CN113549619B - 一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子、其质粒载体及其应用 - Google Patents

一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子、其质粒载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子、其质粒载体及其应用，谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。本发明使用启动子PA368构建蛋白表达载体，并通过在培养基中添加乙醇，实现重组蛋白在谷氨酸棒杆菌二次生长阶段的高水平表达，克服了现有启动子强度低、诱导物渗透性且昂贵等不足，相比于现有的谷氨酸棒杆菌强启动子PH36，本发明启动子PA368调控下的绿色荧光蛋白表达水平提高了2.43倍，同时在分泌重组蛋白VHH及XynA时可以实现更高的表达水平。

Description

一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子、其质粒载体及其 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子、其质粒载体及其应用。
背景技术
谷氨酸棒状杆菌是一种放线纲棒状杆菌属的革兰氏阳性菌，广泛用于各种氨基酸的工业化发酵生产。同时，由于其极高的安全性、优良的发酵性能和理想的分泌特征(内源性分泌蛋白少，胞外蛋白酶活性极低)，谷氨酸棒状杆菌在近些年成为备受关注的重组蛋白表达宿主，形成了以味之素公司(日本)的
Figure GDA0003529872790000011
为代表的商业化谷氨酸棒杆菌表达系统。
启动子是RNA聚合酶识别结合的特定核苷酸序列，其控制的转录起始作为基因表达的第一步，极大程度地影响重组蛋白的终表达水平，因而启动子是蛋白表达系统中最重要的生物学元器件之一。谷氨酸棒杆菌可以使用革兰氏阴性菌来源的启动子，例如来自大肠杆菌的诱导型启动子PlacUV5、Ptac、Ptrp、ParaBAD都已经成功地用于谷氨酸棒杆菌中的基因表达调节，然而这些启动子在谷氨酸棒杆菌中使用时存在强度低、诱导物渗透性差等问题，很难真正用于重组蛋白的工业化生产。
谷氨酸棒杆菌可以利用乙醇作为生长的唯一碳源，同时其对乙醇的利用存在延迟效应，即在混合碳源培养基中可观察到菌群的二次生长现象，这是由于其优先利用葡萄糖后利用乙醇所致；此外，乙醇具有成本低、可再生、对环境友好等优势，其作为发酵过程的碳源符合生物炼制的理念。因此，开发以乙醇为碳源和诱导剂的谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达系统有重要的工业应用意义，而发掘乙醇诱导的高活性启动子是构建该系统的重要前提。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子，其基因序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述的谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子的质粒载体。
作为本发明所述的质粒载体的一种优选方案，其中：含有谷氨酸棒杆菌的质粒复制子，包括pBL1、pCG1、pGA1、pNG2中的一种。
作为本发明所述的质粒载体的一种优选方案，其中：包括p19-0载体。
作为本发明所述的质粒载体的一种优选方案，其中：所述质粒装载有重组蛋白的编码基因。
作为本发明所述的质粒载体的一种优选方案，其中：所述重组蛋白包括绿色荧光蛋白、VHH、XynA。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述的谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子的菌株。
本发明的另一个目的是提供所述的菌株在谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
使用本发明所述启动子PA368，通过乙醇诱导实现重组蛋白编码基因的高水平表达，克服了现有启动子强度低、诱导物渗透性且昂贵等不足。利用含有该启动子的蛋白表达质粒转化至谷氨酸棒杆菌构建重组蛋白表达菌株，实现了比现有谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子PH36高2.43倍的绿色荧光蛋白表达水平，和更高的XynA和VHH分泌表达水平(双砷化合物反应荧光分别提高12.0％和19.5％)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明p19-RiboJ-RBS-sfGFP的质粒图谱。
图2本发明启动子PA368表达sfGFP时的表达强度及诱导效果图。该图分析比较了PH36、PICL和PA368三种启动子表达sfGFP时的表达强度，以及乙醇添加后的诱导效果。
图3为本发明含有启动子PA368的蛋白表达菌株的生长曲线及蛋白表达水平图。该图分析比较了使用PH36和PA368两种启动子表达sfGFP时，相应菌株在36小时发酵周期内的生长曲线和不同时间下的sfGFP表达强度。
图4为本发明启动子PA368调控下的VHH及XynA蛋白分泌表达效果图，包括双砷化合物与发酵上清反应形成的荧光信号图及对应的SDS-PAGE电泳图。该图分析比较了使用PH36和PA368两种启动子分泌表达VHH(a)和XynA(b)时，相应菌株在36小时发酵周期内的蛋白表达水平(泳道1-4对应PH36,泳道5-8对应PA368)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：启动子强度分析载体p19-RiboJ-RBS-sfGFP的构建
使用引物spacer-F(SEQ ID NO.1)和spacer-R(SEQ ID NO.2)扩增出含有spacer编码序列的核酸片段，使用引物RiboJ-RBS-sfGFP-F(SEQ ID NO.3)和RiboJ-RBS-sfGFP-R(SEQ ID NO.4)扩增出含有RiboJ-RBS-sfGFP编码序列的核酸片段，并利用Gibson组装技术整合至SmaI限制酶处理后的p19-0载体中，获得的质粒命名为p19-RiboJ-RBS-sfGFP，p19-RiboJ-RBS-sfGFP的质粒图谱如图1所示，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。
该质粒用于不同启动子在谷氨酸棒杆菌中的强度分析，spacer与RiboJ序列之间的XhoI限制酶识别位点用于载体线性化并插入启动子片段。RiboJ绝缘子可以在mRNA水平切除输入启动子中的5‘-UTR序列，进而形成完全一致的mRNA(即相同的翻译效率)。因此使用该质粒载体表达sfGFP时，荧光强度与输入启动子的转录强度成正相关。
实施例2：乙醇诱导启动子PA368的获得及强度分析
中国专利《一种含有乙醇诱导启动子的质粒载体及其在提高谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达量中的应用》(公开号CN108642074A)中，我们得到了含有乙醇诱导启动子PICL的质粒载体，其具有显著提高重组蛋白表达的作用。通过对PICL启动子的上游调控序列进行生物信息学分析，找到其中潜在的转录因子结合位点，并对这些位点进行删改，从而得到表达强度显著提高的本发明的启动子(命名为PA368)，PA368启动子的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
使用引物PICL-F(SEQ ID NO.7)和PICL-R(SEQ ID NO.8)扩增出PICL的启动子片段，使用引物PA368-F(SEQ ID NO.9)和PA368-R(SEQ ID NO.10)扩增出PA368的启动子片段，使用引物PH36-F(SEQ ID NO.11)和PH36-R(SEQ ID NO.12)扩增出PH36的启动子片段，并利用Gibson组装技术整合至XhoI限制酶处理后的p19-RiboJ-sfGFP载体中，得到三种质粒分别转化至谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌株。
重组菌株在固体平板上划线活化后，挑菌接种至2ml LBB培养基，30℃摇床(220rpm)培养过夜得种子液。以起始OD＝0.3将种子液转接至10ml LBB培养基中(一组添加1％v/v乙醇，另一组不添加)，30℃摇床(220rpm)培养36个小时，取发酵液加水稀释40倍(50ul发酵液+1950水)，分别测OD600和荧光强度(激发波长485nm，发射波长510nm)。标准化的sfGFP表达水平以荧光强度比OD600表示。PH36启动子的基因序列如SEQ ID NO.13所示。
实验证明表达sfGFP时(1％乙醇诱导)，PA368启动子比原始的PICL的表达水平提高了2.68倍，比高强度组成型启动子PH36高2.43倍(图2)。无论乙醇添加与否，PA368启动子在生长前期的活性低于PH36启动子；添加1％乙醇时，菌体出现二次生长现象，并且PA368启动子的活性在第二生长阶段大幅提高(图3)。
实施例3：高强度乙醇诱导启动子PA368提高重组蛋白的分泌产量
(1)骆驼源抗体片段VHH及木聚糖酶XynA分泌表达质粒的构建：使用引物Promoter-F(SEQ ID NO.14)和Promoter-R(SEQ ID NO.15)扩增sfGFP表达质粒中的启动子(含RiboJ+RBS)片段，使用引物CspB-F(SEQ ID NO.16)和TC-R(SEQ ID NO.17)扩增N端带有CspB信号肽、C端带有四半胱氨酸标签的VHH及XynA蛋白编码片段，将PA368的启动子片段、PH36的启动子片段和蛋白编码片段利用Gibson组装技术整合至SmaI限制酶处理后的p19-0载体中，获得相应质粒并转化至谷氨酸棒杆菌中，获得重组蛋白VHH和XynA的分泌表达菌株。VHH的基因序列如SEQ ID NO.18所示；XynA的基因序列如SEQ ID NO.19所示。
(2)摇瓶发酵：将蛋白分泌表达菌株于固体平板活化后，接种至2ml LBB培养基，30℃摇床(220rpm)培养过夜得种子液。以起始OD＝0.3将种子液转接至10ml LBB培养基(添加1％v/v乙醇)中，30℃摇床(220rpm)培养36个小时。
(3)分泌蛋白表达水平检测：发酵液经离心后取上清液并用去离子水稀释(VHH发酵液稀释10倍，XynA发酵液稀释4倍)。取180ul稀释后的上清液与20ul双砷化合物溶液(10μM FlAsH-EDT2,10mM DTT)混合，室温震荡孵育一小时后，使用多功能酶标仪检测荧光信号，设置检测荧光信号的参数为：激发波长485nm，发射波长528nm。双砷化合物FLAsH-EDT2与重组蛋白C端四半胱氨酸标签反应形成荧光，荧光值与重组蛋白的含量成正比关系。
检测结果表明：如图4所示，当分泌表达重组蛋白时，PA368启动子相比于PH36启动子在菌体生长前期具有更低的蛋白积累，即发酵6h上清液形成的荧光信号分别低了6.4％(XynA)和10.1％(VHH)；而发酵结束时PA368启动子能形成更高的分泌蛋白产量，即发酵36h上清液形成的荧光信号分别提高12.0％(XynA)和19.5％(VHH)。SDS-PAGE结果与荧光反应结果一致。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子、其载体及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacagctctc gagcaggatg tgacgagcgg tg 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catcctgctc gagagctgtc accggatgtg c 31
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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acccgtgaag gtgagccagt gagttgattg ctacgtaatt agttagttag cccttagtga 120
ctcgaattcg cggccgcttc tagagctcgg taccaaattc cagaaaagag gccgcgaaag 180
cggccttttt tcgttttggt cctactagat gcctccacac cgctcgtcac atcctgctcg 240
agagctgtca ccggatgtgc tttccggtct gatgagtccg tgaggacgaa acagcctcta 300
caaataattt tgtttaatac tagagaaaga ggagaaatac tagatgcgta aaggcgaaga 360
gctgttcact ggtgtcgtcc ctattctggt ggaactggat ggtgatgtca acggtcataa 420
gttttccgtg cgtggcgagg gtgaaggtga cgcaactaat ggtaaactga cgctgaagtt 480
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tggtgttcag tgctttgctc gttatccgga ccatatgaag cagcatgact tcttcaagtc 600
cgccatgccg gaaggctatg tgcaggaacg cacgatttcc tttaaggatg acggcacgta 660
caaaacgcgt gcggaagtga aatttgaagg cgataccctg gtaaaccgca ttgagctgaa 720
aggcattgac tttaaagaag acggcaatat cctgggccat aagctggaat acaattttaa 780
cagccacaat gtttacatca ccgccgataa acaaaaaaat ggcattaaag cgaattttaa 840
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tctgtctaaa gatccgaacg agaaacgcga tcatatggtt ctgctggagt tcgtaaccgc 1020
agcgggcatc acgcatggta tggatgaact gtacaaatga 1060
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<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 19
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcccagcagc ccggctggat gcagagcctc agcggcagcg cgctgcgcca ggcgatgatc 420
gaccacatca acggcgtgat ggcccactac aagggcaaga tcgtccagtg ggacgtcgtg 480
aacgaggcct tcgccgacgg cagttcggga gcgcggcggg actccaacct gcaacgcagc 540
ggcaacgact ggatcgaggt cgccttccgc accgcgcgcg ccgccgaccc gtccgccaag 600
ctctgctaca acgactacaa cgtcgagaac tggacctggg ccaagaccca ggccatgtac 660
aacatggtgc gggacttcaa gcagcgcggc gtgccgatcg actgcgtcgg cttccagtcg 720
cacttcaaca gcggcagccc ctacaacagc aacttccgca ccacactgca gaacttcgcc 780
gccctcggcg tcgacgtggc catcaccgag ctggacatcc agggcgcccc ggcctcgacc 840
tacgccaacg tgaccaacga ctgcctggcc gtctcgcgct gcctcggcat caccgtctgg 900
ggtgtgcgcg acagcgactc ctggcggtcg gagcagacgc cgttgctgtt caacaacgac 960
ggcagcaaga aggccgcgta caccgccgtc ctcgacgcac tcaacggcgg cgactcctcg 1020
gagccccccg cggacggggg acagatcaag ggcgtcggtt cgggccgctg cctcgacgtg 1080
cccgacgcca gcacctccga cggcacccag ctccagctgt gggactgcca cagcggcacc 1140
aaccagcagt gggccgccac tgacgcgggc gagctcaggg tctacggcga caagtgcctg 1200
gacgccgcag gcaccggcaa cggctccaag gtccagatct acagctgctg gggcggcgac 1260
aaccagaagt ggcgcctcaa ctccgacggg tccgtcgtcg gcgtccagtc cggcctctgc 1320
ctcgacgccg tcgggaacgg cacggccaac ggcaccctga tccagctgta cacctgctcc 1380
aacggcagca accaacgctg gacccgcacc ttcctgaact gctgccctgg ctgctgcatg 1440
gaaccatga 1449

Claims (8)

1.一种谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子，其特征在于：其基因序列如SEQ ID NO.6所示。
2.包含权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子的质粒载体。
3.如权利要求2所述的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体为p19-0载体。
4.如权利要求2或3所述的质粒载体，其特征在于：所述质粒装载有重组蛋白的编码基因。
5.如权利要求4所述的质粒载体，其特征在于：所述重组蛋白包括绿色荧光蛋白、VHH、XynA。
6.包含权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子的谷氨酸棒杆菌。
7.如权利要求6所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于：权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌高强度乙醇诱导启动子与其调控的外源基因整合入所述谷氨酸棒杆菌基因组。
8.如权利要求6或7所述的谷氨酸棒杆菌在重组蛋白表达中的应用。
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