CN113234654B

CN113234654B - 一种重组枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN113234654B
Application number: CN202110493809.2A
Authority: CN
Inventors: 黄耀伟; 陈楚; 徐令东; 吕方理
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Hangzhou Xuemeng Pet Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2041-05-06
Also published as: CN113234654A

Abstract

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其应用。所述重组枯草芽孢杆菌，将编码抗病毒多肽的基因与枯草芽孢杆菌中编码芽孢外壳蛋白的基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源融合表达，获得能够在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示所述抗病毒多肽的重组枯草芽孢杆菌，所述抗病毒多肽来源于猫冠状病毒，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明重组枯草芽孢杆菌产生的孢子采用经灌胃和滴鼻的途径免疫小鼠，能够在肠粘膜中激活强的粘膜免疫反应，以及小鼠体内的特异性和全身性免疫反应，且能够抵抗胃肠道的不良环境，有效定植，表明重组枯草芽孢杆菌的孢子是一种潜在的优良载体。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

猫冠状病毒(Feline Cornavirus，FCoV)感染在猫中极其常见。目前还没有有效的治疗方法。基于FCoV尖峰蛋白的七肽重复序列2(HR2)设计合成的肽已被证明具有抗病毒作用(Liu，I.J.，et al.Peptides corresponding to the predicted heptad repeat2domain of the feline coronavirus spike protein are potent inhibitors ofviral infection.PLoS One 8(12)：e82081.2013)。

枯草芽孢杆菌是一种安全的益生菌，被广泛添加到食品、药物和饲料中。枯草芽孢杆菌孢子表面展示(Bacillus subtilis Spore Surface Display Technology，BSSD)技术被认为是表达具有高活性和稳定性的异源蛋白的最有前途的方法之一。外源抗原或蛋白质在枯草芽孢杆菌孢子表面的表达已经实践了十多年，并取得了显著的成功。

比如，公开号为CN102676570A的发明申请公开了一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有免疫球蛋白结合蛋白功能域编码基因。本发明还公开了含有该重组表达载体的重组枯草芽孢杆菌，其可以用于制备粘膜免疫佐剂，应用时，与抗原一起给药。本发明还提供了一种在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答的组合物，其至少包含一种抗原和一种有佐剂活性的重组芽孢。本发明用免疫球蛋白结合蛋白重组载体构建重组枯草芽孢杆菌口服疫苗的研究方案是“扬长避短”的一种新尝试，即通过芽孢直接展示免疫球蛋白结合蛋白与人源IgG-Fc段结合将融合人源IgG-Fc段的基因工程蛋白吸附在芽孢表面进行粘膜免疫。

然而，到目前为止，还没有相关研究在枯草芽孢杆菌芽孢表面进行表达展示猫冠状病毒相关的多肽。

发明内容

开发了一种抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌，这是一种针对猫冠状病毒的方便的接种策略。本研究以枯草芽孢杆菌芽孢外壳蛋白B(CotB)为载体，构建了一种在其芽孢表面表达FCoV HR2区域衍生肽的重组枯草芽孢杆菌，命名为rBS^CotB-HR2P。在小鼠模型中，通过灌胃和鼻内接种来评价用重组菌株免疫后产生的免疫应答能力。结果表明，重组菌株孢子可引起强烈的特异性粘膜和体液免疫反应。重组枯草芽孢杆菌可为开发新的安全的防控猫冠状病毒提供潜在的新应用途径。

常规可溶性抗原在口服免疫过程中，由于胃肠道耐受性差，容易降解而难以正常发挥作用，而枯草芽孢杆菌作为载体，可以顺利通过胃肠道屏障，并刺激一定的黏膜免疫反应，在运输方面也具有独特的优势，对恶劣条件耐受。此外，一般来说肌肉注射免疫可以引起良好的免疫反应，但这种接种途径会引发猫的不良应激反应。有报道表明，用于治疗艾滋病毒的抗病毒肽安夫维尔肽(T-20)在注射后出现了许多不良反应，如疼痛、硬结和红斑是最常见的临床症状。因此，将枯草芽孢杆菌作为一种有效的递送载体可能是解决FCoV感染的一种候选方案。

首次构建一株表面展示FCoV HR2抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌，该抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌创新性地使用滴鼻接种免疫，且在滴鼻免疫后可检测到特异性FCoV的IgG抗体和中和抗体。且抗病毒肽的重组枯草芽孢杆菌可在动物鼻腔或肠道中定植，可能为动物带来长久的保护。

本发明是通过以下步骤得到的：

所述的猫冠状病毒毒株为79-1683(GenBank Accession No.X80799.1)，所述的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168，采用10⁸CFU的rBS^CotB-HR2P接种小鼠，能够引发较高的体液粘膜免疫反应，并产生中和抗体。

本研究根据猫冠状病毒的S蛋白的HR2区域设计了一条抗病毒多肽命名为HR2P，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码抗病毒多肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

通过大肠杆菌原核表达纯化后，对其进行梯度稀释，与FCoV在37℃共孵育1h，将多肽-病毒混合物感染猫肾细胞(CRFK)细胞，24h后测定体外抑制FCoV感染效率，发现其具有较好的抑制病毒感染能力，IC₅₀为0.299μM。将纯化的多肽HR2P通过肌肉注射免疫小鼠，收集小鼠血清，检测产生了抗FCoV的中和抗体。将HR2P与枯草芽孢杆菌的芽孢表达调控基因CotB进行串联表达，构建穿梭质粒pDG364-CotB-HR2P，电击转化到枯草芽孢杆菌感受态中，通过穿梭质粒上的同源区将CotB-HR2P整合到枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因(amy E)上，得到一株重组枯草芽孢杆菌，命名为rBS^CotB-HR2P，对其进行诱导芽孢培养，验证HR2P在rBS^CotB-HR2P进行了表面展示，阳性率约为65％。将获得的rBS^CotB-HR2P通过滴鼻和灌胃的方式免疫小鼠，结果显示，能够引起小鼠的体液免疫反应应答，产生中和抗体。

本发明的有益效果：设计并合成的基于FCoV S蛋白HR2区域的多肽HR2P在体外(CRFK细胞)上具有较好的抑制病毒复制能力。构建了一株能够在表面展示HR2P的枯草芽孢杆菌，采用rgS^CotB-HR2P经灌胃和滴鼻的途径免疫小鼠，能够在肠粘膜中激活强的粘膜免疫反应，以及小鼠体内的特异性和全身性免疫反应，且rgS^CotB-HR2P能够抵抗胃肠道的不良环境，有效定植，表明重组枯草芽孢杆菌的孢子是一种潜在的优良载体。

附图说明

图1为基于FCoV(MG893511)S蛋白HR2区域的多肽HR2P方案设计，以及多株FCoVHR2区域同源性比较。SS：信号序列；TM：跨膜域；CY：细胞质尾巴。

图2为抗His抗体Western blot分析：His融合蛋白的表达和纯化。泳道1：表达重组HR2-His蛋白的大肠杆菌粗提物；泳道2：空载体pET32a表达的蛋白。

图3为HR2衍生肽对FCoV的抑制作用。将FCoV(MOI＝0.01)与梯度稀释的可溶性HR2P(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μM)混合孵育CRFK细胞。病毒感染检测采用GFP阳性细胞计数。

图4为HR2P肽免疫小鼠血清中和实验，空白对照为不加血清直接感染，阴性对照为阴性小鼠采集的血清。

图5为重组枯草芽孢杆菌孢子表面表达CotB-HR2P的过程。

图6为Western blot检测DSM诱导24-72h重组枯草芽孢杆菌CotB-HR2P的表达。

图7为流式细胞术分析WT(野生型枯草芽孢杆菌芽孢)和rBS^CotB-HR2P芽孢表面CotB-HR2P的表达，其中，A：野生型枯草芽孢杆菌芽孢群；B：rBS^CotB-HR2P芽孢群；C：野生型枯草芽孢杆菌芽孢的荧光(FITC)信号激发；D：rBS^CotB-HR2P芽孢的荧光(FITC)信号激发。

图8为DSM诱导孢子后48h和72h的时间点，CotB-HR2P在WT和rBS^CotB-HR2P表面的荧光。BF，白光；IF，免疫荧光。

图9为扫描电子显微镜和透射电子显微镜得到WT(野生型枯草芽孢杆菌芽孢)和rBS^CotB-HR2P的代表性图像，其中，A：扫描电子显微镜下对WT(野生型枯草芽孢杆菌芽孢)和rBS^CotB-HR2P的观察；B：透射电子显微镜下对WT(野生型枯草芽孢杆菌芽孢)的观察。

图10为小鼠实验方案示意图，每组6周龄雌性小鼠(n＝5)，给予PBS、WT(野生型枯草芽孢杆菌芽孢)、rBS^CotB-HR2P(芽孢)、纯化的HR2P。

图11为不同时间点小鼠血清(每组3只)抗HR2P-His总IgG(A)和总IgA(B)水平检测结果图。

图12为rBS^CotB-HR2P免疫小鼠血清中和实验结果图。

图13为rBS^CotB-HR2P在小鼠小肠定殖量的检测结果图。

具体实施方式

实施例1：HR2衍生肽的设计、表达与体外抑制效果测定

S蛋白FCoV的HR2区是用计算机软件LearnCoil-VMF预测的。HR2结构域的下游，包括跨膜区和细胞质尾。选择了不同毒株的HR2结构域进行序列比对，包括I型(strain SB22，GenBank Accession No.MH817484.1)，(strain NTU/2R/2003，GenBankAccessionNo.DQ160294.1)，(strain Black，GenBank Accession No.EU186072.1)和II型(strain NTU156P2007，GenBank Accession No.GQ152141.1)，FECV(strain 79-1683，GenBank Accession No.X80799.1)，FIPV(strain FCoVWSU791146_P50，GenBankAccession No.KC461237.1)，FIPV(strain HRBXF17，GenBank AccessionNo.MK987175.1)，并发现HR2结构域在FCoV的不同毒株之间，包括血清I型和II型，FECV与FIPV之间都高度保守(图1)。证明了对FCoV HR2结构域设计的肽可能对多种不同毒株的FCoV具有针对性。

根据FCoV S2亚单位的HR2结构域，设计了一个对应于HR2的肽命名为HR2P，基因序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

构建原核表达质粒pET-32a-HR2P，并在大肠杆菌中表达为His融合蛋白(HR2P-His蛋白)，空载体pET-32a作为对照。表达的蛋白是可溶的，通过大量表达和浓缩，蛋白浓度为3mg/ml(图2)。

然后，测试了不同浓度梯度的肽HR2P对CRFK细胞的细胞毒性，在24、48或72h检测最终浓度为8μM的肽HR2P对CRFK细胞的活性影响，由CCK8确定(试剂盒购自Beyotime公司)。根据细胞活力结果，选择(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μm)的HR2P进一步检测其抗病毒作用。将FCoV(TCID50＝10^^-7.4)与制备的浓度梯度的HR2P进行混合，形成HR2P-FCoV复合物，在37℃下感染细胞24h。

结果为：对照(未处理)细胞和仅暴露于肽HR2P或无关对照(His标签蛋白，使用带有His标签的GST蛋白)的细胞之间的细胞活性没有统计学上的显著差异，所有细胞的存活率大于95％，证明HR2P是非细胞毒性的。

且HR2P-FCoV复合物感染24h后，进行间接免疫荧光(IFA)，结果显示HR2P可显著降低病毒感染，病毒滴度呈浓度依赖性(图3)。HR2P的IC50值为0.299μM。证明HR2P有效地阻断病毒进入细胞，表明其是FCoV复制的一种非常有效的抑制剂。

实施例2：制备HR2P的小鼠多抗血清及中和抗体检测

通过用在大肠杆菌中表达的可溶性HR2P-His蛋白免疫小鼠来制备小鼠抗HR2P的血清，并假设它也可以阻断病毒的进入，并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测试所得抗血清的反应性，使用HR2P-His作为抗原，包被浓度为1∶2000。此外，测试了抗血清的中和能力，以确定是否通过用HR2P-His免疫产生了针对FCoV的中和抗体。

结果：未免疫小鼠血清不能中和FCoV感染，而免疫HR2P-His的小鼠抗血清能有效抑制FCoV感染，一抗为与FCoV具有高度同源性的TGEVN蛋白抗体(图4)。结果显示抗血清在1∶64至1∶32稀释度之间抑制50％的FCoV感染。制备的FCoV-HR2P具有良好的免疫原性和一定的中和能力，制备的小鼠多克隆血清具有抗FCoV-HR2P结构域的抗体。但如果直接对猫进行肌肉注射免疫，可能会出现较大的应激反应，操作麻烦，口服免疫可能会使动物消化道内的多肽降解。因此，寻找合适的载体将HR2P抗原传递给猫是非常必要的。

实施例3：表面展示HR2P重组枯草芽孢杆菌的构建及鉴定

选择枯草芽孢杆菌作为在动物体内递送抗原的候选载体，并构建了在表面表达HR2P的重组枯草芽孢杆菌菌株。首先，提取枯草芽孢杆菌基因组作为模板扩增CotB基因(基因序列如SEQ ID No.3所示)，已构建质粒pET32a-HR2P作为模板扩增HR2P，这两个基因通过重叠聚合酶链反应(Overlap PCR)连接，然后通过Hind III和EcoRI(TaKaRa，Japan)双酶切消化，使用骨架质粒pDG364，构建穿梭质粒pDG364-CotB-HR2P(载体可以通过amy E区域同源臂将外源基因CotB-HR2P整合到野生型芽孢枯草杆菌的基因组中)，并通过AvrII酶消化线性化，电转枯草芽孢杆菌感受态细胞，通过同源区将外源基因(CotB-HR2P)整合到枯草芽孢杆菌染色体中的淀粉酶基因(amy E)处(图5)，构建的菌株命名为rBS^CotB-HR2P。以野生型枯草芽孢杆菌(用WT表示)为阴性对照，在DSM产孢培养基中诱导rBS^CotB-HR2P细菌孢子72h。然后提取rBS^CotB-HR2P的孢子蛋白，进行HR2P的表达分析。为了研究外源蛋白的插入是否影响枯草芽孢杆菌本身的萌发和形态，通过扫描电镜和透射电镜观察了诱导72h后孢子的形态。

结果为：Western blot分析显示CotB-HR2P的表达是从24h开始至72h(图6)。流式细胞术进一步证实，诱导后72h，65％的重组枯草芽孢杆菌表达CotB-HR2P(图7)。为了验证重组融合蛋白CotB-HR2P在rBS^CotB-HR2P孢子表面表达，进行了免疫荧光实验，在rBS^CotB-HR2P孢子周围观察到强荧光信号，而野生型的孢子为阴性(图8)。扫描电镜和透射电镜结果表明外源片段的插入不影响枯草芽孢杆菌的表面或内部结构形态(图9)。

实施例4：通过灌胃和滴鼻的方法免疫rBS^CotB-HR2P的孢子，检测小鼠的血清及粘膜抗体反应

为了测试rBS^CotB-HR2P孢子是否对促进小鼠免疫反应具有积极的作用，将小鼠(6周龄的雌性小鼠)在第1天、第14天、28天通过滴鼻和灌胃的方式接种rgS^CotB-HR2P。在第7天和第21天收集小鼠血清用于ELISA检测IgG水平，在处死小鼠后第35天收集肠内容物用于检测粘膜IgA水平，以分别评估重组孢子引发粘膜和全身免疫的能力。具体动物实验设计方案如图10所示，在指定时间点采集血清、肠道内容物。

结果如图11所示：在第一周，接种了rBS^CotB-HR2P的小鼠，血清中的IgG水平明显升高。就接种途径而言，鼻内接种产生较高水平的IgG，总的来说，IgG水平低于直接肌肉注射HR2P的水平。在第21天，接种rBS^CotB-HR2P的小鼠显示出与第7天相似的血清IgG水平显著增加，与灌胃接种相比，通过鼻滴注接种产生的IgG水平更高，并且显著高于阴性组(P＜0.01)。第5周处死小鼠，收集小肠粘膜内容物，检测分泌性IgA检测，接种rBS^CotB-HR2P小鼠与阴性组相比，引起显著的粘膜抗体反应(P＜0.01)，IgG水平显著升高，鼻内接种小鼠可引起较高水平的IgA。证明rBS^CotB-HR2P接种可以通过灌胃和滴鼻诱导显著的特异性血清和粘膜抗体反应，且相比较而言滴鼻组产生了更好的免疫反应。

实施例5：对接种rBS^CotB-HR2P小鼠血清进行中和抗体检测。

将收集到的小鼠血清进行梯度稀释后，与FCoV在37℃共孵育1h，将血清-病毒复合物感染CRFK细胞，24h后进行免疫荧光实验检测。空白对照为不加血清直接感染，阴性对照为阴性小鼠采集的血清。

结果如图12所示：在1：64至1∶32稀释度范围内，经滴鼻接种的rBS^CotB-HR2P小鼠抗血清可抑制50％的FCoV感染；在1∶64至1∶32稀释度范围内，经灌胃接种的rBS^CotB-HR2P小鼠抗血清可抑制50％的FCoV感染。

实施例6：小鼠肠道内rBS^CotB-HR2P定植量的检测

为检测重组枯草芽孢杆菌是否在小鼠体内的定植以及相应的定植量，收集小肠内容物并梯度稀释(5倍、25倍、125倍)，在37℃培养17-24h，根据形成的菌落数计算重组枯草芽孢杆菌在肠道中的定植量。

结果如图13所示：灌胃组rBS^CotB-HR2P定植量略高于滴鼻组。无论采用哪种接种方法，重组菌都能在小鼠肠道内定植。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种重组枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accttagata tttttaatgc aacctatctg aatctgaccg gcgaaattga tgatctggaa 60

tttcgcagcg aaaaattaca taataccacc gtggaactgg ccattctgat tgataatatt 120

aataataccc tggtgaattt agaatggtta aatcgtattg aaac 164

<210> 2

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Leu Asp Ile Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu Ile

1 5 10 15

Asp Asp Leu Glu Phe Arg Ser Glu Lys Leu His Asn Thr Thr Val Glu

20 25 30

Leu Ala Ile Leu Ile Asp Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val Asn Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Asn Arg Ile Glu Thr

50 55

<210> 3

<211> 1143

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

atgagcaaga ggagaatgaa atatcattca aataatgaaa tatcgtatta taactttttg 60

cactcaatga aagataaaat tgttactgta tatcgtggag gtccggaatc taaaaaagga 120

aaattaacag ctgtaaaatc agattatata gctttacaag ctgaaaaaaa aataatttat 180

tatcagttgg agcatgtgaa aagtattact gaggatacca ataatagcac cacaacaatt 240

gagactgagg aaatgctcga tgctgatgat tttcatagct taatcggaca tttaataaac 300

caatcagttc aatttaacca agggggtccg gaatctaaaa aaggaagatt ggtctggctg 360

ggagatgatt acgctgcgtt aaacacaaat gaggatgggg tagtgtattt taatatccat 420

cacatcaaaa gtataagtaa acacgagcct gatttgaaaa tagaagagca gacgccagtt 480

ggagttttgg aagctgatga tttaagcgag gtttttaaga gtctgactca taaatgggtt 540

tcaattaatc gtggaggtcc ggaagccatt gagggtatcc ttgtagataa tgccgacggc 600

cattatacta tagtgaaaaa tcaagaggtg cttcgcatct atccttttca cataaaaagc 660

atcagcttag gtccaaaagg gtcgtacaaa aaagaggatc aaaaaaatga acaaaaccag 720

gaagacaata atgataagga cagcaattcg ttcatttctt caaaatcata tagctcatca 780

aaatcatcta aacgatcact aaaatcttca gatgatcaat catccaaatc tggtcgttcg 840

tcacgttcaa aaagttcttc aaaatcatct aaacgatcac taaaatcttc ggattatcaa 900

tcatccaaat ctggccgttc gtcacgttca aaaagttctt caaaatcatc taaacgatca 960

ttaaaatctt cagattatca atcatcaaaa tcatctaaac gatcaccaag atcttcagat 1020

tatcaatcat caagatcacc aggctattca agttcaataa aaagttcagg aaaacaaaag 1080

gaagattata gctatgaaac gattgtcaga acgatagact atcactggaa acgtaaattt 1140

taa 1143

Claims

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将编码抗病毒多肽的基因与枯草芽孢杆菌中编码芽孢外壳蛋白的基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源融合表达，获得能够在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示所述抗病毒多肽的重组枯草芽孢杆菌，

所述抗病毒多肽来源于猫冠状病毒（Feline Cornavirus），命名为HR2P，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码抗病毒多肽的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢外壳蛋白为枯草芽孢杆菌的CotB蛋白。

4.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，融合后的基因通过整合到枯草芽孢杆菌的基因组中进行稳定表达，获得所述重组枯草芽孢杆菌。

5.如权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将融合后的基因克隆到穿梭质粒pDG364中，通过同源重组将融合后的基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中的淀粉酶基因处。

6.权利要求1~5任一所述重组枯草芽孢杆菌在制备猫冠状病毒疫苗中的应用。