NO169242B - Eksternalisering av bakterielle produkter - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av et genprodukt fremstilt av klonede mikroorganismer, hvor fremgangsmåten er særpreget ved de trekk som fremgår av krav l's karakteriserende del.

Et problem ved å bruke E^ coli og andre prokaryotiske mikroorganismer som verter for ekspresjon av ønskede proteiner, har ofte vært eksternalisering av proteinene fra vertscellene for rensing. Forsøk på å overvinne dette pro-blemet innebefatter fysisk brytning av celler såsom homo-genisering eller ultralydbehandling, kjemisk brytning av celler såsom ved behandling med detergens eller lysozym, og sammensmeltning av en DNA-sekvens som koder for et eks-kresjonssignalpeptid til et strukturelt gen som koder for det ønskede produkt. F.eks. beskriver Weissman et al., europeisk patentansøkning 61.250 behandling av vertsceller med et lysings- eller permeabiliseringsmiddel; Silhavy et al., U.S. patent 4.33 6.336 beskriver en fremgangsmåte for å sammenknytte et gen for et cytoplasmisk protein med et gen for et ikke-cytoplasmisk protein slik at et resulterende hybridprotein transporteres til nær eller forbi verts-celleoverflaten; Gilbert et al., US patent 4.338.397 beskriver en fremgangsmåte for å fremstille ferdige utskilte proteiner omfattende innsetting av et strukturelt gen for et preprotein i en ekspresjonsvektor.

E. coli kan infiseres med en obligat parasitt, fag lambda, som er en dobbeltkjedet DNA-virus. Lambdagenetikk i likhet med E_j_ coli-genetikk er godt studert. Se f.eks. "The Bacteriophage Lambda," forfattet av A.D. Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1971.

Lambda, en temperat fag, formerer seg i E^. coli i en av to faser. I en, den lytiske fase, replikerer fag DNAet autonomt og styrer dannelse av kapsidproteiner, pakking og verts-cellelysing. Ekspresjon av lambda DNA under den lytiske fase er meget effektiv. Transkripsjon foregår på begge DNA-kjeder, på den ene i høyre reting og på den andre i venstre retning. Induksjon kan føre til frigjøring av ca. et hundre fagpartikler i løpet av 50 minutter ved 37°C. Se, Hershey, ovenfor. I den andre fasen, den lysogene fase, integreres lambda DNA i vertscellens genom og replikeres passivt sammen med vertskromosom DNAet av vertens replikasjonsenzymer. En fag i den lysogene fase er kjent som en profag; og verten er kjent som en lysogen og sies å være immun.

Immunitet kan tapes når forskjellige forhold opptrer som induserer den lytiske fase. Produktene fra lambdas int og xis gener katalyserer frigjøring av lambda-genomet fra E. coli genomet under dannelse av en kovalent lukket sirkel i stand til autonom replikasjon. Syntesen av disse gener og, enten direkte eller indirekte, alle andre lambda-gener undertrykkes av produktet fra lambda cl-genet. Som reaksjon på bestemte kjemikalier eller DNA-ødeleggende reagenser, styrer bakteriene syntese av produktet fra det bakterielle recA-genet. recA genproduktet spalter proteolytisk cl-repressorproteinet og muliggjør ekspresjon av den lytiske fases gener. Formering av fagen krever da samspill mellom flere lambdaregulerende elementer som til slutt igangsetter autonom replikasjon av lambda-DNAet. Produktene fra lambda P- og 0-genene kreves for DNA-replikasjon. Etter DNA-replikasjonen må fagen styre syntese av virusstruktur-proteiner, dvs. hode- og hale-proteiner og deres sammensetning til intakte tomme virioner. Samspill mellom minst 18 gener kreves for å utføre dette. Til slutt pakkes DNAet i de tomme virioner og gir infektiøse intakte virioner, og cellen sprenges av endolysin, som kodes for av lambda S- og Fe-genene som aktiveres av produktet fra Q-genet, og derved frigjøres fagene, fi-genet aktiveres ved N funksjonen. N-genet undertrykkes av cl-funksjonen.

De 18 gener som prøves for kapsid sammensetning ligger mellom ca. kartposisjoner 3 og 36 på den høyre transkrip-sjonskjeden, hvilke kartposisjoner er representative for andeler av totalt lambda DNA. De første gener fra venstre mot høyre er A, W og B; den siste er J. I normale lysogener er det til høyre for J-genet åtte bakterielle gener. Fem av disse, bio A, B, C, D og F inngår i biosyntesen av biotin. Et sjette, uvrB gir resistens mot ultrafiolett bestråling. De siste to, chlA og E gir sensitivitet overfor klorater. Se Guest, Mol. Gen. Genet. 105: 285-289 (1969) og Stevens et al, i "The Bacteriophage Lambda", forf. av Hershey, et al, som ovenfor, på sidene 515-534.

Et annet lambda-gen som fungerer i naturlig vertscellelyse er kil-genet. Funksjonen til kil-genet er ikke helt ut forstått. Celler som uttrykker kil-genet har en redusert celleveksthastighet etter induksjon. Tap av kilfunksjonen tillater celler å vokse med normale hastigheter dvs. log fasevekst, etter induksjon inntil lyse opptrer. I likhet med S- og R-gener, reguleres kil-genet av cl-repressoren indirekte gjennom N-genet. Se Greer, Virology 66: 589-604

(1975).

Temperatursensitive lysogener er blitt grundig studert. De er f.eks. beskrevet av Campbell, Virology 14: 22-32 (1961). cI857-genet er en temperatursensitiv cl-mutant. Den fungerer ved eller under 38°C. Se Sussman et al., C. R. H. Acad. Sei. Paris 254: 1517 1519 (1962). Lignende fagsystemer er kjent

å opptre i andre slekter. F.eks. rapporterer Lomovskaya et al., J\_ Virol. 9:258-262 (1972) temperatursensitive mutanter av en temperert fag som infiserer Streptomyces; Flock, Mol. Gen. Genet. 155: 241-247 (1977), rapporterer temperatursensitive mutanter av den temperate fag, phi-105 som infiserer Bacillus; Botstein et al., Nature 251: 584-588

(1974) rapporterer temperatursensitive mutanter av den temperate fag, P22, som infiserer Salmonella. Jostrom et al., Bacteriol. 119:19-32 (1974), og Thompson, J. Bacteriol. 129:778-788 (1977), rapporterer temperatursensitive mutanter av den temperate fag, phi-11, som infiserer Staphylococcus; Miller et al, Virol. 59:566-569

(1974) rapporterer temperate fager hos Pseudomonas.

Lambda endolysin er funnet å lyse Salmonella stammer som kan absorbere fagen som rapportert av Botstein et al., Ann. Rev. Genetics 16:61-83 (1982).

Perricaudet et al., FEBS Lett. 56:7-11 (1975), beskriver delesjon av lambdagener mellom kartstillinger 58 og 71 (58-71), hvilket segment inneholder lambda int-, xis-, red-, gam-, cIII- og kil-gener.

Hershberger et al., europeisk patentansøkning nr. 2.084.584 beskriver bruk av en lysogen som en vertscelle for å stabilisere og selektere for nærvær av et plasmid. Forfat-terne beskriver f.eks. transformering av en lysogen med et defekt cl-gen med et plasmid som har et funksjonelt cl-gen. I en beskrevet utførelsesform er det funksjonelle cl-gen cI857-genet.

Det er kjent at transposable elementer, dvs. gener som kan rekombinere uavhengig av vertskromosomrekombineringsmeka-nismer, kan innsettes i vertsceller som markører. Ross et al., Cell 16:721-731 (1979) rapporterer fysikalske struk-turer for delesjoner og inversjoner frembragt av det transposable tetracyklinresistenselement, tnlO. Davis et al., "Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (198 0), beskriver bruk av transposable elementer.

Ruvkun et al., Nature 289:85-88 (1981) rapporterer integrering av det transposable kanamycinresistens og neomycin-resistens element, tn5, i Rhizobium meliloti kromosomalt DNA ved konjugering av et plasmid med et tn5 etterfulgt av homolog rekombinasjon. Integrering av et heterologt gen ved rekombinasjon som resulterer av nærvær av homologe flanke-ringssekvenser, er også beskrevet i europeisk patentsøknad 74.808.

Foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte ved fremstilling av et genprodukt i bakterier som anvender endolysinkod-ende gener fra temperate fager. Fremgangsmåten omfatter transformasjon av en temperatur sensitiv bakteriestamme, som har et temperatursensitivt X-cI-fagrepressorgen og funksjonelle faglysozym-kodende gener slik at de lysozym-kodende gener undertrykkes under permissive betingelser og uttrykkes under restriktive betingelser, med ett DNA-molekyl (eller fler) som uttrykker, direkte eller indirekte, produktet; dyrkning av den transformerte stamme under permissive betingelser slik at produktet dannes; heving av temperaturen til restriktive betingelser; og, eventuelt, isolering av produktet fra kulturmediet eller et konsentrat av dette.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte ved fremstilling av et produkt i bakterier hvori man transfor-merer en bakterie som produserer produktet med en fag DNA sekvens som har et temperatursensitivt X-cl-fagrepressorgen og faglysozym-kodende gener slik at de lysozymkodende gener undertrykkes under tillatende betingelser og uttrykkes under restriktive betingelser for å gjøre bakteriene lytiske; dyrkning av den transformerte bakterie under permissive betingelser slik at produktet dannes; forandring av temperaturen til restriktive betingelser; og eventuelt, gjenvinning av produktet fra kulturmediet eller et konsentrat av dette.

Et annet aspekt av oppfinnelsen er å dyrke en bakterie med et DNA-fragment omfattende en defektiv fagsekvens med et temperatursensitivt repressorgen og funksjonelle lysozym-kodende gener, slik at de lysozymkodende gener undertrykkes under permissive betingelser og uttrykkes under restriktive betingelser, en selekterbar markør og, fortrinnsvis flankering av DNA sekvenser som er homologe med en tilstø-tende sekvens i kromosomet til en vertscelle.

Andre aspekter av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av en temperatursensitiv lytisk bakterie som omfatter transformering av en bakterie med DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen, som angitt i krav 14.

En temperatursensitiv bakterie er en som har en profag DNA-sekvens inneholdende et temperatursensitivt repressorgen, slik at ved dyrkning i et temperaturområde (permissive betingelser) er repressoren funksjonell; men ved dyrkning i et annet temperaturområde (restriktive betingelser) er repressoren ikke i funksjon; repressoren uttrykkes ikke eller er ikke stabil. Under restriktive betingelser uttrykkes fag-genene innebefattet faglysozymkodende gener, hvilket forer til cellelysing. Slike temperatursensitive bakterier er lytiske bakterier. Alle lytiske bakterer som her er angitt kan brukes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Temperatursensitive temperate fagrepressorgener er tilgjengelige eller kan dannes ved mutasjon av slike gener ved tidligere kjente fremgangsmåter. F.eks- beskriver Campbell, Virology 14.: 22-32 (1961) en fremgangsmåte for isolering av temperatursensitive fagmutanter. Generelt omfatter fremgangsmåten mutagenese av faginfiserte bakterier såsom ved ultrafiolett bestråling og deretter inkubering av overlevende ved høy temperatur for å gi induksjon av alle temperatursensitive repressormutanter. Lysatet brukes så for å infisere sensitive bakterier. De nye lysogener underkastes varmeinduksjon og fager som fremstilles etter varmeinduksjon, brukes for å fremstille lysogener fra sensitive bakterier. Dette kretsløp (lysogenfremstilling, induksjon, re-preparering) fører til identifikasjon av fagrepressor-mutanter. 3 til 4 slike kretsløp er gjerne tilstrekkelig til å gi slike mutanter.

Den følgende beskrivelse vedrører hovedsakelig lytisk E. coli- og spesielt cI857 E^. coli-lysogener. Ikke desto mindre vil en fagmann ut fra denne beskrivelse kunne utøve oppfinnelsen såvidt den vedrører andre lytiske E^. coli- samt andre lytiske bakterier ved å bruke repressor og endolysin-kodende gener fra lambda eller fra andre temperate fager såsom de ovenfor angitte temperate fager.

cI857-lysogener, som er kjente og lett tilgjengelige, produserer cl-repressor, hvilken er aktiv ved eller under 38°C

men inaktiv over 38°C. Disse foretrekkes fremfor andre temperatursensitive L. coli-lysogener, fordi i tillegg til en mutasjon som gjør repressoren inaktiv over 38°C inneholder cI857-genet en andre mutasjon som får cl-repressorproteinet til å være insensitivt overfor proteolytisk spaltning av produktet til X recA-genet. Ved kultivering under permissive betingelse er således cl-repressorproteinet stabilt, og derfor virksomt ved opprettholdelse av immunitet.

E. coli-stammen UC5822 er en lysogen som har cI857 mutasjonen. Det er også en punktmutasjon i int-genet (int 6 am, en amber mutasjon) og i P-genet (£3 am, en amber mutasjon).

(Amber mutasjoner signaliserer avslutning av translasjon). UC5822 foretrekkes generelt fremfor f.eks. MM294(cI857) fordi UC5822 er defekt, dvs. den produserer generelt ikke infeksjonsgivende fagpartikler. Defekte lyso- gener foretrekkes, spesielt når de er brukt for å gi et polypeptid til et pattedyr. UC5822 produserer imidlertid mindre mengder av lysozymet, fortrinnsvis fordi det har et lavere kopian-tall av S- og R-genene, nemlig ett, enn MM294(cI857) gjør, nemlig femti til et hundre etter induksjon. Ikke desto mindre lyser UC5822 lett etter induksjon.

I et aspekt av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen transformeres temperatursensitive bakterier med et DNA-molekyl (eller fler.) som koder, direkte eller indirekte for et ønsket produkt. Transformasjonen kan utføres ved en hvilken som helst teknikk som lar DNA-molekylet komme inn i vertscellen og uttrykke produktet. Teknikker omfatter, f.eks. transformasjon, transduksjon, konjugasjon og celle-fusjon. Mange egnede ekspresjonsvektorer er velkjente og allment tilgjengelige i likhet med teknikker for kloning av gener for produkter og transformering av celler med slike molekyler. Generelt vil produktet være et ikke utskilt, heterologt genprodukt, dvs. et som ikke produseres naturlig av verten og som ikke utskilles. Produkter som uttrykkes direkte er polypeptider; produkter som uttrykkes indirekte er polypeptider, glykoproteiner, antibiotika og andre molekyler såsom f.eks. metallioner som kan utskilles i en metalltionein-produserende bakterie.

Transformerte cI857-vertlysogener kan dyrkes opp ubegrenset under permissive betingelser (-<38°C, normalt 32 til 36°C) hvilket er optimalt for ekspresjon av det ønskede produkt. Når tilstrekkelig vekst er oppnådd, dvs. normalt når midten av logfasevekst (A650= 0,5) er blitt oppnådd, induseres syntese av lambda endolysin ved dyrkning av lysogenet under restriktive betingelser. Dette kan oppnås ved å øke temperaturen i dyrkningsmediet eller av et cellekonsentrat derav til, i tilfellet CI857, høyere enn 38°C, fortrinnsvis 42 til 44°C, i ca. 90 til 120 minutter. Alternativt økes temperaturen til dyrkningsmediet, eller et konsentrat derav, til høyere enn 38°C, fortrinnsvis 42 til 44°C, i en kortere tide, dvs. en tilstrekkelig tid til å indusere fag DNAet, fortrinnsvis minst ca. fem minutter, hvoretter temperaturen senkes til 0 til 38°C, fortrinnsvis 2 til 36°C.

Det foretrekkes å holde restriktive betingelser i 90 til 120 minutter fordi lysing er mer virkningsfull og rask. Imidlertid foretrekkes sistnevnte metode for visse formål, f.eks. når et ønsket protein er varmelabilt eller når om-kostningene ved å holde restriktive betingelser er prohi-bitiv.

Hvis cI857-vertlysogenet har et funksjonelt lambda cro-gen, vil cellene fortsette å syntetisere lysozymet med alle temperaturer ved hvilke cellene funksjonerer inntil lysing opptrer. Selv om lambda endolysin er aktivt helt nede på 0°C er den nødvendige tid for lysing lenger ved lav temperatur p.g.a. en reduksjon i proteinsyntesehastigheten og kataly-tisk aktivitet generelt.

Rett før eller etter induksjon konsentreres cellene fortrinnsvis såsom ved filtrering, sentrifugering eller på andre måter, og inkuberes i denne konsentrerte form inntil lysing. En slik fremgangsmåte letter isolering og rensing av det ønskede produkt. Etter induksjon nedbrytes bakteriecel-leveggen vesentlig. Cellene vil i form av protoplaster fortsette å syntetisere det ønskede produkt som i stor grad frigjøres i mediet mellom cellemembranene. Fullstendig frigjøring i mediet oppnås ved lysing. Lysing kan observeres ved at kulturmediet eller konsentrater blir klart og/eller en økning i viskositeten til kulturmediet eller konsentra-tet. Lysing kan forsterkes såsom ved mekanisk røring eller rask forandring av dyrkningsbetingelsene, f.eks. raskt å forandre temperaturen mellom 2 og 25°C eller forandre mediets eller konsentratets osmotiske styrke. Fortrinnsvis oppslemmes induserte celler eller konsentrering av celler og dekantering av biproduktholdig supernatant i en minimal mengde saltbuffer eller 0,1 M tris buffer, 50 mM NaCl og 1 mM EDTA og røres for å bevirke lysing.

Det ønskede produkt kan så isoleres fra mediet eller kon-sentratet og renses, om ønskelig ved kjente teknikker.

I en alternativ fremgangsmåte konsentreres.hele celler og kan gis oralt til et pattedyr før induksjon av den lytiske fase. Induksjon vil så foregå innvendig, hvilket fører til frigjøring av det ønskede polypeptid. Denne fremgangsmåte kan være spesielt anvendelig for administrering av antigener til dyr i tilfeller hvori hele celler samt det ønskede antigen er foretrukket for å frembringe en immunobeskyttende reaksjon. F.eks. kan temperatursensitive lysogener med gener som koder for antigener såsom et LT-B antigen gis direkte til griser og/eller kalver. Mengden av celler som gis til hvert dyr, vil være den mengde som inneholder en effektiv dose. Mengden av protein produsert av en enhetsmengde celler kan beregnes ved kjente teknikker.

Et aspekt ved oppfinnelsen er bruk av et DNA-fragment som kan brukes for å konstruere en lytisk bakterie for bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Et slikt DNA-segment omfatter en defekt fagsekvens med temperatursensitivt repressorgen og funksjonelle lysozymkodende gener. Et slikt DNA-fragment omfatter en defekt lambdasekvens med et temperatursensitivt cl-gen og funksjonelle lambda endolysin-kodende gener (N, Q, S og R) slik at endolysinet uttrykkes under restriktive betingelser, en valgbar markør, og fortrinnsvis, flankering av DNA-sekvenser som er homologe med en tilstøtende DNA-sekvens i et vertcellekromosom. I en spesiell utførelsesform omfatter DNA-fragmentet lambda DNA som deleteres i genene som ligger mellom kartstillinger 58 og 71, og derfor mangler int-, xis- og kil-genene har et temperatursensitivt cl-gen og har mutasjoner i O- og P-genene og i hvilken cl-<g>enet er cI857-mutanten og produserer endolysin under restriktive betingelser. 0- og P-mutasjonene kan være delesjons- eller punktmutasjoner. Punktmutasjoner såsom Q29-, P3- og P80-mutasjoner, foretrekkes fordi de er lett tilgjengelige. P3-mutasjonen foretrekkes fremfor P80-mutasjonen.

I en annen spesiell utførelsesform omfatter fragmentet lambda DNA som er vesentlig deletert i genene som ligger mellom kartstillinger 3 og 71. Et slikt fragment mangler i det vesentlige alle essensielle gener for lambda kapsiden-het samt int-, xis- og kil-gener.

En vertcelle, Ej. coli eller annen bakterie, som produserer et ønsket produkt eller som man forut eller senere får til å produsere det ønskede produkt, såsom ved genmanipulerings-teknikker, kan transformeres med en fag DNA-sekvens som har temperatursensitivt fagrepressorgen og faglysozymkodende gener med kjente teknikker. Disse innebefatter infeksjon av bakteriene med en temperat fag med et slikt temperatursensitivt repressorgen, fortrinnsvis en defekt fag. Disse innebefatter også transformering av bakterier med DNA-fragmentet ifølge oppfinnelsen ved kjente teknikker, f.eks. transformasjon, transduksjon, konjugasjon og fusjon. Transformasjon medfører generelt at man innfører fragmentet i en vektor såsom en fag eller et plasmid. F.eks. kan fragmentet klones i et plasmid, såsom pBR322 eller andre og dyrkes opp in vivo i en passende vert som mangler en tilstøtende sekvens homolog med sekvenser som flankerer fragmentet som er defekt for rekombinasjonsformål (rec—). Plasmidet kan isoleres og brukes til å transformere en passende vert for fremstilling av et ønsket produkt. Etter transformasjon av en slik vert, vil fragmentet som har flankerende del av sekvenser homologe med en tilstøtende DNA-sekvens i vertkromosomet integreres ved spontan rekombinasjon i punktet for den homologe tilstøtende sekvens. Alternativt kan en passende vert for produksjon av et ønsket produkt transformeres med det isolerte DNA-fragment i lineær eller sirkulær form.

DNA-fragmentet har en seleksjonsmarkør for å gjøre seleksjonen av transformanter lettere. Selekterbare markører er typisk gener som koder for målbare enzymer, hvilke restau-rerer prototrofi til en auksotrop vert eller som gir be-standighet overfor dødelig eller inhiberende forbindelser, normalt antibiotika. Fortrinnsvis er seleksjonsmarkøren et gen som gir antibiotikaresistens ettersom disse ikke krever bruk av en auksotrop vert, hvilken ikke behøver å være tilgjengelig eller hvilken spontant kan falle tilbake til prototrofi. Tetracyklinresistens foretrekkes fordi tetracyklin er billig og fordi resistens overfor tetracyklin ikke normalt tilegnes spontant.

Nærvær av markøren i transformanter tyder på at verten inneholder DNA-fragmentet. Hvis fragmentet integreres, vil hele fragmentet integrere p.g.a. homologi mellom DNA-fragmentet og vertscelle DNAet foreligger bare i ormådet som flankerer lambda DNA og markoren.

Uten en markør i DNA-fragmentet ville seleksjonen av vert-celler lambda DNA etter transduksjon eller en annen trans-formeringsmetode kreve superinfeksjon av putative transduktanter med en defekt fag (ikke-integrerende) og selek-sjon for immune bakterielie overlevende.

E. coli stammer som er gjort lytiske ved integrering av et DNA-fragment ifølge oppfinnelsen innebefatter f.eks. MG-stammer. Disse stammer er lysogener hvori lambda DNA er deletert i gener som ligger mellom kartstillinger 58 og 71, og derfor mangler int-, xis-, red-, <g>am-, kil- og cIII-gener, har cl857-mutasjonen og har mutasjoner i 0- og P-genene og har funksjonelle N-, Q-, S- og R-gener slik at endolysin uttrykkes under restriktive betingelser. I en utførelsesform, stamme MG1 /C600 (X 58-71, CI857, P3, 029), SuII<+>, galK, lacZ, thi, gal;ttnlO tet<R>/, leses punkt (amber) mutasjon gjennom og O- og P-genene uttrykkes p.g.a. produksjonen til vertcelle DNAet av en amber supressor, dvs. en translasjonssupressor av UAG translasjonsavslutningskodo-net.

En sterkere foretrukket vertcelle for bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en som er fenotype oj og P~. En utførelsesf orm har stamme MG3 /N99 ( A- A 58-71, CI857, P_3, 029) ga IK, lacZ, thi , gal: : tnlO tetR/ . samme lambda DNA fragment som stamme MGl. Imidlertid er den fenotype 0_ — og P_ — samt tet R, A kil, h int og Å xis.

De sterkest foretrukne lytiske _E_. coli er MG4 stammer. Disse er stammer som er deletert i hovedsakelig alt lambda strukturprotein og sammensetningsgener og den normale høyre profag-bakterieskjøt, dvs. høyre festepunkt (att ). Spesielt er de lysogene som er deletert i hovedsakelig alle lambda gener som ligger mellom kartstillinger 3 og 71, har punktmutasjoner i O- og P-genene har et temperatursensitivt cl-gen og har funksjonelle _N-, _Q-, _S- og R-gener slik at endolysin uttrykkes under restriktive betingelser, og har en selekterbar markør, nemlig det tnlO tetracyklinresistens transposable element. Slike defekte lysogener har 4 uavhengige blokker for virus formering: (i) tap av 0 og P replikasjonsfunksjoner, (ii) tap av att som gjør profagen ute av stand til å komplementeres av int og xis gener fra en superinfiserende fag, (iii) uten evne til å kode for lambda strukturgener og, (iv) størrelsen av lambda DNA er langt under den nødvendige minimumsstørrelse for pakking. Disse kan først fremstilles av klorat-stress-ede cl85 7, 0~, _P_<-> lysogene stammer, såsom MG stammer,

for å produsere kloratresistente mutanter og selektere slike mutanter som er ute av stand til komplementformering av en superinfiserende heteroimmun eller virulent lambda eller lambdoid fag som mangler A-og B-funksjoner. Et DNA-fragment omfattende markøren, lambda DNA og flankerende sekvenser fra E_. coli kromosomet, kan isoleres fra MG4-stammer såsom ved behandling med restriksjonsendonukleaser eller Pl transduksjon.

MG4 kan avledes fra MG3 ved delesjon av alle eller de fleste bakteriofaggenene som koder for de virale strukturbe-standdeler. For å bekrefte tap av disse gener, er det tilstrekkelig å demonstrere at virusgenomet i MG4 er ute av stand til å komplementere og formere en superinfiserende fag som i seg selv er defekt for disse gener. Å. charon 3A (\ A_~, _B_ imm80) er et eksempel på en fag som kan bru-

kes for denne superinfeksjon. Alternativt kan alle fager med amber mutasjoner i A_, B_ eller annet viralt strukturelt cistron pelleteres på sensitive E^ coli i nærvær av en heteroimmun eller virulent fag (X vir). Rekombinasjon vil opptre mellom de to fager og føre til dannelse av en rekombinant, f.eks. virA_. Frekvensen av rekombinanter vil være mellom 1 - 50%, avhengig av de eksperimentelle betingelser. Rekombinanter kan gjenfinnes ved deres evne til å pelletere på suppressorholdige lysogener /Y mel ( X)/ og deres manglende evne til å produsere plaques på ikke-suppresserende7 X sensitive stammer, såsom N99. Plaques erholdt fra ovennevnte krysspelleteres på petriskåler inneholdende Y mel ) eller N99 og rekombinanter renses. Lambdaf agdef ekt i A_, og/eller B_ genef unks jon foretrekkes, fordi, som en følge av deres stilling på genomet, må MG4 kandidater som ikke kan komplementere for disse funksjoner mangle alle andre lambda strukturgener. Bruken av defekte fager og verter på denne måten kalles "markørredning" og anvendes meget, se f.eks. "The Baeteriophage Lambda,"

forf. av A. D. Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory,

1971, spesielt, Stevens et al., på sidene 515-533. Foreliggende oppfinnelse kan brukes til å produsere alle bak-terieprodukter. Eksempler er mange og innebefatter blant annet insulin, rabies glykoprotein, K99 og 987P antigener, antibiotika, veksthormoner, metallotioneiner, alfa-l-anti-trypsin, influensaantigener, lymfokiner og interferon. I tillegg kan oppfinnelsen brukes i koloniutvalg, RNA isolering og plasmidfremstilling, ettersom oppfinnelsen sterkt forenkler og forkorter den nødvendige tid for slike fremgangsmåter ved å gå utenom lyseringstrinnet som ellers kreves.

I de følgende eksempler som er illustrerende for oppfinnelsen, er alle utgangsmaterialer lett

tilgjengelige eller kan lett fremstilles ved tidligere kjente teknikker. Transduksjoner ble utført hovedsakelig som beskrevet i "Experiments in Molecular Genetics", forf. av J. H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,

(1972) sidene 201-205.

Eksempel 1

Konstruksjon av MGO

Stamme C600 (E_. coli SuII<+> K12 galK lacZ sull thi) ble inkubert i nærvær av Xcl857 P3 029 (gave fra W. Syzbalski,^ U. av Wisconsin). Etter vekst natten over ved 32°C ble overlevende bakterier isolert og renset. Åtti prosent av disse bakterier ble funnet å være immune overfor superinfeksjon, å være ute av stand til å vokse ved 44°C, og å produsere lambda fag (etter utsettelse for 44°C) hvilket ikke kunne adskilles fraAcl857 P_3 0_29 (bedømt som evne av fagen til å produsere plaques på stamme C600 men ikke på stamme N99 (E_. coli K12 galK lacZ suO thi) . En av denne klasse overlevende ble renset og gitt betegnelsen MGO (C600 ( X cl857 P3 029)).

Eksmepel 2

Konstruksjon av MG0- AR6

Stamme N5151 (E_;_ coli K12 SA500 galK lacZ pro thr his ga!8

(Xcl_857 Å58-71 AH1)) ble inkubert i nærvær av Plcml900 fag som var dyrket på stamme AR4 ( E. coli K12 gal::tnlO (PlcmlOO)). Krysningen mellom N5151 og PlcmlOO dyrket på AR4 førte til isolering av tetracyklinresistente, UV sensitive, temperatursensitive lysogener. Et av disse isola-tene ble renset og kalt MG0-AR6 (E. coli K12 ga! 8 gal: :

tnloXA 58 -71 cl857 AhI ( bio uvrB) ) .

Eksempel 3

Konstru ksjon av MGl

MG0-AR6 ble gjort til et PlcmlOO lysogen 'ved å isolere overlevere av AR6 som var inkubert i nærvær av PlcmlOO. PlcmlOO lysogenet til MG0-AR6 ble kalt MG0-AR18.

Stamme MGO ble krysset ved Pl transduksjon med PlcmlOO som var dyrket på MG0-AR18. Etter tilstrekkelig tid for fagab-sorpsjon ble cellene utsatt for en UV innflytelse på 4 J/m 2 (bestråling med 254 nm lys var med en styrke på 2 J/m 2/s målt med et UV dosimeter) og inkubert i nærvær av tetracyklin. Elleve prosent tetracyklinresistente kolonier var resistente overfor UV lys hvilket tyder på at de ikke hadde noen Hl delesjon og at de således hadde lambdagener fra cl gjennom høyre ende av fagen. Spesifikt betyr dette at disse kloner har P_3-og 029- muta jsoner og intakte _S_-og Fa-gener. En tredjedel av de UV resistente, tetracyklinresistente celler var ute av stand til å produsere fag. Disse ble derfor antatt å ha tilegnet seg 58-71 delesjonen til lambda, og således ha tapt int, xis og kil genene. Denne klasse ble renset og kalt MGl (C600) (X-A 58-71 CI857 P<_>3 029) SuII<+> galK lacZ thi gal::tnlO tet<R>).

Eksempel 4

Ko nstruksj on av MG_3

MGl ble inkubert i nærvær av PlcmlOO og overlevere ble renset. Blant disse overlevere ble en høy prosentdel MGl celler identifisert som var blitt PlcmlOO lysogener. Et PlcmlOO lysogen av MGl ble renset og kalt MG2.

Stamme N99 ble krysset ved PlcmlOO transduksjon med PlcmlOO som var dyrket på MG2. Tetracyklinresistente transduktanter ble utvalgt. Alle disse ble funnet å være immune overfor lambda og ble derfor ansett å være lambda lysogener. En av disse lysogener ble renset og kalt (MG3 (N99 ( 58-71 cl857 P_3 029) ) .

MG3 ble funnet å lyse etter eksponering for 44°C i 90-

120 minutter. Ingen fag ble funnet i cellekulturer, verken før eller etter slik eksponering (<1/0,1 ml av en kultur

8

med 3,3 x 10 celler pr. ml). Nærvær av fag ble målt på C600 celler. Kontrollkulturer av _E_. coli-s tammer som inne-bar ikke-defekte lambdaprofager inneholdt mellom 10^ og 9 8

10 fager pr. ml av en kultur med 3,3 c 10 celler pr.

ml.

Eksempel 5

Konstruksjon av MG3

Stamme MG3 ble konstruert hovedsakelig som beskrevet i de

overnevnte eksempler, bortsett fra at stamme N99 ble lyso-genisert direkte med A c!857 P3 029. Det resulterende lysogen ble krysset ved Pl transduksjon med stamme MG0-AR18 og tetracyklinresistente lysogener som lyserte etter tempera-turinduksjon men som ikke produserte fag, ble utvalgt.

Eksempel 6

Konstr uksjon av UC5822

Stamme UC5822 ble konstruert ved å infisere stamme N99 med Aint6 red3 CI857 _P80 og A-hy5 climm21 Ab2_. X hy5 climm21 A b2 er et hybrid mellom fag A og fag 21. Hensikten med A hy5 climm21 A b2_ i denne konstruksjonen er å tilveiebringe int funksjonen in trans hvilket kreves for at X int6 red3 cI857 _P80 skal lysogenisere denne stammen. A b2 mutasjonen gjør Ahy5 climm21 A b2 fagen ute av stand til å dirigere sin egen integrering i denne stammen. En overlever av denne kryssing som viste immunitet overfor superinfiserende lambda, men som var sensitiv overfor fag 21, ble renset og kalt UC5822. Denne stammen overlever ikke eksponering til 44°C. Ingen fag kunne påvises i kulturer av UC5822 verken før eller etter inkubering ved 44°C.

Eksempel 7

Konstruksjon av MG4

Kulturer av MG3 dyrkes i Luria medium eller andre full-stendige medier ved 32°C inntil A,ro „ c , ^

^ 650 = 0,5. Kulturen

vil inneholde ca. 5x10 g celler/ml. Kulturen pelleteres så på næringsagarplater supplementert med 0,2% glukose og 0,2% KCIO^. Platene inkuberes under anaerobe forhold ved 32°C inntil kolonier dannes (3 til 5 dager). Vekst på dette medium under disse betingelser selekterer for E. coli som har mutasjoner i chl A, B, C eller D genet. Se, "Expts. in Molecular Genetics", J. Miller, sidene 226-227.

Mutasjon i chlB, C eller D vil ikke føre til isolering av MG4. Blant mutasjonene som påvirker chlA-ekspresjon vil det være punktmutasjoner i chlA og delesjoner som strekker seg til venstre eller høyre for chlA. Delesjoner som går til venstre for chlA kan føre til brudd på det tilstøtende uvrB-genet og således frembringer en UV-sensitiv fenotype av organismen. Av samme grunn kan delesjoner som går mot høyre fra chlD-genet også frembringe en UV sensitiv fenotype på organismen. Kloratresistente kolonier erholdt fra anaerob inkubering undersøkes for å bestemme om de nå er UV-sensitive. Dette er enkelt å gjøre ved å stryke en kloratresistent koloni tvers over en petriskål, dekke halvparten av skålen og utsette den andre halvpart for 10 j/m 2 254 nm UV-lys. Denne dose er tilstrekkelig til å drepe UV-sensitive celler, men ikke UV—resistente mutanter. I UV-sensitive mutanter (omfattende mutasjoner i chlA eller chlD undersøkes med hensyn til nærvær av defekt lambda profag. Dette gjøres ved å kryss-stryke cellene gjennom en strek av et homoimmunt fag. Lambda—sensitive bakterier drepes av faget ved kryss-streken; lambda lysogener er immune overfor superinfeksjon og drepes ikke. Som en følge av plasseringen til chlA-og chlD-qenene vil lambda genomet og uvrB-genet, alle UV sensitive chip mutanter være lambda sensitive, mens noen UV-sensitive chlA-mutanter kan være lambda lysogener. UV-sensitive, lambda lysogener inneholder derfor delesjoner av chlA som går mot venstre inn i uvr B_. Hvis delesjonen går gjennom uvrB kan den gå inn i biotinoperonet og eventuelt inn i de strukturelle lambda gener. Delesjoner av strukturelle lambdagener er oppnådd på denne måten (Grier, Virology 66:589-604

(1975). Alle UV-sensitive, chlA~, lambdalysogener infiseres med"XvirA_<->. Etter 2-1/2 time, pelleteres lysater for X. vir A fag og for A. vir A<+> rekombinanter. MG4 kandidater som frembringer X virA_~ og/eller produserer A.vir-A<+> fager kastes; kandidater som ikke kompiementerer X virA eller produserer virA]<*>" har en delesjon som går fra chlA gjennom A_genet til lambda. Slike MG4 kandidater som har delesjoner fra chlA gjennom A_-genet til lambda, undersøkes for lytisk bakterieegenskap (lysing etter vekst' ved >38°C). Kandidater som inneholder delesjonen som har beholdt den lytiske bakterieegenskap renses som MG4.

Eksempel 8

Kloning i MM294( cl857) og UC5822

E. coli stamme MM294 ble inkubert i nærvær av X c!857. Etter vekst natten over ved 32°C ble overlevende bakterier isolert og renset. Kloner som var immune overfor superinfeksjon og som var ute av stand til å vokse og produserte fag ved 44°C/ble isolert. Den resulterende CI857 lysogene stamme, MM294 (Xcl857), og E. coli-stamme UC5822 ble gjort kompetente ved CaCl2 behandling og transformert med pDN5, et plasmid med gener for E^ coli LT-B-antigen og for ampicillin og tetracyklinresistens.

Ampicillin og tetracyklinresistente transformanter av begge lytiske bakteriestammer vokste godt i et standard næringsmedium ved 30-32°C og uttrykte LT-B-antigen. Bakteriene ble sammenklumpet ved sentrifugering og overført til et standard næringsmedium ved 42°C. I løpet av 90-120 minutter var cellelysing tydelig og i det vesentlige fullstendig. LT-B antigen ble frigjort i mediet. I en prøve av MM294 (cl_857) tr ansf ormanten omfattende 4xl0<7 >celler/ml, ble ca. 2x10 lambda fager samlet pr. ml. I

en lignende prøve av UC5822 transformanter ble ingen fager (<20/ml) samlet.

Eksempel 9

Kloning i UC5822

En podekultur av E^ coli UC5822 inneholdende plasmidet

pESS2 som har gener for E^ coli LT-B-antigen,ble inokulert i et 5 mis rør med L medium inneholdende ampicillin. Etter 6 timer ble rørinnholdene overført til 500 ml kulturmedium inneholdende ampicillin og inkubert natten over under rys-ting ved 32°C. For å inokulere 10 1 ble 400 ml overnatt

kultur overført til 10 1 medium inneholdende ampicillin i en Virtis benk-topp fermentor. Kulturen ble holdt på

32°C og hver time ble en 100 mis prøve undersøkt for vekst ved A^g- Ved 4 timer ble kulturen tilført 200 ml 50% dekstrose og 0,1 ml antiskummiddel. Ved 8 timer var kulturen på 4,8 A^g ~en^eter °9 kle forandret til 43°C. Kulturen ble igjen ved 10 timer tilført 200 ml 50% dekstrose og ved 14 timer ble dyrkningen stoppet. En prøve av et cellekonsentrat ("klump") og av cellesupernatanten ved 4 timer, 6 timer, 8 timer, 9 timer, 10 timer, 10,6 timer og 14 timer ble undersøkt med hensyn til LT_ ved å bruke en ELISA-prøve med kjente konsentrasjoner av LT som standarder.

Resultatene er vist i tabell I. I de første 4 til 8 timer satt mer enn 90% av LT-B i cellen, men i løpet av 2 timer etter temperaturforandringen (10 timer etter inokulering)

var 90% av LT-B i supernatanten. Ved 6 timer etter temperaturforandringen, var 95% av LT-Bet i supernatanten; LT-B

representerte 8,5% av det totale protein. Utbyttet av LT-B var mye større enn utbyttet fra E. coli MM294 transformert med pESS2.

I løpet av 2-4 timer etter temperaturforandring var lysing tydelig ved øket viskositet av dyrkningsmediet og synlig celleavfall. 4-6 timer etter temperaturforandringen var viskositeten sterkt redusert og kulturen var lett å pumpe gjennom et ultrafiltreringsapparat for å fjerne alt avfall og alle gjenværende ikke-lysede celler. Den økede viskositet viser frigjøring av DNA og RNA med høy molekylvekt i mediet; virkning av endogene nukleaser fører til slutt til en observerbar reduksjon av viskositeten.

Den foregående beskrivelse og eksemplene viser at frem-gangsmåtene og stoffblandingene ifølge oppfinnelsen er anvendelige for å fremstille og eksternalisere produkter i bakterier.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et genprodukt, karakterisert ved å (i) dyrke en temperatursensitiv bakterie, hvilken bakterie: a) uttrykker genproduktet intracellulært, b) er en lysogen bakterie med defekte eksisjons- og replikasjons-funksjoner, og c) inneholder en profag DNA-sekvens, hvilken profag DNA-sekvens omfatter et temperatur-sensitivt lambda cl-fagrepressor-gen samt funksjonelle lambda fag lysozym-kodende gener, under permissive betingelser slik at genproduktet blir uttrykt intracellulært og de lysozym-kodende gener undertrykkes, og derpå (ii) heve temperaturen for å danne restriktive betingelser slik at de lysozym-kodende gener blir uttrykt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav l, karakterisert ved at cl-genet er cI857-mutanten.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bakterien er en E^. coli lambda lysogen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3 , karakterisert ved at bakterien er coli-stamme UC5822 som er dannet ved å infisere stamme N99 f E. coli K12 galK lacZ su<0>thi) med fag X int6 red3 cl857 P80 og X hy5 cl imm 21 A b2.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at lambda profag DNA-sekvensen mangler genene som ligger mellom kartposisjon 58 og 71 og er mutert i 0- og P-genfunksjonene.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at lambda profag DNA-sekvensen er flankert av en utvelgbar markør som er et gen som koder for en påviselig egenskap og 0- og P-mutasjonene er punktmutasjoner.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at lambda profag DNA-sekvensen er flankert på oppstrøms side av det tn 10 tetracyklinresistente transposable element og 0- og P-genene er 029- og P3-genene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakteris, ert ved at bakterien er avledet fra Ei coli-stamme MGO som er konstruert ved å infisere stamme C600 ( E_^ coli Sull, K12, galK, lacZ, sull, thi) med fag X cl857, P3, 029.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at bakterien er stamme MG3 avledet fra N99 og med genotype N99 (XA 58-71, cl857, P3,

029) .

10. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at lambda profag DNA-sekvensen mangler gener som ligger mellom kartposisjon 3 og 71.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at lambda profag DNA-sekvensen er flankert av en utvelgbar markør som er et gen som koder for en påviselig egenskap og hvor 0- og P-mutasjonene er punktmutasjoner.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at lambda profag DNA-sekvens en er flankert på oppstrøms side av det tnlO tetracyklin-resistente transposable element og 0- og P-genene er 029- og P3-genene.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at bakterien er en E_j_ coli MG4 stamme avledet fra N99 og med genotype MG4 [N99 (XA 3-71, cl857, P3, 029) galK, locZ, thi, gal::tnlO tet<R>].

14. Fremgangsmåte ved fremstilling av en temperatursensitiv bakterie, karakterisert ved at den omfatter å transformere en bakterie med et DNA-fragment som omfatter (i) en utvelgbar markør som er et gen som koder for en påviselig egenskap; (ii) en lambda profag DNA-sekvens med et temperatur-sensitivt cl-repressorgen samt funksjonelle lysozym-kodende gener, slik at de lysozym-kodende gener blir undertrykt under permissive betingelser og uttrykt under restriktive betingelser, hvor profag DNA-sekvensen inn-befatter funksjonelle N-, £>-, S- og R-gener, er i hovedsak fri for gener som ligger mellom kartposisjonene 3 og 71, fortrinnsvis 58 og 71, og har mutasjoner i 0- og P-genene som resulterer i tap av 0- og P- genfunksjonene, og (iii) flankerende DNA-sekvenser som er homologe med en konti-nuerlig sekvens i kromosomet til en vertsbakterie for å tillate rekombinasjon mellom fragmentet og vertscelle-kromosomet.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at cl-genet er c!857-genet, 0- og P-mutantene er 029- og P3-mutanter og den utvelgbare markør er det tnlO tetracyklin-resistente transposable element.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at bakterien er E_j_ coli.