CN108130342B - 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法 - Google Patents

基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108130342B
CN108130342B CN201711249583.1A CN201711249583A CN108130342B CN 108130342 B CN108130342 B CN 108130342B CN 201711249583 A CN201711249583 A CN 201711249583A CN 108130342 B CN108130342 B CN 108130342B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
expression cassette
vector
nucleic acid
acid construct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711249583.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108130342A (zh
Inventor
朱健康
王木桂
毛妍斐
陆钰明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Original Assignee
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS filed Critical Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Publication of CN108130342A publication Critical patent/CN108130342A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108130342B publication Critical patent/CN108130342B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology

Abstract

本发明提供了基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法。具体地，本发明提供了基于Cpf1(AsCpf1、FnCpf1、LbCpf1)的植物基因组定点编辑的核酸构建物，载体或载体组合，以及植物基因组定点编辑方法。具体地，所述的核酸构建物包括第一表达盒和任选的第二表达盒，所述的第一表达盒为Cpf1‑NLS融合蛋白表达盒，所述的第二表达盒为crRNA表达盒。利用本发明的方法,可以在预定的植物基因组位点，简便而高效地进行单基因敲除、多基因敲除或者同源重组和外源片段的定向插入。

Description

基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及RNA引导的植物基因组定点编辑方法。
背景技术
近年来，随着基因定向编辑工具如锌指蛋白核糖核酸酶(Zinc finger nulease，ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effectors nulease，TALEN)和规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系统的推广应用，特别是CRISPR-Cas9系统由于活性高，特异性好而且构建方便，近三年来发展非常迅速，并且在大量物种上得到成功应用(Li etal.,2012；Sun et al.,2012；Zhang et al.,2012；Dang et al.,2013；Feng et al.,2013；Li et al.,2013；Shan et al.,2013)。然而CRISPR-Cas9系统亦有其局限性：1、CRISPR是一段被一种短重复序列分隔的核酸序列，它们转录形成的CRISPR RNA(crRNA)与另一种返式作用型crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)部分区域配对形成二元复合体，然后该二元复合体一起引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白切割与crRNA匹配的DNA序列，所以工程化的CRISPR-Cas9系统也需要将crRNA与tracrRNA融合在一起形成单一的chimericRNA(chiRNA)，并且需要在宿主RNA酶的帮助下才能发挥作用。2、需要序列为NGG的PAM(protospacer-adjacent motif)，这就制造了序列限制，对于富含AT的序列不好编辑。3、Cas9剪切基因组形成的是平末端，方便实现基因敲除但不利于外源基因的定向插入。
2015年，科学家发现并改造出Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella1)系统，以Fn Cpf1(Francisella novicida U112 Cpf1)为例，研究表明该系统能克服CRISPR-Cas9的上述局限，进一步通过评估来自16种不同细菌的Cpf1酶，最终发现有2种Cpf1蛋白：AsCpf1(Acidaminococcus sp.BV3L6 Cpf1)和LbCpf1(Lachnospiraceaebacterium ND2006 Cpf1)，能够在体内定向剪切人类DNA(Zetsche et al.,2015)。Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶的功能，不但能靶向切割DNA双链，而且能把相应的非成熟型crRNA(pre-crRNA)加工剪切成成熟型crRNA(Fonfara et al.,2016)。目前AsCpf1和LbCpf1系统已经在人类细胞和动物细胞上得到应用(Kim et al.,2016a；Kim et al.,2016b；Tóthet al.,2016)。尽管LbCpf1系统亦已报道在水稻中的应用，但其突变效率并不高，并且需要依赖长链非成熟型直接重复序列(DR)，短链成熟型DR序列却未见产生突变(Xu et al.,2016)。
综上所述，为植物基因工程的需要，丰富植物基因编辑的工具箱并克服CRISPR-Cas9系统的其局限性，本领域迫切需要开发简便而高效的基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法。由于成熟型crRNA更加短小，便于人工合成并且更加容易转化进入细胞，所以开发基于成熟型crRNA的CRISPR-Cpf1系统会更具优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一套基于Cpf1(包括AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1)的植物基因组定点编辑方法，可以简单高效地在单双子叶植物实现单基因敲除、多基因敲除和同源重组或外源片段定点敲入。
在本发明的第一方面，提供了一种用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，所述的核酸构建物包括第一表达盒和任选的第二表达盒；
其中，所述的第一表达盒为Cpf1-NLS融合蛋白表达盒，其中所述的Cpf1-NLS融合蛋白具有式I结构：
P1-A-B1-C-B2-D-B3-E1 (I)
式中，
P1为第一启动子；
A为无、信号肽、和/或蛋白标签序列；
B1为无或核定位信号序列NLS；
B2为无或核定位信号序列NLS；
B3为无或核定位信号序列NLS；
附加条件是，B1、B2和B3中至多一个为无；或者B1和B3为无，而B2为核定位信号序列NLS；
C为Cpf1的N端片段元件；
D为Cpf1的C端片段元件；
E1为第一终止子；
其中，所述的N端片段元件和C端片段元件共同构成一个完整的Cpf1蛋白；
以及，所述的第二表达盒为crRNA表达盒，在所述的crRNA表达盒含有对应于成熟型crRNA或非成熟型pre-crRNA的编码序列。
在另一优选例中，“-”表示键。
在另一优选例中，所述的核酸构建物包括第一表达盒和第二表达盒。
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的表达载体上。
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。
在另一优选例中，在第一表达盒中，
B1和B3为无，而B2为核定位信号序列NLS；或
B1为无，而B2和B3为核定位信号序列NLS；或
B2为无，而B1和B3为核定位信号序列NLS；或
B3为无，而B1和B2为核定位信号序列NLS；或
B1、B2和B3为核定位信号序列NLS。
在另一优选例中，所述核定位信号序列NLS选自或来自下组：SV40、KRP2(Kip-related protein gene NO.2)、MDM2、CDc25C、DPP9、MTA1、CBP80、AreA、M9、Rev、hTAP、MyRF、EBNA-6、TERT、Tfam、或组合。
在另一优选例中，所述的C对应于Cpf1蛋白的第1位至第n位的氨基酸序列，其中n为627-673(AsCpf1)、691-718(FnCpf1)或615-633(LbCpf1)的正整数。
在另一优选例中，n为628-672(AsCpf1)、692-717(FnCpf1)或616-632(LbCpf1)中任一正整数。
在另一优选例中，n为652(AsCpf1)、709(FnCpf1)或627(LbCpf1)。
在另一优选例中，所述的D对应于Cpf1蛋白的第n+1位至第m位的序列，其中n如上定义，m为全长Cpf1的最后一个氨基酸的位置编号。
在另一优选例中，所述B2位于Cpf1多肽的非保守区。
在另一优选例中，所述的第二表达盒具有式II结构crRNA表达盒：
P2-(R-S)q-T (II)
式中，
P2为第二启动子；
各R独立地为对应于成熟型或非成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)
各S独立地为无或目标位点引导序列sg；
q为≥1的正整数；
T为无或终止序列。
在另一优选例中，所述终止序列选自下组：polyT、NOS、polyA或其组合。
在另一优选例中，q为1。
在另一优选例中，所述的第二表达盒为具有式III或IV结构crRNA表达盒：
P2-R-S-R-T (III)
P2-(R-S)8-R-T (IV)。
在另一优选例中，q为2-50，较佳地2-10，较佳地3-15。
在另一优选例中，q为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。
在另一优选例中，各S为sg序列。
在另一优选例中，所述的sg序列的长度为17-35nt，较佳地18-28nt，更佳地18-24nt。
在另一优选例中，第一启动子为Pol II类型的启动子。在另一优选例中，第一启动子选自下组：Ubi、Actin、CmYLCV、UBQ、35S、SPL，组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS，诱导型启动子XEV或其组合。
在另一优选例中，第二启动子为Pol II类型或Pol III类型的启动子。
在另一优选例中，第二启动子选自下组：OsU3、OsU6a、OsU6b、OsU6c、AtU6-1、AtU3b、AtU3d、AtU6-1、AtU6-29、Actin、35S、Ubi、UBQ、SPL、CmYLCV和组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS，诱导型启动子XEV或其组合。
在另一优选例中，所述的第二表达盒为具有式IV结构crRNA表达盒：
P2-(R-S)8-R-T (IV)
式中，
P2为2×35S、Actin、Ubi或CmYLCV。在另一优选例中，第一终止子选自下组：NOS终止子、Poly A终止子。
在另一优选例中，所述的构建物为载体。
在另一优选例中，所述的构建物为质粒。
在另一优选例中，所述的构建物为线性核酸。
在本发明的第二方面，提供了一种载体或载体组合，所述的载体或载体组合含有本发明的第一方面所述的核酸构建物。
在另一优选例中，所述的核酸构建物包括第一表达盒和第二表达盒。
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上，并且在所述第一表达盒和第二表达盒的侧翼(即左侧和右侧)设有LB序列和RB序列。
另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的第一表达载体和第二表达载体。
另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的第一表达载体和第二表达载体时，则在所述第一表达载体中在所述第一表达盒的侧翼设有LB序列和RB序列，以及在所述第二表达载体中在所述第二表达盒的侧翼设有LB序列和RB序列。
在另一优选例中，所述的载体组合还包括携带供体DNA表达盒的辅助载体。
在另一优选例中，所述的载体至少还包括携带供体DNA表达盒。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂组合，包括：
(i)本发明的第二方面所述的载体或载体组合。
在另一优选例中，所述试剂组合还包括供体DNA。
在本发明的第四方面，提供了一种对植物进行基因编辑的方法，包括步骤：
(i)将(a)本发明的第二方面所述的载体或载体组合以及(b)任选的供体核酸片段，导入植物细胞、植物组织或植物(植株)，从而在所述植物细胞、植物组织或植物中产生基因编辑；和
(ii)任选地，对发生所述基因编辑的植物细胞或植物进行检测、筛选或鉴定。
在另一优选例中，所述的方法还包括：
(iii)对步骤(ii)中经鉴定发生了所述基因编辑的植物细胞、植物组织或植物进行再生或培养。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括基因敲除、定点插入、基因置换、或其组合。
在另一优选例中，所述的定向插入包括基于同源重组或非同源重组末端连接的定点插入。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括单位点或多位点的基因编辑。
在另一优选例中，所述的多位点包括同一基因上不同位点，同一基因家族不同基因上的位点，同一信号通路上不同基因上的位点。
在另一优选例中，所述导入为通过农杆菌导入。
在另一优选例中，所述导入为通过基因枪导入。
在另一优选例中，所述导入为通过显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法导入。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科植物、豆科植物和十字花科植物。
在另一优选例中，所述的植物包括：拟南芥、小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、高粱、粟、大豆、花生、烟草和番茄。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为水稻单位点敲除CRISPR-AsCpf1(ncNLS)表达载体构建示意图
图2为拟南芥单位点敲除CRISPR-AsCpf1表达载体构建示意图。NLS设计三种放置方式：同时置于AsCpf1编码序列5'端和3'端(ncNLS)；仅置于AsCpf1的3'端(cNLS)或内置于AsCpf1编码序列的非保守区(mNLS)。AsDR指AsCpf1的直接重复序列。
图3为水稻单位点敲除CRISPR-AsCpf1(cNLS)表达载体构建示意图(不含AsCpf1编码序列5'端的蛋白标签和核定位信号序列NLS)。
图4为水稻单位点敲除CRISPR-FnCpf1(ncNLS)表达载体构建示意图。
图5为水稻单位点敲除CRISPR-FnCpf1(cNLS)表达载体构建示意图(不含FnCpf1编码序列5'端的蛋白标签和核定位信号序列NLS)。
图6为水稻单位点敲除CRISPR-LbCpf1(ncNLS)表达载体构建示意图。
图7为水稻多位点敲除CRISPR-AsCpf1表达载体构建示意图。
图8为水稻多位点敲除CRISPR-FnCpf1表达载体构建示意图。
图9为水稻多位点敲除CRISPR-LbCpf1表达载体构建示意图。
图10为拟南芥多位点敲除CRISPR-FnCpf1表达载体构建示意图。
图11为YP报告基因测试Cpf1切割产生的粘性末端介导外源片段定点插入。
图12为GUUS和YFFP报告基因系统。GU-US和YF-FP基因检测不到信号，当靶向位点切割产生DNA双链断裂时GU-US和YF-FP会通过单链退火(single strandannealing，SSA)的方式修复成完整的GUS基因和YFP基因，从而可通过GUS染色或荧光显微镜检测到信号。gRNA靶位点区在本发明中亦称为MRS。
图13为以YFFP报告基因系统测试不同NLS放置方式的CRISPR-AsCpf1切割活性，每个转化重复两次。
图14为AsCpf1(ncNLS)、FnCpf1(ncNLS)和LbCpf1(ncNLS)在YFFP报告基因系统的切割活性比较。
图15为AsCpf1(ncNLS)转化具有GUUS报告基因系统的拟南芥后对T1代植株进行GUS染色检测。A,E:两株独立的T1代稳定转化植株。B,C,D:在叶片和根系放大的GUS染色蓝斑。
图16为利用CRISPR-LbCpf1(ncNLS)系统对水稻靶位点OsPDS-1进行敲除产生的白化叶片。Bar＝1cm。
图17为利用CRISPR-LbCpf1(ncNLS)系统对水稻靶位点OsPDS-1进行敲除产生的颜色嵌合叶片。Bar＝1cm。
图18为Pol II启动子驱动的CRISPR阵列及Cpf1表达盒。
图19为双DR构架的crRNA表达盒。
图20为H-HDV构架的crRNA表达盒。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次构建了一种基于Cpf1的高通用性、高特异性的CRISPR/Cpf1植物基因组定点编辑系统，以及用于植物基因组定点编辑的核酸构建物、载体或载体组合，以及植物基因组定点编辑方法。具体地，基于本发明的方法,可以在预定的植物基因组位点，简便而高效地进行单基因敲除、多基因敲除或者同源重组和外源片段的定向插入。在此基础上，完成了本发明。
具体地，本发明CRISPR/Cpf1编辑系统采用成熟型crRNA，由于成熟型crRNA更加短小，便于人工合成并且更加容易转化进入细胞，所以开发基于成熟型crRNA的CRISPR-Cpf1系统会更具优势。在此基础上，还开发了将核定位信号序列(NLS)置于Cpf1蛋白的N端、C端以及Cpf1多肽的非保守区的技术方案。实验结果表明，采用上述技术方案成功完成了拟南芥和水稻的基因编辑，效率高达60％-70％。其中，核定位信号序列(NLS)内置于Cpf1编码序列内非保守区的设计(mNLS)具有相对较高的活性。
术语
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文中述及的所有出版物和其他参考文献都通过引用纳入本文。
如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
基于Cpf1的植物基因组定点编辑的核酸构建物和方法
本发明提供了一种用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，所述的核酸构建物包括第一表达盒和任选的第二表达盒；
其中，所述的第一表达盒为Cpf1-NLS融合蛋白表达盒，其中所述的Cpf1-NLS融合蛋白具有式I结构：
P1-A-B1-C-B2-D-B3-E1 (I)
式中,
P1为第一启动子；
A为无、信号肽、和/或蛋白标签序列；
B1为无或核定位信号序列NLS；
B2为无或核定位信号序列NLS；
B3为无或核定位信号序列NLS；
附加条件是，B1、B2和B3中至多一个为无；或者B1和B3为无、而B2为核定位信号序列NLS；
C为Cpf1的N端片段元件；
D为Cpf1的C端片段元件；
E1为第一终止子；
其中，所述的N端片段元件和C端片段元件共同构成一个完整的Cpf1蛋白；
以及，所述的第二表达盒为crRNA表达盒，在所述的crRNA表达盒含有对应于成熟型crRNA或非成熟型pre-crRNA的编码序列。
在本发明中，上述的各元件可用常规方法(如PCR法、人工全合成)制备，然后用常规方法进行连接，从而形成本发明所述的核酸构建物。如需要，在连接反应之前，可以任选地进行酶切反应。
此外，本发明的所述核酸构建物可以是线性的，也可以是环状的。本发明的所述核酸构建物可以是单链的，也可以是双链的。本发明的所述核酸构建物可以是DNA，也可以是RNA，或DNA/RNA杂合。
如本文所用，nNLS是指核定位信号序列NLS位于Cpf1蛋白编码序列的5'端，cNLS是指核定位信号序列NLS位于Cpf1蛋白编码序列的3'端，ncNLS是指Cpf1蛋白编码序列的5'端和3'端均设置核定位信号序列NLS，mNLS是指NLS核定位信号序列内置于Cpf1蛋白编码序列内非保守区。
如本文所用，“外源基因”指作用是阶段性作用的外源DNA分子。可用于本申请的外源基因没有特别限制，包括转基因动物领域常用的各种外源基因。代表性例子包括(但并不限于)：β-葡萄糖苷酸酶基因、红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白基因、溶菌酶基因、鲑鱼降钙素基因、乳铁蛋白、或血清白蛋白基因等。
如本文所用，“筛选标记基因”指转基因过程中用来筛选转基因细胞或转基因动物的基因，可用于本申请的筛选标记基因没有特别限制，包括转基因领域常用的各种筛选标记基因，代表性例子包括(但并不限于)：潮霉素抗性基因(Hyg)、卡那霉素抗性基因(NPTII)、新霉素基因、或嘌呤霉素抗性基因。
如本文所用，术语“表达盒”是指含有待表达基因以及表达所需元件的序列组件的一段多聚核苷酸序列。例如，在本发明中，术语“筛选标记表达盒”指含有编码筛选标记的序列以及表达所需元件的序列组件的多聚核苷酸序列。表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，筛选标记表达盒还可以含有或不含有其他序列，包括(但并不限于)：增强子、分泌信号肽序列等。
如本文所用，术语“植物启动子”指能够在植物细胞中启动核酸转录的核酸序列。该植物启动子可以是来源于植物、微生物(如细菌、病毒)或动物等，或者是人工合成或改造过的启动子。
如本文所用，术语“植物终止子”指能够在植物细胞中可使转录停止的终止子。该植物转录终止子可以是来源于植物、微生物(如细菌、病毒)或动物等，或者是人工合成或改造过的终止子。代表性的例子包括(但并不限于)：Nos终止子。
如本文所用，术语“Cpf1蛋白”指一种核酸酶。典型的Cpf1蛋白包括(但并不限于)：FnCpf1(Francisella novicida U112 Cpf1),AsCpf1(Acidaminococcus sp.BV3L6Cpf1)和LbCpf1(Lachnospiraceae bacterium ND2006Cpf1)。
如本文所用，术语“Cpf1蛋白的编码序列”指编码具有切割活性的Cpf1蛋白的核苷酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性Cpf1蛋白的情况下，技术人员会认识到，因为密码子的简并性，有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。另外，技术人员也会认识到不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表达的需要，会对Cpf1蛋白的密码子进行优化，这些变异体都被术语“Cpf1蛋白的编码序列”所具体涵盖。此外，术语特定地包括了全长的，与Cpf1基因序列基本相同的序列，以及编码出保留Cpf1蛋白功能的蛋白质的序列。
在本发明中，所述的C对应于Cpf1蛋白的第1位至第n位的氨基酸序列，其中n为627-673(当C为AsCpf1或类似蛋白的N端时)、691-718(当C是FnCpf1或类似蛋白的N端时)、615-633(当C是LbCpf1或类似蛋白的N端时)的正整数。
典型地，所述的第二表达盒具有式II结构crRNA表达盒：
P2-(R-S)q-T (II)
式中,
P2为第二启动子；
各R独立地为对应于成熟型或非成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)
各S独立地为无或目标位点引导序列sg；
q为≥1的正整数；
T为无或polyT或Nos或polyA序列。
本发明还提供了一种载体或载体组合，所述的载体或载体组合含有本发明所述的核酸构建物。
优选地，本发明所述的载体组合还包括携带供体DNA表达盒的辅助载体。
在本发明的核酸构建物和/或载体中，一些元件之间(尤其是各表达盒中的相应元件)是可操作连接的。例如当启动子与编码序列可操作连接时，指所述启动子能够启动所述编码序列的转录。
本发明还提供了含有上述载体或载体组合的试剂组合以及试剂盒，它们可用于本发明的植物基因编辑方法。
本发明还提供了一种对植物进行基因编辑的方法，包括步骤：
(i)将(a)本发明所述的载体或载体组合以及(b)任选的供体核酸片段，导入植物细胞、植物组织或植物(植株)，从而在所述植物细胞、植物组织或植物中产生基因编辑；和
(ii)任选地，对发生所述基因编辑的植物细胞或植物进行检测、筛选或鉴定。
在本发明中，所述的基因编辑包括基因敲除、定点插入、基因置换、或其组合。
本发明的植物基因编辑方法，可用于改良各类植物，尤其是对农作物进行改良。
如本文所用，术语“植物”包括全植株、植物器官(如叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及它们的子代。可用于本发明方法的植物的种类没有特别限制，一般包括任何可进行转化技术的高等植物类型，包括单子叶、双子叶植物和裸子植物。
应用
本发明可以用于植物基因工程领域，例如植物基因功能研究和作物遗传改良。
本发明的主要优点在于：
相对于传统的CRISPR/Cas9基因编辑系统，CRISPR/Cpf1系统具有以下优点：
(1)只需要crRNA，而不需要与另一种返式作用型crRNA(tracrRNA)融合即可引导Cpf1蛋白切割靶标DNA序列；
(2)PAM序列为TTN或TTTN，便于编辑富含AT的序列；
(3)PAM序列位于sg的5'端，而且切割位点远离PAM 15-18个碱基，对于靶位点的选择提供了更大的灵活性；
(4)Cpf1剪切基因组形成的是粘性末端，这使得外源基因的定向插入更加方便和可控；
(5)Cpf1自身具有RNA酶活性，可以自我剪切加工形成成熟的crRNA序列，这样一个crRNA表达盒即可串联多个DR-sg序列从而方便实现多位点敲除。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
材料
Cpf1蛋白序列
AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1的蛋白编码序列为人源优化的编码序列、具体序列可分别登录以下网址查看：https://benchling.com/s/wXO8WZJ7/edit、https://benchling.com/s/0xgyNBMK/edit、https://benchling.com/s/HVIyGqQs/edit。
序列一AsCpf1之crRNA表达盒的相关序列(SEQ ID NO.1)：
下划线标示HindIII酶切位点，为方便克隆至pCambia表达载体而设置；黑色底纹标示AsCpf1对应的成熟型DR序列；方框内为两个BsaI酶切位点相关的序列，构建基因敲除载体时该序列会被sg序列代替；加粗字母为转录终止子序列；其余为OsU6启动子的序列。
Figure BDA0001491428600000111
序列二FnCpf1之crRNA表达盒的相关序列(SEQ ID NO.2)：
下划线标示HindIII酶切位点，为方便克隆至pCambia表达载体而设置；黑色底纹标示FnCpf1对应的成熟型DR序列；方框内为两个BsaI酶切位点相关的序列，构建基因敲除载体时该序列会被sg序列代替；加粗字母为转录终止子序列；其余为OsU6启动子的序列。
Figure BDA0001491428600000112
序列三LbCpf1之crRNA表达盒的相关序列(SEQ ID NO.3)：
下划线标示HindIII酶切位点，为方便克隆至pCambia表达载体而设置；黑色底纹标示LbCpf1对应的成熟型DR序列；方框内为两个BsaI酶切位点相关的序列，构建基因敲除载体时该序列会被sg序列代替；加粗字母为转录终止子序列；其余为OsU6启动子的序列。
Figure BDA0001491428600000113
序列四FnCpf1之多基因位点编辑crRNA表达盒的相关序列(SEQ ID NO.4)
下划线标示HindIII酶切位点，为方便克隆至pCambia表达载体而设置；黑色底纹标示FnCpf1对应的成熟型DR序列；方框内为四个靶向位点的sg序列，按5'到3'的顺序分别为798sg，799sg，802sg和803sg；加粗字母为转录终止子序列；其余为OsU6启动子的序列。
Figure BDA0001491428600000121
序列五LbCpf1之多基因位点编辑crRNA表达盒的相关序列(SEQ ID NO.5)
下划线标示HindIII酶切位点，为方便克隆至pCambia表达载体而设置；黑色底纹标示LbCpf1对应的成熟型DR序列；方框内为四个靶向位点的sg序列，按5'到3'的顺序分别为240sg，260sg，230sg和250sg；加粗字母为转录终止子序列；其余为OsU6启动子的序列。
Figure BDA0001491428600000122
序列六
Hammerhead(HH)核酶序列：Z1-Z2，
其中Z1为N6，Z2为CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTC(SEQ ID NO.50)
Z1-Z2的序列为：
5’—NNNNNNCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTC
序列七
Hepatitis deltavirus(HDV)核酶序列：
5’—GGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGAC(SEQ ID NO.51)
方法
(1)构建CRISPR-AsCpf1表达载体用于单位点敲除
需要构建crRNA和AsCpf1两个表达盒并克隆到pCambia表达载体上。以水稻为例，crRNA表达盒从5'-3'具有以下4个元件：OsU6或OsU3启动子、AsCpf1对应的成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)、两个BsaI酶切位点用于对sg序列进行无缝克隆、转录终止子序列(TTTTTTT)(序列一)。AsCpf1表达盒从5'-3'具有以下元件：来源于玉米的Ubi启动子、3×Flag或3×HA蛋白标签、NLS核定位信号序列(nNLS)、AsCpf1的编码序列、第二段NLS核定位信号序列(cNLS)、NOS转录终止子序列(图1)。用于拟南芥敲除，则把相应的OsU6或OsU3启动子换作AtU6或AtU3启动子，Ubi启动子换作UBQ启动子，其它元件一致(图2)。根据Cpf1的蛋白解析结果，其5'端的序列相对保守，所以本发明的另一设计是在上述构造的基础上去掉AsCpf1编码序列5'端的蛋白标签和NLS核定位信号序列，其它元件保留(图3)，或者直接把NLS序列置于AsCpf1编码序列内一非保守区(mNLS)(图2)，以期提高AsCpf1在体内的切割活性。
(2)构建CRISPR-FnCpf1表达载体用于单位点敲除
需要构建crRNA和FnCpf1两个表达盒并克隆到pCambia表达载体上。以水稻为例，crRNA表达盒从5'-3'具有以下4个元件：OsU6或OsU3启动子，FnCpf1对应的成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)，两个BsaI酶切位点用于无缝克隆sg序列，转录终止子序列(TTTTTTT)(序列二)。FnCpf1表达盒从5'-3'具有以下元件：来源于玉米的Ubi启动子、3×Flag或3×HA蛋白标签、NLS核定位信号序列(nNLS)、FnCpf1的编码序列、第二段NLS核定位信号序列(cNLS)、NOS转录终止子序列(图4)。根据Cpf1的蛋白解析结果，其5'端的序列相对保守，所以本发明的另一设计是在上述构造的基础上去掉FnCpf1编码序列5'端的蛋白标签和NLS核定位信号序列，其它元件保留(图5)，或者直接把NLS序列置于FnCpf1编码序列内一非保守区(mNLS)，以期提高FnCpf1在体内的切割活性。用于拟南芥敲除则置换相关元件，见方法(1)。
(3)构建CRISPR-LbCpf1表达载体用于单位点敲除
需要构建crRNA和LbCpf1两个表达盒并克隆到pCambia表达载体上。以水稻为例，crRNA表达盒从5'-3'具有以下4个元件：OsU6或OsU3启动子、LbCpf1对应的成熟型直接重复序列(direct repeat,DR)、两个BsaI酶切位点用于无缝克隆sg序列、转录终止子序列(TTTTTTT)(序列三)。LbCpf1表达盒从5'-3'具有以下元件：来源于玉米的Ubi启动子、3×Flag或3×HA蛋白标签、NLS核定位信号序列(nNLS)、LbCpf1的编码序列、第二段NLS核定位信号序列(cNLS)、NOS转录终止子序列(图6)。根据Cpf1的蛋白解析结果，其5'端的序列相对保守，所以本发明的另一设计是在上述构造的基础上去掉LbCpf1编码序列5'端的蛋白标签和NLS核定位信号序列，其它元件保留，或者直接把NLS序列置于LbCpf1编码序列内一非保守区(mNLS)，以期提高LbCpf1在体内的切割活性。用于拟南芥敲除则置换相关元件，见方法(1)。
(4)构建CRISPR-Cpf1(AsCpf1、FnCpf1或LbCpf1)载体用于多位点敲除
由于Cpf1自身具有RNA酶活性，可以自我剪切加工转录的前体crRNA序列，推测如果一个crRNA表达盒串联多个DR-sg序列，转录后可由Cpf1剪切分成单个的DR-sg序列，从而方便的实现多位点敲除。该设计需要构建多位点crRNA表达盒，以水稻为例，从5'-3'具有以下元件：OsU6或OsU3启动子、各Cpf1对应的crRNA序列(含DR序列)、对应靶标位点1的sg1序列、crRNA序列、对应靶标位点2的sg2序列、crRNA序列、对应靶标位点3的sg3序列、crRNA序列、对应靶标位点N的sgN序列、转录终止子序列(TTTTTTT)。而Cpf1表达盒与单位点敲除的构建一样。最后把上述两个表达盒克隆到pCambia表达载体上(图7、8、9)。或者置换相关元件用于拟南芥多位点敲除(图10)。
(5)利用CRISPR-Cpf1(AsCpf1、FnCpf1或LbCpf1)进行同源重组或基于非同源末端连接(non-homologous end joining、NHEJ)介导的外源片段定点插入
与Cas9切割产生平末端的特性不一样，Cpf1剪切基因组形成的是粘性末端，理论上更适合进行外源片段的定向插入。利用CRISPR-Cpf1在靶标位点附近制造一个DSB，同时利用基因枪轰击或DNA病毒复制的方式导入大量外源片段，即可高效地实现植物细胞的基因同源重组或定向插入。以一个YP报告基因为测试系统验证Cpf1切割产生的粘性末端介导外源片段定点插入的设计如图11所示。
实施例1测试CRISPR-Cpf1系统在拟南芥细胞内的切割活性
瞬时转化实验：分离野生型拟南芥(Arabidopsis Thaliana Columbia-0)的原生质体，以PEG介导的方式同时转入YFFP报告基因系统(图12)和靶向YFFP报告基因的设置NLS不同放置形式的CRISPR-AsCpf1核酸构建物(图2)，若干天后在荧光显微镜下观察YFP信号。结果表明，把NLS序列内置于AsCpf1编码序列内非保守区的设计(mNLS)具有相对较高的活性(图13)。在另一瞬时转化实验里，发明人比较了AsCpf1(ncNLS)、FnCpf1(ncNLS)和LbCpf1(ncNLS)分别对YFFP报告基因两个靶向位点的切割活性，结果表明LbCpf1的活性最高(图14)。
稳定转化实验：把pCambia-CRISPR-AsCpf1质粒导入农杆菌GV3101，然后通过常规的浸花法转化具有GUUS报告基因系统的拟南芥植株(图12)，在T1代植株进行GUS染色，发现在植株的叶片和根系里均可检测到蓝色区域/斑点(图15)。
实施例2利用CRISPR-AsCpf1(ncNLS)系统对水稻内源基因进行单位点敲除
选取三个水稻内源基因位点：OsEPSPS、OsBEL、OsPDS、各基因设计两个CRISPR-AsCpf1靶向位点序列(sg)，分别通过BsaI酶切位点连接到pCambia-CRISPR-AsCpf1表达载体上。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴(Oryzasativa ssp japonica cv.Nipponbare)的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株，在再生植株群体中随机抽样提取DNA并对靶标位点进行扩增测序。结果显示(表1)，该系统能在水稻细胞内靶向切割产生突变并生成突变体植株，但效率比较低，在试验的6个位点中仅发现OsEPSPS-1位点有8％的突变率。
表1.CRISPR/AsCpf1(ncNLS)系统对水稻不同基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代植株的鉴定结果
Figure BDA0001491428600000151
注：黑体字母表示PAM序列；WT野生型，He杂合突变体。
实施例3利用CRISPR-FnCpf1(ncNLS)系统对水稻内源基因进行单位点敲除
选取三个水稻内源基因位点：OsEPSPS、OsBEL、OsPDS，各基因设计两个CRISPR-FnCpf1靶向位点序列(sg)，分别通过BsaI酶切位点连接到pCambia-CRISPR-FnCpf1表达载体上。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株，在再生植株群体中随机抽样提取DNA并对靶标位点进行扩增测序。结果显示(表2)，该系统能较高效率地在水稻细胞内靶向切割产生突变并生成突变体植株，在试验的6个位点中最高有接近20％的突变率。
表2.CRISPR/FnCpf1(ncNLS)系统对水稻不同基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代植株的鉴定结果
Figure BDA0001491428600000161
注：黑体字母表示PAM序列；WT野生型，He杂合突变体，Chi嵌合突变体。
实施例4利用CRISPR-LbCpf1(ncNLS)系统对水稻内源基因进行单位点敲除。
选取三个水稻内源基因位点：OsEPSPS、OsBEL、OsPDS，各基因设计两个CRISPR-LbCpf1靶向位点序列(sg)，分别通过BsaI酶切位点连接到pCambia-CRISPR-LbCpf1表达载体上。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。在靶位点OsPDS-1的转化植株中可以看到纯合突变或等位双突变产生的白化叶片(图16)或嵌合突变产生的颜色嵌合叶片(图17)。对各转化产生的再生植株群体随机抽样提取DNA并对靶标位点进行扩增测序。结果显示(表3)，该系统能非常高效率地在水稻细胞内靶向切割产生突变并生成突变体植株，在试验的6个位点中最高有超过70％的突变率。
表3.CRISPR/LbCpf1(ncNLS)系统对水稻不同基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代植株的鉴定结果
Figure BDA0001491428600000171
注：黑体字母表示PAM序列；WT野生型，He杂合突变体，Chi嵌合突变体，Bi等位双突变体。
实施例5包含DR-sg序列串的CRISPR-FnCpf1载体用于水稻多位点敲除
选取水稻受体激酶基因家族相关的四个基因位点：OsRLK-798(LOC_Os02g04430)，OsRLK-799(LOC_Os02g07960)，OsRLK-802(LOC_Os01g39600)和OsRLK-803(LOC_Os06g04370)。每个位点各设计一条FnCpf1靶向位点序列(sg)，通过FnCpf1的成熟DR序列间隔连接，并处于同一个OsU6启动子的控制(序列四SEQ ID NO.4)。随后将该表达盒与FnCpf1表达盒连接并置于pCambia1300的LB与RB序列内。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。在再生植株群体随机抽样提取DNA并对各靶标位点进行扩增测序。结果显示，该系统能非常高效率地在水稻细胞内同时进行多基因编辑，在试验的4个位点中达到了50％-87.5％的突变率(表4)。
表4.CRISPR-FnCpf1多基因编辑系统对水稻不同基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代植株的鉴定结果
Figure BDA0001491428600000172
Figure BDA0001491428600000181
注：黑体字母表示PAM序列；WT野生型，He杂合突变体，Chi嵌合突变体，Bi等位双突变体，Ho纯合突变体。
实施例6包含DR-sg序列串的CRISPR-LbCpf1载体用于水稻多位点敲除
选取水稻CYP81A基因家族的四个同源基因位点：OsBEL-230(LOC_Os03g55230)，OsBEL-240(LOC_Os03g55240)，OsBEL-250(LOC_Os03g55250)和OsBEL-260(LOC_Os03g55260)，每个基因各设计一条LbCpf1靶向位点序列(sg)，通过LbCpf1的成熟DR序列间隔连接，并处于同一个OsU6启动子的控制(序列五SEQ ID NO.5)。随后将该表达盒与LbCpf1表达盒连接并置于pCambia1300的LB与RB序列内。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。在再生植株群体随机抽样提取DNA并对各靶标位点进行扩增测序。结果显示，该系统能非常高效率地在水稻细胞内同时进行多基因编辑，在试验的4个位点中达到了40％-60％的突变率(表5)。
表5.CRISPR-LbCpf1多基因编辑系统对水稻不同基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代植株的鉴定结果
Figure BDA0001491428600000182
注：黑体字母表示PAM序列；WT野生型，He杂合突变体，Chi嵌合突变体，Bi等位双突变体，Ho纯合突变体。
实施例7CRISPR-Cpf1利用更改的成熟DR序列进行水稻单位点敲除
不同菌株来源的Cpf1均有其对应的DR序列，各DR序列并不一样。但由于Cpf1蛋白结合DR-sg序列时对其形成的DR-sg具有结构特异性，而不是唯一的序列特异性要求，并且由于Cpf1蛋白家族的保守性，各DR序列亦高度同源。据此推测Cpf1能结合非自身来源的DR序列，即DR序列具有一定的弹性，可作一定程度的序列修改。利用这一特性能进一步优化DR序列的设计，特别是在串联多个DR-sg序列用于多基因位点编辑时，可避免重复使用相同的DR序列。为验证Cpf1蛋白家族的上述特性，我们选取在水稻基因编辑中活性较高的LbCpf1和FnCpf1，互换其成熟DR序列，对水稻OsPDS-1和OsBEL-2位点分别进行单基因编辑。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。在再生植株群体随机抽样提取DNA并对各靶标位点进行扩增测序。结果显示，FnCpf1-LbDR和LbCpf1-FnDR在所测试的两个编辑位点中均保持了较高的突变率，使用效果并不亚于其自身的DR序列(表6)。
表6.LbCpf1和FnCpf1互换成熟DR序列进行水稻单基因编辑的T0代植株鉴定结果
Figure BDA0001491428600000191
注：WT野生型，He杂合突变体，Chi嵌合突变体，Bi等位双突变体。OsPDS-1和OsBEL-2的靶向序列与前文一致。
实施例8在CRISPR-Cpf1系统中利用Pol II类型的启动子驱动长DR-guide阵列用于水稻多位点敲除
在实施例5和实施例6中，利用OsU6启动子驱动的DR-guide阵列能实现水稻四个基因位点的高效率敲除，但U6属于Pol III类型启动子，驱动长链的能力有限，而且Pol III类型启动子不具备条件特异性或组织特异性激活能力，但是Pol II类型的启动子能有效克服上述缺陷。在该实施例中，发明人以FnCpf1为例，分别选取两个Pol II类型的启动子，2×35S和Actin，驱动长DR-guide阵列对水稻进行多基因位点敲除。
选取水稻晚期胚胎发生蛋白家族(Late Embryogenesis Abundant proteingenes，LEA)相关的八个基因作靶点，并且按以下顺序构建DR-guide阵列：LOC_Os01g43530，LOC_Os05g50710，LOC_Os01g12580，LOC_Os03g62620，LOC_Os04g49980，LOC_Os06g02040，LOC_Os08g23870和LOC_Os06g21910。每个位点各设计一条FnCpf1靶向位点序列(sg)，通过FnCpf1的成熟DR序列间隔连接，并且阵列两端均连上DR序列，以2×35S或水稻Actin启动子驱动，以poly A或NOS终止子结束，组成一个完整的CRISPR Pol II表达盒，随后将该表达盒与FnCpf1表达盒连接并置于pCambia1300的LB与RB序列内(图18)。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，然后通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。在再生植株群体随机抽样提取DNA并对各靶标位点进行扩增测序。结果显示，利用PolII类型的启动子驱动长DR-guide阵列可用于水稻多位点敲除，在测试的8个位点中最高可达36％-48.3％的突变率(表7，表8)。然而有些位点突变率较低，如LOC_Os01g43530，LOC_Os05g50710，LOC_Os06g21910等，由于这些位点靠近DR-guide阵列两端，可能受Pol II类型启动子转录的mRNA附带的5’端帽子结构和3’端poly A尾巴的影响，这可以通过在DR-guide阵列两端添加转移RNA(transfer RNA，tRNA)序列、核酶序列或Csy4识别序列等具有RNA剪切功能的辅助工具解决。但也有可能是因为针对这些靶位点的PAM-guide序列效率不高所致，如目前已发现对于FnCpf1，PAM序列的3’端如果是T(如LOC_Os01g43530和LOC_Os05g50710)，或者guide序列5’端的第一位碱基如果是T(如LOC_Os01g43530)，均有可能导致FnCpf1靶向结合切割的效率低下，这种情况可以通过更改或优化靶向上述位点的PAM-guide序列以提高效率。
表7.CRISPR-FnCpf1利用2×35S启动子驱动长DR-guide阵列对水稻八个基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代转化植株的鉴定结果。
Figure BDA0001491428600000211
注：黑体字母表示PAM序列；WT：野生型，He：杂合突变体，Chi：嵌合突变体，Bi：等位双突变体。
表8.CRISPR-FnCpf1利用Actin启动子驱动长DR-sg阵列对水稻八个基因进行敲除的PAM-sg序列及T0代转化植株的鉴定结果。
Figure BDA0001491428600000221
注：黑体字母表示PAM序列；WT：野生型，He：杂合突变体，Chi：嵌合突变体，Bi：等位双突变体。
以另外两种pol II类型启动子，例如来自于玉米的ZmUbi启动子或源自于洋丁香属黄叶卷曲病毒(cestrum yellow leaf curling virus，CmYLCV)的启动子代替2×35S或水稻Actin启动子驱动，得到了类似的结果。
实施例9 CRISPR-Cpf1利用双DR序列(DR-guide-DR)提高水稻单个位点敲除效率
在实施例2-4中，发明人分别利用AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对水稻内源基因进行单位点敲除，其中FnCpf1和LbCpf1对多数位点能实现高效率的敲除，但也有个别位点效率较低，如OsPDS-2位点。靶向该位点的PAM-guide序列已经符合优化的原则，例如PAM序列的3’端不是T，guide序列5’端的第一位碱基亦非T，guide序列的GC含量适中，四种碱基的分布也比较均衡等等。因此发明人推测可能是所采用的U6/U3-DR-guide-poly T构架中，转录产生的3’poly U(UUUUUUU)序列影响了Cpf1蛋白靶向结合的效率。为此发明人在该构架中增加一个DR序列变成U6/U3-DR-guide-DR-poly T，利用Cpf1自身的RNA剪切活性在CRISPR转录产物中切除poly U尾巴成为一个干净的DR-guide靶向序列从而提高敲除效率。为验证这一设想，发明人以LbCpf1靶向OsPDS-2位点为例，把原来的crRNA表达盒变成U6-DR-guide-DR-poly T，除了在guide后面增加一个DR序列，其它均不变，发明人称之为双DR系统(图19)。为了与上述新构架作比较，发明人同时构建了一个利用Pol II类型启动子Actin驱动的crRNA表达盒，利用两种具有RNA自剪切活性的核酶Hammerhead ribozyme(HH)和Hepatitisdeltavirus ribozyme(HDV)把转录后的DR-guide靶向序列分离出来：Actin-HH-DR-guide-HDV-poly T，发明人称之为H-HDV系统(图20)。然后把上述两个crRNA表达盒分别与原有的LbCpf1表达盒克隆到pCambia表达载体上(图19，20)。构建好的载体转化到农杆菌EHA105，通过该菌株侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，共培养3天后所转化的愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养中，培养15天后转移到含有潮霉素的分化培养基中再生植株。对各转化产生的再生植株群体随机抽样提取DNA并对靶标位点OsPDS-2进行扩增测序。结果如表9所示，双DR系统和H-HDV系统均能有效提高OsPDS-2位点的敲除效率，相对于原来实施例4中相同位点只有2.8％的敲除效率得到了大幅的提高，同时也表明双DR系统的效率不亚于H-HDV系统，并且双DR系统不需要配置复杂的Hammerhead ribozyme和Hepatitis deltavirusribozyme核酶序列，在结构上更加简单，在载体构建上也更加经济实用。另外，发明人也看到在产生突变体的类型中，嵌合突变体占了很大一部分，这可能是因为Cpf1的表达量不高所致，通过更换更强的启动子或子房、胚、分生组织等特异的启动子可以解决这个问题。
表9.CRISPR/LbCpf1利用双DR系统和H-HDV系统对水稻OsPDS-2位点进行敲除的PAM-sg序列及T0代植株的鉴定结果。
Figure BDA0001491428600000241
注：黑体字母表示PAM序列；WT：野生型，He：杂合突变体，Chi：嵌合突变体，Bi：等位双突变体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法
<130> P2017-2360
<150> 201611091649.4
<151> 2016-12-01
<150> 201710061568.8
<151> 2017-01-26
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
aagcttggat catgaaccaa cggcctggct gtatttggtg gttgtgtagg gagatgggga 60
gaagaaaagc ccgattctct tcgctgtgat gggctggatg catgcggggg agcgggaggc 120
ccaagtacgt gcacggtgag cggcccacag ggcgagtgtg agcgcgagag gcgggaggaa 180
cagtttagta ccacattgcc cagctaactc gaacgcgacc aacttataaa cccgcgcgct 240
gtcgcttgtg taatttctac tcttgtagat agagacctcg gtctcctttt tttaagctt 299
<210> 2
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
aagcttggat catgaaccaa cggcctggct gtatttggtg gttgtgtagg gagatgggga 60
gaagaaaagc ccgattctct tcgctgtgat gggctggatg catgcggggg agcgggaggc 120
ccaagtacgt gcacggtgag cggcccacag ggcgagtgtg agcgcgagag gcgggaggaa 180
cagtttagta ccacattgcc cagctaactc gaacgcgacc aacttataaa cccgcgcgct 240
gtcgcttgtg taatttctac tgttgtagat agagacctcg gtctcctttt tttaagctt 299
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
aagcttggat catgaaccaa cggcctggct gtatttggtg gttgtgtagg gagatgggga 60
gaagaaaagc ccgattctct tcgctgtgat gggctggatg catgcggggg agcgggaggc 120
ccaagtacgt gcacggtgag cggcccacag ggcgagtgtg agcgcgagag gcgggaggaa 180
cagtttagta ccacattgcc cagctaactc gaacgcgacc aacttataaa cccgcgcgct 240
gtcgcttgtg taatttctac taagtgtaga tagagacctc ggtctccttt ttttaagctt 300
<210> 4
<211> 437
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
aagcttggat catgaaccaa cggcctggct gtatttggtg gttgtgtagg gagatgggga 60
gaagaaaagc ccgattctct tcgctgtgat gggctggatg catgcggggg agcgggaggc 120
ccaagtacgt gcacggtgag cggcccacag ggcgagtgtg agcgcgagag gcgggaggaa 180
cagtttagta ccacattgcc cagctaactc gaacgcgacc aacttataaa cccgcgcgct 240
gtcgcttgtg tgtaatttct actgttgtag atcattcccc atcccgttct ttggctaatt 300
tctactgttg tagatgaagg acagttaggc agcctgggta atttctactg ttgtagatgc 360
aagagcgcct catccacgct ttaatttcta ctgttgtaga tcctcgacgt caaccacctg 420
accgtttttt taagctt 437
<210> 5
<211> 442
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
aagcttggat catgaaccaa cggcctggct gtatttggtg gttgtgtagg gagatgggga 60
gaagaaaagc ccgattctct tcgctgtgat gggctggatg catgcggggg agcgggaggc 120
ccaagtacgt gcacggtgag cggcccacag ggcgagtgtg agcgcgagag gcgggaggaa 180
cagtttagta ccacattgcc cagctaactc gaacgcgacc aacttataaa cccgcgcgct 240
gtcgcttgtg tgtaatttct actaagtgta gatatctcct tctagaagca caagcgtaat 300
ttctactaag tgtagatgtg ccggaacaga gactacatca taatttctac taagtgtaga 360
tctcggtgag tacaagtcta aaagtaattt ctactaagtg tagattgcgg tgagtgagta 420
cgtactttct ttttttaagc tt 442
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
tttcctgttg agaaggatgc gaaagag 27
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
tttccaccag cagcagtcac ggctgc 26
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
tttcatctcc ttctagaagc acaagcg 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
tttaagcagg tcgtcgacga gatcatc 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
ttttgcggga caacttccta ctcatag 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 11
tttgctcctg cagaggaatg ggttgga 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 12
tttcctgttg agaaggatgc gaaagag 27
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 13
tttccaccag cagcagtcac ggctgc 26
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 14
tttcatctcc ttctagaagc acaagcg 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 15
tttaagcagg tcgtcgacga gatcatc 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 16
ttttgcggga caacttccta ctcatag 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
tttgctcctg cagaggaatg ggttgga 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
tttcctgttg agaaggatgc gaaagag 27
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
tttccaccag cagcagtcac ggctgc 26
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
tttcatctcc ttctagaagc acaagcg 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
tttaagcagg tcgtcgacga gatcatc 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
ttttgcggga caacttccta ctcatag 27
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
tttgctcctg cagaggaatg ggttgga 27
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
tttccattcc ccatcccgtt ctttggc 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
tttggaagga cagttaggca gcctggg 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
tttcgcaaga gcgcctcatc cacgctt 27
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
tttacctcga cgtcaaccac ctgaccg 27
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
tttgctcggt gagtacaagt ctaaaag 27
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
tttcatctcc ttctagaagc acaagcg 27
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
tttgtgcggt gagtgagtac gtactttc 28
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 31
tttggtgccg gaacagagac tacatca 27
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 32
ttttcgcgat cttctccgcc acgaac 26
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 33
tttcgccttg tccatcaagc tcgacat 27
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 34
ttcgccttgt ccaccagctg cgccat 26
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 35
ttcgtcggag aaccccacgg tgacgga 27
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 36
ttggcaccgc tcaccatgtc ctgcacct 28
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 37
ttcaccgcgc tcaccttgtc cttcacct 28
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 38
ttggtcgact gcatcgcgtt cttcccg 27
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 39
ttgtggacgc cggccttggc ggaggat 27
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 40
ttttcgcgat cttctccgcc acgaac 26
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 41
tttcgccttg tccatcaagc tcgacat 27
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 42
ttcgccttgt ccaccagctg cgccat 26
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 43
ttcgtcggag aaccccacgg tgacgga 27
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 44
ttggcaccgc tcaccatgtc ctgcacct 28
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 45
ttcaccgcgc tcaccttgtc cttcacct 28
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 46
ttggtcgact gcatcgcgtt cttcccg 27
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 47
ttgtggacgc cggccttggc ggaggat 27
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 48
tttgctcctg cagaggaatg ggttgga 27
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 49
tttgctcctg cagaggaatg ggttgga 27
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 50
ctgatgagtc cgtgaggacg aaacgagtaa gctcgtc 37
<210> 51
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 51
ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 60
aatgggac 68

Claims (37)

1.一种用于植物基因组定点编辑的核酸构建物，其特征在于，所述的核酸构建物包括第一表达盒和第二表达盒；
其中，所述的第一表达盒为Cpf1-NLS融合蛋白表达盒，其中所述的Cpf1-NLS融合蛋白具有式I结构：
P1-A-B1-C-B2-D-B3-E1 (I)
式中，
P1为第一启动子；
A为无、信号肽、和/或蛋白标签序列；
B1为无或核定位信号序列NLS；
B2为无或核定位信号序列NLS；
B3为无或核定位信号序列NLS；
附加条件是，B1、B2和B3中至多一个为无；或者B1和B3为无，而B2为核定位信号序列NLS；
C为Cpf1的N端片段元件；
D为Cpf1的C端片段元件；
E1为第一终止子；
其中，所述的N端片段元件和C端片段元件共同构成一个完整的Cpf1蛋白；
以及，所述的第二表达盒为crRNA表达盒，在所述的crRNA表达盒含有对应于成熟型crRNA的编码序列；
所述Cpf1选自下组：FnCpf1 、LbCpf1；
并且所述的第二表达盒具有式II结构crRNA表达盒：
P2-(R-S)q-T (II)
式中，
P2为第二启动子；
各R独立地为对应于成熟型直接重复序列(direct repeat, DR)
各S独立地为目标位点引导序列sg；
q为2-10；
T为无或终止序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的表达载体上。
3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。
4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述核定位信号序列NLS选自或来自下组：SV40、KRP2、MDM2、CDc25C、DPP9、MTA1、CBP80、AreA、M9、Rev、hTAP、MyRF、EBNA-6、TERT、Tfam、或其组合。
5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的C对应于Cpf1蛋白的第1位至第n位的氨基酸序列，其中n为691-718或615-633的正整数。
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，n为692-717(FnCpf1)或616-632(LbCpf1)中任一正整数。
7.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，n为709(FnCpf1)或627(LbCpf1)。
8.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述的D对应于Cpf1蛋白的第n+1位至第m位的序列，其中n如上定义，m为全长Cpf1的最后一个氨基酸的位置编号。
9.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述B2位于Cpf1多肽的非保守区。
10.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述终止序列选自下组：polyT、NOS、polyA或其组合。
11.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第二表达盒为具有式III或IV结构crRNA表达盒：
P2-R-S-R-T (III)
P2-(R-S)q-R-T （IV）。
12.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，各S为sg序列。
13.如权利要求12所述的核酸构建物，其特征在于，所述的sg序列的长度为17-35nt。
14.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第一启动子为Pol II类型的启动子。
15.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第一启动子选自下组：Ubi、Actin、CmYLCV、UBQ、35S、SPL、组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS、诱导型启动子XEV或其组合。
16.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第二启动子为Pol II类型或PolIII类型的启动子。
17.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第二启动子选自下组：OsU3、OsU6a、OsU6b、OsU6c、AtU6-1、AtU3b、AtU3d、AtU6-29、Actin、35S、Ubi、UBQ、SPL、CmYLCV和组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS、诱导型启动子XEV或其组合。
18.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第二表达盒为具有式IV结构crRNA表达盒：
P2-(R-S)q-R-T （IV）
式中，
P2为2×35S、Actin、Ubi或CmYLCV。
19.一种载体或载体组合，其特征在于，所述的载体或载体组合含有权利要求1所述的核酸构建物。
20.如权利要求19所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的核酸构建物包括第一表达盒和第二表达盒。
21.如权利要求20所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。
22.如权利要求20所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上，并且在所述第一表达盒和第二表达盒的侧翼(即左侧和右侧)设有LB序列和RB序列。
23.如权利要求20所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的第一表达载体和第二表达载体。
24.如权利要求20所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒分别位于不同的第一表达载体和第二表达载体时，则在所述第一表达载体中在所述第一表达盒的侧翼设有LB序列和RB序列，以及在所述第二表达载体中在所述第二表达盒的侧翼设有LB序列和RB序列。
25.如权利要求19所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的载体组合还包括携带供体DNA表达盒的辅助载体。
26.如权利要求19所述的载体或载体组合，其特征在于，所述的载体至少还包括携带供体DNA表达盒。
27.一种试剂组合，其特征在于，包括：
(i)权利要求19所述的载体或载体组合。
28.如权利要求27所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合还包括供体DNA。
29.一种对植物进行基因编辑的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将(a)权利要求19所述的载体或载体组合以及(b)任选的供体核酸片段，导入植物细胞、植物组织或植物，从而在所述植物细胞、植物组织或植物中产生基因编辑；和
(ii)任选地，对发生所述基因编辑的植物细胞或植物进行检测、筛选或鉴定；
所述植物为水稻。
30.如权利要求29所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述的方法还包括：
(iii) 对步骤(ii)中经鉴定发生了所述基因编辑的植物细胞、植物组织或植物进行再生或培养。
31.如权利要求29所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述的基因编辑包括基因敲除、定点插入、基因置换、或其组合。
32.如权利要求31所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述的定点插入包括基于同源重组或非同源重组末端连接的定点插入。
33.如权利要求29所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述的基因编辑包括多位点的基因编辑。
34.如权利要求33所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述的多位点包括同一基因上不同位点，同一基因家族不同基因上的位点，同一信号通路上不同基因上的位点。
35.如权利要求29所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述导入为通过农杆菌导入。
36.如权利要求29所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述导入为通过基因枪导入。
37.如权利要求29所述的基因编辑的方法，其特征在于，所述导入为通过显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法导入。
CN201711249583.1A 2016-12-01 2017-12-01 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法 Active CN108130342B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2016110916494 2016-12-01
CN201611091649 2016-12-01
CN201710061568 2017-01-26
CN2017100615688 2017-01-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108130342A CN108130342A (zh) 2018-06-08
CN108130342B true CN108130342B (zh) 2022-01-11

Family

ID=62242331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711249583.1A Active CN108130342B (zh) 2016-12-01 2017-12-01 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN108130342B (zh)
WO (1) WO2018099475A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111836894B (zh) * 2017-11-21 2023-11-10 基恩科雷有限责任公司 用于使用CRISPR/Cpf1系统进行基因组编辑的组合物及其用途
GB201809709D0 (en) 2018-06-13 2018-08-01 Stichting Wageningen Res Polynucleotide constructs and methods of gene editing using CPF1
CN108841862A (zh) * 2018-07-19 2018-11-20 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种含有ha蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法
CN110129366B (zh) * 2019-05-24 2020-09-01 青岛农业大学 一种载体组合及其应用
CA3142425A1 (en) * 2019-06-01 2020-12-10 Sivec Biotechnologies, Llc A bacterial platform for delivery of gene-editing systems to eukaryotic cells
CN112280799B (zh) * 2020-10-22 2023-02-17 中国热带农业科学院橡胶研究所 利用CRISPR/Cas9系统对橡胶草或蒲公英基因定点突变的方法
CN112760338B (zh) * 2020-12-28 2022-04-26 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种适用于深海真菌FS140的CRISPR/Cpf1载体及其构建方法和应用
CN113151346B (zh) * 2021-02-09 2022-11-08 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/Cas9系统介导的小麦多基因敲除编辑体系
CN113717962A (zh) * 2021-09-10 2021-11-30 武汉艾迪晶生物科技有限公司 用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白及其表达盒子和表达载体
CN113846075A (zh) * 2021-11-29 2021-12-28 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 Mad7-nls融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用
CN115820691B (zh) * 2022-07-25 2023-08-22 安徽农业大学 一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3009511A2 (en) * 2015-06-18 2016-04-20 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017106657A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
CN107012164B (zh) * 2017-01-11 2023-03-03 电子科技大学 CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3009511A2 (en) * 2015-06-18 2016-04-20 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System;Zetsche B等;《Cell》;20151022;第163卷(第3期);第517-521页 *
Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes using Cpf1 from Francisella novicida;Endo A等;《SCIENTIFIC REPORTS》;20161201;第6卷;第38169号 *
Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1 system;Xu R等;《Plant Biotechnol J》;20161122;第15卷(第6期);第713-717页 *
Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array;Zetsche B等;《NATURE BIOTECHNOLOGY》;20161205;第35卷(第1期);第31-34页 *
Multiplex Gene Editing in Rice Using the CRISPR-Cpf1 System;Wang MG等;《MOLECULAR PLANT》;20170705;第10卷(第7期);第1011-1013页 *
The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA;Fonfara I等;《NATURE》;20160428;第532卷(第7600期);第759-771页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108130342A (zh) 2018-06-08
WO2018099475A1 (zh) 2018-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108130342B (zh) 基于Cpf1的植物基因组定点编辑方法
US11584936B2 (en) Targeted viral-mediated plant genome editing using CRISPR /Cas9
WO2019207274A1 (en) Gene replacement in plants
US20240110197A1 (en) Expression modulating elements and use thereof
US20160264982A1 (en) Method for plant genome site-directed modification
KR20200078685A (ko) 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법
WO2019153902A1 (zh) 植物基因组定点替换的方法
US11578334B2 (en) Targeted endonuclease activity of the RNA-guided endonuclease CasX in eukaryotes
AU2004284374A1 (en) DNA cloning vector plasmids and methods for their use
CN110891965A (zh) 植物中使用的抗crispr蛋白的方法和组合物
US20210348179A1 (en) Compositions and methods for regulating gene expression for targeted mutagenesis
CN110396523B (zh) 一种重复片段介导的植物定点重组方法
WO2021185358A1 (zh) 一种提高植物遗传转化和基因编辑效率的方法
WO2023092731A1 (zh) Mad7-nls融合蛋白、用于植物基因组定点编辑的核酸构建物及其应用
WO2021123397A1 (en) IMPROVING EFFICIENCY OF BASE EDITING USING TypeV CRISPR ENZYMES
EP1428885A1 (en) Method of modifying genome in higher plant
WO2018082611A1 (zh) 在植物细胞内表达外源基因的核酸构建物及其应用
JP7288915B2 (ja) 植物のゲノム編集に用いられるｄｎａ構築物
CA3190625A1 (en) Increasing gene editing and site-directed integration events utilizing meiotic and germline promoters
JP7452884B2 (ja) Ｄｎａが編集された植物細胞を製造する方法、及びそれに用いるためのキット
KR100985971B1 (ko) 선발표지 유전자 제거용 형질전환 벡터
CN113891938A (zh) 使用增强的靶向编辑技术的定向基因组工程
CN116829707A (zh) 提高定点整合频率的方法
CA2741918A1 (en) T-dna/protein nano-complexes for plant transformation
JPWO2008059711A1 (ja) 高等植物のプロモーター活性の解析用ベクター及びその利用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20200508

Address after: 200031 building 4, No. 300 Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai

Applicant after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No.

Applicant before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant