CN106834334A - 一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，其序列包含酵母GAL1/GAL10双向启动子、以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区，其中，所述的以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区与Aga2相融合。应用本发明筛选到Fab片段可以直接转换成全长抗体，不存在失活的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒。
背景技术
酵母细胞表面展示抗体库技术被广泛使用，但仍存在两个问题，第一，由于酵母细胞质粒转化效率较低，在酵母中构建抗体库的容量小于噬菌体展示抗体库的容量，同时酵母展示技术依赖于流式分选，对能操作的文库大小也有一定限制；第二，现有酵母系统一般展示scFv，但scFv不够稳定易失活；第三，Fab抗体相对稳定，但筛选难度大，过程复杂，需要分别表达Fab的重链区和轻链区，目前主要通过分别携带有Fab重链区和轻链区的不同配型的酵母细胞交配在酵母表面展示完整的Fab抗体。该方法除费时费力缺点外，易残留只展示Fab抗体重链区的酵母细胞，干扰Fab抗体的筛选或改造。而scFv转化为全长IgG时对抗原的亲和力会变弱甚至失活。
参考文献：
1、Steinwand M,Droste P,Hust M,et al.The influence of antibodyfragment format on phage display based affinity maturation of IgG[J].Mabs,2013,6(1):204-218.
2、Bowley D R,Labrijn A F,Zwick M B,et al.Antigen selection from anHIV-1immune antibody library displayed on yeast yields many novel antibodiescompared to selection from the same library displayed on phage.[J].ProteinEngineering,Design and Selection,2007,20(2):81-90.
3、Colby D W,Kellogg B A,Graff C P,et al.Engineering Antibody Affinityby Yeast Surface Display[J].Methods in Enzymology,2004,388(4):348-358.
发明内容
本发明的目的是克服上述问题，提供一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，该质粒能够使单个酵母细胞同时表达抗体Fab片段的轻链区和重链区，与利用酵母细胞交配筛选抗体Fab片段相比，特异性高，简单易操作，省时省力，节约成本。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，其序列包含酵母GAL1/GAL10双向启动子、以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区，其中，所述的以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区与Aga2相融合。
优选地，所述的以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区位于Aga2的C端或N端。
优选地，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含Aga2引导序列，以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区之前都各带有一段Aga2引导序列。
优选地，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含酵母营养缺陷型筛选标记TRP1、引导单链DNA复制启动子、酵母ADH1终止子、Aga2ORF(a-凝集素亚基2开放阅读框)，HA标签、C-Myc标签、酵母CYC1终止子、pUC原核细胞复制启动子、Ampicillinresistance(bla)ORF(氨苄青霉素抗性开放阅读框)和酵母复制启动子。
优选地，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含位于以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区两端的PacI和SacI酶切位点和位于以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区两端的XhoI和SpeI酶切位。
优选地，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含EcoRI、BamHI和NheI等酶切位点。
优选地，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明使单一酵母细胞同时表达Fab抗体的重链和轻链，且二者等量表达，形成完整的异二聚体Fab抗体片段，避免了单个Fab重链区展示在酵母表面影响Fab抗体筛选的特异性。
2、本发明可以将噬菌体展示抗体库技术和酵母展示抗体库技术有效集成在一起，从而先按照传统亲和力成熟方法，构建超大库容(多样性>1010)的噬菌体展示抗体Fab突变库，并进行一轮“淘选”，初步富集与抗原结合的抗体；之后，将富集的抗体通过亚克隆构建到本发明质粒中并转化到酵母中，较小库容(105多样性)的酵母展示抗体Fab突变库即可以覆盖所有富集的抗体的多样性，接下来应用标准的酵母展示技术进行抗体的亲和力成熟改造，进行半定量筛选具有高亲和力或特殊性质的抗体亚群。该操作结合了噬菌体展示的大库容、操作方便和酵母展示抗体库技术的半定量筛选的优点。
附图说明
图1为用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒图谱；
图2为实施例2中用流式细胞仪于561nm激光激发检测酵母细胞荧光强度图。
图3为ELISA检测噬菌体展示系统中Fab抗体与抗原的结合图。
图4为pcome3xss质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒pYD-AH vector的图谱如图1中A所示，本实施例的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒pYD-HA vector的图谱如图1中B所示。质粒pYD-AH vector和pYD-HA vector的序列包含酵母GAL1/GAL10双向启动子、以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区，其中，所述的以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区与Aga2相融合。
所述的质粒pYD-AH vector和pYD-HA.vector的序列具体包含：
1、Yeast TRP1selection marker ORF(TRP1)：酵母营养缺陷型筛选标记TRP1。
2、f1origin of ss-DNA replication(f1ori)：引导单链DNA复制启动子。
3、Yeast ADH1terminator(T ADH1)：酵母ADH1终止子。
4、Fab L chain：以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区(含一个可变区和一个保守区段)。
5、Fab H chain：以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区(含一个可变区和一个保守区段)。对于质粒pYD-AH vector，以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区位于Aga2的C端，对于质粒pYD-HA vector，以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区位于Aga2的N端。
6、Yeast GAL1/GAL10divergent promoters(P GAL1/P GAL10)(酵母GAL1/GAL10双向启动子)：GAL1/10是酵母双向启动子，利用这个双向启动子可以在一个质粒中同时表达两种蛋白。本发明利用这一特殊启动子实现Fab抗体重链区和轻链区的共表达。GAL1/GAL10启动子在SG培养基(合成葡萄糖基本培养基)中被抑制，在SG培养基(合成半乳糖基本培养基)中被启动。
7、Aga2leader sequence(L Aga2)：Aga2引导序列，以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区之前都各带有一段Aga2引导序列。
8、Aga2ORF(Aga2)：(a-凝集素亚基2开放阅读框)表达Aga2用于在酵母表面展示抗体。
9、HA tag：HA标签。
10、C-Myc tag(Myc tag)：C-Myc标签。
11、Yeast CYC1terminator(T CYC1)：酵母CYC1终止子。
12、pUC origin of replication(pUC ori)：pUC原核细胞复制启动子，用于质粒在大肠杆菌中的扩增。
13、Ampicillin resistance(bla)ORF(AmpR)：(氨苄青霉素抗性开放阅读框)质粒载体具备氨苄青霉素抗性，用于在大肠杆菌中的筛选。
14、2μyeast origin of replication(2μori)：酵母复制启动子。
15、多克隆位点：包括位于以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区两端的PacI和SacI酶切位点和位于以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区两端的XhoI和SpeI酶切位点。如图4所示，质粒pYD-AH vector和pYD-HA vector用于克隆抗体轻链和重链的酶切位点与常用噬菌体展示抗体Fab的载体pcome3xss一致，因此抗体基因可以方便的在噬菌体展示系统和酵母展示系统之间通过亚克隆方便切换。另外质粒上也有EcoRI、BamHI、NheI等常用多克隆位点。
所述的质粒pYD-AH vector和pYD-HA vector的具体序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。质粒各元件序列信息从NCBI基因库中获得。其制备方法为：按照质粒具体序列，拼装后送基因合成公司上海捷瑞生物工程有限公司按照常规方法进行全序列合成；将合成的质粒按照常规方法转化大肠杆菌DH5α(天跟生化科技有限公司，CB101)进行扩增，将扩增后的质粒送基因测序公司铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序，测序确认后保存相应质粒，以备后续使用。
实施例2
为检测实施例1中的质粒pYD-AH vector和pYD-HA vector是否能够在酵母展示筛选系统中正确展示Fab抗体，以血小板生成素受体(Thrombopoietin Receptor,TpoR)抗体3D9(该抗体记载在WO 2014/035693A2中，其轻链区序列为SEQ ID NO:3，重链区序列为SEQID NO:4)和人类表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,Her2，又名c-erb2)抗体4D5为例进行验证。具体步骤为：
(1)按照质粒图谱说明将3D9轻链区利用限制性内切酶PacI和SacI(NEB)亚克隆到质粒pYD-AH vector中：
将3D9轻链区5’端和3’端分别添加限制性内切酶位点PacI(序列ttaattaa)和SacI(序列gagctc)，并送基因合成公司上海捷瑞生物工程有限公司按照常规方法进行全序列合成，用PacI和SacI限制性内切酶(NEB)按照操作说明在37℃条件下分别对质粒载体pYD-AHvector和插入片段3D9轻链区酶切2小时，将载体和插入片段进行DNA凝胶电泳以分离酶切后的片段，然后用凝胶回收试剂盒(Mscherey-nagel,MNG-740609.250)按照试剂盒使用操作手册回收载体和插入片段,并用T4连接酶(NEB，M0202)按照操作说明将二者在16℃条件下连接过夜，接着将该连接产物按照常规方法转化进DH5α细胞(天跟生化科技有限公司，CB101)，挑选克隆接种培养后送铂尚生物技术有限公司进行测序，确定正确的克隆，命名为pYD-AH-TpoR Antibody-L chain。继而在3D9重链区的5’端和3’端分别添加限制性内切酶位点XhoI(序列ctcgag)和SpeI(序列actagt)并送基因合成公司上海捷瑞生物工程有限公司按照常规方法进行全序列合成，利用限制性内切酶XhoI和SpeI(NEB)按照操作说明在37℃条件下酶切质粒载体pYD-AH-TpoR Antibody-L chain和插入片段3D9重链区，将载体和插入片段进行DNA凝胶电泳以分离酶切后的片段，然后用凝胶回收试剂盒(Mscherey-nagel, MNG-740609.250)按照试剂盒使用操作手册回收载体和插入片段,并用T4连接酶(NEB，M0202)按照操作说明将二者在16℃条件下连接过夜，接着将该连接产物按照常规方法转化进DH5α细胞(天跟生化科技有限公司，CB101)，挑选克隆接种培养后送铂尚生物技术有限公司进行测序，确定正确的克隆，将获得的重组质粒命名为pYD-AH-TpoR Antibody3D9。
(2)按照与(1)相同的亚克隆步骤，将3D9轻链区和重链区克隆到载体pYD-HA中，命名为pYD-HA-TpoR Antibody 3D9；将4D5轻链区和重链区(4D5轻链区序列为SEQ ID NO:5，重链区序列为SEQ ID NO:6，该抗体记载在US5821337中)分别克隆到载体pYD-AH和pYD-HA中，分别命名为pYD-AH-Her2Antibody 4D5和pYD-HA-Her2Antibody 4D5。
(4)按照文献描述方法制备酿酒酵母EBY100电转化感受态细胞(Ginger Chao，WaiL Lau，Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display,nature protocols,第9到第10页)。
(5)将(2)获得的重组质粒按照文献描述的方法分别转化进酿酒酵母EBY100电转化感受态细胞。(Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating and engineering humanantibodies using yeast surface display,nature protocols,第9到第10页)。
(6)将电转化后的酵母移至30℃预热的YPD培养基(Amreseco,J903)中，200rpm、30℃条件下培养一小时，2500g离心，弃上清，将离心获得产物重悬于1ml Tpr-营养缺陷型培养基(Clontech，ST0041)中，取10μl重悬酵母菌液涂布在固体Tpr-营养缺陷型培养平板上30℃条件下静置培养2天，获得单克隆酵母株。
(7)将单克隆酵母株在SD培养基(配方见Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating andengineering human antibodies using yeast surface display,nature protocols,第3页)中30℃、200rpm条件下培养过夜，将培养菌液在2500g条件下离心,去掉上清，继而将酵母在SG诱导培养基(配方见Ginger Chao，Wai L Lau，Isolating and engineering humanantibodies using yeast surface display,nature protocols,第3页)中重悬至密度为1OD，体积为5ml。然后将酵母在20℃,200rpm条件下诱导培养36小时后，各取1*108酵母在1.5mL离心管中以离心力14000g离心，去掉上清，用1ml预冷至4℃的PBS缓冲液重悬，离心后再次重悬在1ml预冷至4℃的PBS 缓冲液中，然后分别加入2μl生物素(EZ-Link NHS-PEG4-Biotin,No-Weigh Format,Thermo,Cat.21329)标记的TpoR(R&D,Cat.4444-TR)和Her2(R&D,Cat.1129-ER)，即Biotin-TPOR和Biotin-Her2(浓度0.5μg/mL)，在室温条件下孵育1小时。
(8)将(7)孵育后的产物用预冷至4℃的PBS缓冲液洗三遍，然后重悬于1ml预冷至4℃的PBS缓冲液中。加入二抗SAPE(Streptavidin R-PHYCOERYTHRIN conjugated,thermo,21627)，室温孵育半小时。用预冷的PBS洗三遍后，重悬于1ml预冷的PBS中，置于冰上。
(9)用流式细胞仪于561nm激光激发检测酵母细胞荧光强度。
如图2所示，细胞流式结果显示，pYD-AH和pYD-HA质粒系统均可以使Fab 3D9和Fab4D5抗体在酵母展示系统中正确表达，并且能够与对应抗原TPOR和Her2特异性的结合，不会产生非特异性结合，说明两套酵母展示质粒pYD-AH和pYD-HA均可以正确展示Fab类抗体。
实施例3
构建并检测与pYD-AH/pYD-HA质粒系统多克隆位点一致的Fab抗体噬菌体展示质粒：
(1)将噬菌体抗体展示文库常用质粒pcome3xss的酶切位点改造成与pYD-AH和pYD-HA质粒系统一致的酶切位点，并将Fab 3D9和Fab 4D5分别构建进pcomb3xss质粒。将构建好的质粒转化进Xl-1blue细胞中，生产出展示有抗体Fab 3D9、ScFv 3D9(图3.A)、Fab4D5、ScFv 4D5(图3.B)的噬菌体；
具体操作是：将0.1-50ngpcomb3xss质粒(addgene,Plasmid#63890)转入1管的XL1-BLUE感受态细胞(XL1-Blue Competent Cells，Agilent Stratagene，200249)，冰上孵育30分钟，在42℃水浴锅中热激45秒，再冰浴超过2分钟，加预热的SOC培养基(SOCOutgrowth Medium，NEW ENGLAND BioLabs，3681505)0.9ml并在37℃培养箱中以250rpm转速培养1小时，将菌液(<200μl)涂到细胞培养板SB-Agar培养基上[该培养基由Super Broth(Teknova,Inc)添加Agar(Amresco,2885c049,按25g/L添加)制得]，37℃静置培养过夜。挑单克隆并摇5mlSB培养基[该培养基由Super Broth(同上)添加脱水右旋葡萄糖((Amresco,0188-1KG)制得，右旋葡萄糖终浓度为2％)，同时加入50μl羧苄青霉素(Amresco，J358-250MG，工作浓度为100μg/ml)和10μl四环素(Amersco,E709，工作浓度为10ug/ml)]，在37℃培养箱中以250rpm转速培养过夜。第二天转接到5mlSB培养基(配方及抗生素加入情况同上)至OD为0.1，在37℃培养箱中以250rpm转速培养2-3个小时至OD值为0.5-0.6。加入50μl辅助噬菌体(VCSM13Interference-Resistant HelperPhage Agilent，200251，噬菌体滴度1013/ml)并在37℃培养箱中静置30分钟，期间每隔10分钟，轻摇一次。然后在37℃培养箱中摇1.5h，接着以3000rpm的转速4℃条件下离心15分钟，弃去上清，用SB培养基洗涤一次，再次离心并弃去上清。加适量SB培养基(同上)重悬，测量OD值。最终培养在5ml SB培养基中[配方同上，另外添加50μl羧苄青霉素(同上)，140μl卡那霉素(KANAMYCIN SULFATE,25MG/ML，Amresco,E710，工作浓度为50ug/mL)，10μl四环素(同上)]，OD调为0.8。在30℃条件下，250rpm摇床中培养过夜。次日以5000rpm于4℃条件下离心15分钟并收集上清，取上清用于ELISA实验。
(2)以ELISA方法检测噬菌体是否正确展示了相应抗体，并以噬菌体展示ScFv 3D9和ScFv 4D5分别作为各自Fab抗体的对照，具体步骤为：分别取TpoR(A)蛋白(Tpo R,R&DSYSTEM,QXN0416011)，或Her2(B)(Her2,R&D SYSTEM,FXR0915011)两种抗原50ng及25μlCBS缓冲液(CBS，Sigma,SLBJ-3659V)加入96孔板(Costar Assay Plate,CorningIncorporated，19115015)每种抗原进行三组重复实验，另外还有两组对照，室温结合1小时即可。用PBST缓冲液(由PBS与Tween 20混合构成，其中Tween 20的浓度为1％,PBS,Amersco,E504,Tween 20,amersco,0777)冲洗三遍，并在纸上拍干。每次洗板要避免孔干导致蛋白变性。每孔加100μL 5％Milk-PBST(Milk,BD,3106120)进行封闭，37℃封闭1小时。然后分别加入45μL的展示有抗体Fab 3D9、ScFv 3D9(A)、Fab 4D5、ScFv 4D5(B)的噬菌体上清并在37℃条件下孵育1小时，两种噬菌体互为阴性对照，继而用PBST洗涤未结合噬菌体，然后每孔加入50μlHRP偶联的抗M13抗体(1：5000在Milk-PBST进行稀释)(HRP/ANTI-M13MONOCLNL CONJUG.GE,9597716)在37℃条件下孵育40分钟，用PBST洗涤之后加入50μl底物ABTS(ABTS solution,Roche,11734200)显色并在405nm波长下测定光吸收值(OD405)。**P<0.01vs.对照组；#P<0.05,##P<0.01vs.Fab抗体噬菌体组。统计方法采用单因素方差分析，两两比较采取LSD方法。
如图3所示，ELISA结果显示噬菌体都可以正确展示3D9和4D5的Fab抗体，且能够与相应抗原TpoR和Her2结合，但Fab类抗体与抗原的结合强度低于ScFv类抗体，特别是Fab3D9。该结果说明改造后噬菌体展示质粒pcome3xss可以正确展示Fab抗体。
<110>上海科技大学
<120>一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6955
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
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agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
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ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260
ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320
atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380
gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440
gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500
aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560
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gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680
ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740
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agaaagcaac ctgacctaca ggaaagagtt actcaagaat aagaattttc gttttaaaac 1860
ctaagagtca ctttaaaatt tgtatacact tatttttttt ataacttatt taataataaa 1920
aatcataaat cataagaaat tcgcttattt agaagtgtca acaacgtatc taccaacgat 1980
ttgacccttt tccatctttt cgtaaatttc tggcaaggta gacaagccga caaccttgat 2040
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cagaaaatat tgaaaaacag cgaagtaact gcatgaattc gaattttcaa aaattcttac 2220
tttttttttg gatggacgca aagaagttta ataatcatat tacatggcat taccaccata 2280
tacatatcca tatacatatc catatctaat cttacttata tgttgtggaa atgtaaagag 2340
ccccattatc ttagcctaaa aaaaccttct ctttggaact ttcagtaata cgcttaactg 2400
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taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc aaatgtaata aaagtatcaa 2820
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tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc 3480
tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg 3540
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gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3660
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aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 4080
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 4140
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 4200
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ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4380
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caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 4740
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tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 5520
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aaggttagaa gaaggctact ttggtgtcta ttttctcttc cataaaaaaa gcctgactcc 6000
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tactacgtat aggaaatgtt tacattttcg tattgttttc gattcactct atgaatagtt 6240
cttactacaa tttttttgtc taaagagtaa tactagagat aaacataaaa aatgtagagg 6300
tcgagtttag atgcaagttc aaggagcgaa aggtggatgg gtaggttata tagggatata 6360
gcacagagat atatagcaaa gagatacttt tgagcaatgt ttgtggaagc ggtattcgca 6420
atattttagt agctcgttac agtccggtgc gtttttggtt ttttgaaagt gcgtcttcag 6480
agcgcttttg gttttcaaaa gcgctctgaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt 6540
cggaatagga acttcaaagc gtttccgaaa acgagcgctt ccgaaaatgc aacgcgagct 6600
gcgcacatac agctcactgt tcacgtcgca cctatatctg cgtgttgcct gtatatatat 6660
atacatgaga agaacggcat agtgcgtgtt tatgcttaaa tgcgtactta tatgcgtcta 6720
tttatgtagg atgaaaggta gtctagtacc tcctgtgata ttatcccatt ccatgcgggg 6780
tatcgtatgc ttccttcagc actacccttt agctgttcta tatgctgcca ctcctcaatt 6840
ggattagtct catccttcaa tgctatcatt tcctttgata ttggatcata ttaagaaacc 6900
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 6955
<210> 2
<211> 6961
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240
atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300
aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360
gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420
tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480
atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540
cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600
agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660
atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720
ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780
ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840
actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900
attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960
gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020
atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080
agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140
aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260
ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320
atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380
gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440
gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500
aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560
ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1620
gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680
ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740
tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctgaattgga gcgacctcat gctatacctg 1800
agaaagcaac ctgacctaca ggaaagagtt actcaagaat aagaattttc gttttaaaac 1860
ctaagagtca ctttaaaatt tgtatacact tatttttttt ataacttatt taataataaa 1920
aatcataaat cataagaaat tcgcttattt agaagtgtca acaacgtatc taccaacgat 1980
ttgacccttt tccatctttt cgtaaatttc tggcaaggta gacaagccga caaccttgat 2040
tggagacttg accaaacctc tggcgaagaa ttgttaatta atctagaatt aacactctcc 2100
cctgttgaag ctctttgtga cgggcgaact cagggagctc tgctaaaact gaagcaataa 2160
cagaaaatat tgaaaaacag cgaagtaact gcatgaattc gaattttcaa aaattcttac 2220
tttttttttg gatggacgca aagaagttta ataatcatat tacatggcat taccaccata 2280
tacatatcca tatacatatc catatctaat cttacttata tgttgtggaa atgtaaagag 2340
ccccattatc ttagcctaaa aaaaccttct ctttggaact ttcagtaata cgcttaactg 2400
ctcattgcta tattgaagta cggattagaa gccgccgagc gggtgacagc cctccgaagg 2460
aagactctcc tccgtgcgtc ctcgtcttca ccggtcgcgt tcctgaaacg cagatgtgcc 2520
tcgcgccgca ctgctccgaa caataaagat tctacaatac tagcttttat ggttatgaag 2580
aggaaaaatt ggcagtaacc tggccccaca aaccttcaaa tgaacgaatc aaattaacaa 2640
ccataggatg ataatgcgat tagtttttta gccttatttc tggggtaatt aatcagcgaa 2700
gcgatgattt ttgatctatt aacagatata taaatgcaaa aactgcataa ccactttaac 2760
taatactttc aacattttcg gtttgtatta cttcttattc aaatgtaata aaagtatcaa 2820
caaaaaattg ttaatatacc tctatacttt aacgtcaagg agaaaaaacc ccggatccat 2880
gcagttactt cgctgttttt caatattttc tgttattgct tcagttttag cactcgagct 2940
gcgaagtcac ccatcagggc ctgagcttgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt 3000
gttagtacta gtctgcaggc tagtggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt 3060
ggtggttctt acccatacga cgttccagac tacgctggcg gtggaggcag tcaggaactg 3120
acaactatat gcgagcaaat cccctcacca actttagaat cgacgccgta ctctttgtca 3180
acgactacta ttttggccaa cgggaaggca atgcaaggag tttttgaata ttacaaatca 3240
gtaacgtttg tcagtaattg cggttctcac ccctcaacaa ctagcaaagg cagccccata 3300
aacacacagt atgtttttgg cagtgaacaa aaacttattt ctgaagaaga tctgtaggct 3360
agctaagatc cgctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta 3420
tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt 3480
tttttctgta cagacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg 3540
ttttgggacg ctcgaagatc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 3600
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 3660
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 3720
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 3780
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 3840
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 3900
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 3960
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 4020
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 4080
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 4140
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 4200
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 4260
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 4320
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 4380
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 4440
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 4500
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 4560
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 4620
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 4680
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 4740
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 4800
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 4860
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 4920
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 4980
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 5040
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 5100
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 5160
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caaaaatgca acgcgagagc gctaattttt caaacaaaga atctgagctg catttttaca 5640
gaacagaaat gcaacgcgaa agcgctattt taccaacgaa gaatctgtgc ttcatttttg 5700
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ctttttttct cctttgtgcg ctctataatg cagtctcttg ataacttttt gcactgtagg 5940
tccgttaagg ttagaagaag gctactttgg tgtctatttt ctcttccata aaaaaagcct 6000
gactccactt cccgcgttta ctgattacta gcgaagctgc gggtgcattt tttcaagata 6060
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tctatatact acgtatagga aatgtttaca ttttcgtatt gttttcgatt cactctatga 6240
atagttctta ctacaatttt tttgtctaaa gagtaatact agagataaac ataaaaaatg 6300
tagaggtcga gtttagatgc aagttcaagg agcgaaaggt ggatgggtag gttatatagg 6360
gatatagcac agagatatat agcaaagaga tacttttgag caatgtttgt ggaagcggta 6420
ttcgcaatat tttagtagct cgttacagtc cggtgcgttt ttggtttttt gaaagtgcgt 6480
cttcagagcg cttttggttt tcaaaagcgc tctgaagttc ctatactttc tagagaatag 6540
gaacttcgga ataggaactt caaagcgttt ccgaaaacga gcgcttccga aaatgcaacg 6600
cgagctgcgc acatacagct cactgttcac gtcgcaccta tatctgcgtg ttgcctgtat 6660
atatatatac atgagaagaa cggcatagtg cgtgtttatg cttaaatgcg tacttatatg 6720
cgtctattta tgtaggatga aaggtagtct agtacctcct gtgatattat cccattccat 6780
gcggggtatc gtatgcttcc ttcagcacta ccctttagct gttctatatg ctgccactcc 6840
tcaattggat tagtctcatc cttcaatgct atcatttcct ttgatattgg atcatattaa 6900
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 6960
c
6961
<210> 3
<211> 645
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
ctgtagcact actgggtcag aggcagtagg cacagacgta gacatcctct gtttcactgg 60
tagtgaacag cccgctcagt cccagaaccg tccaccaatc ggaccatagt cgtccttggt 120
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ggtagactac tcgtcaactt tagaccttga cggagacagc acacggacga cttattgaag 420
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ccggacagga gcgggcagtg tttctcgaag ttgtcccctc tcaca 645
<210>4
<211> 669
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
atggcacagg ttcagctggt acagtctggg gctgaggtga ggaaggttgg gtcctcggtg 60
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caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggagggatca tccctatctt tggtactgca 180
gactacgcac agaaattccg gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca 240
gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300
gatcggaagt tagggggatc cgactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgact gtgccctcta gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgt 669
<210>5
<211> 642
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct gtctcagtgg 60
tagtgaacgg cccgttcagt cctacactta tggcgccagc gtaccatagt cgtctttggt 120
ccctttcggg gattcgagga ctagataaga cgtaggaaga acatatcacc ccagggtagt 180
tccaagtcac cgtcatctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240
cttctaaaac gttgaatgat gacagttgtc gtaatgtgat ggggaggctg caagccggtt 300
ccatggttcg aactctagtt tgcttgacac cgacgtggta gacagaagta gaagggcggt 360
agactactcg tcaactttag accttgacgg agacagcaca cggacgactt attgaagata 420
gggtctctcc ggtttcatgt caccttccac ctattgcggg aggttagccc attgagggtc 480
ctctcacagt gtctcgtcct gtcgttcctg tcgtggatgt cggagtcgtc gtgggactgc 540
gactcgtttc gtctgatgct ctttgtgttt cagatgcgga cgcttcagtg ggtagtcccg 600
gacaggagcg ggcagtgttt ctcgaagttg tcccctctca ca 642
<210>6
<211> 669
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caatattaag gacacttaca tccactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcacgt atttatccta ccaatggtta cacacgctac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccgcagaca cttccaagaa cacggcgtat 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgttc gagatggggc 300
ggtgacggct tctatgccat ggactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgact gtgccctcta gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgt 669
Claims (7)
1.一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，其序列包含酵母GAL1/GAL10双向启动子、以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区，其中，所述的以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区与Aga2相融合。
2.如权利要求1所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，所述的以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区位于Aga2的C端或N端。
3.如权利要求1所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含Aga2引导序列，以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区和以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区之前都各带有一段Aga2引导序列。
4.如权利要求1所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含酵母营养缺陷型筛选标记TRP1、引导单链DNA复制启动子、酵母ADH1终止子、Aga2ORF，HA标签、C-Myc标签、酵母CYC1终止子、pUC原核细胞复制启动子、Ampicillinresistance(bla)ORF和酵母复制启动子。
5.如权利要求1所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含位于以GAL10为启动子表达Fab抗体的轻链区两端的PacI和SacI酶切位点和位于以GAL1为启动子表达Fab抗体的重链区两端的XhoI和SpeI酶切位。
6.如权利要求1所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列还包含EcoRI、BamHI和NheI位点。
7.一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒，其特征在于，所述的用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒的序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (1)
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|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110714019A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-21 | 普健生物（武汉）科技有限公司 | 一种新型的人源Fab噬菌体展示载体 |
| WO2022143596A1 (en) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Surface display of antibodies in yeast cell |
| CN115109794A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-27 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用 |
| CN115786387A (zh) * | 2022-09-19 | 2023-03-14 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101473035A (zh) * | 2006-06-20 | 2009-07-01 | 财团法人牧岩生命工学研究所 | 在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法 |
| CN105349569A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-02-24 | 湖北大学 | 一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法 |
-
2016
- 2016-12-30 CN CN201611254587.4A patent/CN106834334A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101473035A (zh) * | 2006-06-20 | 2009-07-01 | 财团法人牧岩生命工学研究所 | 在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法 |
| CN105349569A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-02-24 | 湖北大学 | 一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SIMON ROSOWSKI等: "A novel one‑step approach for the construction of yeast surface display Fab antibody libraries", 《ROSOWSKI ET AL. MICROB CELL FACT》 * |
| TWAN VAN DEN BEUCKEN等: "Affinity maturation of Fab antibody fragments by fluorescent-activated cell sorting of yeast-displayed libraries", 《FEBS LETTERS》 * |
| 翟一凡等: "酵母表面展示技术应用的研究进展", 《生物学通报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110714019A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-21 | 普健生物（武汉）科技有限公司 | 一种新型的人源Fab噬菌体展示载体 |
| CN110714019B (zh) * | 2019-10-18 | 2022-08-05 | 普健生物（武汉）科技有限公司 | 一种新型的人源Fab噬菌体展示载体 |
| WO2022143596A1 (en) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Surface display of antibodies in yeast cell |
| CN115109794A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-27 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种噬菌粒载体及其制备方法和应用 |
| CN115786387A (zh) * | 2022-09-19 | 2023-03-14 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用 |
| CN115786387B (zh) * | 2022-09-19 | 2024-02-13 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用 |
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