CN114410673A - 一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其应用 - Google Patents

一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其应用。其能有效提高谷氨酸棒杆菌外源蛋白的表达。通过通用RBS引物及PCR技术将RBS序列引入基因上游，然后利用生物砖组装技术完成基因多拷贝载体构建，利用该技术实现了蛋白的高效表达。

Description

一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌作为一种不产内毒素、胞外蛋白酶活性低的外源蛋白生产菌株，已完成了诸如BNP(脑钠肽)、α-amy(淀粉酶)、EGF(Human epidermal growth factor，人表皮生长因子)等蛋白的表达。近年来，针对谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达的研究仍然集中在元件的筛选、蛋白酶敲除及发酵条件优化等方向。
RBS序列是一段核糖体结合位点，是控制基因翻译的一种重要组成部分。研究表明，RBS对蛋白表达有显著的影响。目前在利用谷氨酸棒杆菌进行外源蛋白表达研究中，人们依然局限于单个启动子控制单个基因表达，而能否通过单个启动子串联多个基因的表达尚未进行研究。
生物砖(BioBrick)技术是指在特定基因两端添加特定酶切位点，以实现生物组件的标准化装配。利用BioBrick技术进行元件的组装，可以避免传统载体构建过程中PCR、胶回收等操作，只需通过简单的酶切连接就可以将任意一个标准化后的BioBrick组件插入到其他BioBrick组件的上游或者下游，并且新的组装序列仍然是标准化的BioBrick组件。重复操作，可以通过利用简单组件，构建复杂的系统。利用BioBrick技术，成功实现了谷氨酸棒杆菌表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)和水蛭素(recombinant hirudin variants III,rhv3)等外源蛋白的表达(Wang et al.,2020)。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有中存在的问题，提出了本发明。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：包括如下步骤：
标准化SD-目标基因融合载体制备：利用标准化目标基因为模板，采用PCR扩增目标基因，得到带有SD序列的标准化目标基因片段，并连入载体中，得到标准化SD-目标基因融合载体；
增加拷贝数：将不同拷贝量的目标基因连入载体中，电转化导入谷氨酸棒杆菌中，验证其表达和稳定存在。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：单拷贝目标基因标准化载体的制备中，PCR扩增使用的引物为p3A-SD-F/p3A-R。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：单拷贝目标基因表达载体的制备中，利用BioBrick技术将启动子、目标基因进行组装，构建单拷贝目标基因完整表达盒。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：多拷贝目标基因表达载体的制备中，利用BioBrick技术将单拷贝载体与标准化SD-目标基因融合载体进行组装，构建多拷贝目标基因表达载体。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：增加拷贝数中，所述谷氨酸棒杆菌中包括RBS引物。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：目的基因为外源蛋白，所述外源蛋白包括但不限于增强型绿色荧光蛋白、水蛭素中的一种。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：标准化SD-目标基因融合载体制备中，所述载体包括p3A载体。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：增加拷贝数中，所述载体为CspA-rhv3载体。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：多拷贝目标基因表达载体的制备中，使用的剪切酶包括EcoRI、PstI、NheI、SpeI和PstI剪切酶中的一种或几种。
作为本发明所述一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其中：增加拷贝数中，增加的拷贝数≥1，多拷贝数的优选为6。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其应用，其包括，多拷贝目标基因应用于谷氨酸棒杆菌表达系统中。
本发明提供一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法及其应用，通过较为简单的操作步骤的情况下，实现了外源蛋白的高效表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为通用RBS引物PCR扩增示意图；
图2为多拷贝egfp表达载体构建流程图；
图3为多拷贝egfp表达载体酶切验证图；
图4为多拷贝egfp表达载体的荧光强度结果图；
图5为多拷贝水蛭素表达载体酶切验证图；
图6为多拷贝水蛭素表达验证结果图；
图7为多拷贝水蛭素活性验证图；
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。以本领域技术人员能够实施为准，制定了以下实施例。本发明实施例中使用的谷氨酸棒杆菌，其包括的RBS序列表1所示，
表1 通用RBS引物序列
Figure BDA0003467087670000031
Figure BDA0003467087670000041
使用RBS进行引物PCR扩增的过程如图1所示。
实施例1
本实施例提供一种若干拷贝数的表达载体的构建及表达。
利用引物p3A-SD-F/p3A-R对已标准化目标基因进行PCR扩增，得到带有SD序列的标准化目标基因片段。
通过EcoRI、PstI酶切连入p3A-Amp载体，得到融合SD-目标基因的标准化质粒。利用BioBrick技术，EcoRI、NheI酶切标准化p3A-Ptac-目标基因-Kan载体，SpeI、PstI酶切上述标准化p3A-SD-目标基因-Amp载体。经灭活后，将其连入EcoRI、PstI酶切p3A-cm载体。获得两拷贝目标基因表达载体(p3A-Ptac-目标基因-SD-目标基因-cm)。
利用引物p3A-SD-F/p3A-R对标准化CspA-目标基因载体(CspA-目标基因载体由标准化信号肽CspA载体与标准化目标基因载体经BioBrick技术组装获得)进行PCR扩增，得到带有SD序列的标准化CspA-目标基因片段。通过EcoRI、PstI酶切连入p3A-Amp载体，得到SD-CspA-目标基因的标准化质粒。利用BioBrick技术，EcoRI、NheI酶切标准化p3A-Ptac-cspA-目标基因-cm载体，SpeI、PstI酶切上述标准化p3A-SD-CspA-目标基因-Amp载体。经灭活后，将其连入EcoRI、PstI酶切p3A-Kan载体。获得两拷贝目标基因分泌表达载体(p3A-Ptac-CspA-rhv3-SD-CspA-目标基因-cm)。并重复上述增多拷贝数的操作，获得诸如三拷贝、四拷贝、五拷贝及六拷贝等多多拷贝rhv3分泌表达载体。
实施例2
本实施例提供一种两拷贝egfp表达载体构建及表达。
egfp表达载体的构建过程参见图2所示。
利用引物p3A-SD-F/p3A-R对标准化EGFP进行PCR扩增，得到带有SD序列的标准化EGFP片段。通过EcoRI、PstI酶切连入p3A-Amp载体，得到SD-EGFP的标准化质粒。利用BioBrick技术，EcoRI、NheI酶切标准化p3A-Ptac-EGFP-Kan载体，SpeI、PstI酶切上述标准化p3A-SD-EGFP-Amp载体。经80℃灭活20min后，将其连入EcoRI、PstI酶切p3A-cm载体。获得两拷贝EGFP表达载体(p3A-Ptac-EGFP-SD-EGFP-cm)。
按照制备出两拷贝egfp表达载体的方法制备出多拷贝egfp表达载体。
得到的多拷贝egfp表达载体酶切验证如图3所示。
由图3可得，我方发明中制备出的多拷贝egfp表达载体能够得到稳定的多拷贝存在和表达效果。
将构建的单拷贝、两拷贝egfp表达载体经1.8kv，5ms电击两次，分别导入谷氨酸棒杆菌，待长出转化菌落后，挑菌接种至10mL LB,培养基，200r/min，30℃，培养12h。按2％接种量分别将上述菌液转接至2瓶含有10mL的LBB液体培养基中，200r/min，30℃，培养24h。取上述菌体200uL，加PBS稀释21倍，200uL LB培养基做空白对照，设置检测荧光强度的参数为：激发波长488nm，发射波长507nm。荧光测量值/OD600用来表示EGFP的单位表达水平。得到的荧光强度如图4所示，两拷贝EGFP的荧光强度相比较单拷贝荧光强度，提高了93.67％。
由荧光强度的变化可以得到：使用的两拷贝表达载体能够对于表达量有着明显的提升效果，
实施例3
利用引物p3A-SD-F/p3A-R对标准化CspA-rhv3载体(CspA-rhv3载体由标准化信号肽CspA载体与标准化rhv3载体经BioBrick技术组装获得)进行PCR扩增，得到带有SD序列的标准化CspA-rhv3片段。通过EcoRI、PstI酶切连入p3A-Amp载体，得到SD-CspA-rhv3的标准化质粒。利用BioBrick技术，EcoRI、NheI酶切标准化p3A-Ptac-cspA-rhv3-cm载体，SpeI、PstI酶切上述标准化p3A-SD-CspA-rhv3-Amp载体。经80℃灭活20min后，将其连入EcoRI、PstI酶切p3A-Kan载体。获得两拷贝rhv3分泌表达载体(p3A-Ptac-CspA-rhv3-SD-CspA-rhv3-cm)。并重复上述操作，获得三拷贝、四拷贝、五拷贝及六拷贝rhv3分泌表达载体。
将构建的多拷贝rhv3分泌表达载体经1.8kv，5ms电击两次，分别导入谷氨酸棒杆菌，待长出转化菌落后，挑菌接种至10mL LB培养基，200r/min，30℃，培养12h。按2％接种量分别将上述菌液转接至6瓶含有10mL的LBB液体培养基中，200r/min，30℃，培养24h。野生型谷氨酸棒杆菌为对照。收集上述菌体1mL，低温离心取上清，获得分泌蛋白上述蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。发现随着rhv3基因拷贝数的提高，rhv3的表达明显提高(图6)。经凝血酶滴定法检测其单位活性，得到数据记录在表2中，表2凝血酶滴定法检测多拷贝rhv3活性。
表2 凝血酶滴定法检测多拷贝rhv3活性
Figure BDA0003467087670000061
由表2可得，与单拷贝rhv3分泌表达活性相比，两拷贝、三拷贝、四拷贝、五拷贝、六拷贝和七拷贝rhv3的活性分别提高66.3％、166％、264％、353％、357％和361％，所得趋势在图7中可以清晰的看出。
将构建的多拷贝egfp表达载体经1.8kv，5ms电击两次，分别导入谷氨酸棒杆菌，待长出转化菌落后，挑菌接种至10mL LB,培养基，200r/min，30℃，培养12h。按2％接种量分别将上述菌液转接至2瓶含有10mL的LBB液体培养基中，200r/min，30℃，培养24h。取上述菌体200uL，加PBS稀释21倍，200uL LB培养基做空白对照，设置检测荧光强度的参数为：激发波长488nm，发射波长507nm。荧光测量值/OD600用来表示EGFP的单位表达水平。得到的数据记录在表3中。
表3 多拷贝egfp表达载体荧光值
Figure BDA0003467087670000062
由表3可得，当拷贝量向6以上增加时，增加酶活趋势迅速下降，可见拷贝量的优选为6。
我方发明中提供的方法对于目标基因的拷贝方式实现了良好的效果，通过提供的载体、酶等构成的反应体系，能够实现目标基因的导入和稳定存在，并且通过诸如拷贝量等限制，实现了最大经济化原则下的表达量的大幅提升。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：包括如下步骤：
标准化SD-目标基因融合载体制备：利用标准化目标基因为模板，采用PCR扩增目标基因，得到带有SD序列的标准化目标基因片段，并连入载体中，得到标准化SD-目标基因融合载体；
增加拷贝数：将不同拷贝量的目标基因连入载体中，电转化导入谷氨酸棒杆菌中，验证其表达和稳定存在。
2.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述单拷贝目标基因标准化载体的制备中，PCR扩增使用的引物为p3A-SD-F/p3A-R。
3.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述单拷贝目标基因表达载体的制备中，利用BioBrick技术将启动子、目标基因进行组装，构建单拷贝目标基因完整表达盒。
4.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述多拷贝目标基因表达载体的制备中，利用BioBrick技术将单拷贝载体与标准化SD-目标基因融合载体进行组装，构建多拷贝目标基因表达载体。
5.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述增加拷贝数中，所述谷氨酸棒杆菌中包括RBS引物。
6.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述目的基因为外源蛋白，所述外源蛋白包括但不限于增强型绿色荧光蛋白、水蛭素中的一种。
7.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述标准化SD-目标基因融合载体制备中，所述载体包括p3A载体。
8.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述增加拷贝数中，所述载体为CspA-rhv3载体。
9.根据权利要求4中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的方法，其特征在于：所述多拷贝目标基因表达载体的制备中，使用的剪切酶包括EcoRI、PstI、NheI、SpeI和PstI剪切酶中的一种或几种。
10.根据权利要求1中所述的提高重组蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达水平的应用，其特征在于：所述增加拷贝数中，增加的拷贝数≥1，多拷贝数的优选为6。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434733A (zh) * 2016-08-01 2017-02-22 江南大学 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用
CN108642109A (zh) * 2018-05-22 2018-10-12 江南大学 一种提高谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达量的方法
CN111826389A (zh) * 2020-05-26 2020-10-27 江南大学 提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法
CN113652442A (zh) * 2021-08-27 2021-11-16 江南大学 一种棒状杆菌质粒复制子的改造方法及其产品

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434733A (zh) * 2016-08-01 2017-02-22 江南大学 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用
CN108642109A (zh) * 2018-05-22 2018-10-12 江南大学 一种提高谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达量的方法
CN111826389A (zh) * 2020-05-26 2020-10-27 江南大学 提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法
CN113652442A (zh) * 2021-08-27 2021-11-16 江南大学 一种棒状杆菌质粒复制子的改造方法及其产品

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YALI WANG等: "Construction of a 3A system from BioBrick parts for expression of recombinant hirudin variants III in Corynebacterium glutamicum", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 *
张伟等: "利用内源元件在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶", 《生物工程学报》 *
彭枫等: "不同表达模式组合对谷氨酸棒状杆菌中脑钠肽蛋白表达的影响", 《食品与发酵工业》 *
饶贤才等: "基因串联体的构建策略及其表达模式", 《医学研究生学报》 *

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