CN114885899B - 一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用 - Google Patents

一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用。所述构建方法包括：构建用于表达猫氨基肽酶N的重组腺病毒载体，转导到工程细胞中包装获得重组腺病毒；用获得的重组腺病毒感染实验动物，获得对猫冠状病毒易感的实验动物；使用猫冠状病毒感染获得的对猫冠状病毒易感的实验动物，获得猫冠状病毒感染实验动物模型。本发明的构建方法通过包装出了表达fAPN的重组腺病毒，体外证明其能够使293细胞表达fAPN，使其对猫冠状病毒易感。体内将重组腺病毒转导小鼠后，使小鼠能够被FCoV感染，验证了重组芽孢枯草杆菌对小鼠感染模型的免疫保护效果，证明构建的重组腺病毒小鼠感染模型可以用于药物治疗与疫苗评价。

Description

一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用。
背景技术
猫冠状病毒(FCoVs)是家猫的一种重要胃肠道病原体，已知在家猫和多猫家庭中普遍存在。FCoV病毒有4种主要结构蛋白，分别是刺突蛋白(Spike protein，S)、膜蛋白(Membrane protein，M)、小膜蛋白(Small envelope protein，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)。其中S蛋白是排列在包膜突起的糖蛋白，分子量约为180～200kDa，它对于诱导宿主的抗体应答和细胞免疫很重要。冠状病毒可通过S蛋白与特定的细胞受体结合，是决定病毒致病性和组织嗜性的关键因素，S蛋白是诱导机体产生中和抗体的保护性抗原。通过血清学和序列分析可以区分两种型FCoV，分别称为猫科肠道冠状病毒(FECV)和猫科感染性腹膜炎病毒(FIPV)，它们的毒力在本质上不同，这两种生物型存在于血清型I和II中。一些研究表明，血清II型FCoV使用氨基肽酶N作为入侵细胞的受体，然而I型FCoV的受体尚不清楚。绝大多数FECV是良性的，只会引起轻度腹泻，但FIPV可导致致命疾病([1]Dye C，Temperton N，Siddell SG.Type I feline coronavirus spikeglycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor onfeline cell lines.Journal of General Virology，2007，88：1753-60.[2]Jaimes JA，Whittaker GR.Feline coronavirus：Insights into viral pathogenesis based on thespike protein structure and function.Virology，2018，517：108-21.)。FCoV的S蛋白介导宿主细胞进入，S蛋白含有一个编码的多肽，使FCoV囊膜与宿主细胞膜融合。S基因的突变会导致转录S蛋白的氨基酸替换，从而影响FCoV的靶向性。研究已经确定了FCoV的S基因多肽序列的突变，这些突变被认为是FIPV的标记，以及密切相关的蛋白酶切割位点的变化，这些位点也被认为与FIPV相关。
最近，人们发现多肽突变可能是全身性FCoV感染的标志，这可能发生在FIPV和非FIPV猫，而不是FIPV本身。然而，这些突变仍然很重要，因为它可能是通过这些和其他突变，使得FCoV获得其单核/巨噬细胞的靶向性，使它能够在肠道外系统地传播，并促进FIPV的发展。但FIPV临床上很难识别和诊断，也没有研发出相关的有效疫苗。猫冠状病毒感染的预防和治疗面临着值得付出相当大努力的挑战。猫作为一种伴侣动物，从动物福利以及实验动物成本来说，亟需构建相关小动物模型用以疫苗评价和药物治疗等。
然而，到目前为止，还没有相关研究构建过猫冠状病毒感染的小动物模型。
发明内容
申请人通过腹腔注射E1/E3缺失的腺病毒5型载体，将fAPN(猫氨基肽酶N)导入小鼠，使其对FCoV(血清型II)敏感，感染FCoV后，小鼠出现肠炎。
申请人发现小鼠模型是FCoV研究中替代宿主动物猫的良好选择。此外，申请人在FCoV感染小鼠模型中通过口服一株重组芽孢枯草杆菌来评估其免疫保护作用。申请人发现它能有效地抑制FCoV感染，减轻消化道的病理损伤。
由于实验猫的费用和动物福利角度出发，有必要为FCoV开发一种小动物模型，用于药物评估和抗病毒治疗的开发。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建用于表达猫氨基肽酶N的重组腺病毒载体，转导到工程细胞中包装获得重组腺病毒；
(2)用步骤(1)获得的重组腺病毒感染实验动物，获得对猫冠状病毒易感的实验动物；
(3)使用猫冠状病毒感染步骤(2)获得的对猫冠状病毒易感的实验动物，获得猫冠状病毒感染实验动物模型，其中，所述猫冠状病毒为血清II型猫冠状病毒。
具体的，步骤(1)中所述重组腺病毒载体的腺病毒的骨架质粒为E1/E3缺失复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)，其特点是具有较低的免疫原性，是最广泛使用的载体，用于传递治疗性基因。
具体的，构建带有氨基肽酶N的重组腺病毒载体的方法包括：将标签蛋白和猫氨基肽酶N的编码序列整合到E1/E3缺失复制缺陷型5型腺病毒中，即得到用于表达猫氨基肽酶N的重组腺病毒载体，其中，猫氨基肽酶N的编码基因序列如SEQ ID No.1所示，标签蛋白的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，从实验猫的费用和动物福利角度出发，所用实验动物为小鼠。
优选的，步骤(2)中获得的重组腺病毒经腹腔注射感染实验动物。
优选的，腹腔注射到实验动物体内的重组腺病毒的量为2.5×106PFU。
本发明还提供了上述构建方法在动物模型构建领域的应用。
本发明还提供了上述构建方法构建获得的猫冠状病毒感染的动物模型在筛选预防或治疗猫冠状病毒的药物中的应用。
优选的，所述猫冠状病毒是血清II型猫冠状病毒，本申请使用的猫冠状病毒毒株为79-1683(GenBankAccession No.X80799.1)。
本发明的有益效果：
本发明的构建方法通过包装出了表达fAPN的重组腺病毒，并在体外上证明了其能够使293细胞表达fAPN，使其对猫冠状病毒易感。体内将重组腺病毒转导小鼠后，使小鼠能够被FCoV感染，最后验证了重组芽孢枯草杆菌对小鼠感染模型的免疫保护效果，证明构建的重组腺病毒小鼠感染模型可以用于药物治疗与疫苗评价。
附图说明
图1为在Ad5-fAPN转导的293细胞上进行表达fAPN的Western blot图。
图2为Ad5-fAPN转导后FCoV感染的共焦图像。
图3为在转导后12小时、24小时、48小时和72小时，用FCoV感染Ad-fAPN转导的293细胞，293细胞上的病毒生长曲线结果图。
图4为5周龄小鼠经腹腔注射2.5×106PFU Ad5-fAPN/Ad5-GFP，4天后经腹腔注射105PFU FcoV，到接种后21天期间采样和收集血清情况图。
图5为粪便中病毒RNA的定量PCR检测图；分别在感染1、3、5、7、10和14dpi时进行。
图6为十二指肠、空肠以及回肠中病毒RNA的定量PCR检测图；分别在感染1、3、5、7、10和14dpi时进行，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图7为ELISA法检测感染小鼠血清中抗FCoV水平图。
图8为小鼠的肠道切片苏木精/伊红染色图。
图9为在小鼠肠道中双标记免疫荧光细胞染色分析图；fAPN Flag用绿色标记，N用红色标记，细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图10为动物实验方案图；小鼠灌胃接种rBSCotB-HR2P/PBS(Ctrl)3周，腹腔注射2.5×106PFU Ad5-fAPN/Ad5-GFP，4天后腹腔注射105PFU FCoV。
图11为粪便中的病毒RNA通过qPCR测定；分别在感染后1、3、5、7、10和14dpi时进行。
图12为在1、3、5、7、10和14dpi时，通过qPCR测定十二指肠、空肠和回肠中的FCoVRNA载量图；n＝每组3只小鼠；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图13为代表性HE染色小鼠肠道切片图。
图14为肠内N蛋白的IHC染色图。
图15为小肠的典型组织病理学病变图。
具体实施方式
实施例1
重组腺病毒的包装与验证。
腺病毒载体在转基因表达方面具有显著的优势，并能使小鼠对系统感染敏感。E1/E3缺失复制缺陷型5型腺病毒载体(Ad5)的特点是具有较低的免疫原性，是最广泛使用的载体，用于传递治疗性基因。将猫氨基肽酶N(fAPN)(Gene ID：493785)的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)的FLAG-tag cDNA(基因序列如SEQ ID No.2所示)克隆到Ad5中，记为Ad5-fAPN(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)，以开发在小鼠肠道表达fAPN的腺病毒载体，将绿色荧光蛋白(GFP)替代fAPN编码基因所得的腺病毒载体设置为对照组，记为Ad5-GFP。用Ad5-fAPN瞬时转导293细胞48小时，获得细胞裂解物用于分析fAPN的表达(图1)。
结果为：通过转染fAPN质粒的293细胞作为阳性对照，发现24h后293细胞能够有效表达fAPN，WB检测到相应条带，感染Ad5-fAPN的293细胞作为实验组，发现感染后的293细胞能够表达fAPN，而其他未作处理的293细胞不能表达fAPN。
实施例2
重组腺病毒感染使非易感细胞对猫冠状病毒易感。
为了确定Ad5-fAPN是否能在体外高效传递fAPN，293细胞在Ad5-fAPN转导12h后被FCoV感染(猫冠状病毒毒株为79-1683，GenBank号为X80799.1)(图2)，我们用fAPN上连接的Flag标签抗体((F3165)Monoclonal ANTI-FLAG(R)M2 antibody produced in mouse，Merck)作为一抗(绿光)进行免疫荧光染色，用与FCoV具有高度同源性的TGEV N蛋白抗体(浙江大学，动物科学学院预防兽医研究所黄耀伟实验室制备，具体制备方法参照文献“Wang，B.，and Huang Y..Porcine deltacoronavirus engages the transmissiblegastroenteritis virus functional receptor porcine aminopeptidase N forinfectious cellular entry.European Journal of Immunology，2019，49：1633-1633.”。)作为一抗(红光)进行免疫荧光染色。为了确定FCoV复制是否需要fAPN，我们用FCoV感染Ad5-GFP和Ad5-fAPN转导293细胞，收集感染后12h、24h、48h以及72h的细胞上清进行病毒生长曲线的测定(图3)。
结果如图2所示，在Ad5-fAPN感染的293细胞中(12h)观察到Flag标签抗体阳性细胞(绿光)，以及FCoV特异性感染抗核抗体(IFA)阳性细胞(红光)，但在DMEM处理的细胞中未观察到，表明Ad5-fAPN的感染使293细胞表达fAPN，fAPN作为FCoV感染的受体，使得293细胞成为FCoV易感细胞。FCoV在Ad5-fAPN感染24h后的293细胞上的病毒生长曲线结果显示FCoV可以在Ad5-fAPN转导细胞中复制到高滴度(图3)，然而，Ad5-GFP转导的细胞不能够表达fAPN从而不能感染FCoV。这些结果表明，Ad5-fAPN可以将非易感细胞转化为FCoV易感细胞。
实施例3
II型FCoV感染致敏小鼠的研制。
我们通过腹腔注射将2.5×106PFU的Ad5-fAPN或Ad5-GFP导入5周龄BALB/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司购入)，以确定fAPN是否能在体内引起FCoV感染的易感性。四天后，小鼠接受1×105PFU的FCoV，并持续监测(图4)。
在感染后1、3、5、7、10和14天时收集粪便，并通过qPCR进行检测(图5)。Ad5-GFP转基因小鼠的粪便排毒水平和肠道病毒载量低于检测线。然后，我们通过病毒基因组RNA定量来监测小鼠小肠中的病毒复制动力学(图6)。我们收集FCoV感染的Ad5-fAPN转基因小鼠连续三周的血液样本，用ELISA检测血液中抗FCoV的IgG水平(图7)。为了研究FCoV感染Ad5-fAPN转导的小鼠的病理特征，对感染小鼠的肠道切片进行了组织病理学分析(图8)。与组织学检查结果一致，在感染后第五天处收集小鼠的肠组织进行免疫组织化学荧光双重染色，绿色荧光用Flag抗体标记fAPN的表达，红色荧光标记FCoV感染N抗体(图9)。
结果为：收集FCoV感染后的小鼠粪便，检测小鼠粪便排毒情况，发现粪便中病毒滴度在感染后第七天达到106个基因组拷贝/mg的峰值，而阴性对照组的小鼠未发生粪便排毒。同时收集FCoV感染后小鼠的十二指肠、空肠和回肠，检测组织中的病毒载量，发现FCoV感染后小鼠的十二指肠、空肠和回肠对FCoV表现为易感。十二指肠在感染后7天内显示出高病毒载量(106个基因组拷贝/mg)，并在整个感染过程中逐渐降低，空肠和回肠的病毒复制水平高达105个基因组拷贝/mg，在感染后14天后几乎无法检测到，同样的，阴性对照组的小鼠肠道组织无法检测到病毒。总之，Ad5-fAPN转导的BALB/c小鼠的粪便持续排毒和小肠中的高病毒载量表明，fAPN对病毒复制是必要的。通过感染后小鼠的血液样本发现，FCoV的感染也能在血清中诱导特异性IgG抗体，抗体水平不断升高，在感染后三周达到较高水平，而阴性对照组未产生抗FCoV的IgG抗体(如图7所示)。通过对小鼠组织采样后进行组织病理学分析，我们发现FCoV感染导致肠道肉芽肿、局灶性坏死伴炎性细胞浸润、绒毛尖充血和绒毛萎缩(如图8所示)。免疫荧光双染色的结果正如预期的那样，在用Ad5-fAPN转导的小鼠的小肠中检测到了强健的病毒抗原(抗N)(红光)和fAPN的表达(绿光)，表明Ad5-fAPN的转导使得小鼠小肠中能够有效表达fAPN，并且成功感染FcoV(如图9所示)。以上结果表明，构建的FCoV感染Ad5-fAPN转基因小鼠模型能有效模拟FCoV在宿主体内的感染过程，可作为疫苗评价和药物治疗的可靠工具。
实施例4
重组芽孢枯草杆菌在II型FCoV感染致敏小鼠模型上的免疫保护效果。
提取枯草芽孢杆菌基因组作为模板扩增CotB基因(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)，已构建质粒pET32a-HR2P(购自武汉淼灵生物科技有限公司，所编码的基因序列如SEQID No.3所示)作为模板扩增基因HR2P(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)，这两个基因通过重叠聚合酶链反应(Overlap PCR)连接，得到基因CotB-HR2P，然后通过HindIII和EcoR I(TaKaRa，Japan)双酶切消化，使用骨架质粒pDG364，构建穿梭质粒pDG364-CotB-HR2P(载体可以通过amy E区域同源臂将外源基因CotB-HR2P整合到野生型芽孢枯草杆菌的基因组中)，并通过AvrII酶消化线性化，电转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞，通过同源区将外源基因CotB-HR2P整合到枯草芽孢杆菌染色体中的淀粉酶amyE(GenBank号为AKL84826.1)的编码基因处，构建的菌株命名为rBSCotB-HR2P(具体构建步骤参见公开号为CN113234654A的专利申请)。
在FCoV感染小鼠模型中，口服免疫rBSCotB-HR2P可有效抑制FCoV感染，在FCoV小鼠模型中评估了rBSCotB-HR2P是否能抑制FCoV感染。
我们用菌株rBSCotB-HR2P口服免疫小鼠三周，PBS设为对照，通过腹腔注射将2.5×106PFUAd5-fAPN导入小鼠，使小鼠对FCoV敏感，四天后，小鼠接受105PFU FCoV，为了测试rBSCotB-HR2P对FCoV小鼠模型的保护作用，我们收集了感染后的小鼠粪便与肠道组织，检测粪便中FCoV的排毒情况与组织中的FCoV病毒载量。感染5天后，我们取小鼠肠道进行苏木精-伊红(H&E)染色，检测FCoV感染后，Ad5-fAPN转基因小鼠出现的病理损伤情况，同时进行免疫组化染色(IHC)，检测FCoV的N蛋白抗原表达情况，最后我们对小鼠肠道进行解剖学病理观察。
收集FCoV感染后的小鼠粪便，检测小鼠粪便排毒情况，结果如图10所示，发现在口服免疫的rBSCotB-HR2P小鼠中，粪便中的病毒脱落在感染后第三天减少到检测线以下。同时，在感染后1天，如图11和图12所示，在载体处理的小鼠的肠道中检测到病毒，但在rBSCotB-HR2P处理的小鼠的组织中基本上检测不到病毒。感染5天后，如图13所示，苏木精-伊红(H&E)染色显示，FCoV感染后，Ad5-fAPN转基因小鼠出现轻度肠炎，部分肠绒毛坏死脱落。口服rBSCotB-HR2P免疫的小鼠没有明显的肠道损伤。如图14所示的IHC情况，感染状况在FCoV感染小鼠的小肠细胞中广泛传播。相比之下，在用rBSCotB-HR2P处理的小鼠的组织中，FCoV阳性细胞的数量要少得多。与这些发现相一致，没有接受rBSCotB-HR2P的小鼠主要观察到肠道的大体病变，肉芽肿性病变和腹部出血增加(图15)。研究表明，枯草杆菌孢子可以在肠腔中定植，孢子外壳蛋白可以作为载体锚定外源蛋白质并将其展示在表面，孢子具有佐剂活性，可以有效地增加T细胞反应并促进IgA抗体。我们的实验结果证明，提前连续三周饲喂小鼠重组枯草杆菌接种小鼠能激活肠粘膜的强粘膜免疫反应，以及小鼠的特异性和系统性免疫反应，在感染后第一天，粪便中的病毒载量明显降低至检测线下，小肠(十二指肠和回肠)的病毒载量明显降低至检测线下，组织学观察经重组芽孢枯草杆菌免疫的小鼠肠道组织没有出现明显的病理损伤，而攻毒组小鼠出现肠道肉芽肿性病变以及腹腔出血等。重组芽孢枯草杆菌能够抵抗胃肠道的不利环境，能有效定植，表明重组枯草杆菌孢子是一种潜在的的亚单位疫苗载体。
序列表
<110> 岭南现代农业科学与技术广东省实验室
<120> 一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2901
<212> DNA
<213> 猫(cat)
<400> 1
gccaagggct tctacatttc caagcctgtg ggcatcctgg ccatcctcct gggcgtggcg 60
gccgtgtgca ccatcatcgc tctgtccgtg gtgtactccc aggagaagaa caggagcacc 120
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<400> 2
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<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
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gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 4980
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt 5040
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 5100
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 5160
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 5220
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 5280
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 5340
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 5400
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 5460
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 5520
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 5580
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 5640
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 5700
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 5760
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 5820
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 5880
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 5940
ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 6000
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 6060
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 6120
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 6180
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 6240
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 6300
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 6360
atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcactctag gcaaaatagc accctcccgc 6420
tccagaacaa catacagcgc ttcacagcgg cagcctaaca gtcagcctta ccagtaaaaa 6480
agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa 6540
aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt 6600
ccacaaaaaa cacccagaaa accgcacgcg aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa 6660
cccacaactt cctcaaatcg tcacttccgt tttcccacgt tacgtaactt cccattttaa 6720
gaaaactaca attcccaaca catacaagtt actccgccct aaaacctacg tcacccgccc 6780
cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct cattatcata ttggcttcaa 6840
tccaaaataa ggtata 6856

Claims (6)

1.一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建用于表达猫氨基肽酶N的重组腺病毒载体，转导到工程细胞中包装获得重组腺病毒；
(2)用步骤(1)获得的重组腺病毒感染实验动物，获得对猫冠状病毒易感的实验动物；
(3)使用猫冠状病毒感染步骤(2)获得的对猫冠状病毒易感的实验动物，获得猫冠状病毒感染实验动物模型，
其中，所述猫冠状病毒为血清II型猫冠状病毒；
所用实验动物为小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠；
构建用于表达猫氨基肽酶N的重组腺病毒载体的方法包括：将标签蛋白和猫氨基肽酶N的编码序列整合到E1/E3缺失复制缺陷型5型腺病毒中，即得到用于表达猫氨基肽酶N的重组腺病毒载体，其中，猫氨基肽酶N的编码基因序列如SEQ ID No.1所示，标签蛋白的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中获得的重组腺病毒经腹腔注射感染实验动物。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，腹腔注射到实验动物体内的重组腺病毒的量为2.5×106PFU。
4.如权利要求1-3任一所述构建方法在动物模型构建领域的应用。
5.如权利要求1-3任一所述构建方法构建获得的猫冠状病毒感染的动物模型在筛选预防或治疗猫冠状病毒的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述猫冠状病毒是血清II型猫冠状病毒。
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