NO821391L - Kloningsvektorer, rekombinante dna-molekyler samt bakterieverter transformert med disse - Google Patents

Abstract

Kloningsvektorer, rekombinant DNA molekyler og Bacillus-verter transformert med dem hvilke uttrykker fremmede 'DNA sekvenser og fremstiller minst en del av amino-. _'syresekvensen som kodes for gjennom de fremmede DNA j 'sekvenser. Kloningsvektorene, rekombinant DNA molekylene, Bacillus-vertene transformert med dem og frem-. gangsmåteae ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør kloning og ekspresjon av fremmede DNA sekvenser, spe-. isielt slike av eukaryotisk- og virus-opprinnelse i jBacillus-verter. I Bacillus-verter som er fordrageligemed rekombinant DNA molekyler ifølge oppfinnelsen i fremstilles polypeptider som er anvendelige i vaksiner,. farmasøytidce produkter og industrielle produkter.i

Description

I Foreliggende oppfinnelse vedrører Bacillus kloningsvektorer, i r !rekombinante DNA molekyler, Bacillus som er vertstransf or-Imert med dem og fremgangsmåter for ekspresjon av fremmede jDNA sekvenser og for fremstilling av polypeptider kodet for !disse sekvenser. Særlig vedrører oppfinnelsen kloningsvek-l 1 I torer som er anvendelige i Bacillus-verter for kloningi [og . jr j ekspresjon av fremmede gener og fremgangsmåter for slik. j \kloning og ekspresjon. Vektorene, rekombinante DNA moleky-I ler, verter og fremgangsmåter ved denne oppfinnelse er|

ikarakterisert vedat de tillater kloning og. ekspresjon av frem-,mede DNA sekvenser, spesielt sådanne av eukaryotisk og|vi-i rusopprinnelse i Bacillus-verter. Som man vil se fra den ;følgende beskrivelse er vektorene, rekombinante DNA moleky-!ler, verter og fremgangsmåter ifølge nærværende oppfinnelse i anvendelige ved fremstillingen av polypeptider som ikke normalt fremstilles Bacillus-verter. Disse polypeptider er !derpå anvendelige i vaksiner, farmasøytiske produkter og ; 1 industrielle produkter og som utgangsmate-rialer eller for-, :stadier i fremstillingen av andre lignende produkter ved I mer tradisjonelle kjemiske prosesser.

i Tallrike eukaryotiske og virusgener er blitt uttrykt i|den!gram-negative bakterie, Escherichia coli. Eksempler pa slik-

I i ' ekspresjon er fremstillingen av polypeptider som viser; en i i biologisk eller immunologisk aktivitet for human-leukocytt-interfenon (S. Nagata et al., "Synthesis In E. coli Of;A ' Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity", | Nature, 284, s. 316-20 (1980)), antigener som viser spesifi-i teten for human hepatitis B virus antigener (C. J. Burrell i et al.,"Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B ' i' Virus Genes And Their Expression In E. coli", Nature, 282,,

s. 575-79 (1979)) og polypeptider som viser antigenisite- i ! ten til FMD virusantigener (H. Kupper et a-1. , "Cloning1 Of |

I cDNA Of Major Antigen Of Foot And Mouth Disease Virus And : 'Expression In E. coli.", Nature, 289, s. 555-59 (1981)).

i i

i • •

j Imidlertid er fremstilling av slike anvendelige eukaryotiske og virusprodukter i E. coli belemret med flere ulemper, i F.eks., da E.•coli rutinemessig er tilstede i fordøyelses-

trakten, hos dyr og mennesker kreves forsiktig behandling !

j av E. coli verter som er blitt modifisert til å gi et øn- j sket produkt for å forhindre uønsket infeksjon. I øyeblik-j - i ! ket er de E. coli verter som er tillatt brukt'for transi -

I I formasjon for å gi ønskete produkter begrenset til slik*<e>som ikke. vil vokse utenfor laboratoriemiljøet. Videre må de transformerte E. coli verter dyrkes i lukkete systemer under strenge forholdsregler (som nå angitt i retningslin-jer fra the National Institute of Health og andre lignende , offisielle organisasjoner) . De resulterende E. coli kultu-! rer må også behandles slik at bakteriene drepes før syste-j met åpnes mot omgivelsene. Disse krav øker åpenbart sterkt

material- og utstyrsomkostningene for f ermenteringsproses-j i sene som anvender E. coli. Dertil er noen av bakteriepjro-I duktene fra E. coli endotoksiner. Før derfor eukaryotiske i , og virusprodukter som fremstilles i E. coli verter kanj I brukes i dyr og mennesker må E. coli endotoksiner fjernes totalt fra det ønskete produkt. Åpenbart medfører dette og-■ ; så dyr og omstendelig rensning og isoleringsmetoder. ji

Selv ora til slutt noen produkter fremstilt av E. coli verter, f.eks. produktet til genet for•pencillinasemotstand,

: i 'kan utskilles i det periplasmiske rom til E. coli cellen, j-er produktene som fremstilles' fra E. coli vertene ikkej nor-; malt utskilt i det ekstracellulære rommet til E. coli cel<J>1 len. For derfor å gjenvinne de ønskete produkter må E.j coli cellene brytes opp eller lyses på annen måte. Slike dra-stiske behandlinger frigjør selvfølgelig også alle de an- ;

dre celleproduktene og E. coli membranproteiner fra E.<I>i

i coli verten. Derfor nødvendiggjør slike fremgangsmåter! igjen utstrakt rensning av produktblandingen for å isolere og gjenvinne de ønskete eurkaryotiske eller virusprodukter i en form som er brukbar på dyr og mennesker.

Disse mange ulemper ved E. coli verter kan i stor grad unn-I gås ved å bruke Bacillus-verter for å fremstille de ønske'-te eukaryotiske og virusprodukter. Bacillus er en gram^po-sitiv vert. De fleste Bacillus-verter er også ikke-patoge-;

'ne. Den har ikke evnen til å'infisere mennesker eller dyr.!

;Bacillus-verter produserer heller ikke endotoksiner. Derfor har fremstillingen av eukaryotiske og virusproteiner i ;i Bacillus-verter ikke den ulempe at det for vekst og av-!livning kreves strenge betingelser. Videre er det lettere

j å fjerne fra Bacillus kulturer alle spor av toksiske pro- j idukter før deønskete produkter kan brukes i dyr ellerjmen-Jnesker. Bacillus-verter har heller ikke et periplasmisk j i rom og deres celleflate mangler lipopolysakkarider. Dejut-j

•skiller også naturlig flere av sine proteinprodukter ijdetj Ekstracellulære rom. Derfor kan de utskilte produkter fra I

■Bacillus gjenvinnes fra det ekstracellulære rom uten å|bryr ;^te opp eller lyse cellen. Slike fremgangsmåter er selvføl-i gelig fri for kontaminasjon og renseproblemene som følger<!>produktgjenvinning fra E. coli verter. Til slutt er Bacil-;

lus-verter godtkarakterisertog brukes meget i industri- j elle fermenteringer, f.eks. ved fremstillingen av Bacillus-produktet a-amylase.

i

I

c

Til tross for de mange iboende fordeler ved bruken av Ba^<:>cillus-verter for ekspresjon av fremmede genproduktér og for mange forsøk på å anvende Bacillus-verter for å utføre en slik ekspresjon, har imidlertid ingen vellykkete eks-, presjoner av eukaryotiske eller virusgener i Bacillus^-ver--

; ter blitt rapportert.

foreliggende oppfinnelse løser generelt problemere som er omtalt ovenfor ved å tilveiebringe Bacillus- kloningsvektorer, rekombinante DNA molekyler, Bacillus-verter transformert med dem og fremgangsmåter for kloning og ekspresjon , av fremmede DNA sekvenser og fremstilling av polypeptider j ■ kodet ved disse Bacillus-verter. Særlig tilveiebringes!i- ! ■ følge oppfinnelsen en Bacillus kloningsbærerkarakterisertved et intakt replikon som er fordragelig med Bacillus-verter og minst ett endonukleasegjenkjenningspunkt ved; ■ hvilket en slik kloningsbærer kan brytes på en forutbe^-stembar måte uten medfølgende tap av en essensiell biolo-^- : gisk funksjon,karakterisert vedetter innsetning av en DNA sekvens hvorav minst en del av sekvenser koder for en j

fremmed aminosyresekvens, i dette endonukleasegjenkjennel-<1>; sespunkt bg transformasjon av en Bacillus-vert med det ire-l sultérende rekombinante DNA molekyl, er den resulterende i i transformerte Bacillus-vert i stand til å uttrykke minst en del av DNA sekvensen og produsere minst en del av den 1 fremmede aminosyresekvens.. j

i -i '■ Gjennom foreliggende oppfinnelse er det for første gang mulig å anvende Bacillus-verter til å uttrykke fremmede DNA ' sekvenser, spesielt sådanne av eukaryotisk og virusopprin-

i 1 neise og i disse verter frems- tille eukaryotiske og viru! s-' -<]>! polypeptider som er anvendelige i vaksine og farmasøytiske J i produkter og som har forskjellige industrielle anvendelser. Vertskloningsvektorsysternene, rekombinante DNA molekyler, ' og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse mulig-I gjør transformasjonen av Bacillus-verter med fremmede gener som koder for disse polypeptider og replikasjonen og eks-<\>presjonen av disse gener av Bacillus-vertene. bé vertsklonende vektorsysternene, rekombinante DNA molekyler.og fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse er således ikke bare fri for de ulemper som følger anvendelse av E. , coli verter for replikasjonen og ekspresjonen av dissej gener, men kloningsvektorene, rekombinante'DNA molekyler,

■ 'j Bacillus-verter og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen gir de fordeler som karakteriserer fermenteringen, fremstiliin-, gen og gjenvinningen av produkter i Bacillus-verter.

. Som man vil se av den følgende beskrivelse er de vertsklo--nende vektorsystemer og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen i stand til replikering og ekspresjon av gener av fremmed ! opprinnelse hvilket gir eukaryotiske og viruspolypeptider , i Bacillus-verter. i

Fig. 1 gir en skjematisk oppstilling av én utførelsesform av et vertklonende vektorsystem og en fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse for fremstilling av polypeptider med spe-sifisiteten for hepatitis B kjerneantigener i Bacillus-verter..!

i

I

Fig. 2 viser en skjematisk fremstilling av en annen utfø-1 relsesform av et vertskloningsvektorsystem og en fremgangsj-: måte ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av j '. i polypeptider med biologisk eller immunologisk aktivitet avi human-leukocyttinterferon i Bacillus-verter. j l i i''Fig. 3 er en skjematisk oppstilling av en annen utførelses-

' form av et vertsklonende vektorsystem og en fremgangsmåte

ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av polypeptider med spesifisitet for munn- og klovsyre ("FMD") vi-rusaritigener i Bacillus-verter. j

'Ii

I hensikt av en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen skal følgende detaljerte beskrivelse gis. j

i i I beskrivelsen anvendes de følgende betegnelser: j

Polypeptid— En lininær anordning av aminosyrer som er bundet til hverandre gjennom peptidbånd mellom a-amino og karboksygrupper hos tilstøtende aminosyrer.

Ekspresjon— Prosessen som finner sted når et DNA fragment eller et gen fremstiller et polypeptid. Det er en kombinasjon av transskripsjon (prosessen som gi mRNA fra et DNA

i fragment) og translasjon (prosessen for fremstilling av et polypeptid fra MRNA).

Plasmid— En ikke-kromosomt, dobbeltkjedet DNA sekvens omfattende en intakt "replikon" slik at plasmidet replikeres i en vertscelle. Når plasmidet anbringes i en encellet organisme kan karakteristikaene for denne organisme foran-dres eller transformeres som et resultat av DNA'et til plasmidet. F.eks. transformerer et plasmid med genet for tetracyklinresistens (Tet R) en celle som forut var. sensi- , tiv overfor tetracyklin denne i én som er resistent mot det. En celle transformert av et plasmid kalles en "trans-formant".

Fag eller Bakteriefag— Bakteriell virus, hvorav mange

I består av DNA sekvenser innkapslet i et proteinkapsel éi- j " i ler kappe ("kapselprotein"). | j

J Bacillus- Kloningsvektor— Et plasmid, fag DNA eller en annen DNA sekvens som har (a) et intakt replikon, slik at kloningsbæreren er i stand til å replikere i en Bacillus-

i I I vert og (b) ett eller et lite antall endonukleasegjen -j kjennelsespunkter ved hvilke slike DNA sekvenser kan brytes i . I på en bestembar måte uten medfølgende tap av en essensiellj biologisk ' funksjon for kloningsbæreren f.eks. replikasjon,! fremstilling av kappeproteinereller tap av promotor eller bindingspunkter. Fortrinnsvis har Bacillus Kloningsvektoren

■i opprinnelig tilstand eller etter at et DNA fragment fra et forskjellig genom er insatt . i dette, også en markør somi ; er e' gr net for. bruk ved identifiksjo, n av transformerte ce' ll. erj, f.eks. tetracyclin resistens, ampicillin resistens eller j fremstillingen av et påviselig polypeptidprodukt. En Bacillus-Kloningsvektor kalles ofte en Bacillus kloningsbærer.

Klo" ning-- Prosessen for fremstilling av en populasjon :av organismer eller DNA sekvenser avledet fra en slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon.

I

i i Rekombinant DNA molekyl eller Hybrid DNA—.Et molekyl bestående av segmenter av DNA fra forskjellige genomer som' er sammenknyttet ende til ende utenfor de levende celler

og har evnen til å infisere noen vertscelle og bli i disse.

Bacillus Ekspresjon kontroll- sekvens-- En sekvens av nukleotider som kontrollerer og regulerer ekspresjonen av '

i .strukturelle gener i en Bacillus-vert når den er operativ ' knyttet til disse gener. De inneholder Bacillus (3-lac-systemet, Bacillus erytromycinresistenssystemet, Bacillus > a-amylasesystemet og andre sekvenser som er kjent for å kontrollere ekspresjon av gener til prokaryotiske eller

•eukaryotiske celler eller deres virus.

I

Bacillus- vert-- Gram-prositiy, mikrobiell stamme tilhør/ende slekten Bacillus. Den kan inneholde stammer av Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus circulans j og andre stammer av Bacillus. j i Bacillus krevende vektorer, rekombinante DNA molekyler, |. transformerte verter og fremgangsmåter ifølge denne opp-j

i

<1>finnelsen muliggjør ekspresjon av fremmede DNA sekvenser!, spesielt slike eukaryotisk og virus opprinnelse, i Bacillus

• ' i verter og fremstilling av produktene det er kodet for ved

i slike DNA sekvenser. Eksempler på slike produkter er pdly-i

i , peptider med bilologisk og immuoldgisk aktivitet som leuko-j'cyt interferon, fibroblast interferon, andre interferoner, insulin, humane og animalske veksthormoner, hepatitis B i

i virus kjerne antigener, hepatitis B virus overflate.antigener, FMD virus antigener, og andre humane, animalske og virus polypeptider.

Ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykker overnevnte DNA sekvens og fremmede produkter produseres ved innsetning av en DNA sekvens hvorav i det minste en del koder for det 'ønskede produkt i en Bacillus kloningsvektor ifølge foreliggende- oppfinnelse på en slik måte at man ikke ødelegger evnen til det resulterende rekombinant DNA molekyl til å opprettholdes og replikere i Bacillus-verter og slik at ! det blir operativt knyttet til en Bacillus ekspresjons kon- , troll-sekvens. Kloningsvektoren ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et intakt replikon som er fordragelig medBacillus-verter og minst et endonuklease gjenkjennelsespunkt ved hvilket kloningsvektoren kan brytes på en forut bestembar måte uten medfølgende tap av en essensiell biologisk funksjon. De . er kairakterisert ved at etter innsetting av den fremmede DNA sekvens på endonuklease .gj en-kj ennelsespunktet og transformasjonen av en Bacillus-vert med det resulterende rekombinant eller hybrid DNA molekyl, j er den transformerte Bacillus-vert i stand til å uttrykke i det minste en del av DNA sekvensen og fremstille i det minste en del av aminosyresekvensen som er kodet for gjennom fremmed DNA sekvens.

I

Særlig er Bacillus kloningsvektoren, enten i opprinnelig form eller etter innsetting av den fremmede DNA sekvens jogsåkarakterisert veden markør som er i stand.til å muliggjøre selksjon av Bacillus-verter transformert med et rekombinant . DNA molekyl utledet fraBacillus kloningsvektoren.

Særlig er Bacillus' kloningsvektoren ifølge foreliggende oppj finnelse bygget opp av en kombinasjon av minst, en del av en,

DNA sekvens som er i stand til replikasjon i E. coli og ! | ■ 1 1 minst en del av en DNA sekvens som er.i stand til replika- ,

i ■ i sjon i Bacillus. Denne foretrukne kloningsvektor muliggjørj transformasjon og seleksjon utført først i E. coli hvor I j transformasjon er lettere og normalt har en høyere sekvens og -deretter transformeres det utvalgte rekombinante DNA | molekyl til Bacillus-verter.'

For å gjøre foreliggende oppfinnelse bedre forståelig pre-senteres de følgende eksempler som illustrasjon.

EKSEMPEL I

På fig. 1 vises en skjematisk oppstilling av .en utførelses-; form av et Bacillus verts-kloningsvektor system og en frem-| gangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. I denne utførel-sesform fremstilles polypeptider med spesifitet av hepatit B kjerne antigener ("HBcAg") gjennom innsetting av et DNA ;

fragment som koder dette polypeptid i en Bacillus klonings-i

t vektor ifølge foreliggende oppfinnelse og ved transformasjon i ." ! av en Bacillus-vert med en slik vektor for replikasjon dg<1>ekspresjon av det innsatte DNA fragment og fremstilling jav. j. HBcAg produktet.

t

Som vist i fig. 1.ble en Bacillus kloningsvektor konstruerttved' å kombinere E. coli plasmidet pBR322. (F. Bolivar et ' al. ,

l "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene, s. 95-113 (1977);

I

J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Derived From the DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucelo-' tide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5, s. 2721-28 1

(1978); J. G. Sutcliffe, "Complete Nucelotide Sequence Of

The Eschericia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 43, I. s. 77-90 (1978)) med plasmidet pBD9, et plasmid som er kjent for å replikere i Bacillus-verter, ■ "Construction And Properties Of Chimeric Plasmids In Bacil-■ lus. Subtilis", Proe Nat. Acad. Schi. USA, 75, s. 142.3-28

(1978); "Characterization Of Chimeric Plasmid Cloning Vehicles In Bacillus Subtilis", J. Bact eriol. 141, s. 246-53

(1982)).

' Ligeringen av de to plasmider ble utført ved å spalte hver

av plasmidene med restriksjons ekonukleasen EcoRI og spleise de to liniæriserte plasmider i nærvær av T4 DNA ligase. Da pBR322 bærer genene som koder, for penicillinase resistens

R R

(Amp ) og tetracyclin resistens (Tet R ) og pBD9 bærer genene'' som koder for kanamycin resistens (Km ) og erythromycin resistens (Em R)(erytomycin resistens har sammenheng med polypeptid på ca. 29.000 MW. Fremstilling av polypeptidet induseres av. sub-.inhiberende konsentrasjoner av erythromycin.)

og ingen'av disse gener har blitt inaktivert ved fusjon av de to plasmider, bærer det kombinerte plasmid som kalles l ~pKH80 alle fire resistens markører.

■ •" 1 I

I i , Da plasmidet pKH80 er et kombinasjons E. coli og Bacillus plasmid kan begge disse stammer brukes som en vert for j plasmidet. Da transformasjonen av E. Coli verter er noe. lettere enn transformasjonen av Bacillus-verter og spesielt ;

fordi frekvensen til transformasjon normalt er høyere i | I E. coli verter enn i Bacillus-verter, foretrekkes det førstJ

a transformere en E. coli vert med det overfor konstruerte 1 plasmid og deretter velge riktig konstruerte plasmider i denne verten. Disse plasmider kan deretter brukes for å, transformere den ønskede Bacillus-vert.

Riktig konstruerte plasmider ble valgt ved å transformere

E. coli HB101 med de overnevnte plasmider og selektere for resistens mot ampicillin (40 ug/ml), tetracyclin (25 ug/mg) og kanamycin (5pg/ml) på L-agar plate. Den relative orientering av pBR322 og pBD9 i pKH80 ble fastslått ved.nedbrytning med PstI, da to PstI punkter i pKH8 0 er asymetriske i for-hold til' pBD9 og pBR322 delene av pKH80 (fig. 1).

pKH80 gir også erythromycin resistens i E. coli HB101 verter transformert med dette. Videre ble 29.000 MW proteinet kodet for gjennom genet for erythromycin resistens påvist 1 E. coli miniceller transformert med pKH80 og indusert med 2 ug/ml av erythromycin.

For å påvise anvendeligheten av pKH80 som en kloningsvektor

i Bacillus-verter ble et DNA fragment som koder for et polypeptid med antigenisitet for HBcAg selektert og innsatt i kloningsvektoren og Bacillus-verter. transformert med rekombinant eller hybrid DNA molekylet hvilket ga polypeptider med antigenisitet for HBcAg.

Som vist i fig. 1 ble plasmidet pHBV-13 9A (en av en gruppe av rekombinant DNA molekyler kalt pHBV139 i C. J. Burrell et al., ovenfor) behandlet med Pstl for å skjære ut en DNA;sekvens som innholdt et HBcAg-beslektet DNA fragment. Det

utskårede fragment ble behandlet under standard-betingelser[ med eksonuklease Bal31 slik at et gjennomsnitt på 100 base-j par ble fjernet fra hver ende av DNA sekvensen. En blandning av BamHI og Hindll bindere ble deretter legert til endene av det behandlede fragment. Etter BamHI-behandling ble j fragmentet innsatt på BamHI-punktet til pBR322 (fig. 1) .! j E. coli HB101 ble transformert med disse hybrid plasmider og verter som var resistente mot ampicillin (4 0 ug/ml) og sensitive mot tetracyclin (15 ug/ml)* ble selektert. Pias-;

i mid DNA ble isolert fra de selekterte transformerte verter på konvensjonell måte og nukleotid sekvensen på forbindelses-stedet mellom pBR322 og 5' enden til det ihsatte HBcAg. kodende fragment bestemt gjennom metoden til A. M. Maxam and W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe.' Nati-. Acad.. Sei. USA, 74, s. 60-64 (1977) . '

& BamHI-stedet befinner seg i genet som koder for tetra-cyciin resistens i pBR322.. Derfor inaktiverer insetningen av et DNA fragment på dette stedet genet som koder for tetracyclin resistens og gjør en vert som er transformert med det resulterende rekombinant DNA molekyl sensitivt overfor tetracyclin.

Nukleotid sekvensen til ett av de isolerte plasmider (pH98) sammen med den kjente sekvens for genet som koder for erythromycin resistens og' posisjonen til Bell punktet som koder for erythromycin resistens gjorde det mulig å forutsi atBamHI fragmentet til pH98 kunne insettes på Bell punktet

til genet som koder for erythromycin resistens i pKH80 i en riktig avlesningsrekkefølge slik at avslutnings kodonet som står etter tre nukleotider AUG start kodonet til HBcAg forbundet DNA fragment i BamHI fragmentet fra pH98 ville være i fase med genet for erythromycin resistens i pKH80. Derfor ble det forventet at i disse konstruksjoner ville ekspresjon av erythromycin genet begynne ved sitt vanlige start kodon og'ville avsluttes ved- stopp kodonet tilveie-brakt gjennom HBcAg -innsetningen. De novo ekspresjonen i ville så begynne igjen ved. AUG • start kodonet f or. det HBcAg--

I

forbundene DNA fragment og gi et ikke fusjonert produkt-med antigensitet til HBcAg. i

• DNA fragmentene som oppstår ved behandling med BamHI og Bell har sekvensén GATC ved sine 5' ender slik at et frag- i ment fremstilt ved behandling med BamHI kan insettes i et ! Bell punkt. i

j - , Følgelig ble BamHI fragmentet til pH98 insatt i Bell punktet til pKH80.** Som tidligere ble korrekt konstruerte rekombinant DNA molekyler selektert etter transformasjon av E. coli HB101 (nå gjennom resistens mot ampicillin (40 ug/ml) og tetracyclin (25 ug/ml) og sensitivitet mot erythromycin i i (60' ug/ml)). Denne kombinasjonen av antibiotisk sensitivitet og resistens viser at E.coli verten er blitt transformert med et plasmid som medfører resistens mot tetracyclin og ampicillin og ikke medfører resistens mot erythromycin '

(d.v.s. et hybrid molekyl avledet fra pKH8 0, men med genet : som koder for erythromycin resistens inaktivert ved insetting av et fremmed DNA fragment deri).

De selekterte rekombinant DNA molekyler ble isolert fra

E. coli vertene med konvensjonelle metoder for isolering

av plasmid DNA og hybrid molekylene behandles med Xbal for å bestemme orientering til de insatte fragmenter. Av det tre selekterte plasmider hadde to pKH81 og pKH82 DNA frag-' mentet som koder for HBcAg. i samme orientering som gen som koder for erythromycin resistens. Det andre isolerte plas-i mid pKH8 2 hadde det HBcAg-forbundene DNA fragment insatt i motsatt retning (fig.. 1).

Bacillus subtilis stammer MI119 (leu B6, trpC2, r , m )

("Restriction Of Plasmid Mediated Transformations In Bacillus subtilis 168", Mol. Gen. Genet., 175, s. 235-37 (1979))

og SL650 (spoIIA69, trpC2, rif-2) (a gift of R. Piggot)* ble transformert med pKH81,pKH82 og pKH83 ved bruk av konvensjonelle metoder (Contente and Dubnau, "Characterization Of Plasmid Transformations In Bacillus Subtilis:

Kinetic Properties And The Effect of DNA Conf.ormation, Mol. Gen. Genet., 167, s. 251-58 (1979.)). Riktig transformerte \Bacillus-verter ble deretter selektert gjennom resistens mot kanamycin og sensitivitet overfor erythromycin. Pias-midenes struktur i disse selekterte transformert Bacillus- j verter ble også fastslått ved å isolere plasmid DNA fra • verten (Lovettt and Keggins, "Bacillus subtilis. As A Host For Molecular Cloning", in Methods in Enzymol., 68, s.342-47'(1979)), og behandle plasmid DNAet med Xbal. ! r * Stamme SL650 fremstiller ikke sporer eller proteaser som normalt brukes av sporuleringsprofisient B. subtilis. iBacillus-vertene som var transformert med pKH81, pKH82<q>g pKH83 ble fastslått etter induksjon med sub-inhiberende ! konsentrasjoner (0.05 ug/ml) erythromycin (for å indusere<1>syntese av polypeptider insatt i genet som koder for erythromycin resistens) for fremstilling av produkter méd antigenisitet for HBcAg gjennom fast fase radiologisk immunologisk . bestemmelse (se.f.eks. C. J. Burrell et al., overfor). Resultatene var som følger::

EKSEMPEL il I fig. 2 vises en skjematisk oppstilling av en annen utfør-elsesformel av en Bacillus-vert kloningsvektor system og. fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. I denne ut-føre.lsesform fremstilles polypeptider med biologisk eller immunologisk aktivitet av human elukocyt interferon ("IFN-a")

i 1 ved å innsette et DNA fragment som koder for dette polypeptid i en Bacillus kloningsvektor ifølge foreliggende ppp4 finnelse og transformere en Bacillus-vert med slike vektorers, for å frembringe replikasjon og ekspresjon av det innsatte DNA fragment i Bacillus-verten og fremstille IFN-a produktet.

!<*>

i i

i i Som vist i fig. 2 ble en annen Bacillus kloningsvektor ifølge foreliggende oppfinnelse konstruert ved å kombinere plasp j midet pABl24, isolert fra en termofil Bacillus stamme, og | dens delesjons-derivater pAB224 og pAB424 (A.H.A. Bingham et al., Jour. Gen. Microbiol., 114 s 401-408 (1979) A.H.A. Bingham et al., Jour. Gen. Microbiol., 119, s 109-115 (1980).) med-'plasmid pBR325. Liger ingen av de to plasmider ble utført Ved å spalte hvert av plasmidene med EcoRI og koble de to liniæriserte plasmider i nærvær av T4 DNA ligase. Da pBR325 bærer E. coli genene som koder for penicillinase resistens

R R

(Amp ) og tetracyclin resistens (Tet ) og pAB.124, pAB224' og pAB424 bærer Bacillus genet som koder for tetracyclin re-

R

sistens (Tet ) og ingen av disse genene er blitt inaktivert .

ved sammensmeltingen, bærer de kombinerte plasmider som

kalles pAH2 (fra pABl2.4), pAH49 (fra pAB224) og pAH42 (fra pAB424) en ampicillin resistens markør og begge E. coli og Bacillus tetracyclin resistens markørene. Korrekt konstruerte plasmider ble selektert ved å transformere E. coli HB101 med plasmidene og selektere for resistens mot ampicillin og tetracycylin og sensitivitet ovenfor kloramfenikol.*

' Dl' De korrekt konstruerte plasmider er sensitive ovenfor

R

kloramf enikol. ("Cm ) fordi pBR325 inneholder genet som koder for kloramfenikol resistens, men dette genet er blitt inaktivert ved innsetting i déts E. coli punkt i Bacillus plasmidene.

De kimere plasmider eller kloningsvektorer som er fremstilt ovenfor var stabile i E. coli stammene HB101, DS410 og DB11 og i Bacillus stammene BD22.4 og MI119. Ingen delesjoner;

eller omleiringer ble observert i plasmidene som var re-, isolert fra disse stammer etter opprinnelig transformasjon.

For å demonstrere anvendeligheten av pAH4 9 som en kloningsvektor i Bacillus-verter ble DNA fragment som koder for polypeptider med en biologisk eller immunologisk aktivtet av \ IFN-a selektert og innsatt i kloningsvektoren og Bacillus- ! verter transformert med rekombinant eller hybride DNA mole- : kylihvilket ga polypeptider med den biologiske eller immuno-logiske aktiviteten til IFN-a. ,

Plasmid pLMuIF-8, et plasmid som inneholder et DNA fragment | som koder for IFN-a(1) eller 2h (S. Nagata et al., ovenfor) frembrakt gjennom pLMu (fig. 2) ble behandlet med EcoRI og P<g>tl for å fjerne 1,8 Kb EcoRI-Pstl fragment som innneholderIFN-a genet. Dette fragment ble deretter anvendt for å er-statte 0.98 Kb EcoRI-Pstl fragmentet i pAH49. Det resulterende hybrid eller rekombinant DNA molekyl ble selektert gjennom størrelsen og kalt'pAH49-G4. !

E. coli HB101 ble transformert med pAH49-G4 og et delesjons-derivat av dette plasmid pAH49-El6.*

Sc Plasmidet pAH4 9-E16 resulterte av delesjonen av EcoRI-EcoRI fragmentet som inneholdt Bacillus tetracyclin resistens genet (fig. 2) .

I tillegg ble Bacillus subtilis SL650 og MI119 verter transformert med pAH49-64. Interferon fremstilling gjennom disse transformerte verter ble målt på konvensjonell måte (S. Nagata et al., ovenfor.) Resultatene var som følger:

i i

EKSEMPEL III

I fig. 3 er vist en skjematisk oppstilling av en annen ut- J førelsesform av et Bacillus-verts kloningsvektor system og

■ fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. I denne ut-førelsesform fremstilles polypeptider med spesifisitetenj til FMD virus antigener ved å insette et DNA fragment som koder, for dette polypeptid i en Bacillus kloningsvektor og trans- j formere en Bacillus-vert med denne vektor slik.at det innsatte DNA fragment kan replikeres og uttrykket i en Bacillusivert og fremstille det antigeniske produkt.

ii Som vist'i fig. 3 ble plasmidet pBD9 (ovenfor) liniærisert med Bell og det liniærisert plasmid koblet til BamHI-liniærisert plasmid pP VP1-1 (Kupper et al., ovenfor) i nærvær av T4 DNA ligase. Bacillus subtilis BD170 (Content and Dubnauy . ovenfor) ble så transformert med det resulterende rekombinante DNA molekyl og riktig konstruerte plasmider selektert • gjennom sensitivitet av de transformerte verter overfor

erythromycin (5 mg/ml). Disse ble kalt pEVP-1.

Ingen av de ovenfor beskrevene polypeptider ble observert

og være utskilt ekstra-cellulært av Bacillus-verten som var transformert med plasmidene som er beskrevet• i eksemplene I-III. Imidlertid var dette forventet fordi ingen av DNA sekvensene som kodet for slike produkter inneholdt eller, var sammensmeltet med en DNA signalsekvens som kunne identifiseres

og riktig behandlet for sekresjon av Bacillus-verter. Signalsekvenser som gjenkjennes av Bacillus-verter er kjente. De inneholder f.eks. denne signalsekvensen for penicillinase genet til Bacillus'lichenoformis (målt av H. Schaller, privat meddelelse) og signalsekvensen for genet som koder for a-amylase. Derfor vil konstruksjonen- av et plasmid som gir et fremmed gen med slik signalsekvens til at utskillelse av det fremmede gens produkt fra Bacillus-verten. Slike oppbygninger faller ikke utenfor oppfinnelsens ramme og skal anses som

en integral del derav.

Etter induksjon med erythromycin (0.05 mg/ml) ble polypeptider fremstilt av de selekterte transformerte Bacillus-verter, som viste spesifiteten til FMD virus antigener i målinger som i det vesentlige var som beskrevet av Kupper et al., ovenfor.

Mikroorganismer og rekomginant DNA molekyler fremstilt gjen-1 nom de her beskrevne fremgangsmåter er eksemplifisert gjenTnom kulturer som er deponert i kultursamlingen til Deutsche i Sammlung Van Mikroorganism i Gottingen, Vest-Tyskland, 27. i

i 1 april 1981 og angitt som A til C:

A: Bacillus subtilis MI119 (pKH81)

B: Bacillus subtilis BD170 (pEVP-1) I C: Bacillus subtilis MI119 (pAH49-G4)

Disse har fått sammenligninsnummrene

DSM 2084 som angir bakteriestammen MI119.(pKH81), : DSM 2085 som angir bakteriestammen BD170 (pEVP-1) og DSM- 2086 som angir bakteriestammen MI119 (pAH49-G4).

Sel<y>om det her er oppført en rekke utførelsesformer av opp-;

finnelsen er det klart at den grunnleggend<i>e oppbygning kan endres til å gi andre utførelsesformer under anvendelse av fremgangsmåten og sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse. Det skal derfor være klart at rammen av foreliggende oppfinnelse er definert gjennom de følgende krav og ikke gjennom de spesifike utførelsesformer som her er fremført som eksempler.

Claims (10)

1. I 1. Bacillus kloningsvektor bestående av et intakt, repli-!

   I-l kon som er fordragelig med Bacillus-verter og minst i et endonuklease gjenkjennelsespunkt ved hvilket denne I kloningsvektor kan kuttes på en forut bestembar måte j uten medfølgende tap av en essensiell biologisk funk-! sjon, karakterisert ved "at etter ; innsetting av en DNA sekvens hvorav minst en del av sekvensen koder for en fremmed aminosyresekvens i dette endonuklease gjenkjennelsespunkt og transforma-

   . sjon av en Bacillus-vert med det resulterende re- ;

   kombinant DNA molekylet, er den transformerte Bacillus-vert i., stand til ekspresjon av minst en del av denne DNA sekvens og fremstille minst en del av den fremmede aminosyresekvens.
2. 2. Bacillus kloningsvektor ifølge krav 1 karak-

   terisert ved at den også enten er som

   i opprinnelig konstruert - eller etter innsetting deri av DNA sekvensen gjennom minst en markør som er egnet for å identifisere Bacillus-verter som er blitt transformert med dette rekombinant DNA molekylet.
3. 3. Bacillus kloningsvektor ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved - at kloningsbæreren er en kombinasjon av minst en del av en DNA sekvens ■ som har evne til replikasjon i E. coli og minst en del av en DNA sekvens som er i stand til replikasjon i Bacillus.
4. 4. Bacillus kloningsvektor ifølge et av kravene 1-3 karkterisert ved at den velges fra gruppen pKH80, pAH2, pAH4 9, pAH28, pEVp-1 og derivater derav.
5. 5. _ Fremgangsmåte ved oppbygning av en Bacillus kloningsvektor ifølge krav 3 eller 4, karakteri sert ved trinnet og kombinere minst en del av en DNA sekvens som er i stand til replikasjon i E.. coli med minst en del av en DNA sekvens som er i stand til!

   replikasjon i Bacillus, hvilket kombinasjonstrinn !av J de to DNA sekvenser ikke er ødeleggende for klonin1 gs-ii vektorens evne til å replikere i Bacillus. ! '

   i
6. 6. Rekombinant DNA molekyl karakteriser it

   I ved en Bacillus kloningsvektor ifølge hvert av kravene 1 til 4 og en DNA sekvens hvorav minst en ,deli av.sekvensen koder for en eukaryotisk eller virus { aminosyresekvens, hvilken DNA sekvens er innsatt i Bacillus kloningsvektoren slik at rekombinant DNA.

   molekylets evne til å replikere i Bacillus-verter .ikke er ødelagt og slik at det er operativt bundet til :

   enVBacillus ekspresjonskontroll sekvens.
7. 7. Rekombinant DNA molekyl ifølge krav 6, karakterisert ved at den eukaryotiske eller virus amino: syresekvense viser .en innraonologisk eller bio-, logisk aktivitet for polypeptider som er valgt fra gruppen leukocyte interferon, fibroblast.interferon,

   andre interferoner , insulin, humane og animalske , veksthormoner, hepatit B virus kjerne antigener, hepatit B virus overflate antigener, FMD virus antigener og andre humane, animalske og virus polypeptider.
8. 8. Fremgangsmåte for oppbygning av. et rekombinant DNA molekyl ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved trinnet innsetting av en DNA sekvens hvorav minst en del koder for en eukaryotisk eller virus aminosyresekvens i en Bacillus kloningsvektor ifølge ett av kravene 1 til 4, hvilket innsettings-trinn for DNA sekvensen ikke er ødeleggende for rekombinant DNA molekylets evne til å replikere i Bacillus.
9. 9. Fremgangsmåte i fremstilling av et polypeptid hvorav minst en del er av eukaryotisk eller virus opprinnelse i en. Bacillus-vert, karakterisert ; • ved trinnene å dyrke' eri Bacillus-vert transformert

   med et rekombinant DNA molekyl ifølge krav 6 eller |. 7 i:

   og oppsamle dette polypeptid. : j

   i
10. 10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved . at polypeptidet viser en immunologisk eller biologisk aktivitet for polypeptider.; valgt fra gruppe leukocyt interferon, fibroblast interferon, andre interferoner, insulin, humane og animalske veksthormoner, hepatit :B virus kjerne

    antigener, hepatit B overflate antigener, FMA virus

    t antigener og andre humane, animalske eller virus 1 polypeptider.

    i