CN113717962A

CN113717962A - 用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白及其表达盒子和表达载体

Info

Publication number: CN113717962A
Application number: CN202111062804.0A
Authority: CN
Inventors: 王高华; 段芳; 谢先荣; 刘伟智
Original assignee: Wuhan Aidijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aidijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明公开了一种用于水稻基因编辑的CasΦ‑2蛋白及其表达盒子和表达载体，CasΦ‑2蛋白的N端增加1个核定位信号肽氨基酸序列，在C端增加3个核定位信号肽氨基酸序列。CasΦ‑2蛋白的CrRNA表达盒子包括基因编辑靶点、启动子和CasΦ‑2蛋白的CrRNA，CrRNA的核苷酸序列两端分别连接有1个tRNA序列；表达载体含有上述表达盒子和CasΦ‑2蛋白的核苷酸序列。上述表达载体能够有效实现水稻基因的敲除编辑。

Description

用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白及其表达盒子和表达载体

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域领域，特别是用于水稻基因编辑的CasΦ-2 蛋白及其表达盒子和表达载体。

背景技术

CasΦ(Cas12j)是V型CRISPR-Cas蛋白进化而来，一个在噬菌体进化枝中编码的Cas蛋白家族，包含一个C端RuvC结构域，与TnpB核酸酶超家族的结构域具有远源同源性，CasΦ的单个RuvC活性位点能够进行crRNA加工和DNA 切割。然而，CasΦ与其他V型CRISPR-Cas蛋白<7％的氨基酸同源性，并且与不同于V型(Cas14)蛋白的TnpB组最密切相关。

CasΦ的分子量异常小，约为70到80kDa，大约是Cas9和Cas12a大小的一半。CasΦ的分子量小，以及PAM位点覆盖广泛的特点，该蛋白的PAM序列为“TTN”可以扩展其在真核生物基因组上的编辑范围，扩展了适用不同真核生物的基因编辑的可操作性和可选择性，对于基于载体的细胞递送和更广泛的可靶向基因组序列都特别有利，因此它将为CRISPR-Cas工具箱提供强大的补充。

CasΦ-2来源于噬菌体中的CasΦ直系同源物之一。其PAM位点也是富含T/A 区域“TTN”。CasΦ-2核酸酶的剪切方式和Cas12a的很相似，二者PAM位点都是富含T/A区域，像LbCpf1和AsCpf1的PAM位点都是识别“TTTN”，CasΦ-2 的PAM位点识别“TTN”和FnCpf1的类似；另外像LbCpf1的剪切位置在远离PAM 位点的19-24bp处剪切处4或5碱基的粘性末端，而CasΦ-2也是在远离PAM位点处剪切，剪切位置在12-18bp处；再者二者产生的突变类型都是以5bp以上的多碱基缺失为主；二者都是只含有CrRNA，不需要tracrRNA。二者的区别在于靶点的有效长度不同，蛋白的大小不同，以及识别的CrRNA不同。

已有的研究表明在拟南芥原生质体中CasΦ-2核酸酶突变类型主要造成基因组中8到10bp的缺失。

现有技术中，例如中国专利申请CN109306358A提供了利用CRISPR/Cas9 技术创制不包颈水稻两系不育系的方法，该方法根据水稻中EUI基因编码序列设计靶标序列，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9-EUI-gRNA重组载体；通过农杆菌转化水稻愈伤组织获得转基因苗；转基因苗经阳性筛选、测序分析、转基因元件检测，得到不含转基因成分的功能缺失突变体。

又例如中国专利申请CN106676130A提供的利用CRISPR-CAS9技术对水稻 BADH2基因定点突变的方法，针对水稻BADH2基因设计基于CRISPR/Cas9的 sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas 的载体中，转化水稻，实现对水稻BADH2基因的定点突变。其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过CRISPR/CAS9技术对水稻内源基因BADH2进行编辑，获得了BADH2突变体，在创制香米种质资源上更为便捷高效。

又例如文献《CRISPR-CasΦfrom huge phages is a hypercompact genomeeditor》 (Patrick Pansch et al.)中公开了CRISPR-CasΦ系统，CasΦ使用单一活性位点进行CRISPR RNA(crRNA)处理和crRNA引导的DNA切割靶向外源核酸，能够在拟南芥原生质体中CasΦ-2核酸酶突变类型主要造成基因组中8到10bp的缺失。但是，对于CasΦ-2核酸酶在水稻基因编辑中是否能够成功应用，尚未提供相应的技术依据。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白及其表达盒子和表达载体，通过探索CasΦ-2核酸酶在水稻基因编辑中的应用效果，拓宽了基因编辑的范围；具体通过以下技术实现。

一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白，在所述CasΦ-2蛋白的氨基酸序列的N端增加1个核定位信号肽氨基酸序列，在C端增加3个核定位信号肽氨基酸序列。

CasΦ-2蛋白的切割DNA位置在靶点的12-18bp处，产生的突变多为碱基删除突变，可以有效避免Cas9的插入碱基和缺失突变范围小的缺点，可以根据实验目的达到小范围片段删除的需求。CasΦ-2蛋白的切割DNA的方式虽然与Cpf1 核酸酶类似，但CasΦ-2的靶点序列比较短(18-20bp)，而Cpf1的靶点比较长，这点二者之间存在明显差别。

本发明提供的上述CasΦ-2蛋白在传统的核苷酸(或氨基酸)序列的基础上，根据水稻密码子的偏好，对其序列进行了优化，在N端增加1个核定位序列，在C端增加了3个核定位序列。通过上述优化，实现了CasΦ-2蛋白对水稻基因的编辑。

优选地，上述CasΦ-2蛋白，在所述CasΦ-2蛋白的氨基酸序列的N端增加的核定位信号肽氨基酸序列为SV40核定位信号肽氨基酸序列，在C端增加的3 个核定位信号肽氨基酸序列依次为2个SV40核定位信号肽氨基酸序列和1个 NLS核定位信号肽氨基酸序列。

优选地，上述CasΦ-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CasΦ-2 蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白表达载体，在空白载体上含有上述任意一种CasΦ-2蛋白的核苷酸序列。这种CasΦ-2蛋白表达载体，能够通过与CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子一起组装，获得相应的CasΦ-2蛋白的完整表达载体。

优选地，上述CasΦ-2蛋白表达载体中，所用的所述空白载体为 pCAMBIA1300载体，转录CasΦ-2蛋白的核苷酸使用玉米UBI启动子和NOS 终止子；所述玉米UBI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为一种优选方式，上述CasΦ-2蛋白表达载体，可以使用玉米UBI启动子 (核苷酸序列如SEQ NO.4所示)，转录上述CasΦ-2蛋白的核苷酸序列，并使用NOS终止子(核苷酸序列如SEQ NO.5所示)，最终克隆到空白载体上构成。

本发明还提供了一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子，包括CrRNA表达盒空载和针对相应的水稻基因设计的基因编辑靶点；

所述CrRNA表达盒空载包括上述CasΦ-2蛋白的CrRNA，还包括针对转录相应的水稻基因编辑靶点的启动子，并且所述CrRNA的核苷酸序列的两端分别设有1个tRNA序列。

上述CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子是针对某个特定的水稻基因先设计基因编辑靶点序列，将转录基因编辑靶点的启动子、CrRNA、tRNA组装成CrRNA 表达盒空载，再将基因编辑靶点、CrRNA表达盒空载组装连接在一起后构成。基因编辑靶点可以根据选取的水稻基因片段针对性地进行设计。CasΦ-2蛋白的 CrRNA在两端各加一个tRNA序列，目的是提高CrRNA在水稻细胞内的产生效率；另外，可以选用水稻OsU6a启动子转录上述CasΦ-2的CrRNA。

优选地，上述CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子中，针对的水稻基因为OsBEL 基因，所述基因编辑靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，启动所述水稻基因OsBEL的靶点的OsU6a启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述 CasΦ-2蛋白的CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述tRNA序列的核苷序列如SEQ ID NO.8所示；所述CrRNA表达盒空载的核苷序列如SEQ ID NO.9 所示；

组装所述的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子所用的引物为：

BEL-F：ggacCATCTCCTTCTAGAAGCACA；

BEL-R：tgttTGTGCTTCTAGAAGGAGATG；

组装的具体方式为：取引物1μl BEL-F、1μl BEL-R、8μl无菌水，(放入EP 管中)，在PCR扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到BEL引物混合液；再取1μl BEL引物混合液，与30ng CrRNA表达盒空载、1μl 10×CutSmart Buffer、35U T4 DNA连接酶、10U Bsal限制性内切酶和无菌水组成10μl混合体系，37℃培养1h，制得所述CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL。

上述表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL的验证方式为：将产物混合液转化进入大肠杆菌感受肽细胞中，然后再经过菌检，测序确认后即可。

本发明还提供了一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白完整表达载体，所述 CasΦ-2蛋白完整表达载体上连接有权利要求4或5所述的CasΦ-2蛋白表达载体，还连接有权利要求6或7所述的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子。

优选地，上述CasΦ-2蛋白完整表达载体，是先使用引物Pps-R和Pgs-L对 CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子进行扩增，再用BsaI和T4 DNA连接酶与所述 CasΦ-2蛋白表达载体组装连接后构成；

所述引物Pps-R和Pgs-L为：

Pps-R：TAGAggtctcTaccgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG；

Pgs-L：AGTGggtctcGctcgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC。

采用上述方式制备得到的CasΦ-2蛋白完整表达载体，可以借助于工程化的农杆菌EHA105转化到水稻愈伤组织中表达。

优选地，CasΦ-2蛋白完整表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白，并基于该CasΦ-2蛋白获得了一种CasΦ-2蛋白表达载体和CrRNA表达盒子，以及组装CasΦ-2蛋白表达载体和CrRNA表达盒子后获得的 CasΦ-2蛋白的完整表达载体，将该完整表达载体转化EHA105农杆菌后侵染水稻愈伤组织，能够实现上述完整表达载体在水稻愈伤组织中的表达，实现水稻基因的敲除编辑。

附图说明

图1为实施例的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL载体的结构；

图2为实施例的CasΦ-2蛋白表达载体的结构；

图3为实施例的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒空载的结构示意图；

图4为实施例的CasΦ-2蛋白的不含靶点的表达载体pEGCasΦ-2Pubi-H- OsU6a-CrRNA的结构示意图；

图5为实施例的CasΦ-2蛋白的完整表达载体pEGCasΦ-2Pubi-H-OsU6a -CrRNA-BEL的结构示意图；

图6为实施例的BEL-11和BEL-31扩增条带电泳示意图；

图7为实施例的BEL-11样本测序分析结果示意图；

图8为实施例的BEL-31样本测序分析结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例选取水稻的OsBEL基因(LOC_Os03g55240)为研究对象进行试验，具体试验步骤如下：

1、设计OsBEL基因编辑靶点：TTTCATCTCCTTCTAGAAGCACA，PAM 位点为TTT，如SEQID NO.5所示。

2、靶点组装，获得CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子

将上述OsBEL基因编辑靶点、OsU6a启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示)、CrRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)进行组装；

OsBEL基因编辑靶点组装所用的引物如下：

BEL-F：ggacCATCTCCTTCTAGAAGCACA；

BEL-R：tgttTGTGCTTCTAGAAGGAGATG；

组装的具体方式为：取引物1μl BEL-F、1μl BEL-R、8μl无菌水，(放入EP 管中)，在PCR扩增仪上，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到BEL引物混合液；再取1μl BEL引物混合液，与30ng CrRNA表达盒空载、1μl 10×CutSmart Buffer、35U T4 DNA连接酶、10U Bsal限制性内切酶和无菌水组成10μl混合体系，37℃培养1h；

连接完成的混合液转化进入大肠杆菌感受肽细胞中，经过菌检，测序确认，最终组成所述CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL。

上述CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL是由CrRNA表达盒空载和水稻基因OsBEL的基因编辑靶点组成；CrRNA表达盒空载上包括 CasΦ-2蛋白的CrRNA，还包括转录水稻基因OsBEL靶点的OsU6a启动子，并且所述CrRNA的核苷酸序列的两端分别设有1个tRNA序列，如附图3所示；表达盒子的具体结构示意图如图1所示，图1中，CrRNA的两段分别设有1个 tRNA序列，T位置用于组装连接靶点序列BEL；

所述tRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；CrRNA表达盒空载的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

3、构建CasΦ-2蛋白表达载体

选用空白载体pCAMBIA1300，使用玉米UBI启动子(如SEQ ID NO.3所示)转录CasΦ-2蛋白的核苷酸序列，使用NOS终止子(如SEQ ID NO.4所示)，并克隆到pCAMBIA1300上构建成CasΦ-2水稻表达载体；在空白载体上组装 CasΦ-2蛋白的核苷酸序列，获得用于水稻基因OsBEL基因编辑的CasΦ-2蛋白表达载体；CasΦ-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸中含有终止子TAG；表达载体的具体结构示意图如图2所示，图2中在CasΦ-2蛋白的核苷酸序列的左侧(N端)有1个SV40核定位信号肽的核苷酸序列，右侧(C端)有2个SV40核定位信号肽的核苷酸序列和1个 NLS核定位信号肽的核苷酸序列；

CasΦ-2蛋白表达载体的组装方式具体为：

(1)改造pCAMBIA1300载体

CCDB-F：GctatgaccatgattacgaattcCTCGAGAGACCTCTGAAGTG

CCDB-R：AcgacggccagtgccaagcttACCGCGAGACCCACGCTCACC

先把pCAMBIA1300载体使用EcoRI/HindIII双酶切；

酶切体系为：2μg pCAMBIA1300载体、1μl EcoRI限制性内切酶、1μl HindIII 限制性内切酶、5μl 10×FastDigest Green Buffer，加无菌水至50μl，然后在37℃培养箱中反应1小时，使用胶回收试剂盒回收酶切后的pCAMBIA1300载体；

使用引物CCDB-F和CCDB-R，扩增含有BsaI酶切位点的ccdB结构，扩增体系如下：

PCR反应参数：

然后使用胶回收试剂盒回收扩增的CCDB片段；

(2)pEG-ccdB中间载体的构建

使用Gibson assembly的方式构建pEG-ccdB空载；

反应体系为：5μl Gibson assembly mix、50ng酶切后的pCAMBIA1300载体、 50ngCCDB回收片段，加水至10μl，在PCR仪器上反应30min，然后把反应液转化进入DB3.1大肠杆菌感受肽细胞中，然后再经过菌检，测序确认，最终组成所述pEG-ccdB中间载体；

(3)CasΦ-2表达载体空载体的构建

UBI-F：AGTGggtctcGctcgCGGCCATGCGGCCGCAAGCTGGGT

UBI-R：TAGAggtctcTGGTGGCTGCAGAAGTAACACCAAACAACA

CasF2-F：AGTGggtctcGCACCATGCCGAAGAAGAAGCGCAAGGTGTCC CasF2-R:TAGAggtctcTTCACCGCTACTTCTTTTTCTTAGCCTGTCCGGCC TTTTTGG

NOS-F：AGTGggtctcGGTGATCCTCCCGATCGTTCAAACA

NOS-R：TAGAggtctcTaccgGGCGCGCCTGCTCCCGATCTAGTAAC

使用上述三对引物，分别扩增UBI启动子片段和NOS序列，上述两个序列的模板为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(来自于华南农业大学刘耀光院士实验室赠送)，以及CasΦ-2序列模板是按照SEQ ID NO.2全基因合成而来；扩增体系和反应条件参照上述步骤(1)；

使用胶回收试剂盒回收上述3个片段，用Golden Gate的方式进行酶切连接：酶连体系100ng UBI片段、20ng NOS片段、100ng CasΦ-2片段、50ng pEG-ccdB、 1μl 10×CutSmart Buffer、35U的T4 DNA连接酶、10U的BsaI限制性内切酶、无菌水组成混合体系10μl，在37℃培养箱中反应1h，连接完成的混合液转化进入DH5α大肠杆菌感受肽细胞中，然后再经过菌检，测序确认，最终组成所述的 CasΦ-2蛋白表达载体。

4、构建用于水稻基因OsBEL编辑的CasΦ-2蛋白完整表达载体 pEGCasΦ-2Pubi-H-OsU6a-CrRNA-BEL

组装CasΦ-2蛋白完整表达载体的引物如下：

Pps-R：TAGAggtctcTaccgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG；

Pgs-L：AGTGggtctcGctcgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC；

先使用上述引物Pps-R和Pgs-L，对CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子 OsU6a-CrRNA-BEL进行PCR扩增，CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒扩增体系如下：

PCR反应参数：

再使用BsaI和T4 DNA连接酶，将CrRNA表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL与所述CasΦ-2蛋白表达载体，用Golden Gate的方式进行组装连接，构建得到完整的CasΦ-2蛋白完整表达载体pEGCasΦ-2Pubi-H-OsU6a-CrRNA-BEL，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，图4中的T位置即CasΦ-2蛋白完整表达载体中BEL 靶点组装的位置，图5即完成BEL靶点组装的CasΦ-2蛋白完整表达载体的示意图。

5、CasΦ-2蛋白完整表达载体pEGCasΦ-2Pubi-H-OsU6a-CrRNA-BEL的遗传转化

把构建得到的完整表达载体pEGCasΦ-2Pubi-H-OsU6a-CrRNA-BEL，转化 EHA105农杆菌后侵染水稻愈伤组织，经过潮霉素B抗生素2次筛选水稻愈伤组织，分化和生根成完整水稻幼苗，进行分子水平检测鉴定。

6、水稻基因OsBEL的突变类型的检测

(1)设计检测引物(扩增条带544bp)

BEL(det+)：GGAGTGAGTAGAAGTAATCGCC

BEL(det-)：AGGTCACGTCGTGCTCGGTGAA

(2)PCR扩增条件

使用上述BEL(det+)、BEL(det-)这对引物进行PCR扩增，扩增体系如下：

PCR反应参数如下：

使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，。从附图6可以看到， BEL-11和BEL-31样本为右侧两道明亮的条带，约在544bp附近。

(3)对PCR产物sanger测序分析

把上述81个样本的PCR产物送去进行sanger测序，测序结果使用DSDecode 软件分析结果，其中有2个样本被编辑结果如附图7、8所示。从附图7、8可以看到，本发明实验总共测序样品81个，其中只有BEL-11和BEL-31两个样品被编辑，编辑效率2.5％，经过DSDecode软件解码分析BEL-11和BEL-31样品的 Sanger测序数据显示，BEL-11样品缺失11个碱基，BEL-31样品缺失18个碱基。由此证明了，采用上述方法获得的CasΦ-2蛋白的完整表达载体pEGCasΦ-2Pubi-H-OsU6a-CrRNA-BEL能够对水稻基因OsBEL起到基因敲除编辑的作用。

序列表

<110> 武汉艾迪晶生物科技有限公司

<120> 用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白及其表达盒子和表达载体

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Gly Gly Ser Pro Lys Pro Ala

1 5 10 15

Val Glu Ser Glu Phe Ser Lys Val Leu Lys Lys His Phe Pro Gly Glu

20 25 30

Arg Phe Arg Ser Ser Tyr Met Lys Arg Gly Gly Lys Ile Leu Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Glu Glu Ala Val Val Ala Tyr Leu Gln Gly Lys Ser Glu Glu

50 55 60

Glu Pro Pro Asn Phe Gln Pro Pro Ala Lys Cys His Val Val Thr Lys

65 70 75 80

Ser Arg Asp Phe Ala Glu Trp Pro Ile Met Lys Ala Ser Glu Ala Ile

85 90 95

Gln Arg Tyr Ile Tyr Ala Leu Ser Thr Thr Glu Arg Ala Ala Cys Lys

100 105 110

Pro Gly Lys Ser Ser Glu Ser His Ala Ala Trp Phe Ala Ala Thr Gly

115 120 125

Val Ser Asn His Gly Tyr Ser His Val Gln Gly Leu Asn Leu Ile Phe

130 135 140

Asp His Thr Leu Gly Arg Tyr Asp Gly Val Leu Lys Lys Val Gln Leu

145 150 155 160

Arg Asn Glu Lys Ala Arg Ala Arg Leu Glu Ser Ile Asn Ala Ser Arg

165 170 175

Ala Asp Glu Gly Leu Pro Glu Ile Lys Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala

180 185 190

Thr Asn Glu Thr Gly His Leu Leu Gln Pro Pro Gly Ile Asn Pro Ser

195 200 205

Phe Tyr Val Tyr Gln Thr Ile Ser Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Arg Asp

210 215 220

Glu Ile Val Leu Pro Pro Glu Tyr Ala Gly Tyr Val Arg Asp Pro Asn

225 230 235 240

Ala Pro Ile Pro Leu Gly Val Val Arg Asn Arg Cys Asp Ile Gln Lys

245 250 255

Gly Cys Pro Gly Tyr Ile Pro Glu Trp Gln Arg Glu Ala Gly Thr Ala

260 265 270

Ile Ser Pro Lys Thr Gly Lys Ala Val Thr Val Pro Gly Leu Ser Pro

275 280 285

Lys Lys Asn Lys Arg Met Arg Arg Tyr Trp Arg Ser Glu Lys Glu Lys

290 295 300

Ala Gln Asp Ala Leu Leu Val Thr Val Arg Ile Gly Thr Asp Trp Val

305 310 315 320

Val Ile Asp Val Arg Gly Leu Leu Arg Asn Ala Arg Trp Arg Thr Ile

325 330 335

Ala Pro Lys Asp Ile Ser Leu Asn Ala Leu Leu Asp Leu Phe Thr Gly

340 345 350

Asp Pro Val Ile Asp Val Arg Arg Asn Ile Val Thr Phe Thr Tyr Thr

355 360 365

Leu Asp Ala Cys Gly Thr Tyr Ala Arg Lys Trp Thr Leu Lys Gly Lys

370 375 380

Gln Thr Lys Ala Thr Leu Asp Lys Leu Thr Ala Thr Gln Thr Val Ala

385 390 395 400

Leu Val Ala Ile Asp Leu Gly Gln Thr Asn Pro Ile Ser Ala Gly Ile

405 410 415

Ser Arg Val Thr Gln Glu Asn Gly Ala Leu Gln Cys Glu Pro Leu Asp

420 425 430

Arg Phe Thr Leu Pro Asp Asp Leu Leu Lys Asp Ile Ser Ala Tyr Arg

435 440 445

Ile Ala Trp Asp Arg Asn Glu Glu Glu Leu Arg Ala Arg Ser Val Glu

450 455 460

Ala Leu Pro Glu Ala Gln Gln Ala Glu Val Arg Ala Leu Asp Gly Val

465 470 475 480

Ser Lys Glu Thr Ala Arg Thr Gln Leu Cys Ala Asp Phe Gly Leu Asp

485 490 495

Pro Lys Arg Leu Pro Trp Asp Lys Met Ser Ser Asn Thr Thr Phe Ile

500 505 510

Ser Glu Ala Leu Leu Ser Asn Ser Val Ser Arg Asp Gln Val Phe Phe

515 520 525

Thr Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ala Lys Lys Lys Ala Pro Val Glu Val

530 535 540

Met Arg Lys Asp Arg Thr Trp Ala Arg Ala Tyr Lys Pro Arg Leu Ser

545 550 555 560

Val Glu Ala Gln Lys Leu Lys Asn Glu Ala Leu Trp Ala Leu Lys Arg

565 570 575

Thr Ser Pro Glu Tyr Leu Lys Leu Ser Arg Arg Lys Glu Glu Leu Cys

580 585 590

Arg Arg Ser Ile Asn Tyr Val Ile Glu Lys Thr Arg Arg Arg Thr Gln

595 600 605

Cys Gln Ile Val Ile Pro Val Ile Glu Asp Leu Asn Val Arg Phe Phe

610 615 620

His Gly Ser Gly Lys Arg Leu Pro Gly Trp Asp Asn Phe Phe Thr Ala

625 630 635 640

Lys Lys Glu Asn Arg Trp Phe Ile Gln Gly Leu His Lys Ala Phe Ser

645 650 655

Asp Leu Arg Thr His Arg Ser Phe Tyr Val Phe Glu Val Arg Pro Glu

660 665 670

Arg Thr Ser Ile Thr Cys Pro Lys Cys Gly His Cys Glu Val Gly Asn

675 680 685

Arg Asp Gly Glu Ala Phe Gln Cys Leu Ser Cys Gly Lys Thr Cys Asn

690 695 700

Ala Asp Leu Asp Val Ala Thr His Asn Leu Thr Gln Val Ala Leu Thr

705 710 715 720

Gly Lys Thr Met Pro Lys Arg Glu Glu Pro Arg Asp Ala Gln Gly Thr

725 730 735

Ala Pro Ala Arg Lys Thr Lys Lys Ala Ser Lys Ser Lys Ala Pro Pro

740 745 750

Ala Glu Arg Glu Asp Gln Thr Pro Ala Gln Glu Pro Ser Gln Thr Ser

755 760 765

Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Gly Gly Ser Pro

770 775 780

Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Gly Gly Ser Lys Arg Pro Ala Ala Thr

785 790 795 800

Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

805 810

<210> 2

<211> 2433

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgccgaaga agaagcgcaa ggtgtccggc ggctccccga agccagccgt ggagagcgag 60

ttctccaagg tgctcaagaa gcacttccca ggcgagcgct tccgcagcag ctacatgaag 120

cgcggcggca agatcctcgc cgcccagggc gaggaggccg tggtcgccta cctccagggc 180

aagtccgagg aggagccgcc gaacttccag ccgccagcga agtgccacgt cgtgaccaag 240

tcccgcgact tcgccgagtg gccgatcatg aaggcgtccg aggcgatcca gcgctacatc 300

tacgccctca gcaccacaga gcgggccgcg tgcaagccgg gcaagtcctc tgagtcccac 360

gcggcctggt tcgccgccac cggcgtgagc aaccacggct actcccacgt gcagggcctc 420

aacctgatct tcgaccacac actcggcagg tacgatggcg tgctgaagaa ggtccagctt 480

aggaacgaga aggctagggc tcgcctggaa tcgattaacg cctcgcgggc tgatgagggt 540

cttcctgaaa ttaaggctga agaggaagag gtcgcaacca atgaaaccgg tcatcttttg 600

cagcctccgg gcataaaccc gtccttctac gtctaccaaa ctatatctcc tcaggcctat 660

agacctcgcg acgaaatagt cctcccccct gagtatgccg gttatgtgag ggacccgaat 720

gcccccattc cgttgggcgt cgtccgtaat cgttgcgaca tacaaaaggg ctgcccagga 780

tacatcccag agtggcagcg cgaagccgga acagcaataa gccccaagac cgggaaggcg 840

gttacggttc caggactttc tcctaagaag aataagcgca tgaggagata ttggcggtca 900

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<212> DNA

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ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 480

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ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc 6540

atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc 6600

acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc 6660

ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg 6720

aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc 6780

agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg 6840

accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac 6900

cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag gcggagatga 6960

tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa 7020

tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag 7080

aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg 7140

cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa 7200

ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct 7260

agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg 7320

cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga 7380

ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga 7440

cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct 7500

gattccggtg cagccaagcc cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt 7560

taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc 7620

gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc 7680

cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac 7740

aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc 7800

tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca 7860

aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc 7920

ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc 7980

aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct atctgaatac 8040

atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc 8100

taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat 8160

gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa 8220

tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca tccggcccgg 8280

tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg 8340

cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg 8400

atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc 8460

cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc 8520

gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag 8580

ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg 8640

ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg 8700

aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac 8760

acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc 8820

tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg 8880

ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga 8940

tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat cgagctagct gattggatgt 9000

accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc gattactttt 9060

tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg 9120

cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca 9180

agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt 9240

tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg 9300

agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa attgccctag 9360

caggggaaaa aggtcgaaaa gctgtctttc ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa 9420

agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc 9480

ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact 9540

ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg tctggccagc 9600

gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg 9660

ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag 9720

gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc 9780

aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 9840

ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 9900

gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc 9960

ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 10020

tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg 10080

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 10140

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 10200

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 10260

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 10320

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 10380

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 10440

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 10500

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 10560

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 10620

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 10680

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 10740

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 10800

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 10860

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc 10920

attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc tcccaatcag 10980

gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg atatcctccc 11040

tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg cttctcccaa 11100

gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct cccaggtcgc 11160

cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca tacagctcgc 11220

gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg gccagatcgt 11280

tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta tagggacaat 11340

ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg ataatctttt 11400

cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc tcactcatga 11460

gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca ggcagctttc 11520

cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc cctttatacc 11580

ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta tataccttag 11640

caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt tttttcaatt 11700

ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac agtatttaaa 11760

gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc ttgcattcta 11820

aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg cgtataacat 11880

agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc tctgtcatcg 11940

ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg cagcttagtt 12000

gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac aacggctctc 12060

ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc 12120

tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg 12180

acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa 12240

ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat 12300

tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat 12360

gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg 12420

gagaaactcg agcttgtcga tcgacagatc cggtcggcat ctactctatt tctttgccct 12480

cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact atcggcgagt acttctacac agccatcggt 12540

ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg tgtacgcccg acagtcccgg ctccggatcg 12600

gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca agctgcatca tcgaaattgc cgtcaaccaa 12660

gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg gagcatatac gcccggagtc gtggcgatcc 12720

tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta gcgcgtctgc tgctccatac aagccaacca 12780

cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc gtattgggaa tccccgaaca tcgcctcgct 12840

ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt gtccgtcagg acattgttgg agccgaaatc 12900

cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca gtcctcggcc caaagcatca gctcatcgag 12960

agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc gtccatcaca gtttgccagt gatacacatg 13020

gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg ccatgtagtg tattgaccga ttccttgcgg 13080

tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct aagatcggcc gcagcgatcg catccatagc 13140

ctccgcgacc ggttgtagaa cagcgggcag ttcggtttca ggcaggtctt gcaacgtgac 13200

accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt caggctctcg ctaaactccc caatgtcaag 13260

cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc aaagtgccga taaacataac gatctttgta 13320

gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag gacatatcca cgccctccta catcgaagct 13380

gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag ctgcatcagg tcggagacgc tgtcgaactt 13440

ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc ggtgagttca ggctttttca tatctcattg 13500

ccccccggga tctgcgaaag ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc 13560

agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaaggtctt gcgaaggata 13620

gtgggattgt gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga 13680

agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt 13740

gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca 13800

tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca 13860

atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg 13920

gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat 13980

gttatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat 14040

gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat 14100

agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct 14160

tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct 14220

ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga 14280

gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg 14340

cctctccccg cgcgttggcc gat 14363

Claims

1.一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白，其特征在于，在所述CasΦ-2蛋白的氨基酸序列的N端增加1个核定位信号肽氨基酸序列，在C端增加3个核定位信号肽氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白，其特征在于，在所述CasΦ-2蛋白的氨基酸序列的N端增加的核定位信号肽氨基酸序列为SV40核定位信号肽氨基酸序列，在C端增加的3个核定位信号肽氨基酸序列依次为2个SV40核定位信号肽氨基酸序列和1个NLS核定位信号肽氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白，其特征在于，所述CasΦ-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CasΦ-2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白表达载体，其特征在于，在空白载体上含有权利要求1-3任一项所述的CasΦ-2蛋白的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的CasΦ-2蛋白表达载体，其特征在于，所用的所述空白载体为pCAMBIA1300载体，转录CasΦ-2蛋白的核苷酸使用玉米UBI启动子和NOS终止子；

所述玉米UBI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子，其特征在于，包括CrRNA表达盒空载和针对相应的水稻基因设计的基因编辑靶点；

所述CrRNA表达盒空载包括权利要求1-3任一项所述的CasΦ-2蛋白的CrRNA，还包括针对转录相应的水稻基因编辑靶点的启动子，并且所述CrRNA的核苷酸序列的两端分别设有1个tRNA序列。

7.根据权利要求6所述的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子，其特征在于，所述水稻基因为OsBEL基因，所述基因编辑靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，启动所述水稻基因OsBEL靶点的OsU6a启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述CasΦ-2蛋白的CrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述tRNA序列的核苷序列如SEQ ID NO.8所示；所述CrRNA表达盒空载的核苷序列如SEQ ID NO.9所示；

组装所述的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子所用的引物为：

BEL-F：ggacCATCTCCTTCTAGAAGCACA；

BEL-R：tgttTGTGCTTCTAGAAGGAGATG；

组装的具体方式为：取引物1μl BEL-F、1μl BEL-R、8μl无菌水，先在95℃变性，再在55℃退火后，得到BEL引物混合液；再取1μl BEL引物混合液，与30ng CrRNA表达盒空载、1μl10×CutSmart Buffer、35U T4 DNA连接酶、10U Bsal限制性内切酶和无菌水组成10μl混合体系，37℃培养1h，制得所述CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子OsU6a-CrRNA-BEL。

8.一种用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白完整表达载体，其特征在于，所述CasΦ-2蛋白完整表达载体上连接有权利要求4或5所述的CasΦ-2蛋白表达载体，还连接有权利要求6或7所述的CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子。

9.根据权利要求8所述的CasΦ-2蛋白完整表达载体，其特征在于，是先使用引物Pps-R和Pgs-L对CasΦ-2蛋白的CrRNA表达盒子进行扩增，再用BsaI和T4 DNA连接酶与所述CasΦ-2蛋白表达载体组装连接后构成；

所述引物Pps-R和Pgs-L为：

Pps-R：TAGAggtctcTaccgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG；

Pgs-L：AGTGggtctcGctcgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC。

10.根据权利要求9所述的CasΦ-2蛋白完整表达载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。