CN116064628A - 一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，涉及合成生物学领域。本发明包括如下的步骤：1)构建第一质粒，所述的第一质粒具有SpyTag和待表达蛋白的融合蛋白基因；2)构建第二质粒，所述的第二质粒具有INPNC和SpyCatcher基因；3)将第一质粒和第二质粒分别转入同一大肠杆菌，获得表面展示待表达蛋白的工程菌。本发明在大肠杆菌中将冰核蛋白INP与SpyCatcher蛋白融合表达，实现对含有SpyTag短肽标签的其他所有蛋白表面展示。因此，本发明为不同蛋白的表面展示提供了一种便捷通用的方法，实现表面展示平台的搭建。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，同时涉及合成生物学技术领域。具体涉及开发一种通用大肠杆菌表面展示策略。
背景技术
细菌的表面展示可以在细胞表面上呈递蛋白质或者多肽，目前广泛应用于全细胞传感器、原位催化剂、药物载体等领域。表面展示策略的原位酶促反应可以有效避免一些胞内因素影响，同时通过合成生物学方法表面展示的目标蛋白可以自发随着细菌扩增而扩增，无需二次操作。然而，直接表面展示系统若要展示不同的蛋白，需要重新设计质粒并交给公司合成，成本较高；同时直接将锚定蛋白和被锚定蛋白融合很容易对目标蛋白活性造成影响。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种表面展示不同目的蛋白的通用策略，为搭建工程化表面展示平台提供方法。
本发明的技术方案如下：
一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，包括如下步骤：
1)构建第一质粒，所述的第一质粒具有SpyTag和待表达蛋白的融合蛋白基因；
2)构建第二质粒，所述的第二质粒具有INPNC和SpyCatcher基因；
3)将第一质粒和第二质粒分别转入大肠杆菌，获得表面展示待表达蛋白的工程菌。
进一步，所述第一质粒为表达SpyTag-待表达蛋白的融合蛋白基因插入质粒pSB1C3而得。
进一步，所述的第二质粒为INPNC-SpyCatcher基因插入质粒pSB3K3而得。
进一步，所述第一质粒和第二质粒均具有常启动子。
进一步，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步，所述第二质粒的序列为SEQ ID NO：1。
进一步，所述的待表达蛋白为eGFP,HisTag-SpyTag-eGFP CDS序列见SEQ ID NO：2。
进一步，还包括步骤4)工程菌培育，待表达蛋白被表达。
进一步，步骤4)中，无需诱导即可表达蛋白。
进一步，步骤4)中，通过菌体表面是否产生绿色荧光来判断异肽键形成。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明将锚定蛋白和被锚定蛋白分成两个不同抗性的质粒，可以通过更换被锚定蛋白对应的质粒序列实现不同蛋白的锚定；同时SpyTag/SpyCatcher系统形成的linker可以避免锚定蛋白对被锚定蛋白活性造成的影响。冰核蛋白(INP)是一种源自于丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)的锚定蛋白，它能将目标蛋白锚定在细胞膜上，无需其他特定的辅助蛋白。SpyTag是一种肽片段，可以在室温形成异肽键稳定地与SpyCatcher结合。本发明在大肠杆菌中将冰核蛋白INP与SpyCatcher蛋白融合表达，即可实现对含有SpyTag短肽标签的其他所有蛋白表面展示。因此，本发明为不同蛋白的表面展示提供了一种便捷通用的方法。 INP优势明显，外源蛋白可以在宿主中稳定表达而不会被细胞内或细胞外蛋白酶降解。同时锚定完成后细胞活力不会降低，且INP具有分泌，引导和锚定功能，可以使融合蛋白自锚定在细胞表面，而无需其他特定的辅助蛋白。INPNC是一种INP蛋白，其结构上多了部分重复域。
1、本发明无需更改质粒J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB3K3序列，只需更改J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3的eGFP序列即可实现不同蛋白的锚定，操作方便。
2、本发明所述的表面展示方法无需特殊的试剂即可直接自组装固定蛋白，绿色、经济、环保。
3、本发明所述的表面展示系统无需诱导即可表达蛋白，操作简单、便捷高效。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1表面展示系统机理图。
图2重组质粒和酸凝胶图。a选用非通用引物扩增跑胶结果；b选用本发明设计的引物扩增跑胶结果；c选用限制性内切酶分离跑胶的结果。
图3HisTag-SpyTag-GFP粗酶缓冲液WB结果图。
图4荧光共聚焦显微镜观察到INPNC-SpyCatcher与HisTag-SpyTag-GFP的结合，Scale bar:5 μm。
图5INPNC-SpyCatcher与HisTag-SpyTag-GFP的结合导致上清液荧光下降曲线图。
图6双质粒转化后工程菌膜蛋白SDS-PAGE结果图。
具体实施方式
本发明利用模式蛋白eGFP(增强绿色荧光蛋白)作为示例，旨在验证该策略的功能。通过分子克隆技术借助常启动子(编号J23100)首先将表达SpyTag-eGFP的融合蛋白基因和 INPNC-SpyCatcher基因分别导入pSB1C3和pSB3K3质粒中得到两个质粒，对其中一个质粒进行骨架更换，最终构建了两个融合质粒J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB3K3 与J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3。将融合质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)即可构建表面展示eGFP蛋白的工程菌。
本发明所述的核心在于只要更换质粒J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3中 SpyTag所带的蛋白种类就可以实现不同蛋白的大肠杆菌表面展示。在这里本发明优势主要体现在“模块化”，即一种通用方法、一个平台——只要更改融合质粒中eGFP序列，即可实现不同蛋白的展示：不同的两个融合蛋白表达后可在胞内通过SpyCatcher/SpyTag进行自组装，最终通过INPNC展示到胞外。
具体地，本发明的技术方案如下：
(1)J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB1C3载体的构建
设计长度为1536bp的INPNC-SpyCatcher CDS序列，并在序列前后加上满足RFC[10]装配规则的前后缀：含有EcoR I,Xba I,Spe I,Pst I四个限制性酶切位点。其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
全基因合成法合成上述序列SEQ ID NO：1(金斯瑞生物科技股份有限公司)，并将其克隆至已含有上述前后缀的J23100-RBS-pSB1C3质粒(购买自iGEM)的Spe I和Pst I酶切位点之间，构建得到J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB1C3载体。INPNC-SpyCatcher 融合蛋白的表达使用无需诱导的常启动子；终止子为CDS设计时附带的一种t7双终止子。
(2)J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3载体的构建
设计长度为834bp的HisTag-SpyTag-eGFP CDS序列，并在序列前后加上满足RFC[10] 装配规则的前后缀：含有EcoR I,Xba I,Spe I,Pst I四个限制性酶切位点。其DNA序列如SEQ ID NO：2所示。全基因合成法合成上述序列(金斯瑞生物科技股份有限公司)，并将其克隆至已含有上述前后缀的J23100-RBS-pSB1C3质粒(购买自iGEM)的Spe I和Pst I酶切位点之间，构建得到J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3载体。HisTag-SpyTag-eGFP融合蛋白的表达使用无需诱导的常启动子；终止子使用pSB1C3骨架自带his operon终止子。
(3)J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB3K3载体的构建
通过分子克隆手段将J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB1C3质粒上J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator片段切下插入含有上述前后缀的pSB3K3载体(购买自iGEM)EcoR I和Pst I酶切位点之间，构建得到J23100-RBS-INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB3K3载体。其DNA序列如SEQ ID NO：3所示。以上所有重组质粒核酸验证胶结果见图2。
图2a选用非通用引物(SEQ ID NO：4-primer F： gctctagatgcatcaccatcaccatcacgctcacatagtaatggttgatgcatat；SEQ ID NO：5-primer R： aaaactgcagcggccgctactagtattacttatacagttcatccatgccgt)将HisTag-SpyTag-eGFP序列直接扩增跑胶，得到1000bp左右的正确条带；图2b选用自己设计的引物(SEQ ID NO：6-primer F：tgatctggccggcatcgggcaccgttgaaag；SEQ ID NO：7-primer R：gatgccggccagatcaaaccgcaatgatc) 将INPNC-SpyCatcher序列直接扩增跑胶，得到1700bp左右的正确条带；图2c选用限制性内切酶EcoR l,Pst I将INPNC-SpyCatcher序列从pSB3K3骨架上分离跑胶，得到1700bp左右的正确条带。
(4)转化与表达
取50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞加入1.5mL离心管中，再加入5μL待转入质粒，吹打混匀；冰上孵育30min后42℃热激45s后立即冰浴2min。向离心管中加入450 μL LB培养液，在37℃，200rpm的摇床内孵育1.5h。取125μL培养物在LB固体培养基上涂板并37℃过夜培养。提取菌液质粒测序验证正确与否。
取测序正确的单克隆菌落接种于含抗生素的LB培养基中，37℃下200rpm培育16h即可表达目的蛋白。
(5)HisTag-SpyTag-eGFP蛋白表达情况
取测序正确的J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3单克隆大肠杆菌BL21(DE3)落接种于含氯霉素的LB培养基中，37℃下200rpm培育16h。用PBS缓冲液清洗三次，清洗净LB培养液后用PBS重悬，再进行超声破碎处理；在8000g、10min和4℃的条件下离心后，可以得到含有HisTag-SpyTag-eGFP的上清液。取样跑Western Blot(GFP抗)，结果见图 3。
(6)SpyCatcher/SpyTag系统功能验证
在37℃的摇瓶中将上述HisTag-SpyTag-eGFP粗酶与表达INPNC-SpyCatcher膜蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)一起培养。只要异肽键形成，菌体表面就会产生绿色荧光，这一点可以通过Leica TCS SP8 X超分辨荧光共聚焦显微镜捕捉；同时混合液上清荧光会下降，进一步可以佐证表面展示系统的成功搭建。
每两小时采集一次样本。离心样本后测量每个样本50μL上清液的荧光强度(λex＝475nm，λem＝545nm)，其中与eGFP孵育的空载大肠杆菌设为对照组。此外和PBS共孵育的所有组(空载大肠杆菌与表达INPNC-SpyCatcher膜蛋白的大肠杆菌)设置为阴性(-)对照组。荧光共焦显微镜结果如图4所示，大肠杆菌表面有少许荧光。图5显示培养后，上清液荧光强度的降低，而对照组的荧光强度略有变化。结果均表明HisTag-SpyTag-GFP与大肠杆菌BL21(DE3) 表面展示的INPNC-HisTag-SpyCatcher可以结合。
(7)双质粒转化的大肠杆菌膜蛋白表征
将质粒J23100-RBS-HisTag-SpyTag-eGFP-pSB1C3与质粒J23100-RBS- INPNC-SpyCatcher-Terminator-pSB3K3同时转化，使用Kana*&Cm*抗性的LB培养。37℃下200rpm培育16h后使用
细菌膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白。空载大肠杆菌作为对照组，进行SDS-PAGE验证，结果见图6。条带正确，表明系统正常展示。
Sequence1(不含前后缀)
ATCTATGACATTAGATAAAGCTTTGGTACTAAGGACGTGCGCAAATAACATGGCGGATCATTGCGGTTTGATCTGGCCGGCATCGGGCACCGTTGAAAGCCGCTACTGGCAGAGCACCCGTCGTCACGAGAACGGT CTGGTGGGCCTTTTGTGGGGTGCGGGCACTTCAGCGTTTCTGTCCGTGCACGCGGACGCCCGCTGGA TCGTTTGTGAGGTTGCGGTGGCTGACATCATTTCCCTTGAGGAACCGGGTATGGTTAAGTTCCCGCGT GCAGAAGTTGTTCACGTGGGCGACCGCATTTCCGCAAGTCATTTTATTTCCGCGCGTCAAGCGGACCC GGCGTCTACGTCTACGAGCACGAGCACGAGCACTCTGACTCCGATGCCGACCGCGATCCCAACCCCG ATGCCTGCGGTTGCGAGCGTGACCCTGCCGGTCGCCGAGCAAGCGCGTCATGAGGTATTTGATGTTGC GAGCGTCAGCGCTGCGGCTGCTCCGGTCAACACCTTGCCGGTGACGACCCCACAGAATCTGCAAACC GCTACGTACGGCTCCACCCTCAGTGGCGATAATCACAGCCGCCTGATTGCAGGTTACGGTTCTAATGA GACTGCCGGAAACCACTCCGACCTGATCGGCGGTCATGACTGCACCTTAATGGCGGGCGACCAGAGC AGACTGACTGCGGGCAAGAACAGCGTCCTGACGGCTGGCGCCCGTAGCAAACTGATCGGTTCTGAA GGTTCGACCTTGTCAGCCGGTGAGGACAGCACCTTGATTTTTCGTCTGTGGGATGGCAAGCGCTACCG CCAACTGGTTGCCCGTACCGGTGAGAACGGTGTTGAGGCAGACATCCCGTACTATGTTAATGAAGAC GACGACATCGTGGACAAACCGGATGAGGATGATGACTGGATCGAGGTGAAGGGGACGTCGAGCAGC ATAGCAAGCAGCTCTCCGAGCAGTGTGGCGGGCTCCATGAGCTATTACCACCACCACCACCACCATGA TTATGATATTCCGACGACCGAAAACCTGTACTTCCAGGGTGCTATGGTTGATACCCTGTCTGGTTTGAG CTCTGAACAAGGTCAATCCGGAGATATGACCATTGAAGAGGACAGCGCGACCCATATTAAATTCAGCA AACGTGATGAGGACGGCAAAGAACTGGCTGGCGCCACCATGGAACTGCGTGATAGCTCGGGTAAGA CCATCAGCACTTGGATCAGCGATGGTCAGGTCAAAGATTTCTATCTGTACCCGGGTAAGTATACCTTCG TGGAAACCGCGGCGCCGGACGGTTATGAAGTGGCCACCGCAATTACCTTCACCGTGAACGAACAGGG CCAGGTTACCGTTAACGGCAAGGCAACCAAAGGTGACGCACATATCTAATACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTC TCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA
Sequence2(不含前后缀)
atgcatcaccatcaccatcacGCTCACATAGTAATGGTTGATGCATATAAGCCGACGAAAGGCACCAGCGAAAGCAGCGGCTCCGGTTCCGGTGGTTCGGGCTCTGGGGGAGGTGGCATGCGTAAAGGTGAGGAATTGTTTACC GGTGTTGTTCCGATCCTGGTAGAGCTGGATGGCGACGTTAACGGTCACAAGTTCAGCGTCAGCGGTGAGGGTGAGGG CGACGCTACGTATGGTAAGCTGACCCTTAAGTTCATCTGCACCACGGGTAAATTGCCGGTTCCGTGGCCGACGCTGG TGACTACATTTGGTTACGGCGTGCAGTGTTTTGCCCGTTATCCGGACCACATGAAACAACATGACTTCTTCAAAAGC GCAATGCCGGAAGGCTACGTGCAAGAACGCACCATTTTTTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGTGCTGAAGT GAAATTCGAGGGTGATACCCTGGTTAATAGAATTGAGCTTAAGGGTATCGATTTCAAAGAAGATGGCAACATCCTGG GTCATAAGTTGGAGTATAACTACAACAGCCATAACGTGTATATCATGGCAGACAAACAGAAAAACGGCATCAAAGTG AACTTTAAAATTCGTCATAATATCGAGGACGGCTCCGTGCAACTGGCGGATCATTACCAGCAGAATACCCCTATTGG CGACGGTCCGGTCCTGCTCCCAGATAATCATTACCTGTCGACCCAGTCTGCGCTGAGCAAGGATCCGAATGAAAAGC GCGATCATATGGTTTTGTTGGAGTTTGTTACCGCGGCGGGTATTACCCACGGCATGGATGAACTGTATAAGTAA
(下划线部分为eGFP序列)
序列3
tactagtagcggccgctgcagtccggcaaaaaaacgggcaaggtgtcaccaccctgccctttttctttaaaaccgaaaagattacttcgc gttatgcaggcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatctcgagtcc cgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcat atcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtat cggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacga ctgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaac caaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccgg cgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtga gtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaac atcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgaca ttatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataac accccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtgg ctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaa atcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtca gcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgctagcggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatg tggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcg ttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggcc gcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactat aaagataccaggcgtttcccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtc tcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgcctta tccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttga agtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcag agaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttatt aaggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaa aatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctattt cgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgaga cccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccat ccagtctattccatggtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggcagaatttcagata aaaaaaatccttagctttcgctaaggatgatttctggaattcgcggccgcttctagagttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagctacta gagaaagaggagaaatactagATCTATGACATTAGATAAAGCTTTGGTACTAAGGACGTGCGCAAAT AACATGGCGGATCATTGCGGTTTGATCTGGCCGGCATCGGGCACCGTTGAAAGCCGCTA CTGGCAGAGCACCCGTCGTCACGAGAACGGTCTGGTGGGCCTTTTGTGGGGTGCGGGC ACTTCAGCGTTTCTGTCCGTGCACGCGGACGCCCGCTGGATCGTTTGTGAGGTTGCGGT GGCTGACATCATTTCCCTTGAGGAACCGGGTATGGTTAAGTTCCCGCGTGCAGAAGTTG TTCACGTGGGCGACCGCATTTCCGCAAGTCATTTTATTTCCGCGCGTCAAGCGGACCCGGCGTCTACGTCTACGAGCACGAGCACGAGCACTCTGACTCCGATGCCGACCGCGATCCC AACCCCGATGCCTGCGGTTGCGAGCGTGACCCTGCCGGTCGCCGAGCAAGCGCGTCAT GAGGTATTTGATGTTGCGAGCGTCAGCGCTGCGGCTGCTCCGGTCAACACCTTGCCGGT GACGACCCCACAGAATCTGCAAACCGCTACGTACGGCTCCACCCTCAGTGGCGATAATC ACAGCCGCCTGATTGCAGGTTACGGTTCTAATGAGACTGCCGGAAACCACTCCGACCTG ATCGGCGGTCATGACTGCACCTTAATGGCGGGCGACCAGAGCAGACTGACTGCGGGCA AGAACAGCGTCCTGACGGCTGGCGCCCGTAGCAAACTGATCGGTTCTGAAGGTTCGAC CTTGTCAGCCGGTGAGGACAGCACCTTGATTTTTCGTCTGTGGGATGGCAAGCGCTACC GCCAACTGGTTGCCCGTACCGGTGAGAACGGTGTTGAGGCAGACATCCCGTACTATGTT AATGAAGACGACGACATCGTGGACAAACCGGATGAGGATGATGACTGGATCGAGGTGA AGGGGACGTCGAGCAGCATAGCAAGCAGCTCTCCGAGCAGTGTGGCGGGCTCCATGAG CTATTACCACCACCACCACCACCATGATTATGATATTCCGACGACCGAAAACCTGTACTT CCAGGGTGCTATGGTTGATACCCTGTCTGGTTTGAGCTCTGAACAAGGTCAATCCGGAG ATATGACCATTGAAGAGGACAGCGCGACCCATATTAAATTCAGCAAACGTGATGAGGACGGCAAAGAACTGGCTGGCGCCACCATGGAACTGCGTGATAGCTCGGGTAAGACCATCA GCACTTGGATCAGCGATGGTCAGGTCAAAGATTTCTATCTGTACCCGGGTAAGTATACCT TCGTGGAAACCGCGGCGCCGGACGGTTATGAAGTGGCCACCGCAATTACCTTCACCGTG AACGAACAGGGCCAGGTTACCGTTAACGGCAAGGCAACCAAAGGTGACGCACATATCT AATACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTC GTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGG GTGGGCCTTTCTGCGtttata。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，包括如下步骤：
1)构建第一质粒，所述的第一质粒具有SpyTag和待表达蛋白的融合蛋白基因；
2)构建第二质粒，所述的第二质粒具有INPNC和SpyCatcher基因；
3)将第一质粒和第二质粒分别转入同一大肠杆菌，获得表面展示待表达蛋白的工程菌。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：所述第一质粒为表达SpyTag-待表达蛋白的融合蛋白基因插入质粒pSB1C3而得。
3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：所述的第二质粒为INPNC-SpyCatcher基因插入质粒pSB3K3而得。
4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：所述第一质粒和第二质粒均具有常启动子。
6.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：所述第二质粒的序列为SEQ ID NO：1。
7.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：所述的待表达蛋白为eGFP,HisTag-SpyTag-eGFPCDS序列见SEQ ID NO：2。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种大肠杆菌表面展示系统的构建方法，其特征在于：还包括步骤4)工程菌培育，待表达蛋白被表达。
9.如权利要求1-7任一项构建方法构建得到的大肠杆菌表面展示系统。
10.根据权利要求9所述的大肠杆菌表面展示系统，其特征在于：无需诱导即可表达蛋白。
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2022
- 2022-10-14 CN CN202211258645.6A patent/CN116064628B/zh active Active
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Also Published As
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