KR101488110B1

KR101488110B1 - 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용

Info

Publication number: KR101488110B1
Application number: KR20130147812A
Authority: KR
Inventors: 권석태; 조성숙; 유미; 권경민; 김승현
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2013-11-29
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2015-01-29
Also published as: US9416352B2; US20150159146A1

Abstract

나노아케움 이퀴탄스(Nanoarchaeum equitans) 유래 DNA 중합효소 (Neq DNA 중합효소)는 Neq DNA 중합효소 대 단편(Neq L)과 Neq DNA 중합효소 소 단편(Neq S)으로 분할되어 있으며, 상기 단편들은 인테인을 각각 갖고 있다. 본 발명은 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 하나로 연결하여 Neq DNA 중합효소의 전구체 (precursor) 형태인 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소를 제공하는 것으로, 상기 Neq HS DNA 중합효소는 기존의 Neq L 단편과 Neq S 단편을 각각 정제하여 인테인 트랜스 스플라이싱에 의한 hot-start PCR에 사용해야하는 불편함을 개선한 장점을 가진다. 특히 Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인 사이에 6개의 histidine (His-tag) 서열을 유전자 수준에서 삽입하여, 정제방법을 획기적으로 개선할 수 있다. 또한 Neq HS DNA 중합효소의 PCR 효율을 높이기 위해 노력한 결과, Neq HS DNA 중합효소 유전자의 특정부위에 돌연변이를 유발시켜 PCR 증폭속도와 증폭량이 월등히 개선된 Neq HS 돌연변이체 중합효소들 (M1, M2, M3)을 선별하였다. 본 발명에서는 이들 돌연변이체들 중에서 Neq HS M2 중합효소의 경우 PCR 에러율이 Pfu DNA 중합효소보다 약 1.7배 낮아서 정확성을 필요로 하는 PCR에 유용하다. 특히 Neq HS M3 중합효소를 이용하여 dNTP와 dUTP 존재하에서 인간 유전체(human genomic) DNA의 다양한 타깃 단편들을 PCR 방법으로 증폭한 결과, 시중에 판매되는 HS Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소들보다 비특이적인 증폭없이 정확하게 목적의 DNA만을 선택적으로 증폭하는 우수성을 보였다.

Description

나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용 {Mutant Neq HS DNA polymerases from Nanoarchaeum equitans and its application to hot-start PCR}

본 발명은 나노아케움 이퀴탄스 유래의 DNA 중합효소의 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 연결한 Neq hot-start(HS) DNA 중합효소에 관한 것이다. 또 PCR 증폭율이 월등히 향상된 돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소들의 개발에 관한 것이다.

DNA 중합효소(deoxyribonucleic acid polymerase, DNA polymerase, E.C. number 2.7.7.7)는 주형 DNA(template DNA)에 상보적인 DNA를 5'→3' 방향으로 합성하는 효소로서, 생명체에 있어 DNA 복제(replication)나 수리(repair)시에 가장 중요한 역할을 하는 효소로, DNA 중합효소는 아미노산 서열을 근거로 하여 최소 여섯 개의 패밀리(family A, B, C, D, X, Y)로 나누어 질 수 있다(Ohmori, H. et al., 2001, Mol. Cell. 8: 7-8). 패밀리 B에 속하는 대부분의 DNA 중합효소들은 교정 활성(proofreading activity)이라 불리는 3'→5' 핵산 말단가수분해효소 활성(3'→5' exonuclease activity)을 가지고 있어서 높은 정확성 (fidelity)을 가지고 복제를 진행할 수 있다. 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR 기술이 개발되면서, 내열성 DNA 중합효소들이 주목을 받기 시작하였으며, 여러 고온균 및 초고온균(hyperthermophile)들로부터 내열성 DNA 중합효소들이 경쟁적으로 개발되었다. 특히, 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 등의 초고온성 고세균들로부터의 내열성 DNA 중합효소들은 DNA 중합 활성(DNA polymerization activity)과 함께 교정 활성(proofreading activity)이라 불리는 3'→5' 핵산말단 가수분해효소 활성(3'→5' exonuclease activity)도 가지고 있어 고도의 정확성을 요구되는 PCR에 이용되었다.

인테인(intein)은 전구체 단백질(precursor protein) 서열 내에 존재하는 단백질 삽입 서열로서, 전구체 단백질의 스플라이싱 과정(splicing process)에서 스스로 제거되어지므로 전구체 단백질로부터 만들어지는 최종 단백질의 구조나 활성에는 전혀 영향을 주지 않는 부위이다. 단백질 스플라이싱(protein splicing)은 단백질 번역 (translation) 후 일어나는 과정으로서, 이 과정 동안에 인테인은 스스로의 작용에 의해 전구체 단백질로부터 정확히 빠져나옴과 동시에 활성을 가지는 최종 단백질을 구성하는 부위인 익스테인(extein)들이 정상적인 펩타이드 결합 (peptide bond)에 의해 서로 연결되게 된다.

나노아케움 이퀴탄스(Nanoarchaeum equitans; Neq)는 아이슬랜드(Iceland)의 콜베인세이(Kolbeinsey)에 있는 해저 열수공(submarine hot-vent)으로부터 분리된 나노 크기의 혐기성 미생물(anaerobe)이다. 이 균주는 엄격한 혐기 조건 하에서 특별한 숙주(specific host)인 이그니코커스속 균주 KIN4/I(Ignicoccus sp. strain KIN4/I)의 표면에서 기생을 하는 생물체이다.

Neq DNA 중합효소는 나노아케움 이퀴탄스 게놈 상에서 83,295 bp 떨어져 분할되어 존재하며 Neq DNA 중합효소를 암호화하고 있는 2개의 유전자 각각은 익스테인 (extein) 암호화 부위와 분할된 미니 인테인 (split mini-intein) 암호화 부위로 구성되어 있음이 알려져 있고(Waters E. et al ., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 12984-12988), Neq DNA 중합효소는 Neq DNA 중합효소 대 단편 (Neq L)과 Neq DNA 중합효소 소 단편 (Neq S)을 암호화하는 유전자들에 의해 만들어지게 된다. 즉 Neq DNA 중합효소는 게놈 상에서 따로 존재하는 2개의 유전자들로부터 각각의 폴리펩타이드 (polypeptide)로 발현된 다음, 단백질 트랜스 스플라이싱 (protein trans-splicing)을 통해 펩타이드 결합 (peptide bond)으로 연결되어, 최종 활성형의 DNA 중합효소를 형성하게 된다 (Choi J. J. et al ., 2006, J. Mol. Biol. 356:1093-106). Neq L 대 단편은 578 아미노산 잔기로 이루어진 Neq DNA 중합효소의 아미노 말단 부분(amino-terminal part, N-terminal part)에 해당하는 익스테인 부위와 98 아미노산 잔기로 이루어진 단백질 트랜스 스플라이싱에 관여하는 분할된 미니 인테인의 아미노 말단 부분에 해당하는 인테인 부위로 구성되어 있으며, Neq S 소 단편은 30 아미노산 잔기로 이루어진 분할된 미니 인테인의 카르복실 말단 부분(carboxyl-terminal part, C-terminal part)에 해당하는 인테인 부위와 223 아미노산 잔기로 이루어진 Neq DNA 중합효소의 카르복실 말단 부분에 해당하는 익스테인 부위로 구성되어 있다(대한민국 특허등록 제 10-0793007호 및 미국특허등록 US7,749,732). Neq DNA 중합효소 대 단편과 Neq DNA 중합효소 소 단편을 하나의 발현벡터에 구축하여 대장균에서 발현시킨 후, 균체를 회수하여 초음파로 파쇄한 후, 고온에서 트랜스 스플라이싱 반응이 일어남을 SDS-PAGE 및 효소활성을 통해 확인된 바 있다. 즉 대장균 균체내에서 트랜스 스플라이싱에 의해 인테인들은 제거되고 익스테인들만이 펩타이드 결합으로 연결되어 형성된 단백질을 Neq C(protein trans-spliced form of Neq DNA polymerase)라고 하였다. 또한, 인테인 암호화 부위를 제외시킨 Neq L 대 단편 유전자의 익스테인 암호화 부위와 인테인 암호화 부위를 제외시킨 Neq S 소 단편 유전자의 익스테인 암호화 부위를 재조합시켜서 하나의 폴리펩타이드 형태로 대장균에서 발현시켜 얻은 DNA 중합효소를 Neq P(genetically protein splicing-processed form of Neq DNA polymerase)라고 하였다. 그리고 Neq C와 Neq P가 다른 방법으로 제조되었지만, 이 둘은 동일한 활성을 가질 뿐만 아니라 동일한 생화학적 특성을 나타내는 효소임이 알려진 바 있다.

또 Neq L 대 단편 및 Neq S 소 단편을 발현시키는 재조합 벡터를 각각 구축한 후, 대장균에서 발현시킨 후 이들 단편들을 각각 정제하여, 이들 Neq L 대 단편과 Neq S 소 단편들을 함께 첨가하였을 때, 고온에서 트랜스 스플라이싱 반응이 일어남을 SDS-PAGE 및 효소활성을 통해 확인되었다(Choi J. J. et al ., 2006, J. Mol. Biol. 356:1093-106; 등록특허 제 10-0793007호; 미국등록특허 US7,749,732). 또한, 최근에는 Neq L 대 단편과 Neq S 소단편이 고온에서 트랜스 스플라이싱이 일어나는 것을 이용하여 이들 Neq L 대 단편과 Neq S 소단편을 각각 정제하여 핫 스타트(hot-start) PCR에 적용한 것 또한 알려진 바 있다(등록특허 제 10-1230362호).

고세균 유래의 패밀리 B DNA 중합효소는 우라실(uracil)과 하이포잔틴 (hypoxanthine)같은 탈아민화된 염기들을 인식하여 DNA 합성을 멈추게 하는 특이한 포켓을 N-말단 도메인에 가지고 있다(Fogg M. J. et al ., 2002, Nat. Struct. Biol. 9: 922-927; Gill S. et al ., 2007, J. Mol. Biol. 372: 855-863). Neq DNA 중합효소는 일반적인 패밀리 B DNA 중합효소와는 다른 구조를 가진다. 그러나, Neq DNA 중합효소는 우라실을 인식하는 포켓을 가지고 있지 않고 탈아민화된 염기들을 잘 이용할 수 있는 고세균 유래의 패밀리 B DNA 중합효소로서 Neq DNA 중합효소와 Taq DNA 중합효소를 혼합한 Neq plus DNA 중합효소의 제조방법 및 우라실-DNA 글리코실라제와 dUTP를 이용한 PCR의 응용방법이 최근에 보고되었다(참조: Choi J.J. et al ., 2008, Appl. Environ. Microbio. 74: 6563-6569).

PCR에서 발생하는 교차 오염을 방지하기 위한 방법으로서, dTTP 대신 dUTP를 넣어서 PCR을 수행하는 방법이 롱고(Longo) 등에 의해 제시 되었다(Longo M. C. et al., 1990, Gene 93:125-128). 또한, PCR 개시 전에 시료 내에 주형 DNA와 함께 극소량으로 오염된 우라실 함유 DNA를 제거시키기 위해 UDG를 처리하고, 가열에 의해 UDG를 불활성화 시킨 후, 다시 dTTP 대신 dUTP를 첨가하여 PCR을 수행하는 방법들이 보고된 바 있다(Rys P. N. and D. H. Persing, 1993. J. Clin. Microbio. 31: 2356-2360). 이로 인하여 최근에는 PCR 과정에서 UDG를 처리하거나, UDG를 포함하는 PCR 제품들이 판매되고 있는 추세이다.

근래에 PCR-관련 산업에서 중요한 부분으로 여겨지고 있는 기술은 핫 스타트 PCR로, 현재 핫 스타트 PCR은 감염성 질환 (예, HIV), 순도가 높지 않은 DNA를 이용하는 경우, 실시간 PCR, 원스텝 RT-PCR 등 다양한 분야에서 이용되고 있으며, 관련효소에 대한 연구가 매우 다양한 방향으로 진행되고 있다. 핫 스타트 PCR은 PCR 반응성분들을 혼합하는 과정과 초기 PCR 변성과정의 낮은 온도에서 DNA 중합효소 활성이 저해되지만, 프라이머 어닐링 (primer annealing) 온도 (약 55-65℃) 이상에서 정상적인 DNA 중합효소 활성을 허용하는 PCR 방법이다. 즉, 일반적인 PCR에서는 PCR 성분들을 혼합하는 과정과 초기 PCR 변성과정에서 온도가 증가될 때 비특이적인 프라이머 결합이 발생한다. 이때 중합효소의 활성작용에 의해 원하지 않는 PCR 산물을 얻게 되며, 이 PCR 산물은 계속적인 PCR 반응에서 원하는 PCR 산물과의 경쟁적인 반응을 하면서 원하는 PCR 산물의 검출을 방해한다. 비특이적 증폭은 특히 적은 사본수(copy number)의 표적 DNA 검출, 저농도의 DNA 시료의 증폭 및 여러 가지 프라이머를 동시에 사용하는 멀티플렉스 PCR을 수행하는데 있어서 커다란 문제점으로 지적되고 있다. 핫-스타트 PCR은 이런 초기 PCR 과정상의 비특이적인 프라이밍에 의해 생성된 원하지 않은 PCR 산물을 제거하기 위한 방법으로 개발된 것으로서, 프라이머 어닐링 온도 이상에서 DNA 중합효소 활성이 나타나기 때문에 PCR 산물의 특이성을 증가시킬 수 있다는 것이다.

가장 초기에 사용되었던 핫 스타트 PCR 방법으로 매뉴얼 (Manual) 법이 있다. 이 방법은 초기에 PCR에 필요한 성분 중의 하나 (예컨대, MgCl₂, Taq DNA 중합효소, dNTP 등)를 온도가 올라간 상태에서 첨가해주는 방법이다. 그러나 이 방법은 다량의 시료를 처리해야하는 경우에 사용할 수 없는 등 많은 불편한 점을 가지고 있다. 이후에 개발된 방법으로 왁스를 이용하여 PCR의 중요성분들을 분리시켜 제조한 후, 이 분리된 성분들이 온도가 올라가면서 왁스의 용해에 의해 서로 혼합되면서 PCR이 진행되는 방법이다(Chou Q. et al ., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1717-1723). 이 방법은 왁스를 녹여서 첨가를 해 주어야하는 문제, PCR 반응 후 PCR 산물을 얻는데 왁스가 방해를 할 수 있으며, 왁스의 첨가로 전체 반응액의 양이 증가되는 단점이 있다. 또 다른 방법으로 가장 상업적으로 성공을 거두었고, 현재 Invitrogen 등 몇몇 기업체에서 사용하고 있는 방법으로 Taq DNA 중합효소의 항체를 이용하는 방법이 있다 (참조: Kellogg D.E. et al ., 1994, Biotechniques 16: 1134-1137). 이 방법은 상온에서 항체가 중합효소와 반응을 하고 있으므로 효소의 활성을 억제하는 효과를 가질 수 있으며, 온도가 점차 상승되면 항체가 변성되어 효소에서 떨어져 나가므로, 효소의 활성이 작용하게 되어 PCR이 진행하게 된다. 즉, 온도가 상승되었을 때 프라이머들이 타깃 DNA에 정확히 결합할 수 있기 때문에 목적의 타깃 DNA만을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 그러나 이 방법은 과량의 항체의 양을 필요로 하며, 또한 항체의 가격이 고가라는 문제점을 가지고 있다.

최근에 개발된 방법으로써, 화학적으로 변형 (chemical modification)된 DNA 중합효소를 이용하는 방법이 있으며, 이 기술은 Roche (Birch D.E. et al ., 1996, Nature 381: 445-446, Birch D.E. 외 2명, 1997, 미국특허출원 USP 5677152)와 Qiagen (Ivanov Igor 외 4명, 2001, 미국특허출원, USP 6183998)에서 각각 개발되었고, 핫-스타트 관련 미국 시장의 약 68%를 점유하고 있다. 이 방법에 따르면 화학적 변형에 의해 Taq DNA 중합효소의 활성이 억제되어 있다가, PCR 반응 초기 재활성화 과정 (95℃에서 10분)을 통해서 효소의 활성이 재활성화 되어 PCR를 진행하는 방법이다. 그러나 PCR 반응 초기에는 효소의 약 30%만이 재활성되고, 고온에 의한 재활성화로 주형 DNA에 탈퓨린화가 발생되어 긴 길이의 증폭은 불가능한 단점이 있으나, 사용이 편리하여 매우 폭넓게 사용되고 있다. 그 외의 방법으로는 가열 활성화 프라이머의 독특한 설계방법 (Lebedev A.V. et al ., 2008, Nucleic Acids Research 36: No. 20 e131), 마그네슘 침전법 (참조: Barbesnes WM and Rowlyk KR, 2002, Molecular and Cellular Probes 16: 167-171) (고농도의 Mg를 사용, 정확한 농도의 Mg 사용이 불가능), 피로포스파타아제와 피로포스페이트를 이용하는 방법((주)바이오니아, 2007, 대한민국 특허출원 제 10-2007-0109055)이 개발이 되었으나, 이들 방법들 모두 결정적인 문제점을 가지고 있기 때문에 크게 성공하지 못하였다.

최근에는 제조 원가면에서 좀 더 저렴하면서도 핫 스타트 PCR를 효과적으로 구현할 수 있는 새로운 기술의 개발이 요구되었다. 이러한 요구에 부응하고자 본 연구팀에서는 Neq DNA 중합효소의 인테인이 포함된 Neq L 대 단편과 Neq S 소 단편들을 함께 첨가하여 고온에서 트랜스 스플라이싱 반응이 일어나는 것을 기초로 하여 핫-스타트 PCR에 처음으로 적용하였다 (등록특허 제10-1230362호; 미국공개특허 US2012/0135472). 즉, 저온에서는 단백질 트랜스 스플라이싱이 일어나지 않기 때문에 DNA 중합효소의 활성이 없다가 고온 (60 ℃ 이상, 최적 80 ℃)에서 트랜스 스플라이싱에 의해 인테인들은 제거되고 익스테인들만이 펩타이드 결합으로 연결되어 활성형 Neq DNA 중합효소 (Neq C)가 만들어지는 것을 기반으로 한 새로운 개념의 핫-스타트 (hot-start) PCR 방법이다 (등록특허 제10-1230362호). 그러나, 이 방법은 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 각각 별도로 정제하여야 하며, 또 PCR 반응액에 각 단편들의 정확한 농도를 맞추어 PCR 반응액에 첨가해야하는 번거로움이 있다. 또 야생형 (wild-type)의 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 사용했기 때문에 PCR 증폭율이 낮다는 단점도 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 종래 트랜스 스플라이싱을 이용한 핫-스타트 PCR 방법에서 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 별도로 정제하여 PCR 반응액에 정확한 비율로 첨가해야 했던 단점을 극복하여, Neq L 단편과 Neq S 단편들의 인테인들이 결합된 Neq DNA 중합효소의 전구체 (precursor) 형태인 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소의 제조 방법을 제공한다. 또 기존의 PCR 증폭율이 낮은 야생형 (wild-type)의 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 이용한 핫-스타트 PCR 방법을 보완하여 PCR 증폭율이 월등히 향상된 돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소들을 개발하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인이 하나로 연결된 나노아케움 이퀴탄스 균주 유래의 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소(Nanoarchaeum equitans hot-start DNA 중합효소, Neq HS DNA 중합효소)로서, 상기 중합효소는 서열번호 6 (Neq HS DNA 중합효소), 서열번호 32 (Neq HS M1 DNA 중합효소), 서열번호 34 (Neq HS M2 DNA 중합효소), 및 서열번호 36 (Neq HS M3 DNA 중합효소)으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 나노아케움 이퀴탄스 균주 유래의 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 인테인 사이에 6개의 His-tag 서열이 삽입된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 DNA 중합효소는 pH 6.0 - 9.0 의 pH, 0.5 - 1.5 mM의 Mg² ⁺ 농도, 60 - 100 mM의 KCl 농도에서 최적의 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합 효소를 암호화 하는, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 33, 및 서열번호 35로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 DNA 중합 효소를 암호화 하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로, 상기 재조합 벡터는 T7 프로모터가 트립토판(tryptophan) 프로모터로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 재조합 벡터는 pETRPNEQHS, pETRPNEQHSM1, pETRPNEQHSM2, 및 pETRPNEQHSM3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 pETRPNEQHS 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체는 Escherichia coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHS(기탁번호 : KCCM11448P)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 pETRPNEQHSM3 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체는 Escherichia coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM3(기탁번호 : KCCM11449P)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 i) 상기 DNA 중합효소를 발현하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

ii) 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계;

iii) 형질전환체를 배양하는 단계; 및

iv) 형질전환체로부터 DNA 중합효소를 정제하는 단계를 포함하는 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소를 이용한 핫-스타트 중합효소 연쇄반응(hot-start polymerase chain reaction) 수행 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Neq HS DNA 중합효소의 N-말단 및 인테인 전체 부분과 Pfu DNA 중합효소의 C 말단 단편(Pfu-C)이 하나로 연결된 내열성 키메라 Nefu 핫-스타트 DNA 중합효소(chimera Nefu hot-start DNA 중합효소, Nefu HS DNA 중합효소)로서, 상기 중합효소는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 키메라 Nefu 핫-스타트 DNA 중합효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합 효소를 암호화 하는, 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합 효소를 암호화 하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pETRPNPHS인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소의 인테인 전체를 다른 DNA 중합효소들과의 키메라 DNA 중합효소 제조 및 이들 키메라 DNA 중합효소의 인테인을 이용한 고온 (50 - 100 ℃)에서 핫-스타트 중합효소 연쇄반응 (hot-start polymerase chain reaction) 수행 방법을 제공한다.

본 발명에서 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 하나로 연결하여 전구체 (precursor) Neq DNA 중합효소인 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소를 제조하였다. 인테인이 포함된 Neq HS DNA 중합효소들은 새로 구축된 발현벡터 pETRPHIS-5의 tryptophan promoter 조절하에서 발현되었다. 발현 양을 증가시키기 위하여 tRNA codon 플라스미드를 제조하여 발현 숙주 대장균 W3110에 함께 형질전환시켜 발현시킨 결과 발현율이 상승하였다. Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인 사이에 6개의 His-tag 서열을 유전자 수준에서 삽입하여 구축한 결과 재조합 Neq HS DNA 중합효소들을 쉽게 정제할 수 있었다. 또한 PCR 효율을 증가시키기 위해 다양한 돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소들 (M1, M2, M3)을 제조하였다. 이들 돌연변이체들을 이용하여 PCR를 수행한 결과 wild-type Neq HS DNA 중합효소보다는 우수하였다. 특히 Neq HS M3 DNA 중합효소를 이용하여 인간 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과 다른 DNA 중합효소들 보다 더 특이적인 DNA 증폭산물을 얻을 수 있었다. 또 데옥시유티피 (dUTP) 존재 하에서도 Taq DNA 중합효소보다 증폭 효율과 증폭 특이성이 뛰어났다. 본 발명은 우라실 DNA 글리코실라제(uracil-DNA glycosylase, 이하 'UDG'라고 함)와 함께 데옥시유티피 (dUTP)를 이용한 핵산 시료의 교차 오염(carry-over contamination) 방지 기술 및 multiplex PCR에 기존의 DNA 중합효소보다 더 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 하나로 연결하여 Neq DNA 중합효소의 전구체 (precursor) 형태인 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소를 나타낸 것이다.
도 2A는 발현벡터 pETRPHIS-5를 구축한 것이다 (도 2A, 서열번호 9). promoter는 E. coli W3110 유래의 tryptophan (trp) promoter이다. 도 2B는 Neq HS DNA를 암호화하는 유전자를 발현벡터 pETRPHIS-5에 클로닝한 플라스미드 pETRPNEQHS이다.
도 3A는 RILYKT tRNA codon 플라스미드를 구축한 것이다 (서열번호 24). 도 3B는 RILYKT tRNA codon 플라스미드와 pETRPNEQHS와 같이 E. coli W3110에 형질 전환시켰을 때 발현양의 증가를 보여주는 결과이다.
도 4A는 대장균 내에서 발현된 Neq HS DNA 중합효소의 정제 단계에 따른 SDS 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다. lane 1은 LB 배지에서 배양한 대장균 W3110-RILYKT / pETRPNEQHS 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 2는 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 한정 배지에서 배양한 대장균 W3110-RILYKT / pETRPNEQHS 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 3는 HisTrap^TM HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 4는 HiTrap^TM Q HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 5는 HiTrap^TM SP HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료이다. 도 4B는 Neq HS DNA 중합효소의 정제 단계와 동일한 방법으로 정제한 Neq HS 돌연변이 DNA 중합효소들의 정제사진이다. Lane 1은 Neq HS DNA 중합효소, Lane 2는 Neq HS M1 DNA 중합효소, Lane 3는 Neq HS M2 DNA 중합효소, Lane 4는 Neq HS M3 DNA 중합효소이다.
도 5A은 Neq HS DNA 중합효소를 30 pmole 첨가하여 반응온도와 반응시간에 대한 단백질 스플라이싱 반응효과를 비교한 분석한 것이다. 반응온도는 50-95℃ 범위에서 1, 5, 10분간 각각 반응시킨 다음, SDS 변성 겔 전기영동을 통해 분석하였다. 도 5B는 상기 온도와 반응시간에 따른 Neq HS DNA 중합효소 단백질 스플라이싱 반응액을 이용하여 DNA 중합효소 활성을 측정한 결과이다.
도 6A는 프리디네이쳐 과정과 PCR 반응 싸이클 횟수에 따른 Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 효과를 SDS 변성 겔 전기영동을 통해 관찰한 것이다. 프리디네이쳐 과정은 95℃에서 0분, 1분, 3분으로 각각 나누어서 수행하였고, PCR 반응을 1, 2, 3 4, 5, 10, 20 및 30 싸이클을 각각 수행하였다. 도 6B는 상기 5A의 PCR 반응 싸이클 횟수에 따른 Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 Neq HS DNA 중합효소, Neq HS M1 DNA 중합효소, Neq HS M2 DNA 중합효소 및 Neq HS M3 DNA 중합효소들을 이용하여 dNTP 존재하에서 PCR (DNA 중합효소 연쇄반응)에 있어 pH (도 7A), MgCl₂ 농도 (도 7B) 및 KCl 농도 (도 7C) 에 따른 PCR 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 8은 PCR (DNA 중합효소 연쇄반응) 타깃으로 hemoglobin gene (도 8 A, 타깃 194 bp), β-globin gene (도 8 B, 타깃 850 bp), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse gene (도 8 C, 타깃 2.7 kb) 및 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse gene (도 8 D, 타깃 6.25 kb)을 각각 이용하여 dNTP 존재 하에서 Neq HS DNA 중합효소 (lane 1), Neq HS M1 DNA 중합효소 (lane 2), Neq HS M2 DNA 중합효소 (lane 3) 및 Neq HS M3 DNA 중합효소 (lane 4)로 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 PCR 타깃으로 β-globin gene (타깃 1.4 kb), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse gene (타깃 2.7 kb) 및 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse gene (타깃 6.25 kb)을 각각 이용하여 dNTP 존재 하에서 Neq HS M3 DNA 중합효소 (lane 1), HS Taq DNA 중합효소 (Roche) (lane 2), HS Taq DNA 중합효소 (Takara) (lane 3), Taq DNA 중합효소 (Takara) (lane 4) 및 Pfu DNA 중합효소 (Promega) (lane 5)를 각각 이용한 PCR을 수행한 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 10는 dTTP 대신 dUTP 존재 하에서 erythropoietin gene (타깃 194 bp), hemoglobin gene (타깃 400 bp), β-actin gene (타깃 600 bp), β-globin gene (타깃 865 bp)을 이용하여 Neq HS M3 DNA 중합효소 (lane 1), HS Taq DNA 중합효소 (Roche) (lane 2), HS Taq DNA 중합효소 (Takara) (lane 3), Taq DNA 중합효소 (Takara) (lane 4) 및 Pfu DNA 중합효소 (Promega) (lane 5)를 각각 이용한 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 11는 dNTP 존재 하에서 erythropoietin gene (타깃 194 bp), hemoglobin gene (타깃 400 bp), β-actin gene (타깃 600 bp), β-globin gene (타깃 865 bp) 들을 PCR 방법으로 증폭시킬 8 종류의 프라이머들을 반응용액에 함께 넣고 Neq HS M3 DNA 중합효소 (lane 1), HS Taq DNA 중합효소 (Roche) (lane 2), HS Taq DNA 중합효소 (Takara) (lane 3), Taq DNA 중합효소 (Takara) (lane 4) 및 Pfu DNA 중합효소 (Promega) (lane 5)를 이용한 multiplex PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 12A는 Neq DNA 중합효소의 분절된 인테인 (split intein)과 익스테인 (extein)의 인접한 부위의 아미노산 서열 (Neq pol)과 Neq HS DNA 중합효소의 인테인과 익스테인이 6개의 Histidine 잔기를 삽입하여 연결한 아미노산 서열 (Neq HS pol)을 나타낸 것이다. Pfu DNA 중합효소는 인테인이 존재하지 않지만 Neq DNA 중합효소의 익스테인 junction 부위의 아미노산과 동일한 아미노산으로 이루어져 있다. 도 12B는 Neq N-말단 및 인테인을 포함하는 영역의 유전자와 Pfu DNA 중합효소 C말단 영역에 해당하는 유전자를 연결시켜 키메라 Nefu HS DNA 중합효소 구축을 위한 4개의 primer 들의 위치를 도시하였다.
도 13은 키메라 Nefu HS DNA 중합효소를 12 ㎍ 첨가하여 반응온도에 대한 단백질 스플라이싱 반응효과를 비교한 분석한 것이다. 반응온도는 50-95℃ 범위에서 각각 반응시킨 다음, SDS 변성 겔 전기영동을 통해 분석하였다.
도 14는 반응 효소양에 따른 키메라 Nefu HS DNA 중합효소 단백질 스플라이싱 반응액을 이용하여 DNA 중합효소 활성을 측정한 결과이다.
도 15은 PCR (DNA 중합효소 연쇄반응) 타깃으로 Lambda DNA (2kb)을 각각 이용하여 dNTP 존재 하에서 키메라 Nefu HS DNA 중합효소로 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 Neq DNA 중합효소의 인테인이 포함된 Neq L 대 단편과 Neq S 소 단편들을 함께 첨가하여 고온에서 트랜스 스플라이싱 반응이 일어나는 것을 기반으로 한 새로운 개념의 핫-스타트 (hot-start) PCR 방법을 고안하여 국내특허등록 및 미국에 특허출원한 바 있다. 이 방법은 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 별도로 정제하여 PCR 반응액에 정확한 비율을 맞추어 첨가해야 하는 번거로움이 있지만, 현재 상업적으로 판매되고 있는 모노클로날 안티바디를 이용한 핫-스타트 PCR용 제품 보다 사람 게놈을 이용한 목적 DNA를 더 정확히 증폭할 수 있는 장점과 제조원가면에서 유리하다. 그러나, 상술한 것과 같이 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 별도로 발현, 정제하여야 하는 단계가 있으며, 또 PCR 반응액에 정제한 Neq L 단편과 Neq S 단편들의 비율을 매번 정확히 맞추어 각각 첨가해야하는 단점이 있어, 일반 연구자들이 사용하기에는 어려움이 있었다.

또한 Neq S 소 단편의 경우 대장균에서 발현 시 봉입체(inclusion body)로 생성되며, 이러한 봉입체를 urea에 녹여 정제하여도 침전이 잘 생겨서 회수율이 매우 낮아 정제의 어려움이 있다.

따라서 본 발명의 목적은 PCR 반응에 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 별도로 사용해야하는 여러 가지 단점을 해결하기 위해, Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 하나로 연결하여 Neq DNA 중합효소의 전구체 (precursor) 형태인 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소를 만드는 것에 있다. 또 기존의 PCR 증폭율이 낮은 야생형 (wild-type)의 Neq L 단편과 Neq S 단편들을 이용한 핫-스타트 PCR 방법을 보완하여 PCR 증폭율이 월등히 향상된 돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소들을 개발하는 것에 있다.

즉, 본 발명은 Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인이 하나로 연결된 나노아케움 이퀴탄스 균주 유래의 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소(Nanoarchaeum equitans hot-start DNA 중합효소, Neq HS DNA 중합효소)로서, 상기 중합효소는 서열번호 6, 서열번호 32, 서열번호 34, 또는 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 나노아케움 이퀴탄스 균주 유래의 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소를 제공한다.

특히 Neq HS DNA 중합효소 유전자 구축 시에 Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인 사이에 6개의 His-tag 서열을 유전자 수준에서 삽입하여 His-tag affinity column으로 정제방법을 획기적으로 개선하였다. 6개의 His-tag 서열은 인테인 내에 삽입되어 있으므로 Neq HS DNA 중합효소의 스플라이싱 과정에서 스스로 제거되어지므로 Neq HS DNA 중합효소의 구조나 활성에는 전혀 영향을 주지 않는다. 효소 반응액에 상기 Neq HS DNA 중합효소를 첨가하여 반응 온도, 반응시간에 따라 단백질 스플라이싱 효과분석과 DNA 중합효소 활성을 비교한 결과, 정상적인 Neq DNA 중합효소가 고온에서만 만들어진다는 것을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서, 상기 DNA 중합효소는 pH 6.0 - 9.0 의 pH, 0.5 - 1.5 mM의 Mg² ⁺ 농도, 60 - 100 mM의 KCl 농도에서 최적의 활성을 나타내나, 상기 범위에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합 효소를 암호화 하는, 서열번호 5, 서열번호 31, 서열번호 33, 또는 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 유전자를 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, Neq HS DNA 중합효소의 발현율을 증가시키기 위하여 RILYKT tRNA plasmid를 제조하여 발현숙주에 도입하였다. 더 나아가 Neq HS DNA 중합효소 유전자에 PCR 효율을 높이기 위해 특정부위에 돌연변이를 유발시켜 PCR 증폭속도와 증폭량이 우수한 돌연변이체 Neq HS DNA 중합효소들 (M1, M2, M3)을 선발하였다.

상기 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 중, 특히 Neq HS M3 DNA 중합효소를 이용한 최적화된 핫-스타트 PCR 방법은 Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소에 비하여 비특이적인 증폭없이 정확하게 목적의 DNA만을 선택적으로 증폭하는 우수성을 보였다. 또한 Neq HS DNA 중합효소들을 이용한 핫-스타트 PCR은 dUTP를 이용한 PCR에서 다른 핫-스타트 PCR에 이용되는 DNA 중합효소들보다 더 선택적으로 타깃 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다.

그러므로, 본 발명의 또 다른 목적은 인테인이 포함된 Neq HS DNA 중합효소를 암호화하는 염기 서열에 대한 정보도 제공하는 것에 있다. 구체적으로는 상기 Neq HS DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것으로, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 Neq HS DNA 중합효소는, 서열번호 5의 핵산 서열을 가진다. 또, 인테인이 포함된 돌연변이체 Neq HS M1 DNA 중합효소(Neq HS DNA 중합효소의 523번째 alalnine을 arginine으로 치환시킨 효소)를 암호화하는 염기 서열에 대한 정보도 제공하는 것에 있다. 구체적으로는 상기 Neq HS M1 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 Neq HS M1 DNA 중합효소는 바람직하게는 서열번호 31의 핵산 서열을 가진다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 인테인이 포함된 돌연변이체 Neq HS M2 DNA 중합효소 (Neq HS DNA 중합효소의 523번째 alalnine을 arginine으로, 540번째 asparagine을 arginine으로 이중 치환시킨 효소)를 암호화하는 염기 서열에 대한 정보도 제공할 수 있다. 구체적으로는 상기 Neq HS M2 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 Neq HS M2 DNA 중합효소는 바람직하게는 서열번호 33의 핵산 서열을 가진다.

본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 인테인이 포함된 돌연변이체 Neq HS M3 DNA 중합효소 (Neq HS DNA 중합효소의 523번째 alalnine을 arginine으로, 540번째 asparagine을 arginine으로, 185번째 serine을 aspartic acid로 삼중 치환시킨 효소)를 암호화하는 염기 서열에 대한 정보도 제공할 수 있다. 구체적으로는 상기 Neq HS M3 DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 Neq M3 DNA 중합효소는 바람직하게는 서열번호 35의 핵산 서열을 가진다.

또한, 본 발명은 인테인이 포함된 Neq HS DNA 중합효소 및 돌연변이체들의 발현 양을 증가시키기 위하여 tRNA codon 플라스미드를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

즉 본 발명은 DNA 중합 효소를 암호화 하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로, 상기 재조합 벡터는 T7 프로모터가 트립토판(tryptophan) 프로모터로 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 재조합 벡터는 pETRPNEQHS(Neq HS DNA 중합효소 유전자가 삽입된 재조합 벡터), pETRPNEQHSM1(Neq HS M1 DNA 중합효소 유전자가 삽입된 재조합 벡터), pETRPNEQHSM2(Neq HS M2 DNA 중합효소 유전자가 삽입된 재조합 벡터), 또는 pETRPNEQHSM3(Neq HS M3 DNA 중합효소 유전자가 삽입된 재조합 벡터)일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공할 수 있고, 상기 pETRPNEQHS 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체는 Escherichia coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHS(기탁번호 : KCCM11448P)이고, 상기 pETRPNEQHSM3 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체는 Escherichia coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM3(기탁번호 : KCCM11449P)이다.

따라서, 본 발명은 상기 재조합 벡터의 제조를 통해서, 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키고, 형질전환체를 배양하여 형질전환체로부터 DNA 중합효소를 분리해내는 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시예에서, 인테인이 포함된 Neq HS DNA 중합효소 및 돌연변이체들의 유전자 발현 방법 및 재조합 Neq HS DNA 중합효소 및 돌연변이체들의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 DNA 중합효소의 인테인을 이용한 고온 (50 - 100 ℃)에서 hot-start PCR을 수행하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 인간 유전체(human genomic) DNA를 주형으로 이용하여 베타 엑틴 (β-actin gene) 유전자, 베타 글로빈 (β-globin gene), 헤모글로빈 유전자 (hemoglobin gene) 등을 dNTP 또는 dUTP 존재하에서 PCR을 각각 수행하였을 때, 최적화된 인테인이 포함된 Neq HS M3 DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소보다 목적의 DNA만을 특이적으로 증폭시킴으로서 핫-스타트 PCR 효과가 있음을 확인하였다.

특히, 상기에서 서술한 바와 같이 본 발명에서 제공하는 Neq HS M3 DNA 중합효소는 여러쌍의 프라이머들을 사용하는 multiplex PCR에서도 시판용 DNA 중합효소들 (예: HS Taq DNA 중합효소)보다 더 뛰어난 특이성을 보이므로 Neq HS DNA 중합효소 및 이들 변이체들은 질병의 진단 등을 목적으로 수행하는 리얼타임 PCR에 아주 적합할 것이다.

본 발명의 Neq HS DNA 중합효소를 PCR 반응액에 첨가하여 PCR 키트 성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 PCR 키트는, 상기 Neq HS DNA 중합효소 외에도 검출 프라이머를 포함하는 용기, 증폭반응 튜브 또는 컨테이너, 반응 완충액, dNTPs, RNase 및 멸균수 등에서 선택되는 1 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 Neq HS DNA 중합효소를 포함하는 키트는 유전공학 및 분자생물학 실험, 임상진단, 법의학적 연구 등의 다양한 분야에서 Taq DNA 중합효소보다 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 Neq HS M3 DNA 중합효소의 최적 혼합물로 구성된 핫-스타트 PCR용 DNA 중합효소는 인간 유전체(human genomic) DNA를 주형으로 한 PCR에서 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소보다 더 정확한 PCR 증폭 특이성을 보였다. 또한 Neq HS DNA 중합효소 최적 혼합물로 구성된 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소와 마찬가지로 dUTP 존재 하에서 PCR을 수행할 수 있다. 특히 dUTP 존재하에서는 Taq DNA 중합효소 보다 증폭 특이성이 뛰어나며 더 짧은 시간으로 PCR을 수행할 수 있다.

즉, dUTP 존재하에서는 원하는 목표 단편만을 특이적으로 증폭할 수 있으며, 증폭 효율이 더 뛰어났다. 특히, 상기한 바와 같이 본 발명에서 제공하는 Neq HS M3 DNA 중합효소의 최적 혼합물로 구성된 DNA 중합효소는 dUTP 존재 하에서 기존의 중합효소(예: Taq DNA 중합효소)보다 더 뛰어난 중합활성과 증폭 특이성을 가지므로 UDG와 dUTP를 이용하여 질병의 진단 등을 목적으로 수행하는 PCR에 아주 적합할 것이다.

또한, Neq DNA 중합효소와 다른 내열성 DNA 중합효소인 Pfu DNA 중합효소와 연결하여, Neq HS 중합효소 N-말단 및 인테인 전체 부분과 Pfu DNA 중합효소의 C 말단 단편(Pfu-C)이 하나로 연결된 내열성 키메라 Nefu 핫-스타트 DNA 중합효소(chimera Nefu hot-start DNA 중합효소, Nefu HS DNA 중합효소)로서, 상기 중합효소는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 키메라 Nefu 핫-스타트 DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pETRPNPHS인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소의 인테인을 다른 DNA 중합효소들과의 키메라 DNA 중합효소 제조 및 이들 인테인이 포함된 키메라 DNA 중합효소를 이용한 고온 (50 - 100 ℃)에서 핫-스타트 중합효소 연쇄반응 (hot-start polymerase chain reaction) 수행 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 하나로 연결한 전구체 형태인 Neq hot - start ( HS ) DNA 중합효소 제조

본 실시예에서는 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들을 하나로 연결하여 Neq DNA 중합효소의 전구체 (precursor) 형태인 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소를 제조하였다. 특히 도 1에 나타낸 것과 같이, Neq HS DNA 중합효소 유전자 구축시에, Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인 사이에 6개의 His-tag 서열을 유전자 수준에서 삽입하여 재조합 Neq HS DNA 중합효소들의 정제를 His-tag affinity column으로 쉽게 정제 할 수 있도록 설계하였다.

국내 등록특허 1230362호에 기재된 방법에 따라, pET-22b (+) 발현벡터에 클로닝된 Neq L 단편과 Neq S 단편 유전자를 확보하였고, 유전자 서열에 관한 정보를 통해 4개의 PCR primer(서열번호 1-4)들을 각각 합성한 후 overlap extension PCR 방법으로 Neq L 단편과 Neq S 단편 유전자를 연결시켰다(Reikofski and Tao, 1992).

이때, 서열번호 1(Neq FP)은 Neq L 단편의 N 말단 아미노산 서열을 암호화는 염기서열을 5'→3'으로 합성하여 제조되었다. 서열번호 2(HisNeqM)는 Neq S 단편의 N 말단 아미노산 서열(인테인 영역) 일부 및 His-tag와, Neq L 단편의 인테인 아미노산 서열을 암호화는 염기서열의 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성하여 제조되었다. 서열번호 3(HisNeqMR)은 Neq L 단편의 인테인 아미노산 서열 일부 및 His-tag와, Neq S 단편의 N 말단 아미노산 서열 (인테인 영역)을 포함한 부위를 암호화는 염기서열을 5'→3'으로 합성하여 제조되었고, 서열번호 4 (NeqSRSalstop)는 Neq S 단편의 C 말단 아미노산 서열을 암호화는 염기서열의 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성하여 제조되었다.

이에 더하여, 발현벡터에 클로닝을 쉽게 하기 위해 서열번호 1에는 NdeI site와 서열번호 4에는 SalI site를 각각 첨가하여 합성하였다. 먼저 Neq L 단편 유전자를 주형 (template)으로 사용하여 PCR 반응액에 서열번호 1과 2를 첨가한 후, 1차 PCR을 수행하였다. PCR 반응액은 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 구성하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 3분간 변성반응 후, 94 ℃ 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막 72 ℃에서 10분간 반응시켰다.

또한, Neq S 단편 유전자를 주형으로 사용하여 서열번호 3과 4를 각각 첨가한 후 DNA 중합효소로 상기와 동일한 PCR 방법으로 1차 PCR을 수행하였다. 이들 PCR 증폭 산물들을 agarose gel 전기영동으로부터 각각 회수하였다. 이렇게 회수한 두 단편을 동일한 비율로 혼합한 후, 상기의 동일한 PCR 반응액에 첨가하여 95 ℃에서 3분 간 변성시킨 후 다시 50 ℃로 낮추어 annealing 시킴으로써 Neq L 단편의 인테인과 Neq S 단편의 인테인에 해당하는 중복염기서열이 우선적으로 overlap된 hybrid 주형을 제조하였다. 상기 주형을 72 ℃에서 10분간 overlap extension 시켜 Neq L 단편과 Neq S 단편의 유전자를 하나로 연결시켰다. 이것을 주형으로 하여 서열번호 1과 4를 상기의 동일한 PCR 반응액에 첨가하여 2차 PCR를 수행하여 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인들이 하나로 연결된 완전한 Neq hot-start (HS) DNA 중합효소 유전자를 증폭한 후, NdeI /SalI 으로 절단하여 발현벡터인 pET-20b(+) 등의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 ligation 하였다. 이 ligation 혼합액을 E. coli DH5α에 형질전환시킨 후, 형질전환체들로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NdeI 및 SalI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 Neq HS DNA 중합효소 유전자가 발현벡터 내에 정확히 삽입되었다는 것을 확인하였으며, 다시 전체 염기서열을 결정한 결과 Neq L 단편과 Neq S 단편의 인테인 부분이 정확하게 연결된 Neq HS DNA 중합효소 유전자의 염기서열을 재확인하였다(서열번호 5).

상기 Neq HS DNA 중합효소 유전자의 염기서열을 기반으로, 아미노산 서열을 결정하였다(서열번호 6). Neq HS DNA 중합효소 유전자가 pET-20b(+)에 정확하게 구축된 발현벡터를 pETNEQHS로 명명하였다.

서열번호 1(Neq FP): 5'-ATTATAGCATATGTTACACCAACTCCCCACG-3'

서열번호 2(HisNeqM): 5'-ATGTGGTGATGGTGATGGTGATTATTTTTATTTTCATATTCCTTGGC-3'

서열번호 3(HisNeqMR): 5'-AATCACCATCACCATCACCACAATGCGCTATCTTGGCAAAAAGAGAG-3'

서열번호 4(NeqSRSalstop): 5'-NNNNNNGTCGACTTTAAAGAAATCTGTTAGTTTTTT-3'

Neq HS DNA 중합효소 유전자를 발현시키기 위해 발현벡터 pETNEQHS를 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켰다. 상기 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pETNEQHS 균주를 100 ug/ml의 ampicillin 및 34 ug/ml의 chloramphenicol이 최종농도로 첨가된 LB 배양액에 접종하여 37 ℃에서 배양하면서 균체농도가 OD600에서 0.6에 도달하였을 때 최종농도 0.5 mM IPTG (isopropyl-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 6시간 이상 발현을 유도한 후, SDS-PAGE로 발현여부를 분석하였다. 그러나 pETNEQHS를 포함하는 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pETNEQHS에서 Neq HS DNA 중합효소 유전자가 발현이 되지 않았다.

따라서, Neq HS DNA 중합효소 유전자를 발현시키기 위한 또 다른 방법으로 T7 프로모터 대신 tryptophan (trp) 프로모터로 치환시킨 벡터를 아래와 같이 구축하였다. 대장균 trp 프로모터의 염기서열 (Miozzari, G. and Yanofsky, C.,1978 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5580-5584)을 참조하여, primer 서열번호 7(TrpPFPvuII)과 서열번호 8(TrpPRNdeI-2)을 제작하였다. 상기의 동일한 PCR 반응액에 주형 DNA로 대장균 W3110의 게놈을 primer 서열번호 7과 서열번호 8을 함께 첨가하여, PCR 방법으로 69 bp의 trp 프로모터 부위를 증폭시킨 후 PvuII와 NdeI으로 절단하여 아가로스 겔 전기영동으로부터 분리하였다. 이 69 bp의 trp 프로모터 DNA 단편을 PvuII와 NdeI으로 절단하여 T7 프로모터 부위를 제거시킨 2978 bp의 pET-20b(+)의 vector 부분에 삽입하여 ligation 시켰다. 이 ligation 혼합액을 E. coli DH5α에 형질전환시킨 후, 형질전환체로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음 염기서열을 결정하여 trp 프로모터 부위를 정확하게 갖는 발현벡터가 구축되었음을 확인하였다. 이렇게 trp 프로모터가 구축된 발현벡터를 pETRPHIS-5로 명명하였으며, 참고로 샤인달가노 서열(AAGGGT)과 개시코돈 (ATG)과의 거리는 5 bp 이다 (도 2A, 서열번호 9).

서열번호 7 (TrpPFPvuII): 5'-NNNNNNCAGCTGATGAGCTGTTGACAATTAATCATCG-3'

서열번호 8 (TrpPRNdeI-2): 5'-NNNNNNCATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTG-3'

Neq hot-start (HS) DNA 중합효소 유전자를 PCR 방법으로 증폭한 후, 제한효소 NdeI 및 SalI으로 절단하여, 상기의 방법으로 구축된 pETRPHIS-5의 NdeI 및 SalI에 삽입하여 ligation 시켰다. 이 ligation 혼합액을 E. coli W3110에 형질전환시킨 후, 형질전환체로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음 NdeI 및 SalI으로 절단하여 Neq HS DNA 중합효소 유전자의 발현벡터, pETRPNEQHS를 구축하였다(도 2B).

실시예 2: Neq HS DNA 중합효소 유전자의 발현 및 발현율 증가를 위한 tRNA codon plasmid RILYKT 제조

새로 구축한 Neq HS DNA 중합효소 유전자의 발현벡터, pETRPNEQHS을 E. coli W3110에 ampicillin 존재 하에 형질전환시켜 형질전환체 (E. coli W3110/pETRPNEQHS)를 선별한 후, 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 최소배지에서 37 ℃에서 약 20시간 배양하여 SDS-PAGE로 분석한 결과 발현이 되었다 (도 3B). 그러나, 발현율이 낮아서 유전자의 발현율을 증가시키기 위한 방법으로 Neq HS DNA 중합효소와 E. coli 균주와의 코돈 빈도 (codon frequency)를 조사하였으며, 코돈 빈도에서 크게 차이가 나는 코돈들을 표 1에 비교하였다.

[표 1]

특히, Neq HS DNA 중합효소의 코돈들 [AGA (Arg), AUA (Ile), CUA (Leu), UAU (Tyr), AAA (Lys), ACA (Thr), AGG (Arg), UUA (Leu)]의 사용빈도는 대장균 유전자들이 사용하는 해당 코돈 빈도에 비해 2.67-14.9배 많았다 (표 1 참조). 따라서 우선 시판되고 있는 E. coli BL21 codonPlus(DE3)-RIL 균주 (stratagene)로부터 E. coli 코돈 AGA (Arg), AUA (Ile), CUA (Leu)들을 지정하는 argU, ileY, leuW의 tRNA 유전자들의 염기서열을 포함하는 pACYC-LIC 벡터 (이하 'RIL codon plasmid'라고 함, PCT/US2000/002002 참조)를 분리하여 E. coli W3110에 형질전환시킨 후 chloramphenicol 존재 하에서 생육시켜 E. coli W3110-RIL를 제조하였다. 이 균주에 Neq HS DNA 중합효소 유전자의 발현벡터, pETRPNEQHS을 형질전환시켜 ampicillin 및 chloramphenicol 존재하에서 형질전환체 (E. coli W3110-RIL/pETRPNEQHS)를 선별하였다. 이 형질전환체 (E. coli W3110-RIL/pETRPNEQHS)는 AGA (Arg), AUA (Ile), CUA (Leu)의 3개의 코돈에 해당하는 tRNA 유전자들 (argU, ileY, leuW)을 갖는 RIL codon plasmid가 E. coli W3110 숙주에 첨가된 것이다. 이 균주를 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 최소배지 (ampicillin 및 chloramphenicol 첨가)에서 37 ℃에서 약 20시간 배양하여 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE 분석은 Quantity One (Bio-rad) 프로그램을 이용하였다. 분석 결과는 발현율이 E. coli W3110/pETRPNEQHS에 비교해 약 8% 정도 증가에 그쳤다. 따라서 나머지 코돈빈도에서 차이가나는 UAU (Tyr), AAA (Lys), AGA (Arg), AUA (Ile), ACA (Thr), AGG (Arg), UUA (Leu) 코돈을 지정하는 tRNA 유전자들 (tyrV , lysT , argU -ileY, thrU , argW , leuZ)을 RIL codon plasmid에 더 삽입하여 아래와 같은 방법으로 RILYKT codon plasmid를 구축하였다 (도 3A).

특히 codon AGA (Arg)와 AUA (Ile)는 상대적으로 많이 필요로 하기 때문에 argU, ileY tRNA 유전자들을 한번 더 삽입하였다. 먼저 RIL codon plasmid 유전자 정보를 알기 위해 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL로부터 RIL codon plasmid를 분리하여 DNA 염기서열을 결정한 후, 제한효소 부위 및 E. coli argU, ileY, leuW tRNA 유전자들이 삽입된 위치를 파악하였다. 이어서 RIL codon plasmid 내에 E. coli argU , ileY , leuW tRNA 유전자들이 tet promoter 하에 SpeI/XhoI 부위에 삽입되어 있었다 (PCT/US2000/002002 참조). 따라서 차후, 클로닝 site로 활용하기위해 XhoI site의 32 bp 아래쪽 (downstream)에 NdeI site를 다음과 같은 방법으로 첨가하였다. 서열 번호 10와 서열번호 10번에 상보적인 서열번호 11를 이용하여 퀵체인지 점 돌연변이 유발방법(QuikChange site-directed mutagenesis method)을 이용한 PCR 방법으로 NdeI site를 첨가한 RIL-Nde codon plasmid를 구축하였다.

서열번호 10 (tRNA Nde): 5'- CTGGCCACGGGTGCATATGATCGTGCTCC-3'

서열번호 11 (tRNA NdeR): 5'-GGAGCACGATCATATGCACCCGTGGCCAG -3'

이어서 RILYKT codon plasmid를 제조하기 위해 코돈 UAU (Tyr), AAA (Lys), AGA (Arg), AUA (Ile), ACA (Thr), AGG (Arg), UUA (Leu)를 지정하는 tyrV , lysT , argU-ileY, thrU, argW , leuZ의 E. coli tRNA 유전자들을 증폭하기 위해 다음과 같이 PCR primer들을 각각 디자인했다. 먼저 E. coli 의 tRNA 유전자 tyrV (참조: 370 bp, GenBank Accession No. U00096의 염기서열 128640 - 1286760)를 PCR 증폭하기 위해 서열번호 12와 서열번호 13을 합성하였다. 참고로 서열번호 12의 경우 RIL-Nde codon plasmid에 클로닝하기 위해 XhoI 절단 부위 (밑줄친 부분)를 삽입하였다.

서열번호 12 (tRNA YXhoF) : 5'-NNNNNNCTCGAGCCTTCCCCGCATGGGCAGAA-3'

서열번호 13 (tRNA YKR) : 5'-GTTAGCACCCGCCGTGCCACCACCATAATTCAC-3'

E. coli 의 tRNA 유전자 lysT (400 bp, GenBank Accession No. U00096의 염기서열 2726261- 2725862)를 PCR 증폭하기 위해 서열번호 14와 서열번호 15를 합성하였다.

서열번호 14 (tRNA YKF) : 5'-GTGAATTATGGTGGTGGCACGGCGGGTGCTAAC-3'

서열번호 15 (tRNA KRR) : 5'-GAACGACCGCGTCTGATTGACTCACCCTGCCCCG-3'

E. coli 의 tRNA 유전자 argU - ileY (437 bp, pACYC-LIC vector의 염기서열 1674 - 2110)를 PCR 증폭하기 위해 서열번호 16과 서열번호 17을 합성하였다.

서열번호 16 (tRNA KRF) : 5'-CGGGGCAGGGTGAGTCAATCAGACGCGGTCGTTC-3'

서열번호 17(tRNA ITR) : 5'-TTGCATAATTTGTTTTATTGTCATCATGTTTATTGCGTGG-3'

E. coli 의 tRNA 유전자 thrU (200 bp, GenBank Accession No. U00096의 염기서열 4173340 - 4173539)를 PCR 증폭하기 위해 서열번호 18과 서열번호 19를 합성하였다.

서열번호 18 (tRNA ITF) : 5'-CCACGCAATAAACATGATGACAATAAAACAAATTATGCAA-3'

서열번호 19 (tRNA TRR) : 5'-CCATTTATGCCGGGTTTTGGCAGATTTACAGTCTGC-3'

E. coli 의 tRNA 유전자 argW (270 bp, GenBank Accession No. U00096의 염기서열 2464242 - 2464511)를 PCR 증폭하기 위해 서열번호 20과 서열번호 21번을 합성하였다.

염기서열 20 (tRNA TRF) : 5'-GCAGACTGTAAATCTGCCAAAACCCGGCATAAATGG -3'

염기서열 21 (tRNA RLR) : 5'-ATCACCAGCAAAGCCACGCGGCTGTCAACGATC-3'

E. coli 의 tRNA 유전자 leuZ (230 bp, GenBank Accession No. U00096의 염기서열 1989717 - 1989956)를 PCR 증폭하기 위해 서열번호 22와 서열번호 23을 합성하였다. 참고로 서열번호 22의 경우 RIL-Nde codon plasmid에 클로닝하기 위해 NdeI 절단 부위 (밑줄친 부분)를 삽입하였다.

서열번호 22 (tRNA RLF) : 5’-GATCGTTGACAGCCGCGTGGCTTTGCTGGTGAT-3’

서열번호 23 (tRNA LNdeR) : 5’-NNNNNNCATATGACTCCGGAACGCGCCTCCAC-3’

위에서 합성한 각각의 PCR primer들을 이용하여 E. coli 의 tRNA 유전자 tyrV, lysT , argU - ileY , thrU , argW , leuZ의 유전자들을 PCR 방법으로 각각 증폭한 후 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동하여 각각 회수하였다. tyrV , lysT , argU - ileY 4가지 DNA 단편을 혼합하여 어닐링 (annealing)한 후 서열번호 12 프라이머와 서열번호 17 프라이머를 첨가하여 tyrV - lysT - argU - ileY tRNA 유전자가 결합된 유전자를 증폭하였다. 동시에 thrU , argW , leuZ 3가지 DNA 단편을 각각 혼합하여 어닐링 (annealing)한 후 서열번호 18 프라이머와 서열번호 23 프라이머를 이용하여 thrU -argW-leuZ tRNA 유전자가 결합된 tRNA 유전자를 증폭하였다. 그리고 다시 tyrV -lysT-argU-ileY 단편과 thrU - argW - leuZ 단편을 각각 혼합하여 어닐링 (annealing)한 후 서열번호 12 프라이머와 서열번호 23 프라이머를 이용하여 tyrV - lysT - argU -ileY-thrU-argW-leuZ tRNA 유전자를 증폭하였다. 최종적으로 구축된 이들 tRNA 유전자들은 RILYKT codon plasmid를 제조하기 위해 코돈 UAU (Tyr), AAA (Lys), AGA (Arg), AUA (Ile), ACA (Thr), AGG (Arg), UUA (Leu)를 지정하는 유전자들이다.

좀 더 구체적으로 설명하면 E. coli의 코돈 UAU (Tyr)를 지정하는 tRNA 유전자 tyrV (370 bp, GenBank Accession No. U00096의 염기서열 128640 - 1286760 참조)를 PCR로 증폭하기 위해서 서열번호 12 프라이머는 tyrV 유전자의 5' 부위에 존재하는 프로모터의 -10 bp 서열이 포함되게 합성하였고, 서열번호 13 프라이머는 tyrV 유전자의 3' 부위의 염기서열에 상보적인 염기서열 (complementary sequence)을 5'→3'으로 합성하되 다음에 구축될 코돈 AAA (Lys)을 지정하는 tRNA 유전자 lysT의 5' 염기서열을 일부를 포함시켰다. 또 tyrV 유전자를 RIL-Nde codon plasmid의 XhoI 부위에 클로닝을 위해 서열번호 12 프라이머는 5' 부위에 제한효소 XhoI 절단부위가 포함시켰다. 이어서, 주형으로 E. coli 게놈 DNA와 서열번호 12 및 13 프라이머를 PCR 반응액 (200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소)에 첨가하여 tyrV 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 3분간 변성반응 후, 94 ℃ 30초, 55 ℃에서30초, 72 ℃에서 30초의 조건으로 30회 반복한 후, 마지막 72 ℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 반응 산물을 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동하여 370 bp의 tyrV DNA 단편을 확인하였다. PCR이 끝난 반응 혼합물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여, PCR을 통해 증폭된 약 370 bp의 DNA 산물을 MEGA-spinTM Agarose Gel Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Inc. Korea)을 사용하여 정제하여 회수하였다.

상기와 유사한 방법으로 코돈 AAA (Lys)을 지정하는 tRNA 유전자 lysT는 E. coli 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 14와 15 프라이머들을 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 프라이머 합성시 유전자들을 연결할 때의 lysT 유전자 앞과 뒤에 오는 tRNA 유전자들을 고려하여 작성하였다. 따라서 서열번호 14는 lysT 유전자의 5'염기서열을 5'→3'으로 합성으로 합성하되 tyrV 유전자의 3' 염기서열 일부를 lysT 유전자서열 앞부분에 포함하여 합성하였다. 서열번호 15 프라이머는 lysT 유전자의 3' 부위의 염기서열에 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성하되 다음에 구축될 argU 유전자의 5' 염기서열을 일부를 포함시켰다. 이어서, E. coli 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 14 및 15 프라이머를 사용하여 상기에 기술한 PCR 반응조건으로 PCR을 수행한 후, 동일한 방법으로 약 400 bp의 lysT 유전자 DNA 산물을 정제하여 회수하였다.

lysT 유전자 단편 다음에 삽입될 2개의 연속된 코돈 AGA (Arg), AUA (Ile)를 각각 지정하는 tRNA 유전자 argU - ileY를 증폭하기 위한 프라이머들의 합성도 상기와 같은 점을 고려하여 합성하였다. 서열번호 16은 lysT 유전자 염기서열 일부를 포함한 argU 염기서열을 5'→3'으로 합성하였다. 서열번호 17은 다음에 구축될 thrU 유전자 염기서열 일부를 포함한 ileY 유전자의 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성한 것이다. 이어서 RIL codon plasmid를 주형으로 서열번호 16과 17 프라머들를 이용하여 상기와 같은 방법으로 PCR 증폭하여 약 437 bp의 argU - ileY 유전자를 정제하여 회수하였다.

코돈 ACA (Thr)를 지정하는 tRNA 유전자 thrU 를 증폭하기 위한 프라이머들의 합성도 상기와 같은 점을 고려하여 합성하였다. 서열번호 18은 ileY 유전자 염기서열 일부를 포함한 thrU 유전자 염기서열을 5'→3'으로 합성한다. 서열번호 19는 다음에 구축될 코돈 AGG (Arg)를 지정하는 argW 유전자 염기서열 일부를 포함한 thrU 유전자의 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성한 것이다. 이어서 E. coli 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 18과 19를 이용하여 상기와 같은 방법으로 PCR 증폭하여 약 200 bp의 thrU 유전자를 정제하여 회수하였다.

코돈 AGG (Arg)를 지정하는 tRNA 유전자 argW를 증폭하기 위한 프라이머들의 합성도 상기와 같은 점을 고려하여 합성하였다. 서열번호 20은 thrU 유전자 염기서열 일부를 포함한 argW 유전자 염기서열을 5'→3'으로 합성한다. 서열번호 21은 leuZ 유전자 염기서열 일부를 포함한 argW 유전자의 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성한 것이다. 이어서 E. coli 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 20과 21을 이용하여 상기와 같은 방법으로 PCR 증폭하여 약 270 bp의 argW 유전자를 정제하여 회수하였다.

마지막으로 코돈 UUA (Leu)를 지정하는 tRNA 유전자 leuZ를 증폭하기 위한 프라이머들의 합성도 상기와 같은 점을 고려하여 합성하였다. 서열번호 22은 E. coli argW 유전자 염기서열 일부를 포함한 leuZ 유전자 염기서열을 5'→3'으로 합성하였다. 서열번호 23은 leuZ 유전자 염기서열의 상보적인 염기서열을 5'→3'으로 합성한 것이다. 참고로 서열번호 23은 유전자 클로닝을 위해 3' 부위에 NdeI site (밑줄친 부분)를 삽입하였다. 이어서 E. coli 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 21과 22를 이용하여 상기와 같은 방법으로 PCR 증폭하여 약 230 bp의 leuZ 유전자를 정제하여 회수하였다.

최종적으로 상기의 방식으로 제작한 프라이머와 PCR 방법을 이용하여 tyrV (370 bp), lysT (400 bp), argU - ileY (437 bp : RIL codon plasmid로부터 증폭), thrU (200 bp), argW (270 bp), leuZ (230 bp)의 tRNA 유전자 DNA 단편들을 각각 증폭하여 정제 회수하였다. 회수된 tyrV , lysT , argU - ileY 유전자 DNA 단편들을 1:1:1 비율로 혼합하여 어닐링 (annealing)한 후 서열번호 12 프라이머와 서열번호 17 프라이머를 이용하여 상기에 기술한 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 tyrV -lysT-argU-ileY 유전자 DNA 단편을 증폭하여 1,207 bp 단편을 얻었다. 동시에 thrU, argW , leuZ 유전자 DNA 단편들을 1:1:1 비율로 각각 혼합하여 어닐링 (annealing)한 후 서열번호 18 프라이머와 서열번호 23 프라이머를 이용하여 thrU -argW-leuZ 유전자를 증폭하여 700 bp 단편을 얻었다. 그리고 다시 tyrV - lysT - argU -ileY 유전자 DNA 단편과 thrU - argW - leuZ 유전자 DNA 단편을 각각 혼합하여 어닐링 (annealing)한 후 서열번호 12 프라이머와 서열번호 23 프라이머를 이용하여 tyrV -lysT-argU-ileY-thrU-argW-leuZ 유전자를 증폭하여 1907 bp 단편을 얻었다.

상기 증폭된 유전자를 아가로스 겔에 전기영동하여 상기의 아가로스 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 tRNA 유전자 단편을 XhoI/NdeI으로 절단하여, 동일한 제한효소 XhoI/NdeI으로 절단된 RIL-Nde codon plasmid에 삽입하여 T4 DNA 연결효소를 사용하여 연결시킨 후, 대장균 W3110에 형질전환시켰다. 형질전환체들로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 XhoI 및 NdeI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 tRNA 유전자가 발현벡터 내에 정확히 삽입되었다는 것을 재확인하였다. 상기와 같이 구축된 tRNA 유전자의 발현을 위한 발현벡터를 RILYKT codon plasmid (서열번호 24)로 명명하였고, RILYKT codon 플라스미드를 형질전환시킨 재조합 균주 Escherichia coli W3110-RILYKT라고 명명하였다.

상기 실시예 1의 방법에 의해 제조된 pETRPNEQHS 플라스미드를 E. coli W3110, E. coli W3110-RIL, E. coli W3110-RILYKT에 각각 형질전환 시킨 후 각각의 발현 양을 비교해 보았다. 그 결과 Neq HS DNA polymerase의 발현율은 E. coli W3110 보다 E. coli W3110-RIL에서는 약 8% 정도 약간 증가하였으나, E. coli W3110-RILYKT에서는 E. coli W3110 보다 약 55%로 크게 증가함을 확인하였다 (도 3B).

실시예 3: 돌연변이 Neq HS DNA 중합효소 유전자들의 제조

퀵체인지 점 돌연변이 유발방법(QuikChange site-directed mutagenesis method)을 이용하여, Neq HS DNA 중합효소 유전자 (서열번호 5)에 점 돌연변이(point mutation)를 유발하였다(Stratagene사의 QuikChange^? Site-Directed Mutagenesis Kit의 제품사용 매뉴얼 참조). Neq DNA 중합효소를 기준으로 523번 위치의 알라닌(Ala)을 알지닌(Arg), 540번 위치 아스파라진(Asn)을 알지닌(Arg), 185번 위치 세린(Ser)을 아스파틱에시드(Asp)으로 각각 돌연변이 타깃으로 선정하였다. Neq HS DNA 중합효소 유전자로부터 Neq HS 돌연변이 중합효소 유전자를 얻기 위한 프라이머들은 표 2에 나타냈다.

먼저 Neq HS DNA 중합효소 유전자를 주형으로 이용하여 523번 위치 알라닌(Ala)에 해당하는 유전자를 알지닌(Arg)으로 치환시킨 A523R을 제조하였다. 이미 인테인이 제거된 Neq DNA 중합효소의 돌연변이체 Neq A523R은 wild-type Neq DNA 중합효소보다 PCR 속도 및 증폭율이 우수한 것이 보고되었기 때문에 A523R을 선정하였다(Song J. G. et al ., 2010, Protein Engineering, Design & Selection 23: 835-842; 및 대한민국 특허등록 제 10-1105271 참조). Neq HS A523R DNA 중합효소 유전자 구축을 위한 PCR은 0.05 ㎍ pETRPNEQHS plasmid를 주형으로 하여 20 pmole의 5'말단 프라이머 A523RF 및 3'말단 프라이머 A523RR (표 2), 200 μM dNTPs, 10X PyroAce DNA 중합효소 완충용액 및 2.5 U Super PyroAce DNA 중합효소로 이루어진 혼합 조성액을 95℃에서 30초간 반응시킨 후 94 ℃ 30초, 55 ℃에서 1분, 68 ℃에서 7분의 조건으로 12회 반복한 후, 마지막 68 ℃에서 10분간 반응시켰다. 원래의 주형 DNA를 제거하기 위해 메틸화된 DNA (methylated DNA)만 특이적으로 절단하는 제한효소 DpnI을 37 ℃에서 1시간 처리한 후, 절단되지 않은 PCR 증폭된 돌연변이 DNA (PCR 산물은 메틸화 되지 않음)를 대장균 DH5α(Stratagene, USA)에 형질전환시켰다. 형질전환체들로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, DNA 염기서열 결정에 의해 A523R로 치환되었음을 확인하였다 (서열번호 31). 이 Neq HS DNA 중합효소 유전자를 A523R로 치환시킨 Neq HS A523R DNA 중합효소를 간략하게 Neq HS M1 DNA 중합효소로 명명하였다. 이 Neq HS M1 DNA 중합효소 유전자의 염기서열을 기반으로 아미노산 서열을 결정하였다 (서열번호 32). 이 Neq HS M1 DNA 중합효소가 구축된 발현벡터를 pETRPNEQHSM1이라고 명명하였다.

다음은 Neq HS A523R DNA 중합효소 (Neq HS M1 DNA 중합효소) 유전자를 주형으로 이용하여 540번 위치 아스파라진(Asn)을 알지닌(Arg)으로 치환시킨 이중 돌연변이체 Neq HS A523R/N540R DNA 중합효소를 제조하였다. PCR 반응액 조성 및 방법은 주형 plasmid로 0.05 ㎍ pETRPNEQHSM1과 20 pmole의 5'말단 프라이머 N540RF 및 3'말단 프라이머 N540RR (표 2)를 사용한 것만 다르고 나머지는 동일한 조성이며, 또 동일한 PCR 방법으로 수행하여 DpnI을 처리한 후, 돌연변이체 플라스미드들을 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 염기서열 결정에 의해 N540R로 치환된 형질전환체를 선별 확인하였다 (서열번호 33). 이 Neq HS A523R DNA 중합효소 유전자가 N540R로 치환된 Neq HS A523R/N540 DNA 중합효소를 간략하게 Neq HS M2 DNA 중합효소로 명명하였다. 이 Neq HS M2 DNA 중합효소 (A523R/N540R로 이중 치환된 Neq HS DNA 중합효소) 유전자의 염기서열을 기반으로 아미노산 서열을 결정하였다(서열번호 34). 이 Neq HS M2 DNA 중합효소가 구축된 발현벡터를 pETRPNEQHSM2이라고 명명하였다.

세 번째로 Neq HS A523R/N540R DNA 중합효소 (Neq HS M2 DNA 중합효소) 유전자를 주형으로 이용하여 185번 위치 세린(Ser)을 아스파틱에시드(Asp)로 치환시킨 삼중 돌연변이체 Neq HS A523R/N540R/S185D DNA 중합효소를 제조하였다. PCR 반응액 조성 및 방법은 주형 plasmid로 0.05 ㎍ pETRPNEQHSM2와 20 pmole의 5'말단 프라이머 S185DF 및 3'말단 프라이머 S185DR (표 2)를 사용한 것만 다르고 나머지는 동일한 조성이며, 또 동일한 PCR 방법으로 수행하여 DpnI을 처리한 후, 돌연변이체 플라스미드들을 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 염기서열 결정에 의해 S185D로 치환된 형질전환체를 선별 확인하였다 (서열번호 35). 이 A523R/N540R/S185D로 삼중 치환된 Neq HS DNA 중합효소를 간략하게 Neq HS M3 DNA 중합효소로 명명하였다. 또 Neq HS M3 DNA 중합효소 유전자의 염기서열을 기반으로 아미노산 서열을 결정하였다 (서열번호 36). 이 Neq HS M3 DNA 중합효소가 구축된 발현벡터를 pETRPNEQHSM3이라고 명명하였다.

또한, E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHS, E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM1, E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM2 및 E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM3로부터 발현된 각각의 단백질을 상기와 동일하게 Neq HS DNA 중합효소, Neq HS M1 DNA 중합효소, Neq HS M2 DNA 중합효소 및 Neq HS M3 DNA 중합효소라고 명명하였다.

이중에서 pETRPNEQHS 유전자를 포함하는 발현벡터 및 발현벡터를 포함한 대장균을 한국미생물보존센터에(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울 서대문구 홍제1동 361-221) 2013년 8월 29일에 기탁유전자명은 Escherichia coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHS, 기탁번호 KCCM11448P로 기탁하였고, pETRPNEQHSM3 유전자를 포함하는 발현벡터 및 발현벡터를 포함한 대장균의 기탁유전자명은 Escherichia coli W3110-RILYKT / pETRPNEQHSM3, 기탁번호 KCCM11449P로 기탁하였다.

[표 2]

실시예 4: 재조합 Neq HS DNA 중합효소 유전자 및 돌연변이 DNA 중합효소의 발현과 정제방법

상기 실시예 2의 방법에 의해 제조된 E. coli W3110-RILYKT 숙주에 상기 실시예 1과 3에서 제조한 플라스미드들을 형질전환시킨 재조합 균주 E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHS, E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM1, E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM2 및 E. coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM3으로부터 Neq HS DNA 중합효소 및 돌연변이체 M1, M2, M3 DNA 중합효소들을 각각 발현시킨 후, 발현된 단백질들이 인테인 스플라싱이 일어나지 않도록 저온에서 4종류의 Neq HS DNA 중합효소들을 아래와 같이 동일한 방법으로 정제하였다.

상기 실시예 1에서 각각의 재조합 플라스미드를 가지고 있는 E. coli W3110-RILYKT를 최종농도 100 ug/ml 암피실린과 34 ug/ml 클로람페니콜이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 배양액 5 ml을 취하여 100 ug/ml 암피실린과 34 ug/ml 클로람페니콜이 최종농도로 첨가된 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 한정 배지 500 ml에 접종하여 37 ℃에서 20 시간 각각 배양하였다. 6,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 균체 (3.0 g/ wet weight)를 회수한 다음 1 mM PMSF가 포함된 20 ml의 완충용액 A (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.3 M NaCl)에 현탁하여 초음파로 파쇄한 후 18,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 대장균 세포 파편 (cell debris)을 제거하였다. 상기 상층액을 완충용액 A로 평형화사킨 HisTrap^TM HP 컬럼 (GE Healthcare)에 결합시킨 후, 동일한 완충용액 A로 충분히 씻었다. 컬럼에 결합한 단백질들을 동일한 완충용액에서 0 - 0.5 M imidazole gradient로 용출하였다. DNA 중합효소가 들어 있는 피크 프랙션들 (peak fractions)을 선택하여 완충용액 B (20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 M NaCl, 1 mM DDT)에 충분히 투석 (dialysis) 하였다. 참고로 완충용액 B에 1 mM DTT를 첨가하지 않으면 DNA 중합효소들의 침전이 일어날 수 있다. 충분히 투석한 시료를 완충용액 B로 평형화시킨 음이온교환 컬럼 (anion-exchange column)인 HiTrap Q 컬럼 (GE Healthcare)에 통과시켰다. 이때 DNA 중합효소들은 컬럼에 결합하지 않고 그대로 통과되며, HisTrap^TM HP 컬럼에 함께 결합했다가 함께 용출된 소수의 대장균 유래의 단백질들이 HiTrap^TM Q 컬럼에 결합되므로 제거시킬 수 있다. HiTrap^TM Q 컬럼에 결합하지 않고 바로 용출된 DNA 중합효소의 시료들을 모아서 0.2 N HCl 용액을 이용하여 pH 7.0로 조정한 후, 바로 완충용액 C (20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 0.1 M NaCl)로 평형화시킨 양이온교환 컬럼 (cation-exchange column)인 HiTrapTM SP 컬럼 (GE Healthcare)에 결합시겼다. 컬럼을 완충용액 C로 충분히 씻은 후, 컬럼에 결합된 DNA 중합효소를 동일한 완충용액에서 0.1 - 1 M NaCl로 용출하였다. 상기와 같은 방법으로 최종 정제된 DNA 중합효소들은 저장 완충용액 (storage buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% Glycerol)에 투석한 다음, -20℃에 보관하면서 PCR을 수행할 때 사용되었다. 정제된 단백질을 브래드포드 분석(Bradford Assay)으로 단백질을 정량하였다. 참고로 재조합 플라스미드 pETRPNEQHS를 가지는 Escherichia coli W3110-RILYKT로부터 DNA 중합효소를 정제하는 데 있어, 각각 정제 단계별 결과는 하기 표 3 와 같이 예로 들었다. 정제된 Neq HS DNA 중합효소의 비활성도(specific activity)는 2.27 U/mg 이다.

[표 3]

Neq HS 돌연변이체 DNA 중합효소들의 정제도 상기의 동일한 과정을 통해 정제하였다. Neq HS M1 DNA 중합효소, Neq HS M2 DNA 중합효소 및 Neq HS M3 DNA 중합효소 비활성도(specific activity)는 각각 2.33 U/mg, 2.32 U/mg, 및 2.55 U/mg 이다.

이 때 1유닛(U)은 75℃에서 30분간 10 nmol의 dNTP가 산불용성 형태로 삽입되기 위해 필요한 DNA 중합효소의 양으로 정의하였다(참조: Choi J. J. et al ., 2006, J. Mol . Biol . 356:1093-106).

정제 단계별 단백질의 양은 브래드포드 분석(Bradford Assay)을 사용하여 결정하였다 (참조: Bradford M.M., 1976, Anal. Biochem. 72, 248-54). 또한, 변성 겔 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하여 Neq HS DNA 중합효소를 정제 단계에 따른 정제 정도와 동일한 과정을 거쳐 정제한 Neq HS 돌연변이 DNA 중합효소들의 정제 정도를 확인하였다 (도 4 참조). 도 4A는 pETRPNEQHS유래의 Neq HS DNA 중합효소의 정제과정으로 lane 1은 LB 배지에서 배양한 대장균 W3110-RILYKT / pETRPNEQHS 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 2는 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 한정 배지에서 배양한 대장균 W3110-RILYKT / pETRPNEQHS 균체의 초음파 파쇄 시료, lane 3는 HisTrap^TM HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 4는 HiTrap^TM Q HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료, lane 5는 HiTrap^TM SP HP 컬럼 크로마토그래피 후의 시료이다. tryptophan이 일부 존재하는 LB 배지보다는 tryptophan이 완전히 결핍된 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 한정 배지에서 trp promoter에 의해 Neq HS DNA 중합효소 유전자가 발현이 잘 되었다. SDS-PAGE를 통해 Neq HS DNA 중합효소의 DNA 염기서열로부터 환산된 분자량 (MW: 110306.24 Da)과 유사한 약 110 kDa으로 확인되었다. 도 4B는 돌연변이 DNA 중합효소들을 상기의 pETRPNEQHS 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 정제방법과 동일한 방법으로 최종 정제하여 SDS-PAGE 분석결과이다. Lane 1은 Neq HS DNA 중합효소, Lane 2는 Neq HS M1 DNA 중합효소, Lane 3는 Neq HS M2 DNA 중합효소, Lane 4는 Neq HS M3 DNA 중합효소이다. 이들 돌연변이 DNA 중합효소들의 분자량이 거의 유사한 약 110 kDa으로 확인되었다. Lane M은 단백질 저분자량 마커 (low molecular weight marker)를 나타낸다.

실시예 5: Neq HS DNA 중합효소를 이용한 온도와 반응시간에 대한 단백질 스플라이싱 효과 비교

고온이 단백질 스플라이싱에 미치는 영향을 살펴보기 위해 상기 실시예 4에서 정제된 Neq HS DNA 중합효소를 단백질 스플라이싱 반응용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl)에 30 pmole 씩 첨가하여 50-95 ℃ 범위에서 1, 5 및 10분간 반응시킨 다음, SDS-PAGE을 통해 분석하였다. 그 결과를 도 5A에 나타내었는데, 반응 혼합물에 넣어준 정제된 Neq HS DNA 중합효소(분자량 약 110 kDa)의 양이 감소함과 함께 단백질 스플라이싱 산물인 Neq C (Neq DNA 중합효소, 분자량 약 94 kDa)의 양이 증가함을 알 수 있었고, 단백질 스플라이싱은 70 ℃ 이상에서만 발생함을 알 수 있었으며, 95 ℃에서 최대로 발생함을 알 수 있었다. 또 반응 시간이 경과함에 따라 단백질 스플라이싱이 많이 발생함을 알 수 있었다. 도 5A는 정제된 Neq HS DNA 중합효소를 이용하여 반응 온도 및 시간별로 단백질 스플라이싱을 분석한 결과들을 나타낸 것으로서, 도 5A에서 레인 M은 단백질 저분자량 마커를 로딩한 것이다.

도 5B는 상기 온도와 반응시간에 따른 Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소의 활성을 측정한 결과이다. DNA 중합효소활성은 다음과 같이 측정되었다(Choi, J. J. et al ., 2006, J. Mol . Biol . 356, 1093-1106 참조). 정제된 단백질, 1 ㎍ 활성화된 송아지 흉선 DNA (activated calf thymus DNA), 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 100 μM dATP, 100 μM dCTP, 100 μM dGTP, 10 μM dTTP 및 0.25 μCi [methyl-3H] TTP로 구성된 반응 혼합물 (50 ㎕)을 75℃에서 10분간 반응시킨 다음, 얼음에서 급냉시킨 후, DE81 필터 페이퍼 디스크 (DE81 filter paper disc, 23 ㎜, Whatman Co., 영국)에 점적하였다. 반응액이 점적된 DE81 필터 페이퍼 디스크를 65 ℃에서 건조시킨 다음, 0.5 M 소듐 포스페이트 (sodium phosphate, pH 7.0) 완충용액에 10분간, 70% 에탄올 (ethanol)에 5분간 순서대로 세척 (washing)한 후, 다시 65℃에서 건조시켰다. 이렇게 준비된 DE81 필터 페이퍼 디스크의 방사능 (incorporated radioactivity)을 LS6500 섬광 계수기 (LS6500 scintillation counter, Beckman Co., 미국)를 이용하여 측정함으로써 DNA 중합 활성을 확인하였다. 이 때 30 pmole의 Neq P (인테인 암호화 부위를 제외시킨 Neq L 대 단편 유전자의 익스테인 암호화 부위와 Neq S 소 단편 유전자의 익스테인 암호화 부위를 재조합시켜서 하나의 폴리펩타이드 형태로 발현시켜 얻은 DNA 중합효소)의 활성을 100%으로 기준하였으며, Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소의 활성을 측정한 결과를 도 5B에 도시하였다. 온도와 반응시간에 따른 Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소 활성은 70℃ 이하에서는 거의 미미한 수준이었으나, 95 ℃에서 최대로 높음을 알 수 있었다(도 5B). 이러한 결과는 도 5A의 변성 겔 전기영동을 통해 분석한 결과와 잘 일치하였다.

실시예 6: PCR 반응 싸이클 횟수에 따른 Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 효과 관찰

PCR 장치를 이용하여 일반적인 PCR 조건에서 단백질 스플라이싱 효과를 관찰하기 위해 상기 실시예 4에서 정제된 Neq HS DNA 중합효소를 단백질 스플라이싱 반응용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl)에 각각 30 pmole 씩 첨가하여 PCR 반응을 0, 1, 2, 3 4, 5, 10, 20 및 30 싸이클을 각각 수행한 후 변성 겔 전기영동을 통해 분석하였다. 이 때 PCR 반응 조건은 94 ℃에서 20초, 63 ℃에서 20초, 72 ℃에서 20초를 1 싸이클로 하였으며, PCR 싸이클을 수행하기 전에 프리디네이쳐(predenature) 과정을 95 ℃에서 0분, 95 ℃에서 1분, 95 ℃에서 3분으로 각각 나누어서 수행하였다.

그 결과, 반응 혼합물에 넣어준 정제된 Neq HS DNA 중합효소 (약 110 kDa) 양이 감소함과 함께 단백질 스플라이싱 산물인 Neq C (Neq DNA 중합효소, 약 94 kDa ) 양이 증가함을 알 수 있었는데, 단백질 스플라이싱은 PCR 싸이클 횟수가 증가함에 따라 잘 일어남을 알 수 있었다 (참조: 도 6A). 또 PCR 싸이클의 초기 상태에서 단백질 스플라이싱은 프리디네이쳐 시간에도 영향을 받았으나, PCR 싸이클 횟수가 증가할수록 프리디네이쳐 시간에 영향을 받지 않고 단백질 스플라이싱이 잘 일어났다(참조: 도 6A). 도 6B는 PCR 싸이클 횟수에 따른 DNA 중합효소 활성을 상기 실시예 5에서와 같이 DNA 중합효소활성을 측정한 결과이다. 이 때 30 pmole의 Neq P의 활성을 100%으로 기준하였으며, Neq HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소의 활성을 측정한 결과는 도 6A의 결과와 유사하였다 (참조: 도 6B). 초기에 Neq C가 많이 만들어질 경우 스미어(smear) 현상이 생기게 된다. 그러나 Neq HS DNA 중합효소의 경우 싸이클이 증가함에 따라 인테인이 제거된 활성화된 Neq C가 생성되기 때문에 스미어 현상을 극복할 수 있었다.

실시예 7: Neq HS DNA 중합효소 및 돌연변이체 DNA 중합 효소들의 PCR 최적 조건 결정

Neq HS DNA 중합효소, Neq HS M1, Neq HS M2 및 Neq HS M3 DNA 중합효소들을 PCR에 이용하기 위해서는 최적 PCR 반응액의 조성을 결정하여야 한다. 우선, 기본 PCR 반응용액을 아래와 같이 설정하고 pH 또는 각 성분의 농도를 조금씩 변화시키면서 최적화하였다. 즉, 50 ul의 기본 PCR 반응용액 내에 40 mM Tricine-KOH (pH 8.0), 주형으로 50 ng의 human genomic DNA, 각 20 pmole의 β-globin 5' 말단 프라이머 (MP_β_globin_F : 5'- TCCCTCTCAACCCTACAGTCACCCATTTGG - 3') 및 3' 말단 프라이머 (MP_β_globin_R : 5'- CAGTCATGGACAATAACCCTCCTCCCAGGT - 3'), 200 μM dNTPs, 정제된 Neq HS DNA 중합효소, 1 mM MgCl₂, 80 mM KCl 및 0.15% BSA 및 1 mM DTT이 첨가되어 있다. 참고로 효소 첨가양은 50 ul의 PCR 반응용액에 Neq HS DNA 중합효소와 Neq HS M1 DNA 중합효소는 50 ng, Neq HS M2 DNA 중합효소 40 ng 및 Neq HS M3 DNA 중합효소는 90 ng을 효소의 특성에 맞게 각각 다르게 첨가하여 수행하였다. 이 반응혼합액을 95 ℃에서 3분 반응시킨 후, 95 ℃ 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 반응시켰다. 그 후 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과를 확인하였다.

PCR에 있어 Neq HS DNA 중합효소 및 그의 돌연변체들의 pH의 영향을 조사한 결과, PCR 반응 완충용액의 최적 pH는 Neq HS DNA 중합효소의 경우 pH 7.6, Neq HS M1과 Neq HS M2 DNA 중합효소는 동일하게 pH 7.8이며, Neq HS M3 DNA 중합효소는 pH 8.6으로서 다소 차이가 있었다 (도 7A 참조). 도 7A에서 M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타내고, 각각의 lane은 pH를 나타낸 것이다. PCR 증폭 크기는 850 bp이다.

PCR에 있어 Neq HS DNA 중합효소 및 그의 돌연변체들의 2가 양이온 Mg² ⁺의 영향을 조사한 결과, 최적 농도는 Neq HS DNA 중합효소의 경우 1.0 mM, Neq HS M1 DNA 중합효소는 1.25 mM, Neq HS M2 DNA 중합효소는 1.5 mM이며, Neq HS M3 DNA 중합효소는 0.75 mM로서 다소 차이가 있었다(도 7B). 각각의 lane은 MgCl₂ 농도를 나타낸 것이다.

Neq HS DNA 중합효소, Neq HS M1, Neq HS M2 및 Neq HS M3 돌연변이 DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 KCl의 영향을 조사한 결과, 최적 KCl 농도는 각각 80, 70, 90 및 80 mM로 다소 차이가 있었다 (도 7C 참조). 각각의 lane은 KCl 농도를 나타낸 것이다.

Neq HS DNA 중합효소, Neq HS M1, Neq HS M2 및 Neq HS M3 DNA 중합효소들 모두가 PCR에 이용 가능함을 알 수 있었다. 따라서 Neq HS DNA 중합효소 및 이들 돌연변이체들의 최적 PCR 완충용액 조성을 안정제인 0.015% BSA와 1 mM DTT를 포함시켜서 결정하였다. Neq HS DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성은 40 mM Tricine-HCl (pH 7.6), 80 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0.015% BSA, 1 mM DTT로 결정하였다. 또한 Neq HS DNA M1 DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성은 40 mM Tricine-HCl (pH 7.8), 70 mM KCl, 1.25 mM MgCl₂, 0.015% BSA, 1 mM DTT로 결정하였다. Neq HS M2 DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성은 40 mM Tricine-HCl (pH 7.8), 90 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.015% BSA, 1 mM DTT로 결정하였다. Neq HS M3 DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 PCR 완충용액의 조성은 40 mM Tricine-HCl (pH 8.6), 80 mM KCl, 0.75 mM MgCl₂, 0.015% BSA, 1 mM DTT로 결정하였다.

실시예 8: DNA 중합 효소들의 PCR 효율성 분석

먼저 Neq HS DNA 중합효소 및 그의 돌연변이체 DNA 중합효소들 (M1, M2, M3)의 DNA 증폭의 정확성과 효율성을 검증하기 위해 주형 (template) DNA로서 인간 유전체를 이용하여 hemoglobin 유전자의 194 bp 단편, β-globin 유전자의 850 bp 단편, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse 유전자의 2.7 kb 및 6.25 kb를 타깃으로 선정하여 각각 수행하였다.

먼저 인간 유전체의 hemoglobin 유전자의 194 bp 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응용액 (50 ul)을 아래와 같이 구성하였다. 타깃으로 하는 10 pmol의 정방향 프라이머(5'-ACATTTGCTTCTGACACAACTG-3')와 역방향 프라이머(5'-TCCACATGCCCAGTTTCTATT-3'), 50 ng의 인간 유전체 DNA, 250 μM dNTPs, DNA 중합효소, 상기에서 결정된 각 DNA 중합효소들의 최적 PCR 완충용액을 각각 첨가하여 구성하였다. 참고로 DNA 중합효소 첨가양은 50 ul의 PCR 반응용액에 Neq HS DNA 중합효소와 Neq HS M1 DNA 중합효소는 50 ng, Neq HS M2 DNA 중합효소 40 ng 및 Neq HS M3 DNA 중합효소는 90 ng을 효소의 특성에 맞게 각각 다르게 첨가하였으며, 최적 PCR 완충용액도 효소마다 약간 다르다. PCR 반응은 95°C에서 3분간 변성, 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초로 30회 반복하여 수행하였다. 생성된 증폭 산물의 길이를 확인하기 위해서 마지막으로 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다 (도 8A). Lane 1은 Neq HS DNA 중합효소, Lane 2는 Neq HS M1 DNA 중합효소, Lane 3는 Neq HS M2 DNA 중합효소, Lane 4는 Neq HS M3 DNA 중합효소이다. Lane M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다. 여기에서 Neq HS M3 DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소들 보다 타깃 DNA의 증폭량이 많음을 확인하였다.

또한 인간 유전체의 β-globin 유전자 850 bp를 또 다른 PCR 증폭 타깃으로 선정하여 Neq HS DNA 중합효소와 이들 돌연변이체들의 PCR 성능을 비교해 보았다. β-globin 유전자의 850 bp 단편을 타깃으로 하는 10 pmol의 정방향 프라이머(5'-TCCCTCTCAACCCTACAGTCACCCATTTGG-3')와 역방향 프라이머(5'-CAGTCATGGACAATAACCCTCCTCCCAGGT-3')를 사용하였다. PCR 반응액에 첨가한 프라이머만 다르고 PCR 반응액 및 PCR 수행조건은 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 생성된 증폭 산물의 길이를 확인하기 위해서 마지막으로 전기영동을 수행하였다 (도 8B). 여기에서도 Neq HS M3 DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소들보다 타깃 DNA의 증폭량이 많음을 확인하였다.

마지막으로 인간 유전체의 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse 유전자 2.7 kb와 6.25 kb를 또 다른 PCR 증폭 타깃으로 선정하였다. 우선 2.7 kb 타켓을 증폭하기 위한 정방향 프라이머(5'-TGGGATTACACGTGTAACCAACC-3')와 역방향 프라이머 (5'-TGTGACACAGGCAGACTGTGGATC-3')를 사용하였고, 6.25 kb 타깃을 증폭하기 위한 정방향 프라이머 (5'-TGTGGCAGAAGCAGTGAGTAACTG-3')와 역방향 프라이머는 2.7 kb의역방향 프라이머와 동일한 프라이머를 사용하여 상기와 같은 PCR 반응 혼합액으로 PCR을 수행하였다. 2.7 kb의 타깃을 증폭을 위한 PCR 반응은 95 ℃에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 3분으로 반복하여 수행하였고, 6.25 kb의 타깃을 증폭을 위한 PCR 반응은 95 ℃에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 6분으로 반복하여 수행하였고. 생성된 증폭 산물의 길이를 확인하기 위해서 마지막으로 전기영동을 수행하였다 (도 8C, D). 여기에서도 Neq HS M3 DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소들보다 타깃 DNA의 증폭량이 많음을 확인하였다. Lane 1은 Neq HS DNA 중합효소, Lane 2는 Neq HS M1 DNA 중합효소, Lane 3는 Neq HS M2 DNA 중합효소, Lane 4는 Neq HS M3 DNA 중합효소이다. Lane M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다.

또한, Neq HS M3 DNA 중합효소와 시중에 판매되고 있는 DNA 중합효소의 DNA 증폭의 정확성과 효율성을 검증하기 위해 주형 (template) DNA로서 인간 유전체를 이용하여 β-globin 유전자의 1.4 kb 단편과 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse 유전자 2.7 kb와 6.25 kb를 PCR 증폭 타깃으로 선정하였다. 사용된 DNA 중합효소들은 Neq HS M3 DNA 중합효소, 1.25 U의 HS Taq DNA 중합효소(Takara, Roche), 1.25 U의 Taq DNA 중합효소(Takara) 및 1.5 U Pfu DNA 중합효소(Promega)를 각각 사용하였다. 인간 유전체의 β-globin 유전자의 1.5 kb 단편을 타깃으로 하는 10 pmol의 정방향 프라이머(5'-TCTAATCTCCCTCTCAACCCTACAGTCACC-3')와 역방향 프라이머(5'-TGGAAATGATCAGGCTTGGATTCAAAG-3'), 50 ng의 인간 유전체 DNA, 250 μM dNTPs으로 PCR 반응용액을 구성하였으며, 각각의 최적화된 버퍼를 반응 용액에 각각의 DNA 중합효소를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 90초로 30회 반복하여 수행하였다. 또한 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferse 유전자 2.7 kb와 6.25 kb의 프라이머는 상기의 것을 사용하였으며, 2.7 kb 타깃을 증폭을 위한 PCR 조건은 95 ℃에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 3분으로 반복하여 수행하였고, 6.25 kb 타깃을 증폭을 위한 PCR 조건은 95 ℃에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 6분으로 반복하여 수행하여 생성된 증폭 산물의 길이를 확인하기 위해서 마지막으로 전기영동을 수행하였다 (도 9). Lane 1은 Neq HS M3 DNA 중합효소, Lane 2는 HS Taq DNA 중합효소 (Roche), Lane 3는 HS Taq DNA 중합효소 (Takara), Lane 4는 Taq DNA 중합효소 (Takara), Lane 5는 Pfu DNA 중합효소 (Promega)이다. Lane M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다. 여기에서도 Neq HS M3 DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소들 (핫 스타트용 DNA 중합효소 포함) 보다 타깃 DNA의 증폭량이 많음을 확인하였다. 또 길이가 긴 타깃 DNA (6.25 kb) 증폭에서도 우수하였다 (도 9).

PCR에서 발생하는 교차 오염을 방지하기 위한 방법으로서, dTTP 대신 dUTP를 넣어서 PCR을 수행하는 방법이 롱고(Longo) 등에 의해 제시되었다(Longo M. C. et al., 1990, Gene 93:125-128). 따라서 Neq HS M3 DNA 중합효소와 시중에 판매되고 있는 다른 DNA 중합효소들의 dTTP 대신에 dUTP의 PCR 반응에 이용 가능성을 검증하였다. 인간 유전체를 주형으로 이용하여 erythropoietin, hemoglobin, β-actin, β-globin 유전자의 단편들을 타깃으로 하는 프라이머들과 dTTP 대신에 dUTP를 반응액에 첨가하는 것 외에는 상기 PCR 반응액과 동일하다. 각 타깃 크기와 프라이머 서열들은 다음과 같다: erythropoietin (194 bp, 정방향 프라이머; 5'-TTGGGGATGGCAAAAACCTGACCTGTG-3'와 역방향 프라이머 5'-GCATCCACTTCTCCGGCCAAACTTCAAT-3'), hemoglobin (400 bp, 정방향 프라이머; 5'-TCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCC-3'와 역방향 프라이머; 5'-AAGGTGCCCTTGAGCTTGTCCAGGTGAG-3'), β-actin (600 bp, 정방향 프라이머; 5'-TCTTGTCCTTTCCTTCCCAGGGCGTG-3'와 역방향 프라이머; 5'-CTGGGGTCTTGGGATGGGGAGTCTGTT-3') 및 β-globin (865 bp, 정방향 프라이머; 5'-TCCCTCTCAACCCTACAGTCACCCATTTGG-3'와 역방향 프라이머; 5'-CAGTCATGGACAATAACCCTCCTCCCAGGT-3'). PCR 반응은 95°C에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 64 ℃에서 30초, 72 ℃에서 60초로 30회 반복하여 증폭하였다. 타켓 단편을 증폭하여 수행한 결과를 전기영동으로 확인하였다(도 10). 여기에서도 Neq HS DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소들 보다 특이적으로 타깃 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다. 특히 Pfu DNA 중합효소의 경우 dUTP를 이용할 수 없기 때문에 전혀 증폭되지 않았다. Lane 1은 Neq HS M3 DNA 중합효소, Lane 2는 HS Taq DNA 중합효소 (Roche), Lane 3는 HS Taq DNA 중합효소 (Takara), Lane 4는 Taq DNA 중합효소 (Takara), Lane 5는 Pfu DNA 중합효소 (Promega)이다. Lane M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다.

마지막으로 DNA 증폭의 정확성과 임상진단의 가능성을 검증하기 위해 multiplex PCR 수행하였다. 반응 혼합액에 erythropoietin (194bp), hemoglobin (400bp), β-actin (600bp) 및 β-globin (865bp)을 PCR 증폭 타깃으로 하는 5 pmol의 각각의 프라이머들을 함께 넣고, 각각의 DNA 중합효소 및 PCR 최적완충용액, 50 ng의 인간 유전체 DNA, 250 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)으로 PCR 반응용액을 구성하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 3분간 변성, 94 ℃에서 30초, 64 ℃에서 30초, 72 ℃에서 60초로 30회 반복하여 수행한 결과를 전기영동으로 확인하였다(도 11). 결과적으로 Neq HS M3 DNA 중합효소가 다른 DNA 중합효소에 비해 더 정확히 많은 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다. Lane 1은 Neq HS M3 DNA 중합효소, Lane 2는 HS Taq DNA 중합효소 (Roche), Lane 3는 HS Taq DNA 중합효소 (Takara), Lane 4는 Taq DNA 중합효소 (Takara), Lane 5는 Pfu DNA 중합효소 (Promega)이다. Lane M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다. 상기의 multiplex PCR에서 핫 스타트 PCR용 DNA 중합효소들만이 4가지 타깃 유전자를 증폭하는 것이 가능했다.

실시예 9: DNA 중합 효소들의 정확성 조사

Neq HS DNA 중합효소, Neq HS M1, Neq HS M2 및 Neq M3 HS DNA 돌연변이체 중합효소들과 Pfu DNA 중합효소와의 PCR 정확성 (PCR fidelity)을 비교하였다. PCR 정확성 (PCR fidelity)의 측정방법은 룬드버그 (Lundberg)의 방법(Lundberg et al., 1991, Gene 108(1), 1-6)을 약간 변형하여, Song 등의 방법 (Song J. M. et al., 2007, Enzyme Microbe. Technol. 40, 1475-1483; Choi J. J. et al ., 2008, Appl. Environ. Microbiol. 74, 6563-6569)과 동일한 방법으로 아래와 같이 측정하였다. 먼저, lacZ 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pJR2-lacZ의 5' 부분의 835 bp 단편을 측정하려는 DNA 중합효소로 증폭시켰다. 이 때, DNA 중합효소들 각각의 최적 PCR 완충용액을 사용한다. 다음으로, 상기 PCR 증폭산물들을 제한효소 BamHI과 ClaI으로 각각 절단한 다음, 동일한 제한효소들로 절단된 상기 발현벡터 pJR2-lacZ에 재삽입 시킨 후, DNA ligase로 하룻밤 연결반응 시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 항생제 암피실린 및 IPTG와 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)이 포함된 아가 플레이트 배지에 고르게 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 아가 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 보관한 후, 파란색 콜로니 (blue colony)와 흰색 콜로니 (white colony)의 수를 센 다음, 이를 바탕으로 돌연변이 빈도 (mutation frequency)와 에러율을 계산하였다. 그 결과는 하기의 표 4와 같으며, Neq M2 DNA 중합효소 이용한 PCR에 있어서의 PCR 에러율이 Pfu DNA 중합효소에 비해서는 약 1.7배 낮았으며, 또한 Neq M1 DNA 중합효소는 비슷하며, Neq M3 HS DNA 중합효소의 경우 Pfu DNA 중합효소의 에러율 보다 약 1.6배 높았다.

[표 4]

a. Mutation frequency(돌연변이 빈도)는 하얀색 콜로니 / (파란색 콜로니+하얀색 콜로니)로 계산 되었다.

b. Template doublings는 2d = PCR 산물 양 / 초기 타켓양으로 계산되었다.

c. Error rate는 ER = mf / (bp x d)로 계산되었다. 여기서 mf는 mutation frequency이고, bp는 lacZ 타켓 사이즈(=832bp)이고, d는 template가 두배로 늘어난 횟수이다.

실시예 10: Neq DNA 중합효소의 인테인을 이용한 키메라 ( chimera ) Nefu hot-start ( HS ) DNA 중합효소 제조

Neq HS DNA 중합효소의 인테인 전체를 다른 내열성 DNA 중합효소에 도입하여 핫 스타트 PCR에 응용 가능성을 검토해 보았다. 하나의 예로 Pfu DNA 중합효소는 인테인이 존재하지 않지만, Neq DNA 중합효소 익스테인 junction 부위의 아미노산들이 상당히 잘 보존되어 있다(도 12A). 본 실시예에서는 Neq HS DNA 중합효소의 N-말단 및 인테인 전체를 포함한 부분과 Pfu DNA 중합효소의 C말단의 부분인 Pfu-C를 결합시켜 핫 스타트 PCR이 가능한 키메라 Nefu HS DNA 중합효소를 만들고자 하였다. 본 발명에서는 Pfu DNA 중합효소 유전자가 삽입된 발현벡터와 유전자 서열 정보(GenBank accession No. D12983)를 이미 확보하고 있으며, 또 Neq HS DNA 중합효소 인테인에 관한 유전자 확보와 유전자 서열에 관한 정보를 갖고 있다(서열번호 5, Choi J. J. et al ., 2006, J. Mol . Biol . 356:1093-106;). 이러한 정보를 통해 primer들을 각각 합성한 후 overlap extension PCR를 통해 Neq 인테인 뒤쪽에 Pfu-C 단편에 해당하는 유전자를 결합시켜 핫-스타트 PCR용 DNA 중합효소를 만들려고 하였다 (도 12B). Neq N-말단 및 인테인을 포함하는 유전자와 Pfu DNA 중합효소 C 말단의 부분에 해당하는 유전자를 연결시키기 위해 4개의 primer 들이 필요하며, 먼저 서열번호 1 (Neq FP)은 Neq HS DNA 중합효소 유전자의 5' 염기서열을 포함한다. 서열번호 37 (In-Pfu-CR) 프라이머는 Neq HS DNA 중합효소의 인테인 3'쪽 염기서열과 Pfu DNA 중합효소의 Pfu-C 단편의 일부 염기서열이 포함된 염기서열에 상보적 염기서열을 5'→ 3'으로 합성한 것이다(도 12B). 따라서 Pfu-C 단편을 증폭시키기 위해 primer 서열번호 38 (In-Pfu-C)과 서열번호 39 (Pfu-Xho)를 합성하였다(도 12B). 즉 서열번호 38는 Neq 인테인의 C 말단부분의 아미노산 서열 일부와 Pfu-C 단편의 N 말단 아미노산 서열에 해당하는 염기서열을 5'→ 3'으로 합성하였다. 서열번호 39는 Pfu-C 단편의 C 말단부분의 아미노산 서열에 해당하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 5'→ 3'으로 합성하였다. 참고로 발현벡터에 클로닝을 쉽게 하기 위해 서열번호 39에는 XhoI site를 각각 첨가하여 합성하였다. 먼저 Neq HS DNA 유전자를 주형 (template)로 사용하여 서열번호 1과 37을 첨가한 후 DNA 중합효소로 실시예 1에서의 동일한 방법으로 1차 PCR을 수행하여 Neq HS의 N-말단 및 인테인을 포함하는 유전자를 증폭하였다. 또 Pfu DNA 중합효소 유전자를 주형으로 사용하여 서열번호 38과 39를 각각 첨가한 후 DNA 중합효소로 실시예 1에서와 동일한 방법으로 1차 PCR을 수행하여 Pfu DNA 중합효소 C말단의 부분에 해당하는 유전자 Pfu-C를 증폭하였다. 이들 PCR 증폭산물들을 agarose gel 전기영동으로부터 각각 회수한다. 이렇게 회수한 두 단편을 동일한 비율로 혼합한 후, 95 ℃에서 3분간 변성시킨 후 다시 50 ℃로 낮추어 annealing 시키면 Neq HS의 N-말단 및 인테인 전체를 포함하는 유전자와 Pfu-C에 해당하는 유전자 단편에 해당하는 염기서열 일부분이 우선적으로 overlap되어 hybrid 주형이 만들어진다. 여기에 dNTP와 Pfu DNA 중합효소를 첨가한 후 60 ℃에서 10분간 overlap extension 시킨다. 이것을 주형으로 하여 서열번호 1과 39를 첨가하여 실시예 1에서의 동일한 방법으로 2차 PCR를 수행하여 Neq HS의 N-말단 및 인테인 단편과 Pfu-C 단편들이 하나로 연결된 완전한 키메라 Nefu hot-start (HS) DNA 중합효소 유전자를 증폭한 후, NdeI /XhoI 으로 절단하여 발현벡터인 pETRPHIS-5의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 ligation 하였다. 이 ligation 혼합액을 E. coli DH5α에 형질전환시킨 후, 형질전환체들로부터 알칼리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 키메라 Nefu HS DNA 중합효소 유전자가 발현벡터 내에 정확히 삽입되었다는 것을 재확인하였다. 상기와 같이 구축된 키메라 Nefu HS DNA 중합효소 유전자 (서열번호 40)의 발현을 위한 발현벡터를 pETRPNPHS로 명명하였다. 또 Nefu HS DNA 중합효소 유전자의 염기서열을 기반으로 아미노산 서열을 결정하였다 (서열번호 41).

서열번호 37 (In-Pfu-CR): 5'-accatcagtattgtgtaaaactagcccattaa-3'

서열번호 38 (In-Pfu-C): 5'-gttttacacaatactgatggtctctatgcaactat-3'

서열번호 39 (Pfu-Xho): 5'-NNNNNNCTCGAGctaggattttttaatgttaagcc-3'

키메라 Nefu HS DNA 중합효소 유전자를 발현시키기 위해 발현벡터 pETRPNPHS를 E. coli W3110-RILYKT에 형질전환시켰다. E. coli W3110-RILYKT/pETRPNPHS를 최종농도 100 ug/ml 암피실린과 34 ug/ml 클로람페니콜이 첨가된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 배양액 5 ml을 취하여 100 ug/ml 암피실린과 34 ug/ml 클로람페니콜이 최종농도로 첨가된 0.1% glucose와 0.5% casamino acid가 포함된 M9 한정 배지 500 ml에 접종하여 37 ℃에서 20 시간 각각 배양하였다. 6,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 균체 (3.0 g/ wet weight)를 회수한 다음 1 mM PMSF가 포함된 20 ml의 완충용액 A (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.3 M NaCl)에 현탁하여 초음파로 파쇄한 후 18,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 대장균 세포 파편 (cell debris)을 제거하였다. 상기 상층액을 완충용액 A로 평형화시킨 HisTrap^TM HP 컬럼 (GE Healthcare)에 결합시킨 후, 동일한 완충용액 A로 충분히 씻었다. 컬럼에 결합한 단백질들을 동일한 완충용액에서 0 - 0.5 M imidazole gradient로 용출하였다. DNA 중합효소가 들어 있는 피크 프랙션들 (peak fractions)을 선택하여 완충용액 B (20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 M NaCl, 1 mM DDT)에 충분히 투석 (dialysis) 하였다. 충분히 투석한 시료를 완충용액 B로 평형화시킨 음이온교환 컬럼 (anion-exchange column)인 HiTrap^TM Q 컬럼 (GE Healthcare)에 결합시킨다. 컬럼을 완충용액 B로 충분히 씻은 후, 컬럼에 결합된 DNA 중합효소를 동일한 완충용액에서 0.1 - 1 M NaCl로 용출하였다. 상기와 같은 방법으로 최종 정제된 DNA 중합효소들은 저장 완충용액 (storage buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% Glycerol)에 투석한 다음, -20 ℃에 보관하면서 PCR을 수행할 때 사용되었다. 정제된 단백질을 브래드포드 분석(Bradford Assay)으로 단백질을 정량하였다. 최종 정제된 키메라 Nefu HS DNA 중합효소의 양은 0.9 mg 이였다.

먼저, 키메라 Nefu HS DNA 중합효소가 고온에서 단백질 스플라이싱에 미치는 영향을 살펴보기 위해 상기에서 정제된 Nefu HS DNA 중합효소를 단백질 스플라이싱 반응용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl)에 12 ㎍ 씩 첨가하여 50-95 ℃ 범위에서 30 분간 반응시킨 다음, SDS-PAGE을 통해 분석하였다(도 13). 그 결과, 반응 혼합물에 넣어준 정제된 키메라 Nefu HS DNA 중합효소 (분자량 약 110 kDa) 양이 반응온도의 상승에 따라 감소하며, 이와 함께 단백질 스플라이싱 산물인 키메라 Nefu (키메라 Nefu DNA 중합효소, 분자량 약 90 kDa)의 양이 증가함을 알 수 있었다(도 13). 단백질 스플라이싱은 70 ℃ 이상에서만 발생함을 알 수 있었다. 도 13은 정제된 키메라 Nefu HS DNA 중합효소를 이용하여 반응 온도별로 단백질 스플라이싱을 분석한 결과들을 나타낸 것으로서, 도 13에서 레인 M은 단백질 저분자량 마커를 로딩한 것이다.

도 14는 효소 농도에 따른 키메라 Nefu HS DNA 중합효소의 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소의 활성을 측정한 결과이다. DNA 중합효소활성은 단백질 스플라이싱 반응용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl)에 키메라 Nefu HS DNA 중합효소를 80 ℃에서 30분간 반응시킨 반응액을 실시예 5번과 같은 방법으로 측정하였다. 키메라 Nefu HS DNA 중합효소 양에 따른 단백질 스플라이싱 반응액의 DNA 중합효소의 활성을 측정한 결과를 도 14에 도시하였다. DNA 중합효소 활성은 효소 양이 증가함에 따라 dpm의 값이 커짐을 알 수 있었다. 이는 키메라 Nefu HS DNA 중합효소가 활성을 가짐을 의미한다.

도 15은 키메라 Nefu HS DNA 중합효소를 이용한 PCR을 Lambda DNA를 주형으로하여 2 kb 단편을 타깃으로 선정하여 각각 수행하였다. 먼저 Lambda DNA의 2 kb 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응용액 (50 ul)을 아래와 같이 구성하였다. 타켓으로 하는 10 pmol의 정방향 프라이머(5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3')와 역방향 프라이머( 5'-CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG-3'), 25 ng의 인간 유전체 DNA, 250 μM dNTPs, 키메라 Nefu HS DNA 중합효소, 30 mM Tricine-KOH (pH 8.6), 1.5 mM MgCl₂, 70 mM KCl, 0.05% Tween 20이 되도록 첨가하여 구성하였다. 참고로 DNA 중합효소 첨가양은 50 ul의 PCR 반응용액에 100 - 800 ng이다. PCR 반응은 80 ℃에서 10분간 변성, 95 ℃에서 3분간 변성, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2 분으로 30회 반복하여 수행하였다. 생성된 증폭 산물의 길이를 확인하기 위해서 마지막으로 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다(도 15). 각 레인은 키메라 Nefu HS DNA 중합효소의 양을 나타내었고, lane M은 GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Fermentas)를 나타낸다. 여기에서 키메라 Nefu HS DNA 중합효소가 PCR이 됨을 확인하였다(도 15). 그러므로 Neq DNA 중합효소의 인테인을 다른 DNA 중합효소에 도입하여 핫 스타트 PCR이 가능함을 입증한 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11448

20130829

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11449

20130829

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Mutant Neq HS DNA polymerases from Nanoarchaeum equitans and its application to hot-start PCR <130> PB13-11731 <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neq FP <400> 1 attatagcat atgttacacc aactccccac g 31 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HisNeqM <400> 2 atgtggtgat ggtgatggtg attattttta ttttcatatt ccttggc 47 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HisNeqMR <400> 3 aatcaccatc accatcacca caatgcgcta tcttggcaaa aagagag 47 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeqSRSalstop <400> 4 nnnnnngtcg actttaaaga aatctgttag tttttt 36 <210> 5 <211> 2808 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neq HS DNA polymerase <400> 5 atgttacacc aactccccac gatggttgta gaagaaaagg cggtaaaaga ggaagaaggg 60 tatagcgtgc taaaatgtta ttggattaat atagagaaca cccctttaga cgaggtaatt 120 ttaataggta aagacgaaaa taatagagct 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ttggtagacg caccagattt aggttctggc gccgctaggt gtgcgagttc aagtctcgcc 2220 tcccgcacca ttcaccagaa agcgttgatc ggatgccctc gagccttccc cgcatgggca 2280 gaatatttaa ttgcggattc gttgggaagt tcagggactt ttgaaagtga tggtggtggg 2340 ggaaggattc gaaccttcga agtcgatgac ggcagattta cagtctgctc cctttggccg 2400 ctcgggaacc ccaccagggg taattcaaat tttgaggtaa tgcttgagat ggtggtgggg 2460 gaaggattat tcgtcgcttc gctcctcacc cttcgggccg ttgcctgtgg caacgttctc 2520 tcgctttcgc tcgaatcgaa ccttagtcga aggttctcac ccttccccga tgagtgcaaa 2580 ctttcacaat ctcaccgaag ttaccacatc gctgtggtga attatggtgg tggcacggcg 2640 ggtgctaacg tccgtcgtga agagggaaac aacccagacc gccagctaag gtcccaaagt 2700 catggttaag tgggaaacga tgtgggaagg cccagacagc caggatgttg gcttagaagc 2760 agccatcatt taaagaaagc gtaatagctc actggtcgag tcggcctgcg cggaagatgt 2820 aacggggcta aaccatgcac cgaagctgcg gcagcgacgc ttatgcgttg ttgggtaggg 2880 gagcgttctg taagcctgcg aaggtgtgct gtgaggcatg ctggaggtat cagaagtgcg 2940 aatgctgaca taagtaacga taaagcgggt gaaaagcccg ctcgccggaa gaccaagggt 3000 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Val Leu His Asn Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys Ala Leu Glu Phe Val 725 730 735 Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu 740 745 750 Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Val 755 760 765 Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg 770 775 780 Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu 785 790 795 800 Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys 805 810 815 Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys Leu 820 825 830 Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His Glu Tyr Lys Ala Ile 835 840 845 Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala Ala Lys Gly Val Lys 850 855 860 Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp Gly 865 870 875 880 Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu Tyr Asp Pro Lys Lys 885 890 895 His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala 900 905 910 Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg 915 920 925 Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser Trp Leu Asn Ile Lys 930 935 940 Lys Ser *** 945

Claims

Neq L 대 단편과 Neq S 소 단편의 인테인이 하나로 연결된 나노아케움 이퀴탄스 균주 유래의 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소(Nanoarchaeum equitans hot-start DNA 중합효소, Neq HS DNA 중합효소)로서 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진, 나노아케움 이퀴탄스 균주 유래의 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소.
삭제
제1항의 DNA 중합 효소를 암호화하는, 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 유전자.
제1항의 DNA 중합 효소를 암호화 하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로, 상기 재조합 벡터는 T7 프로모터가 트립토판(tryptophan) 프로모터로 치환된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pETRPNEQHSM3인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
삭제
제5항의 pETRPNEQHSM3 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체가 Escherichia coli W3110-RILYKT/pETRPNEQHSM3(기탁번호 : KCCM11449P)인 형질전환체.
i) 제1항의 DNA 중합효소를 발현하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
ii) 상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환시키는 단계;
iii) 형질전환체를 배양하는 단계; 및
iv) 형질전환체로부터 DNA 중합효소를 정제하는 단계를 포함하는 내열성 핫-스타트 DNA 중합효소의 제조방법.
제1항의 핫 스타트 DNA 중합효소를 이용한 인테인 스플라이싱에 의한 핫-스타트 중합효소 연쇄반응(hot-start polymerase chain reaction) 수행 방법으로, 상기 연쇄반응은 pH 6.0 - 9.0 의 pH, 0.5 - 1.5 mM의 Mg²⁺ 농도, 60 - 100 mM의 KCl 농도에서 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 핫-스타트 중합효소 연쇄반응(hot-start polymerase chain reaction) 수행 방법.
Neq HS DNA 중합효소의 N-말단 및 인테인 전체 부분과 Pfu DNA 중합효소의 C 말단의 부분인 Pfu-C를 결합시켜 제조된 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진, 내열성 키메라 Nefu 핫-스타트 DNA 중합효소(chimera Nefu hot-start DNA 중합효소, Nefu HS DNA 중합효소)를 이용한 핫-스타트 중합효소 연쇄반응 수행 방법으로서, 인테인 스플라이싱을 이용한 고온 (50 - 100 ℃)에서 hot-start PCR을 수행하는 방법.