CN101693900A

CN101693900A - 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX作为芽孢表面展示外源蛋白分子载体的应用

Info

Publication number: CN101693900A
Application number: CN200910232920A
Authority: CN
Inventors: 宁德刚; 李倩; 徐卫东
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2010-04-14

Abstract

本发明涉及枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX的应用，具体是枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX作为芽孢表面展示外源蛋白的一种蛋白载体，通过芽孢表面展示技术构建表面展示外源蛋白的重组芽孢。以该载体蛋白的编码基因cotX，与外源蛋白基因的编码序列进行基因重组，构建融合表达重组蛋白的整合性重组质粒，转化枯草芽孢杆菌后筛选重组菌株，诱导重组菌株产生芽孢，得到表面展示外源目的蛋白的重组芽孢。

Description

枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX作为芽孢表面展示外源蛋白分子载体的应用

技术领域：

本发明涉及以一种芽孢表面展示外源蛋白的芽孢衣壳蛋白，特别是枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX作为分子载体，芽孢表面展示外源蛋白。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为环境友好、产芽孢的非致病性革兰氏阳性细菌。在营养缺乏等不利环境条件诱导下，营养细胞分化形成休眠体——芽孢。芽孢由芽孢髓质、皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁构成。外层的芽孢衣壳主要由疏水的衣壳蛋白构成，具有抗酶解，抗药物功能。芽孢的形成是一系列调控基因和结构基因按一定时序调控表达的过程。这些基因包括芽孢衣壳蛋白基因以及调控基因，如cotA、cotB、cotC、cotF、cotG和cotX20余种[HenriquesAO，Moran CP Jr.Methods，2000，20(1)：95～110]。

由于芽孢的特殊结构使其具有独特的抗逆性，能在极端环境(如高温、干燥、化学药物)中长期存活，能顺利通过动物消化道屏障；枯草芽孢杆菌芽孢易于培养诱导、芽孢比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作；以及枯草芽孢杆菌基因组的破译和可操作的遗传系统的建立，使芽孢作为新型的蛋白疫苗或酶类等生物活性蛋白载体成为可能(OggioniMR，et al.2003.Vaccine.21：96-101)。其中，利用枯草芽孢杆菌染色体上编码芽孢衣壳蛋白的基因为分子载体，通过分子生物学技术将芽孢衣壳蛋白基因与外源目的蛋白基因的编码序列重组，以芽孢表面展示技术将外源目的蛋白展示于重组枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建具有生物活性的重组芽孢倍受关注。

Isticato R等(Isticato R，Cangiano G，Tran HT，et al.J Bacteril，2001，183：6294～6301)利用CotB作为芽孢表面展示外源抗原的融合载体蛋白，成功地在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示了破伤风毒素(TTFC)碳末端的459氨基酸片段。试验结果证明TTFC抗原展示于芽孢表面，每个芽孢表面约有1.5×10³个TTFC蛋白分子，可被特异性抗体识别，并且TTFC的出现并未影响芽孢衣的结构和功能。用芽孢衣壳的另一蛋白成分CotC作为融合载体蛋白，分别将TTFC和大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位(LTB)展示于芽孢表面，每个芽孢中CotC-TTFC、CotC-LTB的分子数分别为9.7×10²和2×10²。腹膜注射重组芽孢均能诱导小鼠局部和系统免疫应答，并且TTFC、LTB与CotC融合后并不影响芽孢的结构和功能[Emilia MF，Mauriello A，Ducb Le H，et al.Vaccine，2003，22：1177～118]。Kwon SJ等[Appl EnvironMicrobioL.2007，3(7)：2251-6.]以CotG为蛋白载体将半乳糖苷酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，制备具有半乳糖苷酶催化活性的重组芽孢。

但由于不同的芽孢衣壳蛋白的分子结构，以及在芽孢中的组成存在差异，导致不同的芽孢衣壳蛋白作为分子载体，表面展示外源蛋白的重组芽孢的生物学活性也不同；在已报道的20余种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白中，部分蛋白可能起调控或运输其他衣壳蛋白的作用，不具备作为芽孢表面展示外源蛋白载体的应用价值，除已报道的CotB、CotC、CotG作为枯草芽孢杆菌芽孢表面展示外源蛋白的载体分子外，未见其他衣壳蛋白作为载体的报道或专利。同时，利用芽孢表面展示技术同时展示多种不同抗原蛋白或酶，以制备多价重组抗原疫苗或不同的催化酶，需要多种衣壳蛋白作为载体。因此，筛选新的、能有效展示外源目的蛋白的载体分子，用于芽孢表面展示技术尤为关键。

发明内容

本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX作为一种新的载体蛋白，通过芽孢表面展示技术将外源蛋白展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，制备枯草芽孢杆菌重组芽孢。

本发明所采用的技术方案是：

枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX在制备表面展示外源蛋白的重组芽孢中的应用。

具体地，是利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX的编码基因cotX为分子载体，与外源目的蛋白基因的编码序列重组，构建融合表达重组蛋白的整合型质粒，转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生表面展示外源目的蛋白的重组芽孢。

本发明选择芽孢衣壳蛋白基因cotX(Gene Bank序列号：NP_389058)作为表面展示蛋白的分子载体；选择具有保护性抗原蛋白和具有催化活性的酶基因为被重组基因；以具有转化能力且可产芽孢的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilis 168及其系列衍生菌株(Bacillus Genetic Stock Center，Department of Biochemistry，TheOhio State University，West 12th Avenue，Columbus，Ohio，43210，USA)。

本发明涉及芽孢衣壳蛋白基因cotX，该基因与目的蛋白基因的编码序列重组后构建的重组质粒，重组质粒中分别含有芽孢衣壳蛋白基因cotX的启动子、不含终止密码子的编码序列，与被重组基因的编码序列重组后的基因，可在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢时分别融合表达重组蛋白。

本发明还涉及构建的融合表达重组蛋白的重组质粒转化枯草芽孢杆菌筛选所得到的重组菌株，这些重组菌株诱导形成的芽孢表面展示目的蛋白，并可通过检测被展示的目的蛋白的生物学特性选择相应的检测方法。

本发明涉及基因cotX启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列：

cotX-a：GTCTAGATTACTTTGTCTGCCGACGAGA

cotX-b：GGTACCGAGGACAAGAGTGATAACTAGGATG

与本领域已知的方法相比，本发明是选择一种芽孢衣壳蛋白CotX作为一种新的芽孢表面展示外源蛋白的载体分子，利用分子重组技术和芽孢表面展示技术，将外源目的蛋白或酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面；利用芽孢所具有的独特抗逆性，使重组的目的蛋白或酶具有更好稳定性和生物学活性。

附图说明

图1融合表达CotX-GFP整合性重组质粒pBS15结构示意图。amyE 5’-end和amyE3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus subtilis 168(trp-)染色体的淀粉酶基因中；Em^r，Ap^r分别表示红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp-)中的筛选转化子或重组菌株；cotX-GFP为在Bacillus subtilis 168(trp-)芽孢中融合表达CotX-GFP重组蛋白的基因片段，该片段含cotX启动子序列、不含cotX终止密码子的CotX编码序列，以及GFP的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段

图2菌株DRJS15芽孢表面展示GFP的重组芽孢荧光免疫鉴定。A可见光下观察菌株DRJSGFP重组芽孢(10×100油镜)；B紫外下光观察菌株DRBS15重组芽孢(10×100油镜)。

图3融合表达CotX-Vp28整合性重组质粒pBS16结构示意图。amyE 5’-end和amyE3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus subtilis 168(trp-)染色体的淀粉酶基因中；Em^r，Ap^r分别表示红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp-)的转化子或重组菌株的筛选；cotX-vp28为在Bacillus subtilis 168(trp-)芽孢中融合表达CotX-Vp28重组蛋白的基因片段，该片段含cotX启动子序列、不含cotX终止密码子的CotX编码序列，以及Vp28的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段

图4菌株DRBS16芽孢表面展示Vp28的重组芽孢的荧光免疫鉴定。A可见光下观察菌株DRBS16重组芽孢(10×100油镜)；B紫外下光观察菌株DRBS16重组芽孢。兔抗-Vp28多克隆抗体与菌株DRBS16重组芽孢结合后，与以FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体免疫反应，荧光显微镜(10×100油镜)观察并拍照。

图5融合表达CotX-Vp19整合性重组质粒pBS17结构示意图。amyE 5’-end和amyE3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus subtilis 168(trp-)染色体的淀粉酶基因中；Em^r，Ap^r分别表示红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp-)转化自或重组菌株的筛选；cotX-vp19为在Bacillus subtilis 168(trp-)芽孢中融合表达CotX-Vp19重组蛋白的基因片段，该片段含cotX启动子序列、不含cotX终止密码子的CotX编码序列，以及Vp19的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段

图6菌株DRBS17芽孢表面展示Vp19的重组芽孢的荧光免疫鉴定。A可见光下观察菌株DRBS17重组芽孢(10×100油镜)；B紫外下光观察菌株DRBS17重组芽孢。兔抗-Vp19多克隆抗体与菌株DRBS16重组芽孢结合后，与以FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体免疫反应，荧光显微镜(10×100油镜)观察并拍照。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。

实施例1

以CotX为载体蛋白表面展示绿色荧光蛋白(GFP)的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备

1.分子生物学操作

1.2分子生物学技术

所有质粒的构建采用Sambrook等人(《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行，用于本发明的所有回收DNA片段均采用上海生工生物工程有限公司凝胶回收试剂盒分离纯化。所有PCR产物克隆片段均经上海生工生物工程有限公司测序。

1.3PCR扩增

用于基因扩增的引物由上海生工生物技术有限公司合成，为便于扩增产物的克隆部分引物5’端添加限制性内切酶识别位点，PCR反应体系中含10mmol/L Tris·Cl(pH 8.3)，50mmol/L MgCl₂，上下游引物各100pmol，200μmol/L dNTPs，50ng模板DNA，2.5U DNA聚合酶。PCR反应程序根据不同引物特征设置。

2.质粒的构建

2.1基本质粒构建

重组质粒为整合平台质粒pJS225含来源于Bacillus subtilis 168(trp^-)淀粉酶基因amyE片段，本发明中该片段用于重组基因整合于染色体上，pJS225质粒的构建见专利“表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法”(公开号：CN101418310，申请号：CN200810243647.1)。

根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotX(Gene Bank序列号：NP_389058)序列，设计并合成以下引物：

cotX-a：GTCTAGATTACTTTGTCTGCCGACGAGA

cotX-b：GGTACCGAGGACAAGAGTGATAACTAGGATG

为便于克隆，上游引物cotX-a添加了XbaI位点，下游引物cotX-b添加了KpnI位点。以cotX-a和cotX-b为引物，Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体DNA为模板，扩增含cotX基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物大小为890bp，抽提沉淀后以XbaI和KpnI酶切，插入质粒pUC18(物理图谱见Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning：a laboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.1989.P9，由发明人保存)质粒中的XbaI和KpnI位点，得到的重组质粒以测序确定克隆基因正确后命名pBS11。

根据质粒pMutin2(Vagner V，Dervyn E，Ehrlich SD.1998.Microbiol.144(Pt11)，3097-3104)上的红霉素抗性基因Em^R的序列设计并合成以下引物：

Ems-1：CGAAAAGTGCCACCTGACGTC

Ems-2：GGTCTAGAGTCTAGGGACCTC

以Ems-1和Ems-2为引物，质粒pMutin2为模板，扩增红霉素抗性基因Em^R片段，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物大小为1227bp，回收扩增片段克隆于pMD-18T(宝生物工程(大连)有限公司)载体中，得到的重组质粒以测序确定克隆基因正确后命名pBS12。以SalI和XbaI酶切pBS12，回收基因Em^R片段并克隆于pBS11相应位点，得到的重组质粒为pBS13。以PvuII酶切质粒pBS13，回收约2.3kb含Em^R-CotX的片段，将该片段克隆于整合平台质粒pJS225的SmaI位点，得到整合型重组质粒pBS14。

2.2融合表达CotX-GFP重组蛋白整合型重组质粒构建

本发明实施例中所用的绿色荧光蛋白基因(gfp)来源于pBAD-GFPuv(Crameri A，Whitehorn EA，Tate E，Stemmer WP.1996.Nat.Biotechnol.14(3)，315-319)，并根据该质粒中的gfp基因序列设计并合成以下引物：

gfp-a GGTACCGCTAGCAAAGGAGAAG

gfp-b GAATTCTGCAGGTCGACTCTAGAGG

为便于克隆，上游引物gfp-a添加了KpnI位点，下游引物gfp-b添加了EcoRI位点。以gfp-a和gfp-b为引物，pBAD-GFPuv为模板，扩增含gfp基因的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物大小为774bp，回收扩增产物克隆于pMD-18T载体中，测序确定序列正确后命名为pJS289。以KpnI和EcoRI完全酶切pJS289，回收含gfp片段，并克隆于pBS14相应的位点，得到的整合型重组质粒命名为pBS15。整合型重组质粒pBS15中含重组基因cotX-gfp，该质粒的物理图谱见本发明附图说明及附图1。

3.融合表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌菌株的筛选鉴定

将整合型质粒pBS15转化Bacillus subtilis 168(trp^-)，以含0.4μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，从平板上挑单菌落接种在3mL含相同抗生素的液体LB培养基中培养过夜，按以下两种方法鉴定转化子：(1)淀粉平板碘液染色法。1％淀粉平板的制备：固体LB培养基中加可溶性淀粉至终浓度为1％，高压灭菌后制备平板；碘液的配制：碘化钾2g；蒸馏水300ml；碘1g，先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存在棕色玻璃瓶内。取5μL于含红霉素液体培养基中培养的菌液涂在淀粉平板上，37℃培养16小时，取2mL碘液喷于淀粉平板上，菌落及周围颜色为白色表明重组基因插入Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体上的淀粉酶基因amyE中，菌落及周围颜色变蓝表明重组基因没有插入淀粉酶基因amyE中；(2)特异性引物PCR鉴定。将菌落及周围颜色为白色的转化子培养物提取染色体，PCR进一步鉴定转化子中的重组基因。以引物cotX-a和gfp-b检测pBS15转化后的Bacillus subtilis 168(trp^-)菌株；经上述方法鉴定后的重组菌株分别命名为DRBS15。

4.表面展示GFP重组芽孢的诱导及其鉴定

以DSM培养基诱导重组菌株DRBS15形成芽孢。DSM培养基的配制：0.8％肉汤营养液(Difco)，0.1％KCl，0.025％MgSO₄·7H₂O，1.0mM Ca(NO₃)₂，10μM MnCl₂，1.0μMFeSO₄。取重组菌株DRBS15单菌落接种于3mL DSM培养基中，37℃震荡培养40小时，5000转/分钟离心10分钟收集芽孢，重悬于1mL无菌水中。以终浓度为10mg/mL溶菌酶37℃处理30分钟破坏营养细胞，5000转/分钟离心10分钟沉淀芽孢，加1mL水重悬芽孢。取10μL芽孢悬液涂于载玻片上，盖上盖玻片(注意避免产生气泡)置荧光显微镜下观察结果(见本发明附图说明及附图2)。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示GFP蛋白，该芽孢即为表面展示GFP蛋白的重组芽孢。

本发明利用CotX作为枯草芽孢杆菌表面展示GFP的分子载体，与已报道的CotB、CotC、CotG作为载体芽孢表面展示GFP的运载能力无显著差异。但本发明所涉及的CotX做为一种新的芽孢表面展示的载体分子，使芽孢表面展示技术的操作过程中载体分子具有更多的选择，尤其是应用于芽孢表面同时展示多种抗原蛋白或多种酶蛋白，制备多价抗原疫苗或复合酶催化系统。

实施例2

以CotX为载体蛋白表面展示Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备

1.分子生物学操作

1.1枯草芽孢杆菌染色体的提取

具体操作方法同本发明实施例1，1.2枯草芽孢杆菌染色体的提取

1.2分子生物学技术

具体操作方法同本发明实施例1，1.3分子生物学技术

1.3PCR扩增

具体操作方法同本发明实施例1，1.4分子生物学技术

2.质粒的构建

2.1基本质粒构建

具体操作方法同实施例1，2.1基本质粒的构建

2.2融合表达CotX-Vp28重组蛋白整合型重组质粒构建

本实施例中所用的对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，简称为WSSV)囊膜蛋白基因vp28来自本发明人克隆并保存在质粒pJS212中含vp28基因的全编码序列。pJS212质粒的构建见专利“表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法”(公开号：CN101418310，申请号：CN200810243647.1)。

以SacI和EcoRI酶切质粒pJS212，回收vp28基因片段，插入整合平台质粒pBS14中相应的克隆位点，鉴定后的重组质粒命名为pBS16，该质粒为不含Bacillus subtilis复制位点的整合型质粒，可通过质粒中的被插入失活的amyE基因片段与Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体上的同源片段重组而整合与染色体上，并使重组基因得以稳定遗传。该质粒的物理图谱见本发明附图说明及附图3。

3.融合表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌菌株的筛选鉴定

将整合型质粒pBS16转化Bacillus subtilis 168(trp^-)，以含0.4μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，从平板上挑单菌落接种在3mL含相同抗生素的液体LB培养基中培养过夜，通过以下方法鉴定重组菌株：(1)以淀粉平板碘液染色法鉴定重组菌株，操作方法同本发明实施例1中3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis168(trp^-)菌株的筛选鉴定。(2)特异性引物PCR鉴定，将菌落及周围颜色为白色的转化子培养物提取染色体，PCR进一步鉴定转化子中的重组基因。以引物cotX-a和vp28-2检测pBS16转化后的Bacillus subtilis168(trp^-)菌株；经上述方法鉴定后的重组菌株分别命名为DRBS16。

4.表面展示Vp28重组芽孢的诱导及其鉴定

表面展示Vp28重组芽孢诱导操作方法同本发明实施例1中4。取10μL芽孢悬液涂于载玻片上，干后用丙酮在37℃固定15分钟；用滴加25μL兔抗-Vp28特异性多克隆抗体，置湿盒内，37℃作用30分钟；取出载玻片用PBS冲洗后，用PBS漂洗3次，每次5分钟；用滤纸轻轻吸干玻片后，加25μL FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体，置湿盒内，37℃作用30分钟；漂洗(操作同上)后，用蒸馏水淋洗一次，于电吹风下吹干(或自然干燥)，加封载剂(缓冲甘油)后盖上盖玻片(注意避免产生气泡)置荧光显微镜下观察结果(见本发明附图说明及附图4)。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示Vp28蛋白，该芽孢即为表面展示Vp28蛋白的重组芽孢。表面展示Vp28重组芽孢的诱导及其鉴定，鉴定结果见本发明附图说明及附图5。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示Vp28蛋白，该芽孢即为表面展示Vp28蛋白的重组芽孢。

本发明利用CotX作为枯草芽孢杆菌表面展示Vp28的分子载体，与本发明人发明的以CotC、CotG作为载体芽孢表面展示Vp28的运载能力无显著差异，见专利“表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法”(公开号：CN101418310，申请号：CN200810243647.1)。

实施例3

以CotX为载体蛋白表面展示Vp19的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备

本实施例中所用的WSSV囊膜蛋白基因vp19由本发明人克隆、测序鉴定并保存：以下是WSSV vp19克隆、测序鉴定：

白斑综合征病毒感染后发病死亡的对虾样品采于海南省万宁市，取上述死亡对虾0.1g鳃组织，加入5倍的TN缓冲液(0.02M Tris-HCl，0.4M NaCl，pH 7.4)，以玻璃匀浆器研磨，12000转/分钟离心10分钟，取上清病毒液。加十二烷基磺酸钠至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为100mg/ml，在37℃下处理2小时，利用苯酚/氯仿混合液抽提，加1/4体积的5mol/L的氯化钠和两倍体积的乙醇在-20℃下沉淀16小时，于4℃以12000g离心15分钟，干燥DNA沉淀，溶于最小体积的无菌超纯水中，用于PCR扩增WSSV vp19基因片断的模板。

WSSV vp19基因片断的PCR扩增引物为：

Vp19-1：gagctcgccaccacgactaacactc

Vp19-2：gaattcttactgcctcctcttgggg

PCR扩增反应体系见本发明实施例1中的1.3 PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小为617bp，包括WSSV vp19基因的615bp的编码序列。扩增片段克隆于pMD-18T载体中，克隆重组质粒命名为pJS228，克隆片断测序(由上海生工生物工程技术服务公司完成)，重组质粒中WSSV基因vp19序列为如SEQ ID NO.1所示。

测序结果在Gene Bank中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索比对。WSSV(海南株)基因vp19序列与Gene Bank中序列号分别为AY220744，EU012447，DD681071，AY160771等17个vp19基因的同源性均为99％。

1.分子生物学操作

1.1枯草芽孢杆菌染色体的提取

1.2分子生物学技术

具体操作方法同本发明实施例1，1.3分子生物学技术

1.3PCR扩增

具体操作方法同本发明实施例1，1.4分子生物学技术

2.质粒的构建

2.1基本质粒构建

具体操作方法同实施例1，2.1基本质粒的构建

2.2融合表达CotX-Vp19重组蛋白整合型重组质粒构建

本实施例中所用的WSSV vp19基因来自本发明人克隆并保存在质粒pJS228中含vp19基因的全编码序列

以SacI和EcoRI酶切质粒pJS228，回收vp19基因片段，插入整合平台质粒pBS14中相应的克隆位点，鉴定后的重组质粒命名为pBS17，该质粒为不含Bacillus subtilis复制位点的整合型质粒，可通过质粒中的被插入失活的amyE基因片段与Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体上的同源片段重组而整合与染色体上，并使重组基因得以稳定遗传。该质粒的物理图谱见本发明附图说明及附图5。

3.融合表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌菌株的筛选鉴定

将整合型质粒pBS17转化Bacillus subtilis 168(trp^-)，以含0.4μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，从平板上挑单菌落接种在3mL含相同抗生素的液体LB培养基中培养过夜，通过以下方法鉴定重组菌株：(1)以淀粉平板碘液染色法鉴定重组菌株，操作方法同本发明实施例1中3.融合表达重组蛋白的Bacillus subtilis168(trp^-)菌株的筛选鉴定。(2)特异性引物PCR鉴定，将菌落及周围颜色为白色的转化子培养物提取染色体，PCR进一步鉴定转化子中的重组基因。以引物cotX-a和vp19-2检测pBS16转化后的Bacillus subtilis168(trp^-)菌株；经上述方法鉴定后的重组菌株分别命名为DRBS17。

4.表面展示Vp19重组芽孢的诱导及其鉴定

表面展示Vp19重组芽孢诱导操作方法同本发明实施例1中4.取10μL芽孢悬液涂于载玻片上，干后用丙酮在37℃固定15分钟；用滴加25μL兔抗-Vp19特异性多克隆抗体，置湿盒内，37℃作用30分钟；取出载玻片用PBS冲洗后，用PBS漂洗3次，每次5分钟；用滤纸轻轻吸干玻片后，加25μL FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体，置湿盒内，37℃作用30分钟；漂洗(操作同上)后，用蒸馏水淋洗一次，于电吹风下吹干(或自然干燥)，加封载剂(缓冲甘油)后盖上盖玻片(注意避免产生气泡)置荧光显微镜下观察结果(见本发明附图说明及附图6)。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示Vp19蛋白，该芽孢即为表面展示Vp19蛋白的重组芽孢。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏大学

<120>枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX作为芽孢表面展示外源蛋白分子载体的应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>366

<212>DNA

<213>对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus)

<400>1

atggccacca cgactaacac tcttcctttc ggcaggaccg gagcccaggc cgctggccct 60

tcttacacca tggaagatct tgaaggctcc atgtctatgg ctcgcatggg tctctttttg 120

atcgttgcta tctcaattgg tatcctcgtc ctggccgtca tgaatgtatg gatgggacca 180

aagaaggacg gcgattctga cactgataag gtcaccgatg atgatgacga cactgccaac 240

gataacgatg atgaggacaa atataagaac aggaccaggg atatgatgct tctggctggg 300

tccgctcttc tgttcctcgt ttccgccgcc accgttttta tgtcttaccc caagaggagg 360

cagtaa 366

Claims

1.枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX在制备表面展示外源蛋白的重组芽孢中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotX的编码基因cotX为分子载体，与外源目的蛋白基因的编码序列重组，构建融合表达重组蛋白的整合性质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生表面展示外源目的蛋白的重组芽孢。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，外源目的蛋白基因为编码具有生物学活性的蛋白或酶。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，外源目的蛋白基因为保护性抗原蛋白和具有催化活性的酶基因的编码序列。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的融合表达的整合性重组质粒是将枯草芽孢衣壳蛋白基因cotX与外源目的蛋白基因重组构建的质粒，在这些重组质粒中含有整合基因amyE片段、适用于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、芽孢衣壳蛋白基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与目的蛋白基因的编码序列重组后的基因。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合性重组质粒转化枯草芽孢杆菌的所得菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、以及芽孢衣壳蛋白基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与目的蛋白基因的编码序列重组后的基因，这些基因插入淀粉酶基因中并导致重组菌株的淀粉酶是失活。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌芽孢，芽孢表面展示有外源目的蛋白。