PL228023B1 - Sposób jednoczesnej prezentacji komórkowej i bakteriofagowej oparty o nitkowate bakteriofagi z Neisseria gonorrhoeae - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób prezentacji peptydów i/lub białek na powierzchni komórek bakteryjnych i równocześnie na powierzchni cząstek fagów i/lub ich pochodnych fagmidowych, w którym nie wykonuje się fuzji sekwencji kodującej peptydu i/lub białka, które mają być prezentowane z sekwencją kodującą białko strukturalne, kodowaną przez genom faga, i w którym to sposobie do komórki bakteryjnej wprowadza się sekwencję kodującą peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane oraz funkcjonalną sekwencję faga NgoΦ6 i/lub NgoΦ7, a następnie hoduje się wymienione komórki bakteryjne w warunkach umożliwiających ekspresję sekwencji kodującej peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane oraz ekspresję genów z funkcjonalnej sekwencji faga NgoΦ6 i/lub NgoΦ7, przy czym peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane obejmuje sekwencję niekodowanego przez faga strukturalnego białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych, w szczególności sekwencję białka lub białek błon zewnętrznych bakterii Gram ujemnych.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu prezentacji peptydów i/lub białek na powierzchni komórek bakteryjnych i/lub cząstek fagów i/lub ich pochodnych fagmidowych oraz zastosowania fagów Ngoφ6 i/lub Νοοφ7 i/lub ich pochodnych fagmidowych w tym sposobie.

STAN TECHNIKI

Poznanie biologii bakteriofagów nitkowatych doprowadziło do powstania metody prezentacji określonych peptydów i białek innych organizmów, jako fuzji z białkami strukturalnymi bakteriofagów nitkowatych i dzięki odpowiedniemu doborowi miejsca fuzji w białku strukturalnym („nośniku”), prezentacji tych obcych („pasażerów”) na powierzchni cząstki fagowej. W języku angielskim metoda ta jest określona terminem „phage-display”. Najczęściej wykorzystywanym w tej metodzie fagiem jest fag M13 Escherichia coli (1,2, 3, 4). Przy wykorzystaniu tego faga obce peptydy czy białka są najczęściej dołączane do N-końca wszystkich białek strukturalnych oraz końca C białka pVI. Najczęściej jednak fuzje są tworzone przy wykorzystaniu białek pIll i pVIII, stanowiących odpowiednio mniejsze i główne białko kapsydu. Czynnikiem limitującym stworzenie fuzji jest wielkość obcego białka prezentowanego na każdej cząsteczce białka strukturalnego, co wpływa na możliwość efektywnego tworzenia funkcjonalnego kapsydu oraz na uwalnianie hybrydowych cząstek fagowych i ich zdolności do infekcji komórek bakteryjnych. Sposobem zmniejszającym te problemy jest jednoczesna koinfekcja hybrydowym fagiem lub fagmidem oraz fagiem pomocniczym, co powoduje, że nie wszystkie cząsteczki białka strukturalnego są białkami hybrydowymi. Inną modyfikacją tej metody jest namnażanie faga lub fagmidu hybrydowego w komórce bakteryjnej wraz z jednoczesną kontrolowaną ekspresją dzikiej formy genu kodującego wyjściową formę fagowego białka strukturalnego.

Metodą analogiczną jest metoda prezentacji fuzyjnych białek na powierzchni komórki bakteryjnej (ang. „cell-display”) (5, 6, 7). W metodzie tej tworzone są białka fuzyjne, w których nośnikiem są białka normalnie występujące na powierzchni komórki bakteryjnej. Zależnie od struktury białka „nośnikowego” występującego w błonie zewnętrznej komórki, fuzja tworzona jest na końcu C lub N tego białka lub w jego środku („metoda kanapkowa”). Na wydajność prezentacji wpływa charakter białka nośnikowego, pasażera i komórki gospodarza. Technika ta, podobnie jak „phage-display”, może mieć liczne zastosowania w biotechnologii i przemyśle, w tym w opracowywaniu i wytwarzaniu żywych szczepionek, badaniach bibliotek peptydowych, katalizie z wykorzystaniem całych komórek, tworzeniu czujników biologicznych i bioadsorpcji (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14). Znane w stanie techniki rozwiązania mają jednak pewne ograniczenia, na przykład bardzo istotną sprawą jest posiadanie przez białko, które będzie służyć do dołączania „pasażera”, wydajnej sekwencji sygnałowej lub sygnału transportowego pozwalającego na przechodzenie przez błonę wewnętrzną oraz odpornego na działanie proteaz.

Wszystkie do tej pory badane szczepy Neisseria gonorrhoeae posiadają w swoim genomie sekwencje DNA kodujące genom czterech fagów nitkowatych, z których dwa: Ngoφ6 i Ngoφ7 kodują pełnocenny genom fagowy zdolny do wytworzenia funkcjonalnych, infekcyjnych cząstek fagowych (15, 16, 17). Bakteriofagi te należą do grupy Inoviridae, których przedstawiciele infekują głównie bakterie Gram ujemne (18). Kapsyd tych fagów ma strukturę helikalną o długości od 700 nm do 3000 nm i jest zbudowany z głównych białek strukturalnych o wielkości od 5,0 kDa do 8 kDa oraz kilku białek pomocniczych o różnej wielkości.

Bakteriofagi Ngoφ6 i Ngoφ7 są kodowane odpowiednio przez 8,2 kb i 7,6 kb fragmenty chr omosomalnego DNA i kodują odpowiednio 13 i 12 hipotetycznych ORF. Dotychczasowe dane eksp erymentalne wskazują, że u bakteriofaga Ngo φ6 białka ORF4, ORF5, ORF6 i ORF7 o ciężarze 8,5 kDa, 10,5 kDa, 12,5 kDa i 57,0 kDa kodowane przez odpowiednie geny stanowią białka strukt uralne. Oba bakteriofagi mogą być też wbudowane do cząsteczek plazmidowego DNA tworząc stru ktury fagmidowe.

Fagmidy takie w formie czystego DNA mogą być wprowadzone na drodze transformacji do obcych gatunkowo bakterii lub, po wytworzeniu potomnych cząstek fagowych, na drodze infekcji do szerokiej grupy bakterii Gram ujemnych. Fagmidy zawierające sekwencje plazmidowego DNA zdolnego do replikacji w określonych komórkach bakteryjnych wprowadzone na drodze transformacji w nowym gospodarzu pozostają w formie plazmidowej, a wprowadzone na drodze infekcji wbudowują swój genom do chromosomu gospodarza. W obu przypadkach wprowadzone cząsteczki fagmidowe ulegają replikacji, co prowadzi do wytworzenia potomnych cząstek fagmidowych.

PL 228 023 B1

Twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że fagi nitkowate Ngou6 i Ngou7. których genom jest zintegrowany w chromosomie bakteryjnym, mogą tworzyć kapsyd z białek gospodarza. Tak wykorzystywane białka należą do grupy białek występujących w błonie zewnętrznej komórki bakteryjnej. Było to nieoczekiwane, ponieważ we wszystkich do tej pory opisanych strukturach kapsydu bakteriofagów, podstawowe białka strukturalne są kodowane przez geny fagowe. Jak stwierdzili Twórcy, białka komórkowe tworzą również kapsyd fagmidów skonstruowanych na podstawie wspomnianych fagów nitkowatych. Twórcy stwierdzili również, że specyficzność komórkowych białek wyk orzystanych w budowie kapsydu badanych fagów i fagmidów zależy od gatunku bakterii gospodarza, w którym fag jest namnażany lub fagmid jest replikowany i montowane są potomne cząstki. Użycie komórkowych białek do wytworzenia kapsydu fagów lub fagmidów pozwala, po wytworzeniu białek fuzyjnych pomiędzy komórkowymi białkami strukturalnymi kapsydu i heterologicznymi „pasażerami”, na ich jednoczesną prezentację na powierzchni komórki jak i na cząstkach wirionu.

Ponieważ fagmidy oparte o nitkowate fagi Neisseria gonorrhoeae mogą się replikować i uwalniać potomstwo w wielu gatunkach bakterii Gram ujemnych, możliwe staje się ich znacznie szersze wykorzystanie dla celów praktycznych. Jak wspomniano wyżej, w technice „cell-display” bardzo istotną sprawą jest posiadanie przez białko, które będzie służyć do dołączania „pasażera”, wydajnej sekwencji sygnałowej lub sygnału transportowego pozwalającego na przechodzenie przez błonę wewnętrzną oraz odpornego na działanie proteaz. W rozwiązaniu według niniejszego wynalazku nie ma potrzeby samodzielnego dobierania białka pod kątem pożądanych cech, gdyż białko wykorzystane przez faga do budowy kapsydu w sposób naturalny musi posiadać niezbędne właściwości. Białka te mają jednocześnie bardzo silne właściwości zakotwiczenia się w błonie zewnętrznej.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Stwierdzono więc, że głównymi białkami strukturalnymi cząstek fagów Ngoφ6 i Ngoφ7 oraz ich pochodnych fagmidowych zawierających dowolną cząsteczkę plazmidowego DNA są białka kodowane przez ostatniego gospodarza bakteryjnego, w którym były namnażane fagi lub fagmidy (Przykład 1, Fig. 1, Fig. 2 i Fig. 3), (Tabela 2). To znaczy przykładowo, że u fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych namnożonych w bakteriach Neisseria gonorrhoeae głównymi białkami strukturalnymi są białka kodowane przez genom Neisseria gonorrhoeae, a u fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych namnożonych w Salmonella głównymi białkami strukturalnymi są białka kodowane przez genom Salmonella sp., podczas gdy u tych samych fagów i pochodnych fagmidowych namnożonych w Haemophilus influenzae głównymi białkami strukturalnymi są białka kodowane przez Haemophilus influenzae. W większości przypadków główne białka strukturalne takich cząstek fagowych lub fagmidowych, które kodowane są przez genom bakteryjny, mają wielkość od 25,0 kDa do 55 kDa.

Natomiast białka strukturalne kodowane przez genom fagów i ich pochodnych fagmidowyc h stanowią mniejsze białka strukturalne cząstek fagowych lub fagmidowych.

Główne białka strukturalne fagów i/lub ich pochodnych fagmidowych są białkami występującymi w błonie zewnętrznej bakterii, w której w ostatnim cyklu infekcyjnym namnażały się te fagi lub ich pochodne fagmidowe. Białkami tymi mogą być przykładowo białka błon zewnętrznych (ang. „outer-membrane proteins), w szczególności poryny i/lub tzw. białka Opa (ang. „opacity proteins”) i/lub beta-laktamazy.

Białka gospodarza stanowiące białka strukturalne fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych określone zostają dalej terminem „niekodowane przez faga strukturalne białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych” (ang. „non phage coded structural proteins of phage particles”).

Specyficzność białek komórkowych stanowiących główne białka strukturalne kapsydu faga lub pochodnej fagmidowej określono z pomocą spektroskopii masowej i użyciu odpowiednich programów komputerowych po ich namnożeniu i oczyszczeniu.

Twórcy stwierdzili również, że enzymatyczne białka kodowane przez komórkę bakteryjnego gospodarza, pełniące funkcję białek strukturalnych fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych, zachowują aktywność enzymatyczną występując w strukturze cząstki fagowej lub fagmidowej, co wskazuje na zachowanie odpowiedniego fałdowania i stabilność tak prezentowanych białek.

Wynalazek dotyczy sposobu jednoczesnego prezentowania peptydów i/lub białek na p owierzchni komórek bakteryjnych oraz na powierzchni cząstek fagów i/lub ich pochodnych fagmidowych.

PL 228 023 B1

Prezentowaniu mogą ulegać:

a) natywne białka komórki, w której namnażane są fagi i/lub fagmidy, wbudowujące się do błon zewnętrznych komórki i struktury wirionu,

b) białka obcego gatunku w stosunku do komórki, w której namnaża się fag i/lub fagmid, wbudowujące się do błon zewnętrznych komórki i struktury wirionu. Gen(y) kontrolujący syntezę takiego obco gatunkowego białka w formie plazmidu, cząsteczki stanowiącej fragment chromosomalnego DNA lub faga (np. faga lambda) jest wprowadzany do komórki bakteryjnej, w której jest funkcjonalna sekwencja DNA faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7, na przykład na drodze transformacji lub infekcji fagowej.

c) białka fuzyjne będące fuzją natywnego białka komórki, w której namnaża się fag lub fagmid lub obcego gatunkowo białka włączanego do błon zewnętrznych komórki i struktury wirionu oraz innego białka i/lub peptydu. Sekwencja kodująca fuzyjne białko jest wprowadzana do komórki bakteryjnej, w której jest funkcjonalna sekwencja faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7, na przykład na drodze transformacji lub infekcji fagowej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc sposób prezentacji peptydów i/lub białek na powierzchni komórek bakteryjnych i równocześnie na powierzchni cząstek fagów i/lub ich pochodnych fagmidowych, w którym to sposobie nie wykonuje się fuzji sekwencji kodującej peptydu i/lub białka, które mają być prezentowane, z sekwencją kodującą białko strukturalne kodowaną przez genom faga, i w którym to sposobie:

- do komórki bakteryjnej wprowadza się sekwencję kodującą peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane, oraz funkcjonalną sekwencję faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7,

- a następnie hoduje się wymienione komórki bakteryjne w warunkach umożliwiających ekspresję sekwencji kodującej peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane, oraz ekspresję genów z funkcjonalnej sekwencji faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7,

- przy czym peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane obejmuje sekwencję niekodowanego przez faga strukturalnego białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagm idowych, w szczególności sekwencję białka lub białek błon zewnętrznych bakterii Gram ujemnych.

Przez funkcjonalną sekwencję genomu faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 należy rozumieć sekwencję nukleotydową kodującą faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 umożliwiającą wyłączenie się genomu faga ze stanu integracji w chromosomie gospodarza, powstanie wewnątrz komórki potomnych cząstek fagowych i opuszczenie przez nie komórki, wprowadzenie genomu faga do kolejnych wrażliwych komórek i albo zintegrowanie się z chromosomem gospodarza albo rozpoczęcie bez integracji kolejnego cyklu namnażania się faga. Funkcjonalną sekwencją genomu faga Ngo φ6 i/lub Ngoφ7 są przykładowo fragmenty chromosomalnego DNA przedstawione w GenBank ACC No AE004969 (koordynata 1080185-1088060 dla Ngoφ6 i 1215967-1222383 dla Ngoφ7) lub ich pochodne zapewniające namnożenie się faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 i wytworzenie potomnych cząstek fagowych w komórce gospodarza.

W niniejszym opisie, odniesienia do sekwencji kodującej peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane, obejmują zarówno jedną taką sekwencję kodującą jeden i/lub więcej peptydów i/lub białek, które mają być prezentowane, jak i więcej niż jedną sekwencję kodującą jeden i/lub więcej pept ydów i/lub białek.

Korzystnie, niekodowanym przez faga strukturalnym białkiem cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych jest białko błon zewnętrznych (ang. „outer-membrane proteins) bakterii Gram ujemnych, w szczególności poryna i/lub tzw. białko Opa (ang. „opacity protein) i/lub beta-laktamaza. Może być to białko kodowane przez genom gospodarza lub białko innego gatunku bakterii, którego sekwencję wprowadzono do komórki gospodarza.

Korzystnie, sekwencja faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 wprowadzana jest w postaci cząstek fagowych lub fagmidowych.

Korzystnie, wprowadzana do komórki bakteryjnej sekwencja kodująca peptydy i/lub białka, które mają być prezentowane, występuje w sekwencji chromosomu, plazmidu lub obcego faga (na przykład faga lambda), może ona występować również na przykład w sekwencji fagmidu obejmującego sekwencję faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7.

Przez hodowlę w warunkach umożliwiających ekspresję, rozumie się warunki hodowli, w których komórka bakteryjna gospodarz, wyrażająca prezentowany peptyd i/lub białko oraz białka fagowe, może przeżyć i w których następuje w niej ekspresja sekwencji kodujących białka i/lub peptydy.

PL 228 023 B1

Komórką bakteryjną może być dowolna komórka, w której możliwe jest namnażanie fagów Ngou6 i/lub Ngou7 i/lub ich pochodnych fagmidowych, korzystnie komórka bakterii Gram ujemnej, korzystniej Neisseria gonorrhoeae, Salmonella sp., Haemophilus influenzae.

Pochodna fagmidowa jest w niniejszym opisie definiowana jako cząsteczka DNA zawierająca nienaruszony genom faga zintegrowany z dowolną cząsteczką plazmidowego DNA. Zintegrowany genom faga w fagmidzie może zawierać oprócz sekwencji DNA genomu faga fragmenty sekwencji DNA chromosomu Neisseria gonorrhoeae występujące na lewej i prawej flance od miejsca integracji w chromosomie bakterii.

W niniejszym opisie, termin „niekodowane przez faga strukturalne białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych” oznacza więc białka występujące w cząstkach fagowych i/lub fagmidowych, które nie są kodowane przez genom danego faga, ale przez genom komórki gospodarza, w której dany fag i/lub fagmid namnaża się lub też przez inne sekwencje kodujące białka innych gatunków bakterii, wprowadzone do komórki gospodarza, na przykład na plazmidzie lub z pomocą innego faga i/lub fagmidu. Będą to w szczególności białka błon zewnętrznych (ang. „outer-membrane proteins), w szczególności poryny i/lub tzw. białka Opa (ang. „opacity proteins) i/lub beta-laktamazy.

Twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że w bakteriach, w których namnażane są fagi Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodne fagmidowe, wraz z jednoczesną ekspresją genu występującego przykładowo w sekwencji chromosomu, samego fagmidu i/lub innego plazmidu, który to gen koduje obce, pochodzące z innej bakterii białko, które może stanowić „niekodowane przez faga strukturalne białko cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych”, powstają hybrydowe cząstki fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych, zawierające w cząsteczce faga lub fagmidu zarówno białko kodowane przez komórkę gospodarza jak i wymienione obce białko kodowane przez genom innej gatunkowo bakterii.

Przykładowo, ale nie wyłącznie, fagi Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodne fagmidowe namnażane w Salmonella, w których następuje jednocześnie ekspresja genu kodującego „niekodowane przez faga strukturalne białko cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych”, z Neisseria, wytwarzają potomne fagi lub fagmidy, w których w strukturze kapsydu występuje zarówno białko Salmonella jak i wyrażane w tych komórkach białko Neisseria. Takie kombinacje mogą być tworzone dla genów różnych bakterii, jak przedstawiono w nieograniczających przykładach poniżej. Schemat powstawania takich fagów lub pochodnych fagmidowych przedstawiony jest na Fig. 4.

W świetle niniejszego opisu, specjalista w dziedzinie będzie w stanie dobrać doświadczalnie, bez nadmiernego eksperymentowania, również inne białka mogące stanowić „niekodowane przez faga strukturalne białko cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych”. Taka analiza może pol egać na przykład na wprowadzaniu do komórki bakterii Gram ujemnej sekwencji faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 oraz na analizie białek kapsydu uzyskiwanych fagów sposobami znanymi w dziedzinie, jak na przykład z pomocą spektroskopii masowej. Doświadczenie takie będzie dla specjalisty w dziedzinie rutynowe w świetle niniejszego opisu. Białka takie również można stosować w spos obie według wynalazku.

Rozwiązanie według wynalazku, nie wymaga więc wykonywania fuzji sekwencji kodującej peptyd i/lub białko, które mają być prezentowane, z genami strukturalnymi faga. Taki peptyd i/lub białko mogą być wprowadzone do komórki jako osobne sekwencje w chromosomie, plazmidzie lub innym fagu (np. fagu lambda) lub fagmidzie, w tym również w fagmidzie obejmującym sekwencję faga Ngoφ6 i/lub Ngoφ7.

Jak stwierdzili Twórcy, w komórkach bakteryjnych, w których dochodzi do namnażania się fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych, powstające w wyniku ekspresji genu wprowadzone obce gatunkowo białko ulega prezentacji zarówno na powierzchni cząstki fagowej lub fagm idowej jak i na powierzchni komórki bakteryjnej (Fig. 4B). W sposobie według wynalazku można więc uzyskać prezentację peptydu i/lub białka równocześnie na powierzchni komórki bakteryjnej („cell-display”), jak i cząstek fagowych („phage-display”).

Ponadto, z „niekodowanymi przez faga strukturalnymi białkami cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych” dowolnego gospodarza wbudowywanymi do struktur fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych oraz błon zewnętrznych komórki bakteryjnej, w której następuje namnożenie się fagów Ngoφ6 i/lub Ngoφ7 lub ich pochodnych fagmidowych, a kodowanymi przez dowolny replikon; plazmid, chromosom, fag, można tworzyć fuzje poprzez dołączenie do N-końca, C-końca lub w obrębie cząsteczki białkowej obcych peptydów i/lub białek będących „pasażerami”. „Niekodowane przez faga strukturalne białko cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych” stanowi

PL 228 023 B1 w takim układzie „nośnik” dla peptydu i/lub białka „pasażera”. Takie fuzyjne białka będą wbudowywane zarówno do struktur kapsydu fagów Ngoφ6 i/lub Ngou7 lub ich pochodnych fagmidowych oraz błon zewnętrznych komórki bakteryjnej (Fig. 4C).

W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, sekwencja peptydu i/lub białka, które mają być prezentowane obejmuje ponadto sekwencję innego peptydu i/lub białka, którego prezentacja jest pożądana, w postaci fuzji z sekwencją niekodowanego przez faga strukturalnego białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych.

Powstające fagi lub ich pochodne fagmidowe oraz komórki, zawierające białka fuzyjne odpowiednio w strukturze kapsydu fagów Ngoφ6 i/lub Ngou7 lub ich pochodnych fagmidowych oraz w błonie zewnętrznej komórki, mogą być wykorzystane we wszystkich zastosowaniach wykorzystywanych w technikach „phage-display” i „cell-display”. Zaletą rozwiązania według korzystnego przykładu wykonania wynalazku jest stosowanie wyselekcjonowanych naturalnie białek, które mogą efektywnie pokazywać peptyd „pasażera”.

Rozwiązanie według wynalazku nadaje się do stosowania w różnych gatunkach bakterii Gram ujemnych. Dodatkową zaletą jest łatwość oczyszczania tak prezentowanych białek. W rozwiązaniu według wynalazku możliwe jest wykorzystywanie do przenoszenia peptydu „pasażera” heterologicznych białek z innych gatunków bakterii. Dodatkowo rozwiązanie zapewnia możliwość jednoczesnego przenoszenia dwóch lub większej liczby „pasażerów” po jednym z każdym białkiem komórkowym tworzącym kapsyd fagmidu.

KRÓTKI OPIS FIGUR

Fig. 1 przedstawia wynik analizy białek fagów Ngoφ6 i Ngoφ7 otrzymanych z hodowli komórek Neisseria gonorrhoeae FA1090, rozdzielonych w gradientowym żelu 16% SDS-PAGE. Widoczne są przewidziane na podstawie struktury genetycznej genomu fagów nitkowatych Ngoφ6 i Ngoφ7 strukturalne białka o wielkości 10 kDa, 12,5 kDa, 17,5 kDa (fragment fuzyjny utworzony z białek o ciężarze 8,0 kDa i 10kDa) i dwa białka o nieznanym pochodzeniu o wielkości 28,0 kDa i 34,0 kDa. Tor 1 - standard białek o wielkości molekularnej odpowiednio 10, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 90 i 120 kDa; Tor 2: 2 pl; Tor 3: 5 pl; Tor 4: 10 pl zawiesiny fagowej, odpowiednio.

Fig. 2 przedstawia analizę białek strukturalnych cząstek fagmidu Ngoφ6 namnożonego w komórkach E. coli DH5a, rozdzielonych w gradientowym żelu 16% SDS-PAGE. Widoczne są przewidziane na podstawie struktury genetycznej genomu faga nitkowatego Ngoφ6, strukturalne białka o wielkości 10 kDa, 12,5 kDa, 17,5 kDa i trzy białka o nieznanym pochodzeniu o wielkości molekularnej 27,0 kDa, 35,0 kDa i 37,0 kDa. Tor M: standard białek o wielkości molekularnej odpowiednio 10, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 90 i 120 kDa; Tor 1: 2 pl białek zawiesiny fagmidu.

Fig. 3 przedstawia analizę białek strukturalnych cząstek fagmidu Ngoφ6 namnożonego w komórkach S. enterica, rozdzielonych w gradientowym żelu 16% SDS-PAGE. Dominującymi białkami są nieznane białka o wielkości molekularnej 50,0 kDa i 52,5 kDa. Przewidziane na podstawie struktury genetycznej genomu faga nitkowatego Ngoφ6 strukturalne białka o wielkości 10 kDa, 12,5 kDa, 17,5 kDa widoczne są dopiero przy dużym stężeniu analizowanych białek. Tor M: standard białek o wielkości molekularnej odpowiednio 10, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 90 i 120 kDa; Tor 1: 1 pl; Tor 2: 2 pl; Tor 3: 3 pl; Tor 4: 4 pl; Tor 5: 10 pl i Tor 6: 15 pl zawiesiny fagmidu, odpowiednio.

Fig. 4 przedstawia schemat ilustrujący system jednoczesnej prezentacji fagowej i komórkowej według wynalazku.

A. W komórkach E. coli zawierających fagmid pBL06fm powstają cząstki fagmidowe, których głównym białkiem strukturalnym jest białko poryny kodowane przez gen chromosomalny. To samo białko jest również lokalizowane w komórkowej błonie zewnętrznej.

B. W komórkach E. coli zawierających oprócz fagmidu pBL06fm dowolny plazmid kodujący gen z Neisseria gonorrhoeae odpowiedzialny za syntezę białka poryny powstają dwa typy białka poryny: białko E. coli kodowane przez gen zlokalizowany w chromosomie, białko poryny Neisseria gonorrhoeae kodowane przez gen znajdujący się w plazmidzie. Obydwa białka są lokalizowane w błonie zewnętrznej komórki i obydwa białka są wykorzystane, jako główne białko strukturalne w wyniku czego powstają „mozaikowe” cząstki fagmidowe.

C. W komórkach E. coli zawierających fagmid pBLφ6fm oraz plazmid zawierający gen kodujący rekombinowaną porynę Neisseria gonorrhoeae będącą fuzją białka poryny z dołączonym do końca C-, N- lub w środku białka peptydem pochodzącym z innego białka, w błonę zewnętrzną komórki zostają wbudowane zarówno białko poryny kodowane przez gen chromosomalny jak i rekombinowane białko poryny. Obydwa białka tworzą też „mozaikowy” kapsyd cząstki fagmidu.

PL 228 023 Β1

PRZYKŁADY

Materiały i Metody

W poniższych przykładach, o ile nie zaznaczono inaczej, stosowano standardowe metody biologii molekularnej i wirusologii, w szczególności według Sambrook J, Russell DW, red. 2001. Molecular cloning, a laboratory manuał, wydanie 3-cie. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

Szczepy bakterie, plazmidy i fagi. Szczep Escherichia coli DH5a, F-cp80lacZAM15A(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK- mK+) phoA supE44 λ-thi-l gyrA96 relA1 był hodowany w podłożu Lurii-Bertaniego (LB) w 37°C. Antybiotyki (ampicylinę i tetracyklinę) stosowano w stężeniu końcowym 50 rig/ml i 10 μο^Ι. Szczep Salmonella enterica sv. Typhimurium x3987 otrzymany od dr Roy Curtiss III hodowano na podłożu LB w obecności kwasu diaminopimelinowego (DAP) (100 pi.g/ml stężenie końcowe. Szczep Neisseria gonorrhoeae FA1090 otrzymany od dr W. Shafera z Emory University, Atlanta, GA był hodowany na podłożu GCK (Difco) w obecności czynnika wzrostu (Kellog) w obecności 0.042% NaHCO₃ lub w inkubatorze w 37°C w obecności 5% CO₂. Bakterie Heamophilus influenzae hodowano w podłożu BHI (Brain Heart Infusion) w obecności dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD) i heminy w stężeniu 2 |_ig ml¹ (sBHI). Plazmid pBluescript KS(+) został otrzymany z MBI Fermentas. Konstrukcja fagmidu ρΒί:φ6 i jego własności zostały opisane poprzednio (Piekarowicz A, Majchrzak M, Klyz A, Adamczyk-Poplawska M. 2006. Analysis of the filamentous bacteriophage genomes integrated into Neisseria gonorrhoeae FA1090 chromosome. Pol. J. Microbiol. 55:251-260. 10.1099/jmm.0.46386-0). Szczepy E. coli DH5a, Salmonella enterica ser. Typhimurium oraz Haemophilus influenzae zawierające fagmid ρΒίφδ otrzymane zostały poprzez wprowadzenie fagmidu ρΒίΝοοφδ na drodze transformacji. Plazmid pMPMT6omega otrzymany został od Dr C. Mayera.

Fagmid ρΒί::φ7 powstał w wyniku wstawienia do plazmidu pBLKSII+ fragmentu DNA chromosomu Neisseria gonorrhoeae FA1090 (koordynaty 12159-67-1222383) wraz z sąsiednimi sekwencjami DNA chromosomu, otrzymanego na drodze PCR w miejsce BamH\ plazmidu. Szczep E. coli DH5a (pBLNgo:^7) otrzymany został poprzez wprowadzenie fagmidu ρΒί::φ7 na drodze transformacji.

Sekwencje nukleotydowe fagów Νοοφδ oraz Ν0θφ7 są znane i dostępne w GenBank, w którym zostały zdeponowane pod nr AE004969 jak przedstawiono w poniższej Tabeli 1.

Tabela 1

Fag	Koordynaty sekwencji nukleotydoweja	Długość sekwencji DNA w parach zasad (bp)	Annotacje ORF (Acc. NO.AE004969)	Liczba ORF
Ngo4>6	1080185-1088060	8 235	NGO1137-NGO1146	13
Ngo<t>7	1215967-1222383	7 416	NGO1262-NGO1270	12

^a Koordynaty odnoszą się do sekwencji DNA zawartej w GenBank ACC No AE004969

Manipulacje DNA. DNA genomowy izolowano przy pomocy zestawu Genomie Mini DNA purification kit (ABA Biotechnologies). Plazmidowy DNA izolowano przy pomocy zestawu GeneJet Plasmid Miniprep kit (Fermentas), a produkty PCR oczyszczano przy pomocy zestawu GeneJet PCR purification kit (Fermentas) zgodnie z zaleceniami producenta. DNA fagowy i fagmidowy izolowano przy pomocy zestawu Qlprep Spin M13 kit (Qiagen). Wszystkie inne manipulacje genetyczne prowadzono zgodnie z opisami przedstawionymi przez Sambrook i Russel.

Konstrukcja plazmidu kodującego gen porB Neisseria gonorrhoeae. W celu sklonowania fragmentu DNA Neisseria gonorrhoeae niosącego gen porB fragment (NG01812) ze szczepu FA1090 (AE004969), przeprowadzono reakcje PCR z użyciem starterów PorFor i PorRev. Reakcje PCR prowadzono w 50 μΙ w mieszaninie zawierającej 300 nM starterów PorFor 5’ CTAGCCTCTAGAATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG 3’ (Seq Id No.: 1) oraz PorRev 5’ GATCCCGGGTTAGAATTTGTGGCGCAGAACGAC 3’ (Seq Id No.: 2), a otrzymany amplikon wklonowano w miejsca Xbal i Smal plazmidu pMPMT6omega, w którym ekspresja genu jest kontrolowana przez obecność L-arabinozy, otrzymując plazmid pMPMT6::porngo.

Transformacja. Kompetentne komórki E. coli i Salmonella otrzymywano zgodnie z metodami opisanymi przez Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia

PL 228 023 B1 coli with plasmids. Gene 96:23-28 i przechowywano w -80°C. W celu przeprowadzenia transformacji komórki były rozmrażane w lodzie, dodawano DNA i mieszaninę inkubowano przez 10 minut. Bakterie poddawano szokowi cieplnemu a następnie zawieszano w 2 ml podłoża LB i po 60 minut inkubacji w 37°C komórki wysiewano na odpowiednie podłoża LB zawierające antybiotyki.

Oczyszczanie cząstek fagowych i fagmidowych. Nocne hodowle bakterii rozcieńczano w stosunku 1:100 w 500 ml odpowiedniego podłoża i hodowano z wytrząsaniem w 37°C przez noc. Bakterie odwirowywano przez 20 min przy 7,000 rpm (rotor GSA) a następnie supernatant filtrowano przez filtry o średnicy 0.8 ąm. Przesącz mieszano z 1/5 objętości roztworu zawierającego 20% glikolu polietylenowego (PEG-8000) i 2,5 M NaCI i przetrzymywano w 4°C przez noc w celu precypitacji cząstek fagowych lub fagmidowych. Precypitat zawierający cząstki fagowe lub fagmidowe zbierano przez wirowanie przez 20 min przy 8,000 rpm (rotor GSA). Otrzymany precypitat zawieszano w 4 ml buforu (PBS) i traktowano roztworami DNazy I i RNazy A (25 ąg/ml) przez 3 h w 20°C. Zawiesinę cząstek fagowych lub fagmidowych oczyszczano przez dwukrotne wirowanie przy 4000 rpm przez 10 min a następnie przy 19 000 rpm przez 120 min w 40°C w rotorze SS34 i zawieszanie precypitatu w 1 ml 50 mM buforu Tris-HCI, pH 7.5.

Oznaczenie pochodzenia białek fagowych lub fagmidowych. Oczyszczone cząstki fagowe lub fagmidowe mieszano z buforem do rozdziału na żelach SDS-PAGE w stosunku 1:4, białka denaturowano przez ogrzanie w 95°C przez 5 minut i po schłodzeniu rozdzielano na komercyjnych gradient owych żelach 16% (BioRad) przy stałym natężeniu prądu 30 mA w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu rozdziału żele wybarwiano w roztworze Coomasie Briliant Blue przez noc i odbarwiano w roztworze metanol : woda : kwas octowy lodowaty (1:1:0.2). Po odbarwieniu żele fotografowano w aparacie GelDoc a następnie wycinano analizowane prążki białkowe, zamykano w probówkach eppendorfa i przekazywano do pracowni spektroskopii masowej w IBB Warszawa. Wszystkie operacje przeprowadzano w warunkach zabezpieczających przed zanieczyszczeniem analizowanego preparatu badanego białka obcymi, niespecyficznymi białkami.

P r z y k ł a d 1

Analiza składu białkowego cząstek fagów Ngo^6 i Ngo^7

Komórki Neisseria gonorrhoeae kodują dwa pełnocenne genomy fagów nitkowatych (Piekarowicz A. et al., 2006) zdolnych do wytwarzania potomnych cząstek fagowych. Analiza sekwencji DNA genomu tych fagów sugerowała, że w skład białek strukturalnych mogą wchodzić białka kodowane przez geny orf4, orf5, orf6 i orf7 obydwu fagów o podobnym dla obu fagów hipotetycznym ciężarze cząsteczkowym 8 kDa. 10 kDa, 12,5 kDa i 50 kDa (Piekarowicz A. et al., 2006, Piekarowicz A., Majchrzak M., Klyz A., Adamczyk-Poplawska M. 2006. Analysis of the filamentous bacteriophage genomes integrated into Neisseria gonorrhoeae FA1090 chromosome. Pol. J. Microbiol. 55:251-260. 10.1099/jmm.0.46386-0). Oznacza to, że w hodowli Neisseria gonorrhoeae powinna być mieszanina cząstek obu fagów a białka strukturalne posiadać podobny ciężar cząsteczkowy.

Wyniki przedstawione na Fig. 1 wskazują, że dominującymi wśród białek strukturalnych fagów uwolnionych z komórek hodowli Neisseria gonorrhoeae są białka o ciężarze cząsteczkowym 28,0 kDa i 34,0 kDa, a hipotetyczne białka strukturalne kodowane przez geny fagowe występują w znacznej mniejszości. Analiza przy użyciu spektroskopii masowej wykazała, że dominującymi białkami strukt uralnymi są białka pochodzenia komórkowego o ciężarze cząsteczkowym 35 i 25 kDa.

P r z y k ł a d 2

Analiza składu białkowego cząstek fagmidu Ngo^6 pochodzącego z różnych bakterii

Obecność w cząstkach fagowych, jako głównych białek strukturalnych, białek pochodzenia k omórkowego, stawia pytanie, jakie białka wchodzą w skład białek strukturalnych fagmidów pochodzących od fagów Ngoφ6 i Ngoφ7 namnożonych w innych bakteriach niż N. gonorrhoeae. Aby odpowiedzieć na to pytanie namnożone i oczyszczone zostały cząstki fagmidowe pBLNgoφ6 w komórkach E. coli, Salmonella i Haemophilus, a ich główne białka strukturalne analizowano w sposób analogiczny jak białka strukturalne faga Ngoφ6. Wyniki przestawione na Fig. 2 i 3 wskazują, że we wszystkich przypadkach dominującymi białkami strukturalnymi są białka pochodzenia komórkowego (Tabela 2), komórek, w których namnażał się fagmid. We wszystkich przypadkach były to białka lokalizujące się w normalnych komórkach w błonach zewnętrznych i należące do tej samej rodziny białek.

PL 228 023 Β1

Tabela 2

Przykłady identyfikacji białek o nieznanym pochodzeniu wchodzących w skład kapsydu faga Ngo<])6 izolowanego z Neisseria gonorrhoeae i cząstek fagmidowych namnożonych w różnych bakteriach wykonane techniką spektroskopii masowej. W podobny sposób zidentyfikowano białka po namnożeniu fagmidu w komórkach Salmonella

Białko faga	Ciężar cząsteczkowy	Identyfikacja	Przewidywany ciężar cząsteczkowy
Ngo<$>6 N. gonorrhoeae	35 000	gi170963340 Poryna B	35 516
	27 000	gi499253447 OMP opacity protein B	29 626
pBLNgo<t>6 E. coli	38 000	gl116668363 Osmoprotein C OmpC	38 284
	27 000	gl546975 TEM-2 beta laktamaza	29 031
pBLNgocp6H./7?f luenzae	40 000	gi 491963436 białko OMP	39 351
	38 000	gi23429714 outer membranę protein P2	38 048

Przykład 3

Powstawanie fagmidowych cząstek hybrydowych

Do komórek szczepu Salmonella enterica ser. Typhimurium nr.3987 (pBLNgo<|)6fm) wprowadzono na drodze transformacji plazmid pMPMT6::porngo. Po otrzymaniu transformantów opornych na tetracyklinę wybrano jeden klon, w którym metodą PCR potwierdzono obecność pBLNgo<|)6fm oraz rekombinowanego plazmidu pMPMT6::porngo. Z tego szczepu otrzymano i oczyszczono cząstki fagmidowe, a następnie rozdzielono na żelu SDS-PAGE białka strukturalne. W celu otrzymania cząstek fagmidowych całonocną hodowlę badanego szczepu Salmonella enterica ser. Typhimurium nr.3987 (pBLNgo<|)6fm) niosącego plazmid pMPMT6::porngo rozcieńczano w stosunku 1:100 i po uzyskaniu przez hodowlę wartości OD600 równej 0.6 dodawano roztworu L-arabinozy do końcowego stężenia 0,1%. Hodowlę kontynuowano przez noc w 37°C. Cząstki fagmidowe oczyszczano następnie według procedury opisanej w części Materiały i metody. Otrzymane białka strukturalne analizowano na drodze spektroskopii masowej, jak w poprzednich przykładach. Analiza ta wykazała obecność zarówno białek poryny z Neisseria gonorrhoeae jak i Salmonella potwierdzając obecność mozaikowej struktury fagmidu.

Przykład 4

Analiza składu białkowego cząstek fagmidu Ngo::d)7 pochodzącego z E. coli

Fagmid Ngo:^7 namnożony został w szczepie E. coli DH5a i jego główne białka strukturalne analizowano w sposób analogiczny jak białka strukturalne faga Ngo<|)6. Uzyskany wynik wskazuje, że podobnie jak dla faga Ngo<|)6 dominującymi białkami są białka pochodzenia komórkowego.

Twórcy wykazali więc, że głównymi białkami strukturalnymi fagów Neisseria gonorrhoeae Ngo<|)6 i Ngo<|)7 są białka gospodarza należące do grupy białek błony zewnętrznej, dzięki czemu fagi te mogą znaleźć zastosowanie w nowym sposobie prezentacji białek i/lub peptydów na cząstkach fagowych i/lub fagmidowych („phage-display”) i/lub na powierzchni komórki („cell-display”). Możliwa jest również jednoczesna prezentacja dołączonych do niekodowanych przez faga strukturalnych białek cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych innych peptydów i/lub białek „pasażerów”, co znacznie rozszerza możliwości zastosowania technik „phage-display” i „cell-display”.

PL 228 023 B1

Literatura

1. Smith GP. 1985. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228: 1315-1317.

2. Lindquist BH. 2006. Phage in Display. ln:The Bacteriophages. Ed. R.Calendar Oxford, pp.687-694.

3. Qi, H., Lu, H., Qiu, H., Petrenko V., Liu, A. 2012. Phagemid Vectors for phage display: Properties, Characteristics and Construction. J.Mol.Biol. 417, 129-143.

4. Qi H, Lu H, Qiu HJ, Petrenko V, Liu A. 2013. Phagemid vectors for phage display:properties, characteristics and construction. PLoS Pathog. 9(8).

5. Rutherford N., Mourez M. 2006. Surface display of proteins by Gram-negative bacterial autotransporters. Microbial Cell Factories. 5, 22.

6. Bloois E., Winter, R.T., Kolmar H., Fraaije W. 2011. Decorating microbes: surface: display of proteins on Escherichia coli. Cell, 29, 79.

7. Rajaram K., Vermeeren V., Somers K., Somers V., Michiels L. 2014. Construction of helper plasmid-mediated dual phage for autoantibody screening in serum. Appl. Microbiol. Biotechnology, 98, 6365-6373.

8. Benhar, I. 2001. Biotechnological applications of phage and cell display. Biotechnology Adv. 19, 1-33.

9. Manoutcharian K, Gevorkian G, Cano A, Almagro JC. 2001. Phage displayed biomolecules as preventive and therapeutic agents. Curr. Pharm. Biotechnol. 2: 217-223.

10. Grabowska AM, Jennings R, Laing P, Darsley M, Jameson CL, Swift L, Irving WL. 2000. Immunisation with phage displaying peptides representing single epitopes of the glycoprotein G can give rise to partial protective immunity to HSV-2. Virology. 269 :47-53.

11. De Berardinis P, Haigwood NL. 2004. New recombinant vaccines based on the use of prokaryotic antigen-display systems. Expert. Rev. Vaccines. X:673-9.

12. Schoen C, Loeffler Dl, Frentzen A, Pilgrim S, Goebel W, Stritzker J. 2008. Listeria monocytogenes as novel carrier sytem for the development of live vaccines. Int. J. Microbiol. 298: 45-58.

13. Ulivieri C, Citro A, Ivaldi F, Mascolo D, Ghittoni R, Fanigliulo D, Manca F, Baldari CT, Li Pira G, Del Pozzo G. 2008. Antigenic properties of HCMV peptides displayed by filamentous bacteriophages vs. synthetic peptides. Immunol. Lett. 119:62-70.

14. Samoylova Tl, Norris MG, Samoylov AM, Cochran AM, Wolfe KG, Petrenko VA, Cox NR. 2012. Infective and inactivated filamentous phage as cariers for immunogenic peptides. J. Virol. Meth. 183, 63-68.

15. Kawai M, Uchiyama I, Kobayashi I. 2005. Genome Comparison In Silico in Neisseria Suggests Integration of Filamentous Bacteriophages by their Own Transposase, DNA Res. 12, 389-401.

16. Piekarowicz A, Majchrzak M, Klyz, A, Adamczyk-Poplawska M. 2006. Analysis of the filamentous bacteriophage genomes integrated into Neisseria gonorrhoeae FA1090 chromosome. Pol. J. Microbiol. 55: 251-260.

17. Piekarowicz A, Klyz, A, Majchrzak M, Szczęsna E, Piechucki M, Kwiatek A, Maugel T K, Stein DC. 2014. Neisseria gonorrhoeae filamentous phage NgoPhi6 is capable of infecting a variety of Gram-negative bacteria. J. Virol. 88: 1002-1010.

18. Russel M, Model, P. Filamentous phage, 2006. In: The Bacteriophages. Ed. R. Calender Oxford pp. 146-161.

PL 228 023 Β1

Wykaz sekwencji <110> Uniwersytet Warszawski <120> Sposób jednoczesnej prezentacji komórkowej i bakteriofagowej oparty o nitkowate bakteriofagi Ngo<j>6 i Ngo(f>7 Neisseria gonorrhoeae <130 PK/3302/AGR <160 2 <170> Patentln version 3.5 <210 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> Starter PorFor <400 1 ctagcctcta gaatgaaaaa atccctgatt gccctg 36 <210 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220 <223> Starter PorRev <40 0 2 gatcccgggt tagaatttgt ggcgcagaac gac 33

Claims (6)

1. Sposób prezentacji peptydów i/lub białek na powierzchni komórek bakteryjnych i równocześnie na powierzchni cząstek fagów i/lub ich pochodnych fagmidowych, znamienny tym, że nie wykonuje się fuzji sekwencji kodującej peptydu i/lub białka, które mają być prezentowane, z sekwencją kodującą białko strukturalne kodowaną przez genom faga, i w którym to sposobie:

- do komórki bakteryjnej wprowadza się sekwencję kodującą peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane, oraz funkcjonalną sekwencję faga Ngo<|)6 i/lub Ngo<|)7,

- a następnie hoduje się wymienione komórki bakteryjne w warunkach umożliwiających ekspresję sekwencji kodującej peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane, oraz ekspresję genów z funkcjonalnej sekwencji faga Ngo<|)6 i/lub Ngo<|)7,

- przy czym peptyd i/lub białko, które ma być prezentowane obejmuje sekwencję niekodowanego przez faga strukturalnego białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych, w szczególności sekwencję białka lub białek błon zewnętrznych bakterii Gram ujemnych.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że niekodowanym przez faga strukturalnym białkiem cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych jest białko błon zewnętrznych (ang. „outer-membrane proteins) bakterii Gram ujemnych, w szczególności poryna i/lub tzw. białko Opa (ang. „opacity protein) i/lub beta-laktamaza.

3. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że funkcjonalna sekwencja faga Ngo<|)6 i/lub Ngo<|)7 wprowadzana jest w postaci cząstek fagowych lub fagmidowych lub na drodze transformacji.

4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że wprowadzana do komórki bakteryjnej sekwencja kodująca peptyd i/lub białko, które mają być prezentowane, występuje w sekwencji chromosomu, plazmidu, faga. lub fagmidu, w tym fagmidu obejmującego sekwencję faga Ngo<|)6 i/lub Ngo<|)7.

PL 228 023 Β1

5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że sekwencja peptydu i/lub białka, które mają być prezentowane obejmuje ponadto sekwencję kodującą inny peptyd i/lub białko, którego prezentacja jest pożądana, w postaci fuzji z sekwencją niekodowanego przez faga strukturalnego białka cząstek fagów lub ich pochodnych fagmidowych.

6. Zastosowanie fagów Ngo<|)6 i/lub Ngo<|)7 i/lub ich pochodnych fagmidowych w sposobie prezentacji peptydów i/lub białek na cząstkach faga i/lub na powierzchni komórki bakteryjnej, jak określony w dowolnym z zastrz. 1-5.