CN115786387B - 一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用，涉及蛋白质工程技术领域。本发明提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，包括由酵母启动子‑酵母Aga1基因‑酵母转录终止子组成的表达模块一和由酵母启动子‑展示基因‑Aga2p基因‑酵母转录终止子组成的表达模块二；所述质粒载体将锚定蛋白和展示蛋白同时构建在同一个质粒载体上，使其在酵母细胞内同时实现高效表达，从而使展示蛋白可以高效地在大多数类型的酵母细胞表面进行展示，极大的提高酵母表面展示技术的使用方便性和广泛性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体及其应用。
背景技术
目前比较成熟的展示技术主要包括噬菌体展示技术和酵母展示技术。酵母展示技术被认为是更优于噬菌体展示的蛋白体外筛选技术。酵母展示技术是基于将目的蛋白展示于酵母细胞表面的通用技术，广泛应用于许多生物领域。其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的质粒载体基因序列融合后转化到酵母细胞内，融合蛋白含有可锚定在酵母细胞壁上的结构，经转录翻译后可将外源蛋白固定化表达在酵母细胞表面。
酵母展示技术具有多项优点：酵母表达系统不仅具有操作简单，培养方便等原核生物细菌表达系统的特点，并且由于其属于真核生物系统，具备了蛋白翻译后加工和修饰的功能，使得表达出来的蛋白、抗体、酶等更接近天然结构。酵母细胞的直径比细菌大2-5倍，这使得酵母展示技术的筛选不仅适用于磁珠筛选(MACS)，还可以和流式细胞仪(FACS)结合起来，不但提高筛选的通量和速度，并且可以非常直观跟踪和预估抗体亲和力，极大地提高筛选效率。而且，酵母在生长传代过程中可以使基因文库的多样性得到很好的保真，避免基因文库的偏向性。
酵母表面展示技术已成为蛋白质工程，尤其是抗体工程中广泛应用的强大工具。其中酵母展示技术可以结合流式细胞术，直接分析展示靶标蛋白的表达、稳定性以及与互作蛋白的亲和力，从而成为高效的文库筛选体系。酵母表面展示技术已被用于针对各种抗原的纳米抗体(VHH)和单链抗体(scFv)筛选及其优化。
酵母展示技术相比噬菌体展示技术有着非常突出的优点，但同时也有其明显的不足之处。如野生型酵母由于其锚定蛋白表达水平低，无法有效展示靶标蛋白，必须高表达锚定蛋白才能有效展示靶标蛋白。酵母种类繁多，在不同的应用领域通常会选用更适合本领域的酵母菌株，但目前常用的能高表达锚定蛋白的酵母菌株只有酿酒酵母EBY100及其衍生菌株。目前，酵母展示质粒载体只能展示靶标蛋白，没有同时也高效表达锚定蛋白的质粒载体，锚定蛋白由EBY100的基因组表达元件提供，这就极大的限制了酵母展示技术使用的广泛性和方便性。因此，本领域亟需一种使用方便而且具有通用型的酵母细胞表面展示质粒载体。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，可以使靶标蛋白高效地在大多数类型的酵母细胞表面进行展示，极大的提高酵母表面展示技术的使用方便性和广泛性。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，所述质粒载体包括：由酵母启动子-酵母Aga1基因-酵母转录终止子组成的表达模块一和由酵母启动子-展示基因-Aga2p基因-酵母转录终止子组成的表达模块二。
优选的，所述酵母启动子为GAL1-GAL10双向启动子、GAP/TDH3启动子、TEF1启动子、TEF2启动子、CCW12启动子、PGK1启动子、TPI1启动子、HHF2启动子中的任意一种。
优选的，所述酵母转录终止子为Cyc1终止子、ADH1终止子、PGK1终止子、ENO1终止子、ENO2终止子、SSA1终止子、TDH1终止子、RPL3终止子中的任意一种。
优选的，所述质粒载体还包括在大肠杆菌中进行复制和筛选的元件；所述在大肠杆菌中进行复制的元件为ColE1 ori、P15A ori、CloDF13 ori、RSF1030 ori、COLA或Mini-F/RK2中的任意一种；所述在大肠杆菌中进行筛选的元件为氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因或四环素抗性基因中的任意一种。
优选的，所述质粒载体还包括在酵母细胞中进行复制和筛选的元件；所述在酵母细胞中进行复制的元件为CEN/ARS或2μm Ori；所述在酵母细胞中进行筛选的元件为URA3、His、Trp、Leu或Ile中的任意一种。
优选的，所述展示基因为多肽、纳米抗体、人源化抗体scFv、TCR或酶中的任意一种。
优选的，所述酵母Aga1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述Aga2p基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述酵母细胞表面展示质粒载体不依赖于特定酵母菌株；所述酵母菌株包括：酿酒酵母、己氏酵母、贝酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己利酵母、多形德己利酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母或其衍生物。
本发明还提供了上述的酵母细胞表面展示质粒载体在靶标蛋白展示中的应用。
本发明提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，将锚定蛋白和靶标蛋白同时构建在同一个质粒载体上，使其在酵母细胞内同时实现高效表达，从而使靶标蛋白可以高效地在大多数类型的酵母细胞表面进行展示。本发明所述质粒载体不依赖任何特定的酵母细胞菌株，可以在多种酵母菌株中进行细胞表达展示，具有显著的通用型特征，可以广泛应用于多肽，抗体scFv，TCR，酶等多种靶标蛋白的展示，极大的提高酵母表面展示技术的使用方便性和广泛性。
附图说明
图1为pSBT-YD2图谱质粒图谱。
图2为pSBT-YD4图谱质粒图谱。
图3为anti CD47 scFv展示检测方法示意图。
图4为实施例2蛋白展示表达结果；其中，A和B为荧光视野下观察荧光情况，C和D为亮视野下观察细胞状态，A和C为半乳糖无诱导结果，B和D为半乳糖诱导结果。
图5为实施例3蛋白展示表达结果；其中，A为荧光视野下观察荧光情况，B为亮视野下观察细胞状态。
图6为VHH抗体对靶蛋白CD47的结合能力结果；其中，A为ELISA验证板孔图，从左到右抗体梯度稀释(抗体起始浓度为0.2μg/ul)依次为1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，抗原的包被浓度为5ug/ml,#1，#2为不同浓度的抗体的复孔实验显色情况，B为ELISA验证OD450数值图。
具体实施方式
本发明提供了一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，所述质粒载体包括：由酵母启动子-酵母Aga1基因-酵母转录终止子组成的表达模块一和由酵母启动子-展示基因-Aga2p基因-酵母转录终止子组成的表达模块二。
本发明中，所述酵母启动子优选为GAL1-GAL10双向启动子、GAP/TDH3启动子、TEF1启动子、TEF2启动子、CCW12启动子、PGK1启动子、TPI1启动子、HHF2启动子中的任意一种。所述酵母转录终止子优选为Cyc1终止子、ADH1终止子、PGK1终止子、ENO1终止子、ENO2终止子、SSA1终止子、TDH1终止子、RPL3终止子中的任意一种。
本发明中，所述质粒载体优选的还包括在大肠杆菌中进行复制和筛选的元件；所述在大肠杆菌中进行复制的元件优选为ColE1 ori、P15A ori、CloDF13 ori、RSF1030 ori、COLA或Mini-F/RK2中的任意一种；所述在大肠杆菌中进行筛选的元件优选为氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因或四环素抗性基因中的任意一种。所述在大肠杆菌中进行复制和筛选的元件能够保证质粒在大肠杆菌中复制和筛选。
本发明中，所述质粒载体优选的还包括在酵母细胞中进行复制和筛选的元件；所述在酵母细胞中进行复制的元件优选为CEN/ARS或2μm Ori；所述在酵母细胞中进行筛选的元件优选为URA3、His、Trp、Leu或Ile中的任意一种。所述在酵母细胞中进行复制和筛选的元件能够保证质粒在酵母菌中复制和筛选。
本发明中，所述展示基因优选为多肽、纳米抗体、人源化抗体scFv、TCR或酶中的任意一种。所述酵母Aga1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述Aga2p基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明中，所述酵母细胞表面展示质粒载体不依赖于特定酵母菌株；所述酵母菌株优选的包括：酿酒酵母、己氏酵母、贝酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己利酵母、多形德己利酵母、粟酒裂殖酵母、西方许旺酵母或其衍生物。
本发明还提供了上述的酵母细胞表面展示质粒载体在靶标蛋白展示中的应用。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1.酵母细胞表面展示诱导型表达质粒载体pSBT-YD2的构建
pSBT-YD2载体必需元件与序列设计包括：酵母诱导型启动子GAL10-酵母Aga1基因-酵母Cyc1转录终止子组成的表达模块一、酵母诱导型启动子GAL1-展示基因装入酶切位点EcoRI-锚定蛋白Aga2p-酵母Cyc1转录终止子组成的表达模块二、质粒载体在大肠杆菌中进行复制元件Ori和筛选元件AmpR、在酵母细胞中进行复制的元件2μm Ori和筛选元件His3。所述pSBT-YD2质粒载体的序列如SEQ ID NO.3所示，质粒图谱如图1所示。本实施例所述pSBT-YD2质粒载体由苏州泓迅生物科技股份有限公司通过全基因合成获得。
2.酵母细胞表面展示组成型表达质粒载体pSBT-YD4的构建
pSBT-YD4载体必需元件与序列设计包括：酵母组成型启动子TEF1-酵母Aga1基因-酵母Cyc1转录终止子组成的表达模块一、酵母组成型启动子GAP-展示基因装入酶切位点BamHI与EcoRI-锚定蛋白Aga2p-酵母Cyc1转录终止子组成的表达模块二、质粒载体在大肠杆菌中进行复制元件Ori和筛选元件AmpR、在酵母细胞中进行复制的元件2μm Ori和筛选元件His3。所述pSBT-YD4质粒载体的序列如SEQ ID NO.4所示，质粒图谱如图2所示。本实施例所述pSBT-YD4质粒载体由苏州泓迅生物科技股份有限公司通过全基因合成获得。
3.展示蛋白的基因装入pSBT-YD2或pSBT-YD4
pSBT-YD2的多克隆位点(MCS)是EcoRI，pSBT-YD4的多克隆位点(MCS)是BamHI与EcoRI，用常规基因克隆的方法装入展示靶标蛋白的基因序列即可。
4.酵母感受态细胞的制备
采用常规的LiCl/DTT方法制备酵母感受态即可，此方法制备的酵母感受态细胞的转化效价为103～104/μg质粒DNA。
5.展示质粒转化酵母感受态细胞
1)在1.5ml离心管中，加入如表1组分，配置转化混合液；
表1转化混合液
| Transformation mix components | Volume(ul) |
| PEG 3350(50％w/v) | 520 |
| LiAc 1.0M | 72 |
| Single-stranded carrier DNA(5mg/ml) | 80 |
| pSBT-YD2/4-靶标蛋白展示质粒或质粒文库 | 48 |
| Total volume | 720 |
10s涡旋混匀，瞬时离心。
2)取一支酵母BY4741感受态，融化后，4,000rpm离心2分钟，吸去保存液；加入上一步混好的转化混合液，吹吸重悬酵母细胞，颠倒混匀；
3)42℃水浴热激40分钟，每10分钟颠倒混匀一次；
4)冰浴5分钟；4,000rpm离心2分钟，吸去上清；
5)重悬酵母细胞沉淀到6ml YPD/山梨醇溶液中；30℃，180rpm，恢复培养1h；
6)4,000rpm离心2分钟沉淀过夜培养物，1ml His选择液体培养基重悬，400μl涂布His选择平板；在30℃培养箱中培养3-5天。
6.pSBT-YD4转化后的酵母展示靶标蛋白
挑取用pSBT-YD4展示质粒转化酵母细胞BY4741克隆加入His选择液体培养基，30℃摇床，220rpm培养24-48小时，即可实现靶标蛋白的展示。
7.pSBT-YD2转化后的酵母展示靶标蛋白
1)挑取用pSBT-YD2展示质粒转化酵母细胞BY4741克隆加入His选择液体培养基，30℃摇床，220rpm培养24-48小时。
2)4,000rpm离心2分钟沉淀上述培养物，加入等体积半乳糖诱导His选择液体培养基(2％葡萄糖更换为2％半乳糖诱导剂)，重悬后，30℃摇床，220rpm培养24-48小时，即可实现靶标蛋白的展示。
实施例2
将anti CD47 scFv通过基因合成，根据实施例1所述的方法步骤将anti CD47scFv用EcoRI酶切位点装入实施例1构建得到的pSBT-YD2载体中，得到pSBT-YD2-anti CD47scFv展示质粒，然后将pSBT-YD2-anti CD47 scFv展示质粒转入酵母细胞BY4741，并诱导表达。其中，CD47抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；anti CD47 scFv的氨基酸序列如SEQID NO.6所示；构建得到的pSBT-YD2-anti CD47 scFv展示质粒DNA序列如SEQ ID NO.7所示。
1.pSBT-YD2-anti CD47 scFv展示质粒转化酵母细胞BY4741克隆的培养与诱导表达方法如下：
1)挑取pSBT-YD2-anti CD47 scFv展示质粒转化酵母细胞BY4741克隆加入His选择液体培养基，30℃摇床，220rpm培养24-48小时；
2)4000rpm离心2分钟沉淀上述培养物，加入等体积半乳糖诱导His选择液体培养基(2％葡萄糖更换为2％半乳糖诱导剂)，重悬后，30℃摇床，220rpm培养24-48小时。
2.anti CD47 scFv展示检测方法如下：
具体的检测方法如图3所示；
1)取5ml上述诱导展示酵母细胞，4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，并重悬；加入1μM CD47抗原，4℃孵育1小时；
2)4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，加入anti-His标签一抗，室温孵育1小时；4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，加入荧光标记二抗，室温孵育1小时；
3)4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，并重悬；荧光显微镜下观察荧光情况，得到结果如图4。
可以看出，亮视野下显示酵母细胞生长状态良好，半乳糖诱导后的酵母细胞表面荧光染色率接近100％，而没有半乳糖诱导的酵母细胞表面由于无展示表达，而不被荧光染色。证明ScFv得到了高效展示，并成功与抗原结合。
实施例3
将anti CD47 scFv通过基因合成，根据实施例1所述的方法步骤将anti CD47scFv用BamHI和EcoRI酶切位点装入pSBT-YD4载体中，得到pSBT-YD4-anti CD47 scFv展示质粒；然后将pSBT-YD4-anti CD47 scFv展示质粒转入酵母细胞BY4741，酵母经转化，培养，进行展示。其中，构建得到的pSBT-YD4-anti CD47 scFv展示质粒DNA序列如SEQ ID NO.8所示。
1.所述pSBT-YD4-anti CD47 scFv展示质粒转化酵母细胞BY4741克隆的培养与诱导表达方法如下：
挑取pSBT-YD4-anti CD47 scFv展示质粒转化酵母细胞BY4741克隆加入His选择液体培养基，30℃摇床，220rpm培养24-48小时。
2.anti CD47 scFv展示检测方法如下：
1)取5ml上述诱导展示酵母细胞，4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，并重悬；加入1μM CD47抗原，4℃孵育1小时；
2)4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，加入anti-His标签一抗，室温孵育1小时；4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，加入荧光标记二抗，室温孵育1小时；
3)4,000rpm离心2分钟沉淀诱导培养物，等体积PBS洗涤，并重悬；荧光显微镜下观察荧光情况，得到结果如图5。
可以看出，亮视野下显示酵母细胞生长状态良好，组成型展示表达后的酵母细胞表面荧光染色率接近100％，证明ScFv得到了高效展示，并成功与抗原结合。
实施例4
展示单域抗体VHH酵母展示文库并筛选抗CD47的单域抗体anti CD47 VHH
1.单域抗体VHH酵母展示文库序列如下，由苏州泓迅生物科技有限公司合成并构建：
VHH文库氨基酸序列为：
EVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIGWVRQAPGKGEEWVASIYPTSGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSXXXXXXXXEEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.9)；其中，X为除Cys外的其他19种氨基酸中的任意一种。
VHH文库核苷酸序列为：
(SEQ ID NO.10)；
其中，N为编码除Cys外的其他19种氨基酸的DNA编码序列；两端加粗序列为酶切位点。
2.利用实施例1所述方法将VHH文库核苷酸序列装入pSBT-YD2质粒载体构建得到pSBT-YD2-VHH library展示质粒，并将pSBT-YD2-VHH library展示质粒转化入酵母细胞GS115，培养与诱导表达。
3.对步骤2培养与诱导表达后得到的培养物用磁珠筛选(MACS)进行三轮筛选，具体步骤如下：
1)50ml诱导后的酵母细胞经4000rpm离心2分钟，弃上清；细胞沉淀用50mlselection buffer(20mM HEPES pH7.5，150mM NaCl，0.1％BSA，0.2％maltose)清洗两次，并重悬入2ml selection buffer；
2)加入生物素标记的CD47蛋白10μg，4℃旋转孵育1h；
3)4000rpm，2分钟收集酵母细胞，用2ml selection buffer漂洗1次，并用5mlselection buffer重悬酵母细胞；
4)取100μl streptavidin-conjugated microbeads放磁力架上2分钟，吸弃保存液；加入2ml selection buffer重悬洗涤磁珠，放磁力架上2分钟，吸弃洗涤液；把2mlselection buffer重悬的上述文库酵母细胞加入到磁珠管中；4℃旋转孵育10分钟；
5)放磁力架上2分钟，吸弃未捕获酵母细胞；加入2ml selection buffer重悬洗涤磁珠，放磁力架上2min，吸弃洗涤液；加入2ml His选择培养基，重悬磁珠酵母复合物，并接入50ml His选择培养基中，30℃，220rpm培养24-48小时；
6)培养后的酵母细胞，经过诱导，同样方法进行第二轮和第三轮筛选；为了筛到亲和力较高的VHH抗体，第二轮用5μg的生物素标记的CD47蛋白捕获酵母细胞，第三轮用1μg的生物素标记的CD47蛋白捕获酵母细胞；
7)经过三轮筛选后的酵母细胞经培养后，提取质粒，并转化大肠杆菌感受态细胞，对所获的转化克隆进行测序验证；
8)经过测序验证，筛选后最为富集的克隆序列为：
EVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIGWVRQAPGKGEEWVASIYPTSGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSVMVDPSIQEEFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.11)；
9)构建原核表达载体表达纯化该最为富集的VHH抗体；
10)ELISA验证该VHH抗体对靶蛋白CD47的结合能力，其中，抗原包被浓度为5μg/ml，抗体初始浓度为0.2μg/μl，得到结果如图6。
可以看出，本发明的酵母表面展示载体成功展示了单域抗体VHH文库，并筛选到了结合能力较好的VHH抗体。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述质粒载体包括：酵母诱导型启动子GAL10或者组成型启动子TEF1-酵母Aga1基因-酵母Cyc1转录终止子组成的表达模块一、酵母诱导型启动子GAL1或者组成型启动子GAP-展示基因装入酶切位点EcoRI或者BamHI与EcoRI-锚定蛋白Aga2p-酵母Cyc1转录终止子组成的表达模块二、质粒载体在大肠杆菌中进行复制元件Ori和筛选元件AmpR、在酵母细胞中进行复制的元件2μm Ori和筛选元件His3；
所述质粒载体的序列如SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示；
所述酵母细胞为酵母细胞BY4741。
2.根据权利要求1所述的通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述展示基因为多肽、纳米抗体、人源化抗体scFv、TCR或酶中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述酵母Aga1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的通用型酵母细胞表面展示质粒载体，其特征在于，所述Aga2p基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求1-4任意一项所述的酵母细胞表面展示质粒载体在蛋白展示中的应用。
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Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN115786387B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2787677A1 (en) * | 2010-01-21 | 2011-07-28 | Oxyrane Uk Limited | Methods and compositions for displaying a poypeptide on a yeast cell surface |
| CN103031329A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-04-10 | 山东农业大学 | 一种布拉氏酵母菌表面展示系统及其构建方法 |
| CN104725517A (zh) * | 2015-03-30 | 2015-06-24 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法 |
| CN106834334A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 上海科技大学 | 一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒 |
| CN110184292A (zh) * | 2019-06-17 | 2019-08-30 | 湖北大学 | 一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法 |
| CN111440816A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-24 | 天津大学 | 表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用 |
| CN113913317A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-11 | 厦门大学 | 一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10704040B2 (en) * | 2017-05-22 | 2020-07-07 | Abzyme Therapeutics Llc | Triple-mode system for antibody maturation, surface display and secretion |
| CN112646833A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-04-13 | 杭州阿诺生物医药科技有限公司 | 一种全人源抗体酵母展示技术的设计与构建 |
-
2022
- 2022-09-19 CN CN202211134871.3A patent/CN115786387B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2787677A1 (en) * | 2010-01-21 | 2011-07-28 | Oxyrane Uk Limited | Methods and compositions for displaying a poypeptide on a yeast cell surface |
| CN103031329A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-04-10 | 山东农业大学 | 一种布拉氏酵母菌表面展示系统及其构建方法 |
| CN104725517A (zh) * | 2015-03-30 | 2015-06-24 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种提高酵母细胞表面目的蛋白展示量的方法 |
| CN106834334A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 上海科技大学 | 一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒 |
| CN110184292A (zh) * | 2019-06-17 | 2019-08-30 | 湖北大学 | 一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法 |
| CN111440816A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-24 | 天津大学 | 表面展示型酵母宿主细胞及其在制备猪星状病毒酵母疫苗的应用 |
| CN113913317A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-11 | 厦门大学 | 一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 登录号：AJR92402.1;GenBank;GenBank;431713-131928bp * |
| 登录号：CP046094.1;GenBank;GenBank;693377- 695554bp * |
| 酿酒酵母表面展示表达系统及应用;郭钦;张伟;阮晖;何国庆;;中国生物工程杂志(12);91-95 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115786387A (zh) | 2023-03-14 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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