再将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；用300mL预冷的灭菌去离子水于冰水中轻柔重悬沉淀，至沉淀细胞完全均匀地分散于水中；再在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；再依次用150mL预冷的灭菌去离子水和30mL预冷的10％的甘油(用灭菌去离子水配制)如上所述重悬细胞两次；最后将细胞重悬于1mL预冷的10％的甘油中，置于冰上立即使用或分装；冻存于-80℃中待用；向100μL感受态中加入5μL的第二连接产物，放于冰上预冷，转入预冷后的电转杯中；调节电转仪电压2.5KV电击时间5ms，电击后，迅速加入0.9ml 2YT培养基，37℃振荡培养2小时；取10uL梯度稀释，涂布于SOBAG平板上，计算库容，剩余菌液涂布于10个SOBAG平板上，37℃培养过夜。

对梯度稀释的菌落计数，计算出本次建成的抗体库的库容；从SOBAG平板上随机挑取20个克隆，用菌落PCR检测抗体基因插入载体的效率；将随机挑选的20个克隆送测序分析，检测抗体库容，抗体基因的完整性及多样性。

实施例4

将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：

抗体筛选：

将构建好的抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，应当先拯救文库，使其成为噬菌体展示的抗体库，具体方法如下：

将1.5mL带E-tag标签的抗体库接种到300mL的2YT-AG培养基中，至OD600nm约0.3～0.4；于37℃振荡培养1.5h至OD600nm＝0.5～0.6；按细菌：phage＝1∶5的比例加入helperphage辅助噬菌体(M13K07)，于37℃振荡培养1h；在4000rpm条件下于15℃离心15min，以去除培养基；后加入200mL的2YT-AK(100μg/mL的Amp，50μg/mL的Kan)培养基重悬细菌，于37℃培养2h；于10000rpm离心20min去除沉淀，再在上清中加入40mL的PEG/NaCl沉淀phage，冰浴过夜；于10000rpm离心20min，去掉上清；用0.6mL的2YT培养基重悬phage，于4℃保存备用。若需要大量制备phage，更换kan抗性的培养基以后，培养时间从两小时延长至过夜培养，获得的噬菌体经过梯度稀释，感染TG1菌，涂布SOBAG平板，通过菌落计数计算噬菌体库滴度。

再利用His Bind Resin结合抗原蛋白，从噬菌体展示的抗体库中淘选抗体，具体过程如下：活化His Bind Resin：取200μL的His Bind Resin于1.5mL离心管中，在1000g离心力条件下离心1min，去掉保存溶液；加入200μL的ddH₂O清洗树脂一次，再在1000g离心力条件下离心1min，去掉上清，重复此步骤一次；再加入200μL的离子化缓冲液，重悬树脂，静置10min后，离心去掉上清；加入200μL的结合缓冲液，重悬树脂，静置10min；取40μL树脂加入1.5mL离心管中，离心去掉上清。

取纯化后的RBD蛋白35μL(约10μg)，加入165μL的PBS中，混匀后加入装有活化后的树脂的EP管中，旋转混匀1h，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL的漂洗缓冲液，重悬树脂，在1000g离心力条件下离心1min，去掉上清，此步骤重复一次，取拯救后的噬菌体展示抗体库溶液300μL，加入0.3μL的Triton X-100，用微量移液器轻轻混匀；再加入40μL未活化的树脂，轻微旋转反应1h；再在1000g离心力条件下离心1min，取上清加入40μL已包被抗原蛋白的树脂，轻微旋转反应2h；在1000g离心力条件下离心1min，去掉上清；加入500μL漂洗缓冲液(含0.1％的Triton X-100)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，在1000g离心力条件下离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；

加入500μL漂洗缓冲液含(0.1％的Tween-20)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，再在1000g离心力条件下离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；最后一次漂洗后，将树脂转移到新的EP管中，再在1000g离心力条件下离心1min，去掉上清；加入200μL的洗脱缓冲液，轻微旋转洗脱20min；再在1000g离心力条件下离心1min，取上清，加入5mL的TG1菌液中，于37℃感染1h；将感染的菌液涂布SOBAG平板，30℃倒置培养过夜；次日，用2YT-AG培养基刮下平板上的菌落，并拯救成噬菌体进行下一轮淘选。

从SOBAG平板上随机挑取单菌落接种到96孔细菌培养板中，每孔加入200μL的2YT-AG培养基，于37℃培养过夜；再吸取25μL菌液到新的细菌培养板中，加入175μL的2YT-AG培养基，于37℃培养3h；于3500rpm离心10min，去上清，菌沉淀重悬于200μL的2YT-AI(100μg/mL的Amp，1mM的IPTG)培养基中，于30℃诱导过夜；在3500rpm离心10min，含纯化蛋白的上清于4℃保存备用；将纯化的目的蛋白加入到ELISA板中，于4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，再用4％的PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL以上制备好的纳米抗体上清和50μL的4％的PBSM，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL的anti-E/HRP conjugation(以4％PBSM按1∶5000稀释)，于37℃保温1h；再用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL的TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL的2mol/L的H2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450nm值判定目的蛋白的浓度。

将上述淘选得到的OD450nm值较大的目的蛋白经ELISA鉴定，将鉴定为阳性的单克隆送金开瑞测序，测序的通用引物为S1：5’-GACCATGATTACGCCAAGC-3’，用DNAstar和Clustalw1.8分析抗体的重链与轻链可变区序列。

实施例5

将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：

抗体表达：

通过热击法把质粒转化进大肠杆菌TOP10菌株，将转化后的菌液涂在含有氨苄抗性的平板上，于37℃过夜培养，再从新鲜的平培养板中挑取单克隆于3mL～5mL的LB培养基，并在37℃的条件下以220rpm转速培养8h，培养后的菌种按1/500比例接种于200mL的LB培养基中，再在37℃的条件下以220rpm转速培养16h，后收集菌液，用Qiagen试剂盒抽质粒，按照试剂盒说明书操作，得到的质粒可以直接用于转染。

从液氮中取出一支细胞，在37℃水浴中转动冻存管1至2分钟，使细胞迅速解冻，直至冻存管内仅剩一小块冰芯，用75％的酒精擦拭冻存管，再用1mL的移液器将冻存管内的细胞转移至含有20mL培养基(预热)的100mL摇瓶中，再将摇瓶置于120rpm、37℃和5％的CO₂的培养箱培养，待细胞复苏2～3天后测定细胞密度和细胞存活率，密度在4*10E6～6*10E6，存活率应大于90％，传代细胞，放入120rpm、37℃和5％的CO₂的培养箱培养，每天对细胞密度和活性进行检测，当密度在4*10E6～6*10E6就进行传代。

转染前一天，细胞接种至密度1*10E6，细胞活率要有95％以上，体积100mL，转染当天，测定细胞密度和活率，密度在2*10E6左右，活率要有95％以上，取一个无菌的15mL离心管A，加入5mL培养基，再加入100μg质粒，轻柔混匀。取另一个无菌的15mL离心管B，加入5mL培养基，再加入转染试剂，轻柔混匀。将B中的试剂加入A中，上下颠倒数次混匀，室温下静置孵育10min。然后慢慢将混合物转移至准备好的细胞悬液中，放入培养箱中120rpm、37℃和5％的CO₂的培养箱培养。转染4～5天后，离心收集细胞上清。转染后的细胞培养上清，用0.22μm膜过滤后再用proteinG柱纯化。

实施例6

将实施例6和实施例5进行对比，实施例6和实施例5的区别在于：

抗体应用验证：

为验证所构建的抗体库对适用于临床检测，利用MMP3抗体对(YF39-W2)对24例诊断试剂盒赋值血清样本进行检测，其检测结果如图7和图8所示，此结果表明构建的抗体库用于化学发光平台检测时，与商品化试剂盒测值比对，线性相关系数r2＞0.95，能够满足临床检测需求。

检测的实验流程如下：

A.用0.05mol/L的pH为9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至浓度为1g/mL，后在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL抗体溶液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

B.加待测校准品和待检血清样品50μL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤；

C.于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体100μL，37℃孵育0.5h，洗涤；

D.加入化学发光底物液50μL，避光放置于微孔板化学发光仪上静置5min，依序测量各孔的相对发光单位(RLU)。

E.通过校准曲线和样本测试信号，对待检血清样本的MMP3含量进行计算，再和商品化试剂盒检测值进行比较，线性回归拟合，计算出两者相关系数。

由实施例1-6可知，采用本申请实施例提供的噬菌体展示载体，并利用其制备出MMP3单克隆抗体，具有灵敏度高、临床比对相关性好等诸多优良特点，适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料，尤其是适用于化学发光等诊断试剂盒开发的抗体原料。

本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：

(1)本申请实施例提供的噬菌粒载体，通过在原有的噬菌体展示载体上设置双向启动子、抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因，控制双向启动子将抗体重链可变区基因的5’端和抗体轻链可变区基因的5’端相互连接，使得抗体中抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因能够同时表达，并且由于抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因在同一个噬菌体展示载体上，因此在单细胞内的抗体基因扩增和组装阶段，能保留抗体基因的天然配对，从而能获得亲和力更好的克隆抗体。

(2)本申请实施例提供的噬菌粒载体，由于采用了双向启动子，并且双向启动子、抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因都在同一质粒内，能保证抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因的同时表达，从而保留抗体基因的原始配对，获得亲和力更高的单克隆抗体。

(3)本申请实施例提供的噬菌粒载体，由于将螺旋卷曲结构域分为第一螺旋卷曲结构域和第二螺旋卷曲结构域进行组装，而第一螺旋卷曲结构域和第二螺旋卷曲结构域能表达出相互作用的两个蛋白，利用相互作用的两个蛋白的基因替换抗体恒定区，从而能方便准确的制备类Fab的抗体。

(4)本申请实施例提供的方法，通过分步建库方法，分步制备含有螺旋卷曲结构域的质粒、螺旋卷曲结构域和抗体基因的质粒和含螺旋卷曲结构域、双向启动子和抗体基因的质粒，再结合微液滴技术，能得到表达类Fab抗体的纯净的抗体基因，从而能在抗体库的构建过程中，保留抗体基因中的重链基因和轻链基因的原始配对。

(5)本申请实施例提供的应用，通过将改造后的噬菌粒载体用于抗体库的构建过程中，能构建出保留抗体基因原始配对的单克隆抗体，同时制备出的单克隆抗体具有灵敏度高、临床比对相关性好等诸多优良特点。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaggaattttaattttccacttttttgcgcagctgggccactttggtcttcagcgcgta 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcctgggccacggtagcgaaaccagccagtgccactgcaatcgcgatagctgtcttttt 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagcggatccggatacggcaccggcgcaccggatg 35

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<212> DNA

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Claims

1.一种噬菌粒载体，其特征在于，所述噬菌粒载体包括双向启动子、抗体重链可变区基因和抗体轻链可变区基因，所述抗体重链可变区基因的5’端和所述抗体轻链可变区基因的5’端相对设置，所述双向启动子的一端连接所述抗体重链可变区基因的5’端，所述双向启动子的另一端连接所述抗体轻链可变区基因的5’端。

2.根据权利要求1所述的噬菌粒载体，其特征在于，所述双向启动子的序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的噬菌粒载体，其特征在于，所述噬菌粒载体还包括异源二聚的结构域元件。

4.根据权利要求3所述的噬菌粒载体，其特征在于，所述异源二聚的结构域元件包括异源二聚的卷曲螺旋结构域、抗体重链恒定区CH1基因和抗体轻链CL基因中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的噬菌粒载体，其特征在于，所述结构域元件包括异源二聚的卷曲螺旋结构域，所述卷曲螺旋结构域包括第一卷曲螺旋结构域和第二卷曲螺旋结构域，所述第一卷曲螺旋结构域设于所述抗体重链可变区基因的3’端，所述第二卷曲螺旋结构域设于所述抗体轻链可变区基因的3’端，所述卷曲螺旋结构域的序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的噬菌粒载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

分别对原始噬菌粒载体和所述异源二聚的卷曲螺旋结构域进行第一酶切，再进行DNA回收，分别得到第一目的基因片段和酶切载体；

对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段；

对所述第二连接产物进行测序分析和筛选，得到含双向启动子和螺旋卷曲结构域的噬菌粒载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一酶切所用的酶体系包括Sapi酶和BamHI酶，所述第三酶切所用的酶体系包括Sac I酶和NcoI酶。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第三PCR扩增反应所用的引物组包括重链组扩增引物和轻链组引物；

所述轻链组引物包括如SEQ ID NO.12所示的RbVK-F1，如SEQ ID NO.13所示的RbVK-F2，如SEQ ID NO.14所示的RbVK-F3，如SEQ ID NO.15所示的RbVK-R1，如SEQ ID NO.16所示的RbVK-R2和如SEQ ID NO.17所示的RbVK-R3。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段，具体包括：

11.一种噬菌粒载体的应用，其特征在于，所述应用包括：将如权利要求1-3任一项所述的噬菌粒载体用于抗体库的构建中。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗体库的构建方法包括：

对B淋巴细胞进行前处理，得到纯化的mRNA片段；

对所述第二抗体库进行抗体筛选，得到噬菌体展示抗体库。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述对所述第二抗体库进行抗体筛选，得到抗体库，具体包括：

对噬菌体展示的抗体库进行淘选，得到抗体库。

14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用还包括：将如权利要求1-3任一项所述的噬菌粒载体用于单克隆抗体的制备中。