CN113355343A - 一种基于自组装的表面展示氟化酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于自组装的表面展示氟化酶的方法，属于基因和生物工程领域。本发明通过模块化的方法，将靶蛋白与载体蛋白独立表达，通过翻译后原位组装即可实现复杂蛋白的表面展示。本发明所使用的SC‑ST系统，实现了六亚基结构氟化酶在大肠杆菌表面的展示，避免了复杂的纯化步骤，可以提高下游分离纯化的效率并节省成本。有利于实现氟化酶在工业化生产中的应用。

Description

一种基于自组装的表面展示氟化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种基于自组装的表面展示氟化酶的方法，属于基因和生物工程领域。

背景技术

氟元素(F，元素周期第9)，在地球上所有元素中天然存在的比值排名第24位，在地壳中的卤素元素中天然存在比值排名最高，然而以可溶性氟离子的存在形式却较为稀有。氟元素在水溶液中极易被溶剂化从而导致其生物活性大大降低，与其他卤素相比，很难经过卤素过氧化物酶氧化进而生成高附加值的有机物。这使得氟元素的生物利用收到极大的限制。虽然天然的氟化有机物十分稀有，但氟化物的价值却十分巨大。有机氟化物可以被广泛的应用于生物有机化学，药物化学和生物材料等领域，尤其在医药领域，氟元素的引入能够显增强药物活性。据统计，最畅销药物的药物例如氟化可的松、诺氟沙星、兰索拉唑等，30％的药品中含有氟元素。目前在化合物中引入氟元素主要依靠化学合成的方法，但其难以实现C-F键的选择性引入，并且存在反应条件剧烈、底物毒性大、能耗高、产率低等不足。生物法依靠氟化酶来合成有机氟化物，其能够实现特定C-F键的合成，并且反应温和、底物廉价、环保等特性使其在氟化天然产物的合成研究中已发挥越来越重要的作用。

表面展示技术是将靶蛋白的基因序列与载体蛋白的基因序列连接后导入宿主细胞进行表达，载体蛋白与靶蛋白融合表达，并将靶蛋白定位于宿主细胞的表面从而实现靶蛋白的表面展示，外源蛋白的这种锚定有如下优势：1、可以使得特定的反应在细胞表面直接发生而提高反应效率；2、能克服某些大分子底物不能穿越细胞进入胞内的问题；3、克服某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端；4、简化产物的提取纯化过程。因而受到越来越多的关注，目前研究较多的经典载体蛋白有冰核蛋白(ice nucleationprotein,INP)、自转运蛋白(Autotransporter)、S-蛋白，OmpA、LamB、OmpC、OmpX和OmpS等多种以及脂蛋白与外膜蛋白镶嵌的Lpp-OmpA等。但传统的基因融合方式对所展示的蛋白大小和复杂程度有限制，另外靶错误定位，靶蛋白与载体蛋白表达互相干扰可能导致蛋白失活甚至降解等问题。氟化酶具有复杂的六亚基结构，传统表面展示的方法可能会造成酶催化活性丧失。因此，急需开发一种新型表面展示技术，能表面展示氟化酶等具有复杂的六亚基结构的蛋白新技术。

发明内容

鉴于在现有技术中无法很好地将氟化酶进行表面展示，限制了氟化酶在工业生产中的应用。

本发明提供了一种自组装表面展示的系统，所述系统由质粒A和质粒B组成。

在一种实施方式中，所述质粒A上表达锚定蛋白和SpyCatcher。

在一种实施方式中，所述质粒B上表达目的蛋白和SpyTag。

在一种实施方式中，所述锚定蛋白包括Lpp-OmpA。

在一种实施方式中，所述质粒A上还含有鼠李糖诱导型启动子；所述质粒A上的RBS序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述质粒A上的RBS的序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述Lpp-OmpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述SpyCatcher的核苷酸列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述SpyTag的核苷酸列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，质粒A为pSQ036-TF-LP-SC，所述质粒B为pSQ051。

本发明提供了一种在大肠杆菌表面展示氟化酶的方法，将所述系统转入宿主细胞中，构建得到重组菌，将重组菌培养并进行诱导表达产酶。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌。

在一种实施方式中，编码所述氟化酶的核苷酸列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，将所述重组菌接入LB培养基中，加入终浓度为50-100μg/mL卡那霉素和氨苄霉素，在30-40℃培养；培养10-16h后，将菌液加入液体LB培养基中30-40℃培养；培养至菌体浓度达到OD₆₀₀为0.6-0.8时取出，加入诱导剂在20℃摇床培养过夜。

在一种实施方式中，诱导剂为终浓度为0.1-0.5mM的IPTG和5-20mM的鼠李糖。

本发明提供了所述系统，或所述方法在表面展示目的蛋白中的应用。

本发明的有益效果：

本发明所使用的SC-ST系统，实现了六亚基结构氟化酶在大肠杆菌表面的展示，避免了复杂的纯化步骤，可以提高下游分离纯化的效率并节省成本。本发明所使用的氟化酶，可以催化生成有机氟化物，为氟化代谢途径的第一个酶，因而表面展示氟化酶的获得对于推动有机氟化物的生物法生产具有重要的意义。

附图说明

图1为SC-ST自组装系统表面展示氟化酶示意图。

图2为pSQ036-TF-LP-SC质粒图谱。

图3为pSQ051质粒图谱。

图4为pSQ036-LP-flA质粒图谱

图5为荧光显微镜下不同大肠杆菌细胞的荧光展示图。

图6为茚三酮法检测甲硫氨酸浓度的标准曲线。

图7为茚三酮法检测不通浓度鼠李糖诱导下的自组装展示氟化酶催化生成甲硫氨酸浓度。

图8为HPLC法检测自组装系统与传统表面展示系统氟化酶催化生成甲硫氨酸浓度。

图9为流式细胞术分析自组装表面展示系统与传统表面展示系统展示氟化酶的效率。

图10为流式细胞术结果统计图。

具体实施方式

(1)LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；固体培养基中额外添加15g/L的琼脂粉。

(2)茚三酮法初步检测L-甲硫氨酸含量：0.2mol/L Na₂HPO₄缓冲液的配制：称取1.42g的Na2HPO4，加入去离子水溶解，定容至50mL，备用。0.1mol/L柠檬酸缓冲液的配制：称取1.050g的柠檬酸(C₆H₈O₇H₂O)，加入去离子水溶解，定容至50mL，备用。2％茚三酮溶液的配制：称取2g茚三酮，加入30mL 95％的乙醇微热溶解，定容至50mL，低温避光保存备用。L-甲硫氨酸标准品的配制：称取不同重量的L-甲硫氨酸标准样品，分别配制成0.2g/L，0.19g/L，0.17g/L，0.15g/L，0.13g/L，0.1g/L，0.08g/L，0.06g/L，0.04g/L，0.02g/L，0g/L浓度梯度，备用。

分别移取pH为6.5的100μL柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液至11个1.5mL离心管中，分别加入300μL不同浓度的L-甲硫氨酸溶液，再加入100μL的茚三酮溶液。将配制好的反应体系放至90℃加热10min，室温放置20min后测定562nm处的吸光度。

实施例1：SC-ST表面展示系统的构建

采用质粒共表达系统，选用不同复制子以及抗性的两个质粒对目的蛋白进行表达。对于锚定蛋白Lpp-ompA，选用严格控制型rhaB鼠李糖诱导型启动子，使用RBScalculator对表达载体pSQ036上的RBS进行设计改造(RBS序列如SEQ ID NO.1所示)。对于已报道的基因flA，SpyCatcher，SpyTag，Lpp-OmpA进行基因合成(核苷酸序列见表1)，分别连接至T载体上进行保存。设计引物分别从T载体上对目的基因进行扩增，经DNA琼脂糖胶验证后对PCR产物进行纯化，获得克隆后的目的基因。使用吉布森组装的方法将TriggerFactor(基因号WP_001198386.1)，Lpp-OmpA，SpyCatcher基因连接至表达载体pSQ036构建得到质粒pSQ036-TF-LP-SC(质粒图谱如图2所示)；Lpp-OmpA与SpyCatcher形成复合蛋白表达，与Trigger Factor由两个鼠李糖启动子单独控制表达。而另一个质粒的构建同样采用了吉布森组装的方法，将氟化酶flA与两个标签SpyTag和Myc组装在pET21a载体，构建质粒pSQ051(质粒图谱如图3所示)。

分别获得重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，在37℃培养至长出单克隆，挑取单克隆菌落PCR，确认阳性的进一步测序，测序验证正确的即为阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，即分别得到重组质粒pSQ036-TF-LP-SC和pSQ051。

表1基因或RBS序列

实施例2：大肠杆菌中氟化酶的异源表达

将实施例1中构建好的重组质粒pSQ036-TF-LP-SC以及pSQ051(质粒图谱如图3所示)共同转入E.coliBL21(DE3)中获得自组装SCST系统菌株；将pSQ036-LP-flA质粒(质粒图谱见图4)转入E.coliBL21(DE3)中获得传统基因融合表面展示菌株。

平板活化后将阳性转化子接种至含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，在37℃摇床培养12-16小时。吸取200uL接种至液体LB培养基中。在220RPM、37℃下培养至OD₆₀₀吸光值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG以及终浓度为10mM的鼠李糖，20℃摇床培养过夜(约22h)。

实施例3：氟化酶表面展示效果鉴定

(1)免疫荧光染色初步验证蛋白在细胞表面展示

具体实施过程如下：

1、将实施例2中培养好的菌株测定菌体OD值，计算终OD₆₀₀为1，终体积为1mL所需要的稀释倍数以及菌液体积；

2、取1mL菌液离心，用PBS重悬，取上部计算好的菌液体积，加入相应体积的4％PFA(paraformaldehyde多聚甲醛，新鲜配制)构成1mL体系，反应约15min；

3、将反应后的菌液离心，去除PFA，加入1mL1％-3％BSA(Bovine Serum Albumin牛血清蛋白，现用现配)重悬，封闭30min；

4、吸取20uL的反应液进行一抗(兔抗anti-myc)孵育，提前将抗体PBS进行稀释，按照1:1000的比例，加入到上步含有BSA的体系中，常温反应1-2h；

5、反应结束后离心收集菌体，用PBS洗涤三次。按照1:1000分别加入稀释好的二抗(山羊兔抗Alexfluo488和山羊兔抗Alexfluo594二抗)，常温避光反应2h(或4℃过夜)；选择荧光亮度高、信号强的拍摄图片；

6、离心收集菌体，用PBS洗涤之后制片。每张玻片加入1-2ul样品，使用莱卡荧光显微镜SP8观察，结果如图4所示，在大肠杆菌菌体的表面形成了一个荧光环，表明氟化酶能在大肠杆菌表面进行表达。

(2)茚三酮检测酶活

按照实施例2中的方法，对重组菌菌株进行培养和诱导表达，诱导时加入终浓度为0.5mM的IPTG以及不同终浓度的鼠李糖(分别为0，5，10，15，20mM)，诱导结束后，1.5毫升离心管离心收集菌体并用PBS清洗2次，清洗结束后在离心管中加入终浓度为1mM腺苷甲硫氨酸和10mM NaF，每隔半小时取样检测产生的甲硫氨酸，具体为：取反应液300μL加入茚三酮溶液反应，与标曲比色确定产生的甲硫氨酸。同时取部分反应液液相测试生成的甲硫氨酸。

以大肠杆菌BL21(DE3)为对照菌株，按照上述培养方法并测定甲硫氨酸含量。

图7为不同鼠李糖浓度诱导20h后的菌株，并利用茚三酮法检测的L-甲硫氨酸浓度。

图8显示，终浓度为10mM的鼠李糖诱导培养条件下，自组装SCST系统的重组菌株的甲硫氨酸的浓度显著高于基因融合的菌株和WT。

无论是茚三酮法还是液相色谱法都检测到甲硫氨酸，且明显比对照高，表明了自组装法成功展示有活性的氟化酶。

实施例4：流式细胞仪分析氟化酶表面展示定量效果

对实施例2中利用10mM鼠李糖诱导得到的菌株以及含有空载的空白对照细胞进行免疫荧光染色处理，通过流式细胞术分析细胞带有荧光的情况，从而对两种表面展示技术中阳性细胞占比进行统计比较。

结果如图9、10所示，以空白组为对照进行圈门界定细胞阴阳性。分析后界定Q2门内为阳性有荧光细胞，并对此进行统计。基于自组装的SCST表面展示系统阳性占比为86.4％，高于传统表面展示的7.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于自组装的表面展示氟化酶的方法

<130> BAA210876A

<150> CN 202011630839.5

<151> 2020-12-31

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgaatttca agtcaaggta ggttatata 29

<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcagcaa atggtagcca gcgtccgatt attgcattta tgagcgatct gggcaccacc 60

gatgatagcg ttgcacagtg taaaggtctg atgcatagca tttgtccggg tgttaccgtt 120

gttgatgttt gtcatagcat gaccccgtgg gatgttgaag aaggtgcacg ttatattgtt 180

gatctgcctc gtttttttcc ggaaggcacc gtttttgcaa ccaccaccta tccggcaacc 240

ggcaccacca cccgtagcgt tgccgttcgt attcgtcagg cagcaaaagg tggtgcacgt 300

ggtcagtggg caggtagcgg tgatggtttt gaacgtgcag atggtagcta tatctatatt 360

gcaccgaata atggtctgct gaccaccgtt ctggaagaac atggttatat tgaagcctat 420

gaagtgacca gcaccaaagt tattccggca aatccggaac cgacctttta tagccgtgaa 480

atggttgcaa ttccgagcgc acatctggca gcaggttttc cgctggcaga agttggtcgt 540

cgtctggatg atagtgaaat tgttcgtttt catcgtccgg cagttgaaat tagcggtgaa 600

gcactgagcg gtgttgttac cgcaattgat catccgtttg gtaatatttg gaccaatatc 660

catcgtaccg atctggaaaa agcaggtatt ggtcagggta aacatctgaa aattatcctg 720

gatgatgtgc tgccgtttga agcaccgctg accccgacct ttgcagatgc cggtgcaatt 780

ggtaacattg ccttttatct gaatagccgt ggttatctga gcctggcacg taatgcagca 840

agcctggcat atccgtataa tctgaaagca ggtctgaaag ttcgtgttga agcacgttaa 900

<210> 3

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggtaaag caaccaagct ggttctgggt gctgttatcc tgggttccac cctgctggcg 60

ggttgttcta gcaacgcgaa aatcgatcag ggtatcaaca acaacggtcc tactcatgaa 120

aaccaactgg gcgctggcgc gttcggcggc taccaggtga acccgtatgt cggttttgaa 180

atgggttacg actggctggg tcgtatgccg tacaagggtt ccgttgaaaa cggtgcatac 240

aaagcgcaag gcgtgcagct gaccgcgaaa ctgggctacc cgatcaccga cgacctggat 300

atttacaccc gtctgggtgg tatggtatgg cgtgcagata cgaaatccaa cgtttatggt 360

aaaaaccacg ataccggcgt ttccccagtt ttcgcgggtg gtgttgagta tgccattacc 420

cctgaaattg cgacccgcct ggagtatcag tggaccaata acattggcga tgcccatacc 480

atcggtaccc gtccagacaa c 501

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttgataccc tgagcggcct gagctctgaa cagggccagt ccggtgatat gaccattgaa 60

gaggattctg ctacccacat caagttcagc aaacgcgatg aagacggcaa agaactggct 120

ggtgctacga tggaactgcg tgacagctct ggtaaaacca tcagcacctg gatctctgac 180

ggtcaggtaa aagattttta cctgtaccct ggtaaataca cctttgtgga aaccgcggca 240

ccggacggtt acgaagttgc tactgctatc actttcaccg taaatgagca gggtcaggta 300

accgtgaacg gtaaagctac caaaggtgac gcacacatc 339

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttagtcggt ttgtaagcgt caaccatcac gatgtgtgc 39

Claims (10)

1.一种自组装表面展示的系统，其特征在于，所述系统由质粒A和质粒B组成；

所述质粒A上表达锚定蛋白和SpyCatcher；

所述质粒B上表达目的蛋白和SpyTag。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述锚定蛋白包括Lpp-OmpA。

3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述质粒A上还含有鼠李糖诱导型启动子；所述质粒A上的RBS序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述Lpp-OmpA的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述SpyCatcher的核苷酸列如SEQ IDNO.4所示。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述SpyTag的核苷酸列如SEQ ID NO.5所示。

7.一种在大肠杆菌表面展示氟化酶的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述系统转入宿主细胞中，构建得到重组菌，将重组菌培养并进行诱导表达产酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，编码所述氟化酶的核苷酸列如SEQ IDNO.2所示。

10.权利要求1-6任一所述系统，或权利要求7-9任一所述方法在表面展示目的蛋白中的应用。

Images