CN106434733B - 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体，其能实现谷氨酸棒杆菌对外源蛋白的稳定表达。其包括启动子和外源蛋白编码序列，其特征在于：启动子为aph启动子，其还包括第一编码序列、与第一编码序列连接的RBS序列，aph启动子和第一编码序列连接构成第一顺反子，RBS序列和外源蛋白编码序列连接构成第二顺反子；第一顺反子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，RBS序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

Description

一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用。

背景技术

启动子是一段位于结构基因5’端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶并使之与模板DNA结合进行转录的起始。启动子的结构直接关系到转录的效率，影响到基因的表达水平。RBS序列是一段位于启动子之后，起始密码子之前的一段较短的基因片段，提供了核糖体与转录出的mRNA的结合位点，可以通过16SrRNA通过碱基配对识别。基因的表达不仅受到转录水平的影响，在很大程度上受到翻译起始效率的影响，而翻译起始效率取决于核糖体与mRNA的结合效率及结合强弱。因此，启动子和RBS序列对于外源蛋白的表达非常的重要，关于这两个元件的研究越来越受到人们的重视。

谷氨酸棒杆菌是一种GRAS的革兰氏阳性菌，广泛用于工业生产氨基酸，如谷氨酸和赖氨酸等。目前其基因组已经测序，大约有56%的GC含量。除作为氨基酸的生产以外，谷氨酸棒杆菌还是一种很有潜力的外源蛋白表达宿主，作为宿主菌，谷氨酸棒杆菌具有一些相对于大肠杆菌的优势，如无内毒素，较为安全，只有一层细胞膜，分泌的蛋白可以直接分泌胞外，不易形成包涵体，自身分泌到胞外的蛋白较少，易于产物的纯化，较少检测到胞外蛋白酶，有利于外源蛋白的稳定。因此，谷氨酸棒杆菌是一种很有潜力的外源蛋白表达宿主。

利用谷氨酸棒杆菌表达外源蛋白，首先要解决的是载体的问题，而有限的启动子及RBS序列也是影响其载体构建的一大因素。经申请人研究发现，以aph213为第一顺反子，外源蛋白基因为第二顺反子的双顺反子表达载体能够实现谷氨酸棒杆菌对外源蛋白的稳定表达。

发明内容

本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体，其能实现谷氨酸棒杆菌对外源蛋白的稳定表达。

一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体，其包括启动子和外源蛋白编码序列，其特征在于：所述启动子为aph启动子，其还包括第一编码序列、与第一编码序列连接的RBS序列，所述aph启动子和所述第一编码序列连接构成第一顺反子，所述RBS序列和所述外源蛋白编码序列连接构成第二顺反子；

所述第一顺反子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RBS序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。

一种外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌和上述表达载体。

本发明还提供了上述表达载体或外源蛋白表达系统在外源蛋白表达中的应用。

上述双顺反子表达载体，aph启动子和第一编码序列连接构成第一顺反子， RBS序列和外源蛋白编码序列连接构成第二顺反子，进而构成双顺反子表达结构，经实验证实，含有上述双顺反子表达结构的载体能够应用于谷氨酸棒杆菌，实现谷氨酸棒杆菌对外源蛋白的稳定表达。

附图说明

图1为本发明实验例1构建的双顺反子表达载体的质粒图谱。

图2为本发明的六种启动子在谷氨酸棒杆菌中表达egfp的荧光图。

图3为实验例2的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和大肠杆菌DH5α均购自中国高校微生物资源数据平台；

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen，BstZ-17I内切酶、T4连接酶购自Thermo；

pdxw-8载体的构建参见申请人的在先专利200910233618.1，或参见Xu, D., Y.Tan, et al. (2010). "Construction of a novel shuttle vector for use inBrevibacterium flavum, an industrial amino acid producer." Journal of Microbiological Methods80(1): 86-92；

xk99e载体的构建参见文献：Oliver Kirchner,Andreas Tauch,2003.Tools forgenetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacteriumglutamicum；

puc18-egfp是实验室构建并保存的的载体，用于提供egfp序列。

实验例1

外源蛋白编码序列为egfp对应的核苷酸序列。

1、pdxw-9载体的构建

1）挑取带有pdxw-8载体的大肠杆菌DH5α转接至含有50ug/ml卡那霉素抗生素的LB培养基中， 37℃，230rpm，12h，扩增pdxw-8质粒；

2）通过质粒提取试剂盒提取pdxw-8质粒；

3）用BstZ-17I内切酶对pdxw-8质粒进行酶切；

4）酶切后用胶回收试剂盒回收较大片段；

5）回收后用T4连接酶进行连接，得到pdxw-9载体。

2、双顺反子表达载体的构建

1）以引物aphf和aphr从载体xk99e上扩增出aph启动子及aph基因前213bp的片段。所用引物如下：

Aph-F：5’-ccggaattcagcttcacgctgccgcaagcac-3’

Aph-R：5’-ccgctcgagggccagccacgatagccgcg-3’

RCR程序：94℃、3min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃、7min。

2）回收PCR产物并以EcoRI和XhoI酶切，连接到同样经过EcoRI和XhoI酶切的pdxw-9载体上，得到pdxw-9-aph-213载体。

3）以带有egfp基因的puc18-egfp载体为模板，egfp基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示，分别以上游引物e1-egfp-F、e3-egfp-F、ea2-egfp-F、ea3-egfp-F、dh-egfp-F和da-egfp-F与下游引物egfp-R进行PCR扩增，得到分别带有e1、e3、ea2、ea3、dh和da RBS的以egfp为第二顺反子的基因片段。

六种RBS序列如下：

e1：5’-gaaaggaggtcg-3’

e3：5’-gaaaggaggacc-3’

ea2：5’-caggatgaggatcgtttc-3’

ea3：5’-caggatgaggatcgtcgc-3’

dh：5’-aaaggaggacaacc-3’

da：5’-acaggatgaggatcgtttcgc-3’

所用引物序列如下：

e1-egfp-F：5’-ccgctcgaggaaaggaggtcgtgatggtgagcaagggcgaggag-3’

e3-egfp-F：5’-ccgctcgaggaaaggaggacctaatggtgagcaagggcgaggag-3’

ea2-egfp-F：5’-ccgctcgagcaggatgaggatcgtttctaatggtgagcaagggcgaggag-3’

ea3-egfp-F：5’-ccgctcgagcaggatgaggatcgtcgctaaatggtgagcaagggcgaggag-3’

dh-egfp-F：5’-ccgctcgagaaaggaggacaaccatggtgagcaagggcgaggag-3’

da-egfp-F：5’-ccgctcgagacaggatgaggatcgtttcgcatggtgagcaagggcgaggag-3’

egfp-R：5’-ccgaagcttttacttgtacagctcgtccatg-3’

RCR程序：94℃、3min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。

4）回收上述PCR产物，进过XhoI和HindIII酶切后，连接到同样经过XhoI和HindIII酶切的pdxw-9-aph-213上，得到如图1所示的，以aph213为第一顺反子，egfp为第二顺反子的双顺反子表达载体。

分别为：

pdxw-9-aph213-dA-egfp；

pdxw-9-aph213-eA3-egfp；

pdxw-9-aph213-eA2-egfp；

pdxw-9-aph213-e3-egfp；

pdxw-9-aph213-e1-egfp；

pdxw-9-aph213-dH-egfp。

3、荧光检测

1）将构建好的载体转入大肠杆菌，扩增；提取质粒，电转谷氨酸棒杆菌，30℃培养；

2）将长出的转化子转接到平板上，含30ug/ml、卡那霉素的LBHIS固体培养基，培养，待长出后在荧光透射仪上观察发光情况，其结果如图2所示；

3）挑取转化子，多孔板培养：24孔板，每孔2mlBHI液体培养基，30℃，230rpm，12h；转接，200ul培养物，每孔2mlBHI液体培养基，在30℃，230 rpm，12h；

4）收集培养物，PBS溶液冲洗3次，测OD600，定OD600至0.3；

5）多功能酶标仪测其OD600和荧光强度，荧光强度的测定方法为激发光为488nm，发射光为507nm；

6）荧光强度的计算方法为得到的荧光值比上OD600所得的数值，其结果如下表所示，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032几乎检测不到荧光，而带有不同的RBS序列的双顺反子构造的egfp的荧光强度不同，其中编号为dh的RBS序列对于egfp作为第二顺反子的表达能力最强。

实验例2

为了验证本发明的双顺反子结构能否用于表达其他外源蛋白，我们用来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶作为目标蛋白进行表达测试，即外源蛋白编码序列为α-淀粉酶对应的核苷酸序列，如SEQ ID NO：9所示。

1）选取了表达egfp荧光强度最高的dH RBS序列，通过引物设计的方法，将其连到α-淀粉酶的前端，以枯草芽孢杆菌的基因组为模板进行PCR扩增，得到分别带有dH RBS的以α-淀粉酶为第二顺反子的基因片段。

所用引物序列如下：

Amy-R：5’-ccgaagctttcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag-3’

Amy-F：5’-ccgctcgagaaaggaggacaaccatgtttgcaaaacgattcaaaacc-3’

RCR程序：94℃、3min；94℃、30s，62℃、30s，72℃、2min，35个循环；72℃、7min。

2）回收及连接方法同实验例1，得到了以aph为第一顺反子，α-淀粉酶为第二顺反子的α-淀粉酶双顺反子表达载体；转入大肠杆菌后，扩增，提取质粒，转入谷氨酸棒杆菌，培养。

3）挑取平板上的菌落转接至BHI液体培养基中，30℃，230rpm培养48h。

4）4℃离心，12000rpm， 5min，收集上清。分别对上清进行SDS-PAGE和淀粉酶活性的测定。

SDS-PAGE的结果如图3所示，泳道M为蛋白Marker，泳道1为不含载体的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的上清，2为带有pdxw-9空白载体的谷氨酸棒杆的上清，3为带有pdxw-9-aph213-dH-amy载体的谷氨酸棒杆菌的上清，箭头所指处即为α-淀粉酶分泌到胞外的SDS-PAGE条带，即表明本发明上述包含双顺反子结构的载体能够适用于谷氨酸棒杆菌表达外源蛋白。

淀粉酶的测定方法为：

取100ul稀释的酶液加入到200ul的1%的淀粉溶液中，60℃孵育，10min，加入450ul的DNS终止反应，沸水煮7min；

而对照组为在开始时不加培养物的上清，在加入DNS后再加培养物的上清，同样沸水煮7min；

待冷却后取200ul的终止反应体系加入到3.8ml的双蒸水中，在OD540nm 的条件下测吸光度，按制定好的葡萄糖标准曲线计算生成的还原糖；

酶活的定义为，在上述反应条件下，每分钟水解淀粉生成0.1mmol还原糖为一个酶活单位U；

检测到带有pdxw-9-aph213-dH-amy载体的谷氨酸棒杆菌的α-淀粉酶的胞外的活性为8.9U，而谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的胞外检测到的仅为4.3U。

Claims (3)

1.一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体，其包括启动子和外源蛋白编码序列，其特征在于：所述启动子为aph启动子，其还包括第一编码序列、与第一编码序列连接的RBS序列，所述aph启动子和所述第一编码序列连接构成第一顺反子，所述RBS序列和所述外源蛋白编码序列连接构成第二顺反子；

所述第一顺反子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RBS序列如SEQ ID NO:6所示。

2.一种外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌和如权利要求1所述的表达载体。

3.如权利要求1所述的表达载体或如权利要求2所述的外源蛋白表达系统在外源蛋白表达中的应用。