JPH099976A

JPH099976A - ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法

Info

Publication number: JPH099976A
Application number: JP8057409A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Izutsu; 浩井筒; Kazuhiko Obara; 和彦小原; Akira Matsumoto; 明松本
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 1997-01-14

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】クラミジア・ニューモニエの抗体検査、診断
等に好適な融合タンパク質の製造に有用なＤＮＡ、及び
同融合タンパク質の製造に有用な形質転換体及び抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法を提供する。【解決手段】配列番号１で示されるペプチドに、直接
に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２で示され
るペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸か
らなる配列を含むポリペプチドＡが結合した、ジヒドロ
葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タン
パク質、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ若しく
はそれに相補的なＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えベク
ター、この組換えベクターを含む形質転換体及び前記融
合タンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ジヒドロ葉酸還元
酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、
それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含む組換えベク
ター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造法に関する。本発明
は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の
診断薬の製造において有効に利用される。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。

【０００３】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。

【０００４】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。

【０００５】一方、大腸菌においてタンパク質を大量に
発現させることのできるプラスミドとして、ｐＢＢＫ１
０ＭＭが知られている（特開平４−１１７２８４号公
報）。このプラスミドは、ジヒドロ葉酸還元酵素（以
下、ＤＨＦＲと略す。）と抗アレルギー性ペプチドとの
融合タンパク質を発現させることができる。ここで得ら
れる融合タンパク質にはＤＨＦＲの酵素活性も保持され
ているので、融合タンパク質の精製はＤＨＦＲの特性と
活性を利用して容易に行うことができる。しかし、クラ
ミジア・ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニュ
ーモニエ以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジ
ア・トラコマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に
存在する抗原を含むため、この基本小体を用いる方法で
はクラミジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、
他の種のクラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に
欠ける難点があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適な融
合タンパク質を提供するものである。請求項２記載の発
明は、請求項１記載の発明の効果に加え、感度の高い診
断薬の製造に好適な融合タンパク質を提供するものであ
る。請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明の効果
に加え、抗原としての安定性に優れる融合タンパク質を
提供するものである。請求項４記載の発明は、請求項１
記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの
特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質を提供するも
のである。請求項５記載の発明は、請求項１記載の発明
の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの特異的抗体
検査等に好適な融合タンパク質を提供するものである。

【０００７】請求項６記載の発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診断
に好適な融合タンパク質の製造に有用なＤＮＡを提供す
るものである。請求項７記載の発明は、請求項６記載の
発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの特異的
抗体検査等に適切な融合タンパク質の製造に有用なＤＮ
Ａを提供するものである。請求項８記載の発明は、請求
項６記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニ
エの特異的抗体検査等に適切な融合タンパク質の製造に
有用なＤＮＡを提供するものである。

【０００８】請求項９記載の発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診断
に好適な融合タンパク質の製造に有用な組換えベクター
を提供するものである。請求項１０記載の発明は、請求
項９記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニ
エの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製造に
有用な組換えベクターを提供するものである。請求項１
１記載の発明は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査
やクラミジア・ニューモニエの診断に好適な融合タンパ
ク質の製造に有用な形質転換体を提供するものである。
請求項１２記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感
染の診断薬製造に好適な抗クラミジア・ニューモニエ抗
体の製造法を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、ク
ラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制
限酵素で部分分解してこれをファージベクターλgt11Ｄ
ＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、こ
れを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア・
ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラミ
ジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染
大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸
菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλフ
ァージを精製し、そのＤＮＡを取得した。そして、遺伝
子組換え技術を利用してこのλファージのＤＮＡと上述
のプラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭから組換えプラスミドベ
クターｐＣＰＮ５３３Ｔを構築し、本発明を完成した。

【００１０】即ち、本発明は、下記（１）〜（１２）に
関するものである。（１）配列番号１で示されるペプチドに、直接に又は介
在アミノ酸配列を介して、配列番号２で示されるペプチ
ドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配
列を含むポリペプチドＡが結合した、ジヒドロ葉酸還元
酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質。（２）ポリペプチドＡが、配列番号２で示されるペプチ
ドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、前
記（１）記載の融合タンパク質。（３）ポリペプチドＡが、配列番号２で示されるペプチ
ドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又
は配列番号２で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入
されているポリペプチドである、前記（１）記載の融合
タンパク質。（４）配列番号３で示されるペプチドである、前記
（１）記載の融合タンパク質。（５）配列番号４で示されるペプチドである、前記
（１）記載の融合タンパク質。

【００１１】（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記
載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはそれに
相補的なＤＮＡ。（７）配列番号５で示される塩基配列を有する、前記
（６）記載のＤＮＡ。（８）配列番号６で示される塩基配列を有する、前記
（６）記載のＤＮＡ。（９）前記（６）〜（８）のいずれかに記載のＤＮＡを
含む組換えベクター。（１０）ｐＣＰＮ５３３Ｔプラスミドである前記（９）
記載の組換えベクター。（１１）前記（６）又は（１０）に記載の組換えベクタ
ーを含む形質転換体。（１２）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の融合タ
ンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法。なお、本明細書において、塩基の数が１のデオキシヌク
レオチドはモノデオキシヌクレオチドといい、塩基の数
が２以上のデオキシヌクレオチドは、特に断らない限
り、ＤＮＡと総称した。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。クラミジア・ニューモニエ抗原本発明において、クラミジア・ニューモニエ抗原は、ペ
プチドが抗原性を有する最小の大きさの観点から、配列
番号２で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５
個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド（以下
「ポリペプチドＡ」という）からなるものである。ポリ
ペプチドＡのペプチド鎖中に含有されるクラミジア・ニ
ューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列が長い
ほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることから、ポ
リペプチドＡとしては、配列番号２で示されるペプチド
の中の連続した２０個以上のアミノ酸からなる配列を含
むポリペプチドであることが好ましく、１００個以上の
アミノ酸からなる配列を含むポリペプチドであることが
より好ましく、２５０個以上のアミノ酸からなる配列を
含むポリペプチドであることがさらに好ましい。

【００１３】また、クラミジア・ニューモニエ抗原とし
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡは、配列番
号２で示されるペプチドからアミノ酸（例えば１〜２５
０個）が欠落しているものであってもよい。欠落するア
ミノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドＡのクラミジ
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性が損なわれる傾向
がある。欠落するアミノ酸の個数が多い場合（例えば５
個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原
性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくす
るためには、配列番号２で示されるペプチドから欠落す
るアミノ酸は連続（例えば５個以上）しているものであ
ることが好ましい。

【００１４】また、クラミジア・ニューモニエ抗原とし
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡとしては、
クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミ
ノ酸配列に加えてそれ以外のアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドを利用することもできるが、このポリペプチ
ドは、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性に
対して、クラミジア・ニューモニエ抗原以外の物質とし
ての抗原性がないか又は低いことが必要とされる。この
ようなポリペプチドの例としては、配列番号２で示され
るペプチドの中のアミノ酸（例えば１〜１００個）が他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド、配列番号２
で示されるペプチドの中にアミノ酸（例えば１〜１００
個）が挿入されているポリペプチド等が挙げられる。

【００１５】置換又は挿入されるアミノ酸の個数が多い
場合（例えば５個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗
原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をでき
るだけ小さくするためには、配列番号２で示されるペプ
チドの中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続
（例えば５個以上）しているものであることが好まし
い。置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものであ
ることが好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換
が挙げられる。ポリペプチドＡの具体例としては、例え
ば、配列番号２で示されるペプチド、配列番号２で示さ
れるペプチドの４８８番目のアミノ酸であるアラニンが
グリシンに置換されたペプチド、配列番号４で示される
ペプチドの１６２〜４３２番目のアミノ酸配列からなる
ペプチド、が挙げられる。

【００１６】ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原融合タンパク質本発明のジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモ
ニエ抗原融合タンパク質は、配列番号１で示されるペプ
チドに、直接に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番
号２で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個
のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドＡが結合し
たものである。配列番号１で示されるペプチドは、融合
タンパク質のうち、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）
部分である。配列番号２で示されるペプチドの中の連続
した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリ
ペプチドＡは、前記したクラミジア・ニューモニエ抗原
部分である。介在アミノ酸配列は特に限定されないが、
例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニンのアミノ酸配
列等が挙げられる。

【００１７】本発明のＤＨＦＲ−クラミジア・ニューモ
ニエ抗原融合タンパク質の具体例としては、例えば、配
列番号３及び配列番号４で示されるペプチドが挙げられ
る。配列番号３で示されるペプチドは、ＤＨＦＲにクラ
ミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチド
全体が結合した融合タンパク質であり、クラミジア・ニ
ューモニエ抗原としての抗原性を保有する。配列番号４
で示されるペプチドは、ＤＨＦＲにクラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの一部と他のペ
プチドが結合した融合タンパク質であり、クラミジア・
ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する。上記融合
タンパク質の中では、クラミジア・ニューモニエの５３
ＫＤａの抗原ポリペプチド全体を含むものである配列番
号３で示されるペプチドが好ましい。

【００１８】ＤＨＦＲ−クラミジア・ニューモニエ抗原
融合タンパク質の製造法本発明のＤＨＦＲ−クラミジア・ニューモニエ抗原融合
タンパク質を製造する方法としては、例えば、遺伝子組
換え法が挙げられる。遺伝子組換え法としては、例え
ば、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡをベクター
に挿入して組換えベクターを構築し、それを宿主に挿入
して形質転換体を作製し、その形質転換体から目的の融
合タンパク質を精製する方法が挙げられる。前記融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡについては後述する。ベク
ターとしては、例えば、プラスミドやファージ等が挙げ
られる。宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母
等が挙げられる。以下、形質転換体の作製法と、その形
質転換体を用いた目的の融合タンパク質の精製法につい
て詳しく説明する。

【００１９】融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む
組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作
製まず、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ（後述）と、ＤＨＦＲをコードするＤＮ
Ａ（後述）とを市販のキット等を利用して連結する。市
販のキットとしては、例えば、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造(株)商品名）を用いることができる。連結
によって得られたＤＮＡが複製起点を持たず、プラスミ
ドやファージ等として機能しない場合は、このＤＮＡを
新たなプラスミドベクターやファージベクターに挿入
し、組換えベクターを構築する。新たなプラスミドベク
ターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐ
ＵＣ１９等を使用することができる。いずれにしても、
融合タンパク質をコードするＤＮＡの挿入箇所はプロモ
ーター領域の下流であることが必要とされる。

【００２０】上記連結の反応物又は得られた組換えベク
ターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸菌由来
のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主として
は大腸菌を使用することができ、例えば、大腸菌ＨＢ１
０１株を使用することができる。この宿主をコンピテン
トセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ１０１株を
処理して得たコンピテントセルは宝酒造(株)等から販売
されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換
体を作製する方法の一般的手法は、「サムブロック他編
集、モレキュラー・クローニング第２版（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.
Samblook et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold S
pring Harbor Laboratory Press （1989）、以下、本文
献を文献″モレキュラー・クローニング″という）に記
載されている。

【００２１】得られた形質転換体を培養してコロニーを
形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮＡを取得し、
適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分
析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択
する。このようにして作製されたプラスミドベクターと
しては、例えば、ｐＣＰＮ５３３Ｔプラスミドが挙げら
れる。このようにして作製された形質転換体としては、
例えば、前述の組換えベクターｐＣＰＮ５３３Ｔが入っ
た大腸菌ＨＢ１０１株が挙げられ、この株は受託番号Ｆ
ＥＲＭＢＰ−５２２２として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。

【００２２】形質転換体を培養する方法としては、例え
ば、その形質転換体が成長しうる培地でこの目的の融合
タンパク質が形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で
培養器を振とうする方法を使用することができる。形質
転換体として前述の組換えベクターｐＣＰＮ５３３Ｔが
入った大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシ
リンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その
後、この培養液をアンピシリン及びトリメトプリムを含
むＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養
する方法を利用することができる。ＴＢ培地の調製方法
は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる。

【００２３】培養した形質転換体を破砕する方法として
は、例えば、遠心分離で形質転換体を集め、これを緩衝
液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁液に物理的な衝
撃を与える方法を採用することができる。緩衝液として
は、例えば、ＴＥ緩衝液を使用することができる。上記
懸濁液に物理的な衝撃を与える方法としては、例えば、
上記懸濁液に超音波を照射する方法を使用することがで
きる。形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液に物理
的な衝撃を与える代わりに、例えば、上記懸濁液にリゾ
チームを加え、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含
むＴＥ緩衝液を加えて撹拌することよって形質転換体を
溶解させる方法を採用することもできる。形質転換体を
破砕又は溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、
上清を取得する。

【００２４】融合タンパク質の精製法としては、例え
ば、ストレプトマイシン硫酸塩を添加する核酸の除去及
び硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得の各工程を
使用することができる。ストレプトマイシン硫酸塩を添
加して核酸を除去する工程としては、例えば、上記のい
ずれかの上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、し
ばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿
物として除去し、上清を取得する操作を使用することが
できる。硫酸アンモニウムを添加して蛋白質を取得する
工程としては、例えば、核酸を沈殿物として除去した後
の上清に硫酸アンモニウムを添加し、撹拌し、遠心分離
する操作を使用することができる。通常、沈殿を取得す
るが、目的の融合タンパク質が上清に含まれていること
もあり、サンプリングして、目的の融合タンパク質の有
無を確認しておくことが好ましい。

【００２５】続いて、目的とする融合タンパク質を含む
画分を取得する工程を行う。この工程としては、例え
ば、上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記
上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、目的と
する融合タンパク質が含有されている画分を同定してそ
の画分を取得する方法を使用することができる。目的と
する融合タンパク質が含有されている画分を同定する方
法としては、例えば、クラミジア・ニューモニエ特異的
モノクローナル抗体（後述）を用いるウェスタン・ブロ
ット法が挙げられる。細胞残渣の除去、ストレプトマイ
シン硫酸塩を添加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウム
を添加する蛋白質の取得及びウェスタン・ブロット法の
具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に
記載されている。

【００２６】一方、ＤＨＦＲの親和性を利用して目的と
する融合タンパク質を含む画分を取得する方法も利用す
ることができる。この方法は、例えば、前記上清等をメ
ソトレキセート−アガロースカラムに流し、融合タンパ
ク質をカラムに吸着させ、その後、葉酸を含む溶出液を
利用して融合タンパク質を溶出する工程を使用すること
ができる。

【００２７】融合タンパク質をコードするＤＮＡ本発明において、融合タンパク質をコードするＤＮＡと
は、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を、トリプ
レット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通
りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従って
アミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ
群から選ばれるＤＮＡのことである。融合タンパク質の
うち、ＤＨＦＲ部分の塩基配列の具体例としては、例え
ば、配列番号５で示される塩基配列の１〜４８０番目の
塩基配列が挙げられる。一方、クラミジア・ニューモニ
エ抗原部分の塩基配列の具体例としては、例えば、配列
番号５で示される塩基配列の４８４〜１９４７番目の塩
基配列が挙げられる。配列番号５で示される塩基配列の
４８１〜４８３番目の塩基配列は介在アミノ酸配列部分
の塩基配列である。

【００２８】融合タンパク質をコードするＤＮＡの具体
例としては、例えば、配列番号５で示される塩基配列及
び配列番号６で示される塩基配列が挙げられる。配列番
号５で示される塩基配列は、ＤＨＦＲとクラミジア・ニ
ューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体の融合タン
パク質をコードするＤＮＡとなっており、配列番号６で
示される塩基配列は、ＤＨＦＲとクラミジア・ニューモ
ニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプチド（一部）の融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡとなっている。

【００２９】融合タンパク質をコードするＤＮＡは、遺
伝子組換え法で作製することができる。遺伝子組換え法
としては、例えば、前述したように、クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡと、ＤＨ
ＦＲをコードするＤＮＡを別々に取得し、遺伝子組換え
法によって両者を連結する方法が挙げられる。ＤＨＦＲ
をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡを含むプラスミドベ
クターから制限酵素を用いてそのＤＮＡを切り出すか、
あるいはそのＤＮＡを有するプラスミドＤＮＡやゲノム
ＤＮＡを鋳型とし、適切なプライマーを用いてＰＣＲ法
を行ってそのＤＮＡを増幅することによって取得するこ
とができる。

【００３０】前者の方法では、ＤＨＦＲをコードするＤ
ＮＡを含むプラスミドベクターとして、例えばプラスミ
ドベクターｐＢＢＫ１０ＭＭや本発明の組換えベクター
でもあるｐＣＰＮ５３３Ｔを利用することができる。ｐ
ＣＰＮ５３３Ｔを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭ（Ｂ
Ｐ−５２２２）として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。この大腸菌(プラスミド保持菌)か
らプラスミドを取得するには、通常のプラスミドＤＮＡ
取得方法に従えば良く、この方法は文献″モレキュラー
・クローニング″に記載されている。プラスミドｐＢＢ
Ｋ１０ＭＭを用いる場合は制限酵素としてBamHI及びとX
hoIを使用し、約4.6KbpのＤＮＡ断片を切り出せばよ
い。

【００３１】後者の方法では、プラスミドＤＮＡとして
例えば前述のｐＢＢＫ１０ＭＭやｐＣＰＮ５３３Ｔをそ
のまま利用することができ、ゲノムＤＮＡとしては例え
ば枯草菌のゲノムＤＮＡを使用することができる。ゲノ
ムＤＮＡを取得するには通常のゲノムＤＮＡ取得方法に
従えば良く、この方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。後者の方法に使用するプライ
マーは、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡの５′末端と３′
末端にある塩基配列を考慮して設計・合成することがで
きる。例えば配列番号５の塩基配列の１番目から２０番
目の配列を有するオリゴヌクレオチドと４６１番目から
４８０番目の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。これらのオリゴヌクレ
オチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すること
ができる。

【００３２】次に、クラミジア・ニューモニエから、ク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする
ＤＮＡをクローニングする方法について詳しく説明す
る。クラミジア・ニューモニエの培養培養したＨＬ細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを
感染させておき、この細胞をＳＰＧ液（ショ糖７５．０
ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム
１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットル
に溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）に懸濁し、この
動物細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して上清（クラミ
ジア・ニューモニエの浮遊液）を取得する。クラミジア
・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニュー
モニエＹＫ４１株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イ
ムノロジー、37巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et
al.,Microbiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))
が使用できる。

【００３３】培養したＨＬ細胞等から細胞浮遊液を調製
し、培養上清を除去した後に前記クラミジア・ニューモ
ニエ浮遊液を添加して培養し、遠心分離し、細胞内でク
ラミジア・ニューモニエが増殖したクラミジア・ニュー
モニエ感染ＨＬ細胞を取得する。

【００３４】クラミジア・ニューモニエの基本小体の精
製クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。

【００３５】クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡ
の調製クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（pH８．０）（以下、ＴＥ緩衝液とい
う。）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）水溶液及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液を加え
て保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、
遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素
（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、
クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。

【００３６】ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌ
ｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化Ｄ
ＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデ
ノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ＡＴＰと略す。）及びＴ４リガーゼを添加し
て、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。これを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０
００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取
し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回
収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′
端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。

【００３７】このＤＮＡ断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断しておいたλgt11ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガ
ーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを
用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージング
し、ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。

【００３８】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡのクローニング大腸菌Ｙ１０９０
ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを
感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β
−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸漬したニト
ロセルロースフィルターを利用して、挿入ＤＮＡの発現
により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロー
スフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清ア
ルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次い
でフィルターをクラミジア・ニューモニエ特異的モノク
ローナル抗体と反応させる。クラミジア・ニューモニエ
特異的モノクローナル抗体としては、例えば、ＡＹ６Ｅ
２Ｅ８やＳＣＰ５３を使用することができる。ＡＹ６Ｅ
２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５１５４と
して寄託されている。また、ＳＣＰ５３を産生するハイ
ブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・
ミクロバイオロジー、132巻、583-588頁(1994)（J. Cli
n. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994）に記載され
ている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダー
ゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ
る。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加し
て反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水
素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノール
溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィル
ターを洗浄し、風乾させる。

【００３９】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードす
るＤＮＡをクローン化し、クラミジア・ニューモニエ特
異的モノクローナル抗体反応性の前記ポリペプチドを発
現するλファージを取得する。

【００４０】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの取得取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。こ
のＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Poly
merase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたＤＮ
Ａを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11
・フォワード・プライマー（λgt11 forward primer）
及びλgt11・リバース・プライマー（λgt11 reverse p
rimer）（いずれも宝酒造株式会社製、商品名）が挙げ
られ、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリ
タック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymer
ase）（宝酒造株式会社製、商品名）がある。このＤＮ
Ａ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られてお
り、詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載
されている。

【００４１】増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決
定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製、
商品名）を使用することができる。また、塩基配列を決
定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータ
サイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を
用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売
されているキットを使用することができる。また、分析
にあたっては市販の機械、例えば、３７３Ａ型ＤＮＡシ
ークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）を利用す
ることができる。

【００４２】塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニ
アリング社）を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。一旦、抗原又は有効成分として用いられるポリペプ
チドをコードするＤＮＡが取得されると、遺伝子組換え
法や前述したＰＣＲ法を利用することによって、そのＤ
ＮＡを複製させることができるので、クラミジア・ニュ
ーモニエの基本小体からクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡを再度取得する操作は
不要である。

【００４３】遺伝子組換え法を用いる方法は、例えば、
次のようにして行うことができる。まず、取得された前
記ＤＮＡを上述したように既存のプラスミドベクターや
ファージベクター等に挿入して組換えベクターを作製
し、その組換えベクターを宿主に入れて形質転換体を作
製し、その形質転換体を培養する。この培養により形質
転換体内で組換えベクターが増幅されるので、その形質
転換体から増幅された組換えベクターを取得し、制限酵
素を用いて前記ＤＮＡを切り出す。形質転換体から増幅
された組換えベクターを取得する操作は、例えば、次の
ようにして行うことができる。組換えベクターがプラス
ミドである場合、その形質転換体を破砕し、フェノール
／クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、ＤＮ
Ａを取得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用
い、取得したＤＮＡを超遠心分離し、組換えベクターを
プラスミドＤＮＡとして取得する。一方、組換えベクタ
ーがファージである場合、その形質転換体を破砕し、フ
ァージ粒子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベ
クターをファージＤＮＡとして取得する。

【００４４】ＰＣＲ法を利用する方法としては、例え
ば、増幅させようとするＤＮＡの両末端の塩基配列を基
にして化学合成法によりプライマーＤＮＡを作製し、ク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行う方法を利用する
ことができる。遺伝子組換え法やＰＣＲ法を用いてＤＮ
Ａを複製させる方法の一般的手法は文献″モレキュラー
・クローニング″に記載されている。

【００４５】融合タンパク質を抗原として用いる抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法抗クラミジア・ニュ
ーモニエ抗体を製造する方法としては、例えば、本発明
の融合タンパク質を抗原としてマウスを免疫し、そのひ
臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを作
製し、その中からクラミジア・ニューモニエの５３ＫＤ
ａの抗原ポリペプチドを認識するハイブリドーマを選択
し、これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体を取得する方法を利用することができ
る。骨髄腫細胞株としては、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．
６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）やＰ３／ＮＳＩ
／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８）を使用す
ることができる。抗原として本発明の融合タンパク質を
使用すること以外は、マウスを免疫して抗体を得る公知
の一般的手法に従い、抗クラミジア・ニューモニエ抗体
を製造する。

【００４６】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
以下の実施例において、使用したモノクローナル抗体
は、ＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。ＳＣＰ５３
は、本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニ
エＫＫｐｎ−１株を抗原として、マウスを免疫し、その
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブ
リドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体であり、また、ＡＹ
６Ｅ２Ｅ８は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア
・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、
マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合
させて得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌す
る抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。表１に示されるように、
モノクローナル抗体のＳＣＰ５３及びAY6E2E8は C.ニュ
ーモニエに特異的である。

【００４７】

【表１】

【００４８】モノクローナル抗体の作製方法については
後述する。以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞
の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプ
チドの遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定まで、順
を追って説明する。

【００４９】実施例１クラミジア・ニューモニエ特異
的５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm²）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液
５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰ
ＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）
牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピ
ペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液８mlと１０％牛胎児血清含有
ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混合液４mlずつを６
ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。

【００５０】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１の培養クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株（金本ら：Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,
1993）を用いた。取得したＨＬ細胞に予めクラミジア・
ニューモニエＹＫ−４１株を感染させておき、この細胞
をＳＰＧ液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに
入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チ
ューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取
得し、クラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。６ウェ
ルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細
胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラミジア
・ニューモニエ浮遊液を１ウェルあたり２ml加えて、
２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/ml
シクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離
して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。

【００５１】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ−４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホ
モジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１
０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧ
に懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の
操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。

【００５２】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧ液を加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分
離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧ液に懸濁した。遠心
分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％
から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密
度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００
rpmで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ
ＹＫ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁した
バンドを回収し、これをＳＰＧ液で２倍に希釈し、１０
０００rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳ
ＰＧ液に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド
社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標
準とした）後、−７０℃で保存した。

【００５３】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg
/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿に１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３
００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３
０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを
加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）
飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操
作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液
を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮ
Ａを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、Ｐ
ＣＩという。）３００μｌを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心
分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返し
た。

【００５４】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させた後、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水
溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００rp
mで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管
のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、
これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に保存
した。

【００５５】（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作
製ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１
０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１
／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混
合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。な
お、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋ
ｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予
め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液に
ＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水
層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μ
ｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分
間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，
０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混
ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。

【００５６】得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌ
に溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示す
リンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭＡＴ
Ｐ４．５μｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有
０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍
濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製
水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時
間反応させ、リンカーを付加させた。

【化１】

【００５７】リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、
０．１ＭＮａＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を
０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐ
から７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭＡ
ＴＰ２０μｌ、０．１ＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭジチオ
スレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、
以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。）２０
μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加
え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端を
リン酸化した。ＰＣＩ２００μｌを加えてよく振り混
ぜた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、
水層を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μ
ｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール
４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、
１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠
心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを
加え溶かした。

【００５８】この液０．６μｌに、予め制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断したλgt11 ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタジ
ーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーシ
ョン用緩衝液０．５μl、１０ｍＭＡＴＰ０．５μｌ、
Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃
で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapack）II
Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）を用
い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングし
た。

【００５９】（Ｆ）クラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体の作製骨髄腫細胞株の培養及び継代モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、Ｐ
３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣＴＩＢ−１
８）である。１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で培養し、継代した。細胞融合に供する
２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニン、０．５
μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去剤、大日本
製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後の１週間は
通常の培地で培養した。

【００６０】マウスの免疫タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記基本小体の懸濁
液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心分離
し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁した。こ
れに２００μｌのフロイントコンプリートアジュバント
を加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマウスの
背中の皮下に注射した（この日を０日目とする）。１４
日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質の濃度が２
７０μg/mlの精製基本小体の懸濁液１００μｌをマウス
の腹腔内に注射した。更に、６９日目にタンパク質の濃
度が８００μg/mlの精製基本小体の懸濁液５０μｌ、９
２日目に同懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射
し、９５日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。

【００６１】細胞融合免疫したマウスの脾臓から得られた脾細胞１０⁸個に対
して骨髄腫細胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、
よく混合し、１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を
除去した後、細胞を更によく混合した。予め３７℃に保
温しておいた３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール
を含むＲＰＭＩ１６４０培地０．４mlを加え、３０秒間
放置した。７００rpmで６分間遠心分離した後、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地１０mlを加え、ポリエチレングリコール
がよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転さ
せ、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を完全に
除去し、沈殿に５mlのＨＡＴ培地を加え、５分間放置し
た。更に１０〜２０mlのＨＡＴ培地を加え、３０分間放
置した後、骨髄腫細胞濃度が３．３×１０⁵/mlとなるよ
うにＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピ
ペットを用い９６ウェルプラスチック製培養容器のウェ
ルに２滴ずつ分注した。５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気
下、３６℃で培養し、１日後、７日後及び１４日後にウ
ェルにＨＡＴ培地を１〜２滴加えた。

【００６２】抗体生産細胞のスクリーニング精製したクラミジアニューモニエＹＫ４１の基本小体を
１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで可溶化し、０．０２％アジ化ソ
ーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に
対して透析したのち、タンパク質濃度が１μg/mlとなる
ように希釈した液を、塩化ビニル製９６ウェルＥＩＡ用
プレートのウェルに５０μｌとり、４℃で一晩放置し、
抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに０．０２
％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳ１５０μｌを加
え、３分間放置し、その後除去・洗浄した。洗浄操作を
更に１回行なった後、ウェルに１％（ｖ／ｖ）牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、４℃で一晩放
置し、ブロッキングを行なった。牛血清アルブミンを含
むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２
０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに融合細胞
の培養上清を５０μｌ加え、室温で２時間放置した。
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様
に３回洗浄後、ウェルに２５ng/mlのペルオキシダーゼ
標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ加え、室温で
２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を
含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液
（ＫＰＬ社製）を５０μｌ加え、室温で１５分〜１時間
放置して発色反応させた後、９６ウエルＥＩＡプレート
用光度計で４０５nmの吸光度を測定した。

【００６３】この結果、陽性のウエルが見出され、その
培養上清中には基本小体と反応する抗体が含まれている
ことが分かった。このウェル中の細胞をそれぞれパスツ
ールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製培養
容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２ｍｌを加え、同様に培養
した。

【００６４】限界希釈法によるクローニング２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた融合細
胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個／mlとなるよう
それぞれをＨＴ培地で希釈した。別にＨＴ培地に懸濁し
た４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラスチッ
ク製培養容器に２×１０⁵個／ウェルとり、これに上記
の融合細胞（細胞濃度が２０個／ml）を５０μｌ／ウェ
ルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃
で培養し、その１日後、７日後及び１４日後にＨＴ培地
を１〜２滴／ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェ
ルの培養上清を５０μｌ回収し、上記と同様の方法で抗
体の生産を確認した。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイ
ブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を得た。

【００６５】モノクローナル抗体の生産ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を、１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを入れた７５
cm²プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、３
〜４日ごとにその培養液から１６〜１８mlを抜き取り、
代わりに新鮮な１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地を総量で２０mlとなるように補い、継代
培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、１２
００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗
体含有培養上清）を回収した。また、予め２週間前にプ
リスタン０．５mlを腹腔内に注射しておいたＢａｌｂ／
ｃマウスのその腹腔内に、１×１０⁶個／mlとなるよう
ＰＢＳで懸濁したハイブリドーマ株を１ml注射した。３
週間後、ｂａｌｂ／ｃマウスの腹水を回収し、１２００
rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗体含
有腹水）を回収した。

【００６６】モノクローナル抗体の精製ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が生産するモノクローナ
ル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマＡ
Ｙ６Ｅ２Ｅ８をマウス腹腔内に注射して得られたモノク
ローナル抗体含有腹水１容に３容のＰＢＳを加えて混合
し、３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清をポ
アサイズ０．２２μｍのフィルタで濾過後、これをクロ
マトップスーパープロテインＡカラム（径４．６mm×１
００mm、日本ガイシ(株)製）を用いるＨＰＬＣで精製し
た。カラムは予め、ＰＢＳで平衡化しておいた。０．２
２μｍフィルタで濾過後のサンプル１ｍｌをカラムに注
入後、ＰＢＳを１ml/minで３分間流し、次いで、５ml/m
inで４分間流してカラムを洗浄した後、精製水１ＬにＮ
ａＣｌ８．７７ｇ、クエン酸（一水和物）１６．７ｇ
及びＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ１４．７２ｇを溶かした
液を２ml/minで５分間流してモノクローナル抗体を溶出
した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、ＴＴＢＳ
溶液で希釈した。

【００６７】クラミジア・ニューモニエの基本小体を溶
解し、基本小体に含有されているペプチドを取得した。
このペプチドと上記モノクローナル抗体を用いてウェス
タンブロットを行い、取得したモノクローナル抗体の特
異性を確認した。その結果、取得したモノクローナル抗
体はクラミジア・ニューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプ
チドを認識することがわかった。ハイブリドーマＡＹ
６Ｅ２Ｅ８と同様にして、ハイブリドーマＳＣＰ５３を
取得した。上記の方法と同様にしてハイブリドーマＳＣ
Ｐ５３が産生するモノクローナル抗体の特異性を調べた
結果、このモノクローナル抗体は、クラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識することが
わかった。また、ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８及び
ハイブリドーマＳＣＰ５３が産生するモノクローナル抗
体のサブクラスを調べた結果、これらの抗体のサブクラ
スは、それぞれ、ＩｇＧ₂b及びＩｇＧ₁であった。

【００６８】（Ｇ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａのクローニング大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ₄３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシ
リン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ５ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、
３７℃で一晩振とう培養した後、これを２，０００rpm
で１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ
ＭｇＳＯ₄水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の０．３５mlを採り、これにλgt11（ＤＮＡライブラリ
ー）懸濁液を０．１μｌ加え、３７℃で２０分間インキ
ューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予め４７
℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５mlに、上記λgt11
感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上に撒い
た。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４時間培
養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭＩＰＴＧ
水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター（φ８２
mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間培養し
た。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突き刺し
てフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地
からとり出し、１５０ｍＭＮａＣｌ及び０．１％ツィ
ーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）
（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄した。寒天
培地は冷蔵庫中に保存した。

【００６９】フィルターを１５０ｍＭＮａＣｌ含有２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ
緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸
し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄し
たのち、５μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体（ＡＹ６Ｅ２Ｅ８又はＳＣＰ５３）の
ＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィ
ルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシ
ダーゼ標識の（５０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液
（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フ
ィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で
３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに
３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％４−クロ
ロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０mlを加えて調
製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色し
た時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾
した。

【００７０】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ
ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラ
チン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以
下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
クローン化した。このようにして、クラミジア・ニュー
モニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・
ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファ
ージが得られ、これを５３−３Ｓλファージと命名し
た。

【００７１】（Ｈ）５３−３Ｓλファージの培養とＤＮ
Ａ精製前記（Ｆ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液
に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ
培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μ
ｌに、λファージ液５μｌを加え、３７℃で２０分間放
置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３７℃に
温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地
５０mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こ
るまで３７℃で５時間振とう培養した。２５０μｌのク
ロロホルムを加え、３，０００rpmで１０分間遠心分離
し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λ
ファージＤＮＡは、Wizardλ preps キット（プロメガ
社、商品名）を用いて精製した。

【００７２】（Ｉ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの増幅６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μ
ｌ、１０倍濃度反応用緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、
１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液pH８．３）１０μｌ、２０ｍＭｄＮＴ
Ｐ１μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μ
ｌ、２０ｎＭ λgt11 forward primer（宝酒造(株)
製、商品名）１μｌ、２０ｎＭ λgt11 reverse prime
r（宝酒造(株)製、商品名）１μｌ、AmpliTaq DNA Poly
merase（宝酒造(株)製、商品名）０．５μｌを入れ、ミ
ネラルオイルを２滴重層した。９４℃ ３０秒、５５℃
３０秒、７３℃ ２分のサイクルのインキュベーショ
ンを３０回繰返し、ＤＮＡを増幅した。反応後、１．２
％低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された
ＤＮＡを切り出して Wizard PCR Prep キット（プロメ
ガ社製、商品名）で精製した。

【００７３】（Ｊ）ＤＮＡ塩基配列分析ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオ
システムズ社製、商品名）で分析を行った。得られたＤ
ＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」
（日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名）
を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行な
い、配列番号７の配列を得た。配列番号７の配列の解析
結果から、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドについて、その
Ｎ末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解
明されたことが分かった。

【００７４】上記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡは、クラミジア・ニューモニ
エに特異的で、かつ、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認
識するモノクローナル抗体を利用してクローニングされ
たので、このＤＮＡは、明らかに５３ＫＤａ抗原ポリペ
プチドをコードしている。配列番号７の塩基配列及びア
ミノ酸配列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベース
で行なった結果、高い相同性を示す既知の配列は無かっ
た。

【００７５】実施例２ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドの一部を含む融合
タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターの
作製及びそれを含む形質転換体の作製プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを制限酵素BamHIとXhoIで
切断し、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳動を行
い、約４．６KbpのＤＮＡ断片を切り出して精製した。
一方、５３−３ＳλファージＤＮＡを制限酵素EcoRIで
切断し、同様に約１．０KbpのＤＮＡ断片を精製した
後、さらに制限酵素AvaIIで切断し、同様に約０．８Kbp
のＤＮＡ断片を精製した。上記の約４．６KbpのＤＮＡ
断片１００ngに上記の約０．８KbpのＤＮＡ断片１００n
g、配列番号８〜１１の合成ＤＮＡ各１ngを添加し、Ｄ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いてこれらの
ＤＮＡを連結した。この反応物を大腸菌ＨＢ１０１株コ
ンピテントセル（宝酒造）に入れ、形質転換体を作製し
た。

【００７６】この形質転換体を、５０mg/Lのアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養
した。得られた大腸菌のコロニーを５０mg/Lのアンピシ
リンを含むＬＢ培地３mlに接種し、３７℃で一晩振とう
培養した。アルカリ溶解法でプラスミドベクターを分離
し、制限酵素NruIで切断し、０．８％アガロースゲル電
気泳動で分析し、６１６bpと４８２２bpのＤＮＡ断片が
生じている組換えプラスミドベクターをもつ大腸菌を選
択した。得られた組換えプラスミドベクターをｐＣＰＮ
５３３Ｔと名付けた。このプラスミドベクターは、配列
番号１２の塩基配列を有する約５．４ｋｂｐのＤＮＡで
あり、ＤＨＦＲのＣ末端にクラミジア・ニューモニエの
５３ＫＤａ抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチド
を連結した融合タンパク質を発現させるものである。こ
の融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は配列
番号６のようになっており、この塩基配列から推定され
るアミノ酸配列はを配列番号４のようになっていた。

【００７７】実施例３ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドの一部を含むポリ
ペプチドの融合タンパク質の確認プラスミドｐＣＰＮ５３３Ｔを保持する大腸菌ＨＢ１０
１株１白金耳を５０mg/lのアンピシリンを含むＬＢ培地
３mlに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この大腸
菌を含む培地１０μｌに１０μｌのローディング緩衝液
（０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％メルカプ
トエタノール、２０％グリセロール、５％ＳＤＳを含む
０．１５６Ｍトリス塩酸緩衝液、pH６．８）を加え、８
０℃で５分間加熱した後、反応液を５−２０％ポリアク
リルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけた。セミド
ライブロッティング装置の陽極板上に、１０％メタノー
ル、０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．３Ｍ
トリス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、
０．０５％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２５ｍＭトリ
ス水溶液で湿らせたろ紙１枚、１０％メタノール、０．
０５％ドデシル硫酸ナトリウム、４０ｍＭアミノカプロ
ン酸を含む２５ｍＭトリス水溶液で湿らせたニトロセル
ロース膜１枚、上記電気泳動の終了したポリアクリルア
ミドゲル、４０ｍＭアミノカプロン酸を含む２５ｍＭト
リス水溶液で湿らせたろ紙２枚をこの順序で重ね、陰極
板をセットして２．５mA／cm²の電流密度で1時間電流を
流し、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロ
セルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を
０．１％牛血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液に入れ、
室温で１時間以上放置し、ブロッキングした。ニトロセ
ルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、ハイブ
リドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が生産するモノクローナル抗体
溶液（１０μg/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で３７℃、１
時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢＳ緩衝液
で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識した抗マウス
ＩｇＧ抗体溶液（５０ng/ml ＴＴＢＳ緩衝液中）中で
３７℃１時間振とうした。ニトロセルロース膜をＴＴＢ
Ｓ緩衝液で3回洗浄した後、発色基質液（１００mlのTBS
緩衝液に６０μｌの３０％過酸化水素水溶液と２０mlの
４−クロロ−１−ナフトールメタノール溶液を混合す
る）に入れ、室温で３０分間反応させた。ニトロセルロ
ース膜を取り出し、精製水で洗浄した後風乾した。この
結果、融合タンパク質の大きさに相当する位置に発色し
たバンドが観察され、プラスミドｐＣＰＮ５３３Ｔをも
つ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエ特異的に反応す
るモノクローナル抗体と反応することのできる５３ＫＤ
ａ抗原を発現していることが示された。

【００７８】実施例４クラミジア・ニューモニエの５
３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取
得配列番号７の塩基配列を元に、配列番号１３及び１４の
塩基配列を有するＤＮＡを、ＤＮＡ合成機を用いて合成
した。実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ４
１株のゲノムＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ含有量：
約１μｇ）に、１０倍濃縮Ｋバッファ５μｌ、精製水３
５μｌ及び制限酵素ＨｉｎｄIII（１９Ｕ／μｌ）５μ
ｌを添加し、３７℃で３時間保温した。得られた反応液
をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離
して沈殿を取得した。この沈殿に、ＰＣＲ in vitro Cl
oning Kit(宝酒造(株)製、商品名)中のＨｉｎｄIIIカセ
ットＤＮＡ（２０ng/μl）５μｌ、ライゲーション溶液
１５μｌを添加し、１６℃で３０分間保温した。取得し
た反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、
遠心分離して沈殿を取得し、これを１０μｌの精製水に
溶解した。

【００７９】得られた溶液１μｌに、精製水７８．５μ
ｌ、１０倍濃縮ＰＣＲ用バッファ１０μｌ、２．５ｍＭ
ｄＮＴＰ８μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（５
Ｕ／μｌ）を添加し、さらに、プライマーＤＮＡとし
て、配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol
/μl）１μｌ及び配列番号１５の塩基配列を有するＤＮ
Ａ（２０pmol/μl）（上記キットにおいて、プライマー
Ｃ１として同封されていたもの）１μｌを添加して、こ
れらを０．６ｍｌのマイクロチューブに入れ、ミネラル
オイル２滴を重層し、９４℃３０秒、５５℃２分、７２
℃３分の温度サイクルを３０回繰り返した。以上の工程
をＰＣＲ工程という。

【００８０】ＰＣＲ工程後の反応液１μｌに、プライマ
ーＤＮＡとして、配列番号１４の塩基配列を有するＤＮ
Ａ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１６の塩基配列
を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおい
て、プライマーＣ２として同封されていたもの）１μｌ
を用い、再度ＰＣＲ工程を行った。２番目のＰＣＲ工程
後の反応液を１．２％低融点アガロースゲル電気泳動さ
せ、約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡが含有されている
アガロースゲルを切り出した。ＤＮＡの精製には Wizar
d PCR Prep キット（プロメガ社製、商品名）を用い
た。即ち、切り出したアガロースゲルにキットに同封さ
れている緩衝液を添加し、加熱してアガロースゲルを溶
解し、キットに同封されている精製用樹脂を添加してＤ
ＮＡを樹脂に吸着させ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿
として取得した。沈殿をプロパノールで洗浄し、再度遠
心分離して沈殿を取得した。沈殿に精製水を添加し、精
製用樹脂からＤＮＡを溶出して、遠心分離し、上清（Ｄ
ＮＡ水溶液）を得た。以上の工程をＤＮＡ精製工程とい
う。

【００８１】取得したＤＮＡ水溶液を用い、含まれるＤ
ＮＡを鋳型とするTaq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標
識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス
反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライ
ドバイオシステムズ社製、商品名）でそのＤＮＡの塩基
配列を分析した。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列
分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジ
ニアリング(株)製、商品名）を用いて、編集、連結、ア
ミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の工程を塩基配
列解析工程という。

【００８２】取得したＤＮＡの塩基配列を解析した結
果、このＤＮＡは実施例１で取得したクラミジア・ニュ
ーモニエの抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの中の
３′末端側の約５０ｂｐの塩基配列を有していた。さら
に、その塩基配列の下流には、終始コドンを含有する約
０．７ｋｂのコード領域が存在していることがわかっ
た。配列番号７の塩基配列を元に、クラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチドのをコードするＤＮＡの上流
部分に相当するプライマーとして、配列番号１７の塩基
配列を有するＤＮＡを、また、上記の約０．７ｋｂのコ
ード領域を含む塩基配列を元に、クラミジア・ニューモ
ニエの抗原ポリペプチドのをコードするＤＮＡの下流部
分に相当するプライマーとして、配列番号１８の塩基配
列を有するＤＮＡを、それぞれ、ＤＮＡ合成機を用いて
合成した。

【００８３】実施例１で得たクラミジア・ニューモニエ
ＹＫ４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１μｌを用い、プラ
イマーＤＮＡとして配列番号１７の塩基配列を有するＤ
ＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１８の塩基配
列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌを用いてＰＣ
Ｒ工程を行った。３番目のＰＣＲ工程後の反応液を用
い、上記ＤＮＡ精製工程を行い、約１．５ｋｂｐのＤＮ
Ａを取得した。取得したＤＮＡ水溶液を用い、上記塩基
配列解析工程を行った。取得したＤＮＡの塩基配列を解
析した結果、このＤＮＡは配列番号５の４８４〜１９４
７番目の塩基配列を有しており、配列番号３の１６２〜
６４９番目のアミノ酸配列をコードしていることがわか
った。またプラスミドｐＣＰＮ５３３Ｔと前述のλgt11
のＤＮＡライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行
い、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペ
プチド全体をコードするＤＮＡを取得した。

【００８４】実施例５ＤＨＦＲとクラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体の融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製及
びそれを含む形質転換体の作製プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭと前記クラミジア・ニュー
モニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードする
ＤＮＡを用い、実施例２と同様にしてＤＨＦＲとクラミ
ジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体
の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベク
ターとそれを含む形質転換体を作製する。この融合タン
パク質をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号５のよ
うになっており、この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列はを配列番号３のようになっている。

【００８５】実施例６融合タンパク質を抗原として用
いる、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造本発明の融合タンパク質を抗原として用いる抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体のは、例えば、次のようにして製
造することができる。（Ａ）骨髄腫細胞株の培養及び継代骨髄腫細胞株はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８０）を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、継代する。細胞融合
に供する２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニ
ン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０（マイコプラズマ
除去剤、大日本製薬（株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛
胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、
その後の１週間は通常の培地で培養する。

【００８６】（Ｂ）マウスの免疫タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心
分離し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁す
る。これに２００μｌのフロイントコンプリートアジュ
バントを加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマ
ウスの背中の皮下に注射する（この日を０日目とす
る）。１４日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質
の濃度が２７０μg/mlの上記融合タンパク質の懸濁液１
００μｌをマウスの腹腔内に注射し、更に、６９日目に
タンパク質の濃度が８００μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液５０μｌ、９２日目に同懸濁液１００μｌをマ
ウスの腹腔内に注射し、９５日目に脾臓を取り出し、細
胞融合に供する。

【００８７】（Ｃ）細胞融合上記脾臓から得られる脾細胞１０⁸個に対して骨髄腫細
胞１０⁷個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、
１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞
を更によく混合する。予め３７℃に保温してある３０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＲＰＭＩ１６
４０培地０．４mlを加え、３０秒間放置する。７００rp
mで６分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１０m
lを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるように
ガラスチューブをゆっくり回転させ、１４００rpmで５
分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に５mlのＨ
ＡＴ培地を加え、５分間放置する。更に１０〜２０mlの
ＨＡＴ培地を加え、３０分間放置し、骨髄腫細胞濃度が
３．３×１０⁵/mlとなるようにＨＡＴ培地を加えて細胞
を懸濁させ、パスツールピペットを用い９６ウェルプラ
スチック製培養容器のウェルに２滴ずつ分注する。５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、１日
後、７日後及び１４日後にウェルにＨＡＴ培地を１〜２
滴加える。

【００８８】（Ｄ）抗体生産細胞のスクリーニング上記融合タンパク質をタンパク質濃度が１〜１０μg/ml
となるように０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ソーダ含有
０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に懸濁し、
０．０２％アジ化ソーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩
衝液（pH９．６）に対して透析し、その後、タンパク質
濃度が１〜１０μg/mlとなるように希釈した液を、塩化
ビニル製９６ウェルＥＩＡ用プレートのウェルに５０μ
ｌとり、４℃で一晩放置し、抗原を吸着させる。上澄み
を除去し、ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０
を含むＰＢＳ１５０μｌを加え、３分間放置し、その後
除去・洗浄する。洗浄操作を更に１回行なった後、ウェ
ルに１％（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１０
０μｌを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを
行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、
０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様
に２回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ
加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツ
ィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに
２５ｎg/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を５０μｌ加え、室温で２時間放置する。０．０
２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回
洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μ
ｌ加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、
９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度
を測定する。そして陽性のウエル中の細胞をそれぞれパ
スツールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製
培養容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２mlを加え、同様に培
養する。

【００８９】（Ｅ）限界希釈法によるクローニング２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた２株の
融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個／mlとな
るようそれぞれをＨＴ培地で希釈する。別にＨＴ培地に
懸濁した４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラ
スチック製培養容器に１〜２×１０⁵個／ウェルとり、
これに上記の融合細胞（細胞濃度が２０個／ｍｌ）を５
０μｌ／ウェルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲
気下、３６℃で培養し、その１日後、７日後及び１４日
後にＨＴ培地を１〜２滴／ウェル加える。細胞の増殖が
見られたウェルの培養上清を５０μｌ回収し、上記
（Ｄ）の「抗体生産細胞のスクリーニング」と同様の方
法で抗体の生産を確認する。ウェル中に単一の細胞コロ
ニーしか存在せず、基本小体と反応する抗体を生産する
もので、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き
続き２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させる。
更に、同様のクローニング操作を繰り返し、抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体を産生するハイブリドーマを取得
する。これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・
ニューモニエ抗体を製造する。

【００９０】

【発明の効果】請求項１記載の融合タンパク質は、クラ
ミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適である。請求
項２記載の融合タンパク質は、請求項１記載の融合タン
パク質の効果を奏し、さらにアミノ酸配列が短いため、
担体等に固定化できる抗原ペプチドの数を多くすること
ができ、それにより感度の高い診断薬の製造に利用でき
る。請求項３記載の融合タンパク質は、請求項１記載の
融合タンパク質の効果を奏し、さらにタンパク質分解酵
素による分解を受けにくい構造を造ることができるの
で、抗原としての安定性に優れる。請求項４記載の融合
タンパク質は、請求項１記載の融合タンパク質の効果を
奏し、さらにクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原
ポリペプチドの全体を有するので、クラミジア・ニュー
モニエの特異的抗体検査等に極めて適切である。請求項
５記載の融合タンパク質は、請求項１記載の融合タンパ
ク質の効果を奏し、さらにクラミジア・ニューモニエに
特異的な抗原部分を有するので、クラミジア・ニューモ
ニエの特異的抗体検査等に好適である。

【００９１】請求項６記載のＤＮＡは、クラミジア・ニ
ューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診
断に好適な融合タンパク質の製造に利用できる。請求項
７記載のＤＮＡは、請求項６記載のＤＮＡの効果を奏
し、さらにこのＤＮＡにコードされている融合タンパク
質は、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペ
プチドの全体を有するので、クラミジア・ニューモニエ
の特異的抗体検査等に極めて適切な融合タンパク質の製
造に利用できる。請求項８記載のＤＮＡは、請求項６記
載のＤＮＡの効果を奏し、さらにこのＤＮＡにコードさ
れている融合タンパク質は、クラミジア・ニューモニエ
に特異的な抗原部分を有するので、クラミジア・ニュー
モニエの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製
造に利用できる。

【００９２】請求項９記載の組換えベクターは、クラミ
ジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモ
ニエの診断に好適な融合タンパク質の製造に利用でき
る。請求項１０記載の組換えベクターは、請求項９記載
の組換えベクターの効果を奏し、さらにクラミジア・ニ
ューモニエに特異的な抗原部分を有する融合タンパク質
を発現させることができるので、クラミジア・ニューモ
ニエの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製造
に利用できる。請求項１１記載の形質転換体は、クラミ
ジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモ
ニエの診断に好適な融合タンパク質の製造に利用でき
る。請求項１２記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体
の製造法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断薬製
造に好適である。

【００９３】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：160 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160

【００９４】配列番号：2 配列の長さ：488 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala 260 265 270 Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala 275 280 285 Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr 290 295 300 Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys 325 330 335 Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350 Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys 355 360 365 Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile 370 375 380 Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400 Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu 405 410 415 Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln 420 425 430 Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala 435 440 445 Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln 450 455 460 Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile 465 470 475 480 Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488

【００９５】配列番号：3 配列の長さ：649 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 Val Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala 420 425 430 Ala Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala 435 440 445 Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Thr Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val 465 470 475 480 Lys Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile 485 490 495 Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val 500 505 510 Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala 515 520 525 Lys Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val 530 535 540 Ile Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val 545 550 555 560 Val Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser 565 570 575 Glu Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu 580 585 590 Gln Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln 595 600 605 Ala Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr 610 615 620 Gln Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala 625 630 635 640 Ile Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 645 649

【００９６】配列番号：4 配列の長さ：432 配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 Val Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 420 425 430 432

【００９７】配列番号：５配列の長さ：１９４７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 CTG ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC 528 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 ATG TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT 576 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 AAG CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT 624 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 AAA AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA 672 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 AAA GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT 768 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 GAT ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 ACA AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG 864 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 GAA GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 TCC GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA 1008 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 ACA TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG 1152 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 GAA CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT 1248 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 GTG ATG ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT 1296 Val Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala 420 425 430 GCT ATT TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT 1344 Ala Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala 435 440 445 GCT GTA GGT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA 1392 Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala 450 455 460 ACC ACG GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG 1440 Thr Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val 465 470 475 480 AAA CAA GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA 1488 Lys Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile 485 490 495 AAA GCG GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC 1536 Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val 500 505 510 AAA GCG ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT 1584 Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala 515 520 525 AAG GGA ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC 1632 Lys Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val 530 535 540 ATC TCG TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA 1680 Ile Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val 545 550 555 560 GTT GCG GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG 1728 Val Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser 565 570 575 GAG ATG CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG 1776 Glu Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu 580 585 590 CAG GCT GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG 1824 Gln Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln 595 600 605 GCA AGT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT 1872 Ala Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr 610 615 620 CAA AAA GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA 1920 Gln Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala 625 630 635 640 ATC AGC GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA 1947 Ile Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 645 649

【００９８】配列番号：6 配列の長さ：1296 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 CTG ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC 528 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 ATG TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT 576 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 AAG CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT 624 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 ＡＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＣＣ
ＡＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＡ 672 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 AAA GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT 768 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 GAT ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 ACA AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG 864 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 GAA GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 TCC GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA 1008 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 ACA TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG 1152 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 GAA CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT 1248 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 GTG ATG ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG GGG CCC TTA ATT AAT 1296 Val Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 420 425 430 432

【００９９】配列番号：7 配列の長さ：1048 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：C. ニューモニエ株名：YK-41 直接の起源クローン：53-3S 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：236..1012 特徴を決定した方法：Ｐ配列ＴＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＣＧＧＣ
ＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＴＴＴＡＣＡ６０ＴＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣ
ＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＧＣＡＡＡ 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG AAGGGGTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 Ile Ala ２５９

【０１００】配列番号：８配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GATCCTGATG TCTATTTCAT CTTCTTCAG 29

【０１０１】配列番号：9 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTCCTGAAGA AGATGAAATA GACATCAG 28

【０１０２】配列番号：10 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AATTGCCATG GGGGCCCTTA ATTAATTAAC 30

【０１０３】配列番号：11 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC 30

【０１０４】配列番号：12 配列の長さ：5438 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖配列の種類：他の核酸プラスミド配列 ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCGG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA 60 TCAGTCTGAT TGCGGCGTTA GCGGTAGATC GCGTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCGT 120 GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTGGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA 180 TGGGCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240 TCAGCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA 300 TCGCGGCGTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCGGTCGC GTTTATGAAC 360 AGTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAAGGCG 420 ACACCCATTT CCCGGATTAC GAGCCGGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC GAATTCCACG 480 ATGCTGATGC GCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTGGAGCGG CGGATCCTGA 540 TGTCTATTTC ATCTTCTTCA GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA 600 CATCGACACC CCAGGGCGTG CCCCAACAAG ATAAGCTGTC TGGCAACGAA ACGAAGCAAA 660 TACAGCAAAC ACGTCAGGGT AAAAACACTG AGATGGAAAG CGATGCCACT ATTGCTGGTG 720 CTTCTGGAAA AGACAAAACT TCCTCGACTA CAAAAACAGA AACAGCTCCA CAACAGGGAG 780 TTGCTGCTGG GAAAGAATCC TCAGAAAGTC AAAAGGCAGG TGCTGATACT GGAGTATCAG 840 GAGCGGCTGC TACTACAGCA TCAAATACTG CAACAAAAAT TGCTATGCAG ACCTCTATTG 900 AAGAGGCGAG CAAAAGTATG GAGTCTACCT TAGAGTCACT TCAAAGCCTC AGTGCCGCGC 960 AAATGAAAGA AGTCGAAGCG GTTGTTGTTG CTGCCCTCTC AGGGAAAAGT TCGGGTTCCG 1020 CAAAATTGGA AACACCTGAG CTCCCCAAGC CCGGGGTGAC ACCAAGATCA GAGGTTATCG 1080 AAATCGGACT CGCGCTTGCT AAAGCAATTC AGACATTGGG AGAAGCCACA AAATCTGCCT 1140 TATCTAACTA TGCAAGTACA CAAGCACAAG CAGACCAAAC AAATAAACTA GGTCTAGAAA 1200 AGCAAGCGAT AAAAATCGAT AAAGAACGAG AAGAATACCA AGAGATGAAG GCTGCCGAAC 1260 AGAAGTCTAA AGATCTCGAA GGAACAATGG ATACTGTCAA TACTGTGATG ATCGCGAAGG 1320 GGTTCGAATT GCCATGGGGG CCCTTAATTA ATTAACTCGA GAGATCCAGA TCTAATCGAT 1380 GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG 1440 CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG GGCTCATGAG 1500 CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCGTGGCCG GGGGACTGTT GGGCGCCATC 1560 TCCTTGCATG CACCATTCCT TGCGGCGGCG GTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC 1620 TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC GCATAAGGGA GAGCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC 1680 AACCCAGTCA GCTCCTTCCG GTGGGCGCGG GGCATGACTA TCGTCGCCGC ACTTATGACT 1740 GTCTTCTTTA TCATGCAACT CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC 1800 GAGGACCGCT TTCGCTGGAG CGCGACGATG ATCGGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC 1860 TTGCACGCCC TCGCTCAAGC CTTCGTCACT GGTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG 1920 CAGGCCATTA TCGCCGGCAT GGCGGCCGAC GCGCTGGGCT ACGTCTTGCT GGCGTTCGCG 1980 ACGCGAGGCT GGATGGCCTT CCCCATTATG ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCGGGATG 2040 CCCGCGTTGC AGGCCATGCT GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACAGCTTCAA 2100 GGATCGCTCG CGGCTCTTAC CAGCCTAACT TCGATCACTG GACCGCTGAT CGTCACGGCG 2160 ATTTATGCCG CCTCGGCGAG CACATGGAAC GGGTTGGCAT GGATTGTAGG CGCCGCCCTA 2220 TACCTTGTCT GCCTCCCCGC GTTGCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA 2280 ATGGAAGCCG GCGGCACCTC GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA GCCAATCAAT 2340 TCTTGCGGAG AACTGTGAAT GCGCAAACCA ACCCTTGGCA GAACATATCC ATCGCGTCCG 2400 CCATCTCCAG CAGCCGCACG CGGCGCATCT CGGGCAGCGT TGGGTCCTGG CCACGGGTGC 2460 GCATGATCGT GCTCCTGTCG TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGGGGTTGC CTTACTGGTT 2520 AGCAGAATGA ATCACCGATA CGCGAGCGAA CGTGAAGCGA CTGCTGCTGC AAAACGTCTG 2580 CGACCTGAGC AACAACATGA ATGGTCTTCG GTTTCCGTGT TTCGTAAAGT CTGGAAACGC 2640 GGAAGTCAGC GCCCTGCACC ATTATGTTCC GGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC 2700 CCTGTGGAAC ACCTACATCT GTATTAACGA AGCGCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC 2760 TCTGGTCCCG CCGCATCCAT ACCGCCAGTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGG 2820 CATGTTCATC ATCAGTAACC CGTATCGTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA 2880 CCCCCATGAA CAGAAATTCC CCCTTACACG GAGGCATCAA GTGACCAAAC AGGAAAAAAC 2940 CGCCCTTAAC ATGGCCCGCT TTATCAGAAG CCAGACATTA ACGCTTCTGG AGAAACTCAA 3000 CGAGCTGGAC GCGGATGAAC AGGCAGACAT CTGTGAATCG CTTCACGACC ACGCTGATGA 3060 GCTTTACCGC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA 3120 GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA 3180 GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA 3240 TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 3300 CATATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT 3360 TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 3420 GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 3480 ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 3540 TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 3600 CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC 3660 TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC 3720 GTGGCGCTTT CTCAATGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC 3780 AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC 3840 TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT 3900 AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT 3960 AACTACGGCT ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC 4020 TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT 4080 TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG 4140 ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC 4200 ATGAGATTAT CAAAAAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA 4260 TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG 4320 GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG 4380 TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA 4440 GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG 4500 CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA 4560 GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC 4620 ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA 4680 AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG 4740 ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT 4800 AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC 4860 AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG 4920 GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG 4980 GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT 5040 GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA 5100 GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA 5160 CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT GAGCGGATAC 5220 ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA 5280 GTGCCACCTG ACGTCTAAGA AACCATTATT ATCATGACAT TAACCTATAA AAATAGGCGT 5340 ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTA ATTGTTATCC GCTCACAATT AATTCTTGAC 5400 AATTAGTTAA CTATTTGTTA TAATGTATTC ATAAGCTT 5438

【０１０５】配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA 20

【０１０６】配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTCGAAGGAA CAATGGATAC 20

【０１０７】配列番号：15 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23

【０１０８】配列番号：16 配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TAATACGACT CACTATAGGG AGA 23

【０１０９】配列番号：17 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT 28

【０１１０】配列番号：18 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA ３
０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 7804−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/571 33/571 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 49/00 49/00 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (54)【発明の名称】ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で示されるペプチドに、直接
に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号２で示され
るペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸か
らなる配列を含むポリペプチドＡが結合した、ジヒドロ
葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タン
パク質。
【請求項２】ポリペプチドＡが、配列番号２で示され
るペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドで
ある、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】ポリペプチドＡが、配列番号２で示され
るペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて
いるか又は配列番号２で示されるペプチドの中にアミノ
酸が挿入されているポリペプチドである、請求項１記載
の融合タンパク質。
【請求項４】配列番号３で示されるペプチドである、
請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】配列番号４で示されるペプチドである、
請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤ
ＮＡ。
【請求項７】配列番号５で示される塩基配列を有す
る、請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項８】配列番号６で示される塩基配列を有す
る、請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項９】請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡ
を含む組換えベクター。
【請求項１０】ｐＣＰＮ５３３Ｔプラスミドである請
求項９記載の組換えベクター。
【請求項１１】請求項９又は１０に記載の組換えベク
ターを含む形質転換体。
【請求項１２】請求項１〜５のいずれかに記載の融合
タンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造法。