KR100313135B1 - 세포 표면 발현 모체로서의 대장균 유래 세포외막 단백질 ｃ(ｏ - Google Patents

세포 표면 발현 모체로서의 대장균 유래 세포외막 단백질 ｃ(ｏ Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물 세포 표면에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있도록 표면 발현 모체로서 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터와 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있도록 구성된 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 전기 발현벡터에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 발현벡터로 형질전환체를 제조하여 배양하고, 발현을 유도하여 세포 표면에 발현시키는 공정을 포함하는 외래 단백질의 세포 표면 발현방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포 표면 발현 모체인 대장균 유래 OmpC의 유전자 및 폴리-히스티딘 링커 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의하여 형질전환되어, 세포 표면에 폴리-히스티딘을 발현하는 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 중금속 제거제를 제공하는 것이다. 본 발명의 발현벡터를 이용하여 세포 표면에 외래 단백질을 발현시키면, 삽입되는 외래 유전자에 따라, 재래식 백신보다 지속적이고 강력하게 면역 반응을 나타낼 수 있는 재조합 생백신, 중금속 제거나 폐수 처리에 응용이 가능한 전세포 흡착제, 생물학적 전환에 이용되는 효소를 세포 표면에 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소 없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물전환 등의 목적에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

세포 표면 발현 모체로서의 대장균 유래 세포외막 단백질 Ｃ(ＯｍｐＣ)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터{Expression Vectors Comprising a Gene Encoding OmpC Derived from E.coli as Cell Surface Anchoring Motif}
본 발명은 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 세포 외막 단백질 C(OmpC: outer membrane protein C)를 세포 표면 발현 모체(cell surface anchoring motif)로 이용하여 외래 단백질이나 펩타이드를 세포 표면에 발현시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 표면 발현 모체인 대장균 유래 OmpC를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 미생물 및 그를 이용하여 외래 단백질을 미생물의 세포 표면에 효율적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.
지금까지 생물공학의 발전에 있어서 박테리아는 중요한 위치를 차지하고 있다. 특히, 왓슨과 크릭에 의해 DNA 이중 나선 구조가 밝혀진 이후, 미생물의 DNA 조작 기술을 이용하여 여러 유용 물질의 생산에 응용되어 왔다. 이 DNA 조작 기술은 미생물의 폭넓은 산업적 이용을 가능하게 하였고, 이에 따라 여러 유용 물질을보다 효율적으로 생산하기 위한 기술도 함께 발전하여 왔으며, 단순한 단백질 생산에서 시작된 생물공학 기술은 현재 썩는 플라스틱에서부터 중금속 제거, 황 제거, 폐수 처리 공정, 식품에까지 그 응용범위가 넓어지게 되었다.
이러한 생물공학 관련 기술의 괄목한 만한 성장을 토대로 최근 새롭게 등장한 기술 중에 하나가 분자 생물학의 기본 지식과 단백질의 분비 발현기술을 토대로 한 세포 표면 발현(cell surface display) 기술이다.
1980년대 중반 조지 스미스(George P. Smith)가 펩타이드나 작은 단백질을 필라멘터스 파아지(filamentous phage)의 pIII와 융합하여 발현시켜 이를 표면 발현 시스템(surface-expression system)이라고 언급한 후, 미생물의 분비 기작에 대한 연구가 활발히 진행되면서 원하는 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 세표 표면 발현이라는 새로운 분야가 등장했다. 세포 표면 발현은 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 기술로서 최근에 등장한 새로운 분야이다.
처음에는, 파아지의 표면이 박테리아보다 단순하기 때문에, 파아지 표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 먼저 진행되어 졌다. 그러나, 파아지를 이용하는 경우, 삽입되어 표면에 발현될 수 있는 외래 단백질의 길이가 매우 제한되고 응용범위에도 한계가 있어(참조: Georgiou, G.,et al, Nature Biotechnol.,15:29-34, 1997), 점차 박테리아를 이용한 세포 표면 발현에 많은 과학자들이 관심을 가지고 연구를 진행하고 있다.
한편, 그램 음성 박테리아의 경우, 세포내막, 주변 세포질, 세포외막으로 이루어진 매우 복잡하고 독특한 막구조를 가지고 있다. 이러한 막구조를 가지고 있는 대장균과 같은 박테리아에서 세포 표면 발현을 하기 위해서는, 우선 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 세포 표면까지 안정적이며 효율적으로 이동시킬 수 있는 표면 발현 모체의 사용이 필요하다. 박테리아의 표면 단백질을 이용하여 외래 단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는, 적당한 표면 단백질과 외래 단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합 단백질이 생합성되도록 하고, 이들이 안정하게 세포 내막을 통과하여 세포 표면에 부착하여 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 성질을 가지는 표면 단백질을 선정하여 표면발현의 모체로 사용해야 한다.
먼저, 외래 단백질을 세포 표면까지 보내기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 매우 효율적인 분비신호 서열을 가지고 있고, 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목표신호(targeting signal)를 갖추며, 동시에 큰 크기를 가지고 있는 외래 단백질도 전달이 가능하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있어야 한다. 지금까지 대장균에서 사용된 표면 발현 모체는 LamB, PhoE(참조: Agterberg, M.,et al., Gene88:37-45, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용하였다. 그러나, 이 경우 외래 단백질을 세포 표면에 돌출한 루프(loop)에 삽입시켜 성공적으로 표면에 발현시켰지만, 삽입할 수 있는 단백질의 크기가 구조적으로 제한되어 있다(참조: Georgiou, G.,et al, Nature Biotechnol.,15:29-34, 1997).
또한, 삽입된 외래 단백질의 C-말단(C-terminal)과 N-말단(N-terminal)이 입체적으로 가깝게 위치해야 하므로, 거리가 먼 경우에는 연결 펩타이드로 두 말단 사이를 가깝게 하여야 한다. 실제로 LamB나 PhoE의 경우 50 내지 60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 단백질을 삽입하면, 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못한다(참조: Stahl, S.,et al., Trends Biotechnol., 15:185-192, 1997).
선택되어진 표면 발현 모체에 우리가 발현하고자 하는 외래 단백질을 용합시켜 세포 표면에 발현시키고자 할 때, 지금까지 세포 표면 발현에 크게 세종류의 융합 방법이 사용되어 왔다: 첫째로, 표면 발현 모체의 C-말단에 발현하고자 하는 외래 단백질을 융합시키거나 C-말단 부분을 제거시키고 바로 외래 단백질을 융합(C-terminal deletion fusion)시키는 방법이다; 둘째, 반대로 표면 발현 모체의 N-말단에 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질을 융합시키는 방법이 있다. 이 경우에 해당하는 것은 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(참조: Gunneriusson, E.,et al., J. Bacteriol.,178:1341-1346, 1996), 스타필로코커스 오레우스의 피브로넥틴 결합 단백질 B(fibronectin binding protein B)(참조: Stasuss, A.,et al., Mol. Microbiol., 21:491-500, 1996), 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)의 피브릴라 M 단백질(fibrillar M protein)(참조: Pozzi, G.,et al., Infect. Immun., 60:1902-1907, 1992) 등으로서, 그램 양성세포의 경우에 해당되며 대장균과 같은 그램 음성균은 이런 시스템을 사용할 수 없다; 세 번째 방법은 샌드위치 융합(sandwich fusion) 방법으로, 이 방법은 세포 표면에 발현하고자 하는 외래 단백질을 표면 발현 모체로 사용되는 단백질 사이에융합시키는 방법이다. 대장균에서 PhoE(참조: Agterverg, M.,et al.,Gene,88:37-45, 1990), FimH(참조: Pallesen, L.,Microbiology,141:2839-2848, 1995), PapA(참조: Steidler, L.,et al., J. Bacteriol.,175:7639-7643, 1993) 등과 같은 여러 단백질들이 이 방법을 이용하여 표면에 발현시켰다. 그러나, 이와 같은 방법은 외래 유전자를 융합시키기가 어렵고 발현된 외래 단백질이 활성을 잃는 경우가 많으며, 삽입시킬 수 있는 외래 단백질의 크기가 약 60 내지 70 개의 아미노산으로 제한된다는 것이 큰 문제라 볼 수 있다(참조: Georgiou, G.,et al., Nature Biotechnol.,15:29-34, 1997; Stahl, S.,et al., Trends Biotechnol., 15:185-192, 1997).
박테리아의 분비 시스템을 응용한 세포 표면 발현의 생물공학적 응용범위는 매우 넓다. 세포 표면 발현의 응용범위는 세포 표면에 발현시키고자 하는 외래 단백질의 종류에 따라 결정된다. 우선, 병원성 유래 항원 에피토프(epitope)를 세포 표면에 발현시켜 박테리아 백신을 제조할 경우, 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 재래식 백신보다 훨씬 지속적이고 강력하게 면역 반응을 나타내어 환자에게 사용할 수 있다(참조: Nguyen, T. N.,et al., Gene, 128:89-94, 1993). 이와 같은 재조합 생백신 뿐만 아니라, 특정 Fab 혹은 scFv를 세포 표면에 발현시킬 경우 여러 펩타이드나 항체의 선별(screening)을 쉽고 간단하게 수행할 수 있다(참조: Francisco, J. A. R.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 91:10444-10448, 1993). 이 외에도, 특정 항원을 발현하는 박테리아를 동물에 투여하여 항체를 생산하거나(참조: Charbit, A.,et al., Gene, 70:181-189, 1988),세포 표면에 금속 흡착 단백질을 발현시켜 중금속 제거 및 폐수 처리에 응용하는 전세포 흡착제(참조: Sousa, C.,et al., J. Bacteriol., 180:2280-2284, 1998), 생물학적 전환에 이용되는 효소를 세포 표면에 안정적으로 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소 없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물 전환(참조: Richins, R.,et al., Nat. Biotechnol., 15:984-987, 1997) 등 그 응용 가치가 매우 높다고 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 미생물에서 세포 표면에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 새로운 표면 발현 모체로서, 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)를 선택하고, 이를 이용하여 외래 단백질이나 펩타이드를 세포 표면에 발현시킬 수 있는 여러 재조합 발현벡터를 작제하고, 이것으로 형질전환된 형질전환체에서 외래 단백질이 효율적으로 형질전환체의 세포 표면에 발현됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 아울러, 외래단백질로서 폴리-히스티딘 링커 펩타이드를 발현하도록 구성된 발현벡터에 의하여 형질전환된 미생물이 중금속을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명은 폴리-히스티딘 링커 펩타이드가 OmpC와 융합된 형태로 세포 표면에 발현하도록 구성된 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 중금속 제거제를 포함한다.
결국, 본 발명의 첫째 목적은 미생물 세포 표면에 외래 단백질을 효율적으로발현시킬 수 있도록 표면 발현 모체로서 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있도록 구성된 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 발현벡터에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 발현벡터로 형질전환체를 제조하여 배양하고, 발현을 유도하여 세포 표면에 발현시키는 공정을 포함하는 외래 단백질의 세포 표면 발현방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 세포 표면 발현 모체인 대장균 유래 OmpC의 유전자 및 폴리-히스티딘 링커 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의하여 형질전환되어, 세포 표면에 폴리-히스티딘을 발현하는 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 중금속 제거제를 제공하는 것이다.
도 1은 플라스미드 pTrcC의 유전자 지도이다.
도 2는 발현벡터 pTCdP의 유전자 지도이다.
도 3은 발현벡터 pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3, 및 pTCHP6의 유전자 지도와 각각의 발현벡터에 삽입된 폴리-히스티딘 링커의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 발현벡터 pTCHP(n)으로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 분획한 세포외막 단백질을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 5a는 발현벡터 pTCdP으로 형질전환된 재조합 대장균을 Ni-NTA-아가로오스 비드에 흡착시켜 촬영한 광하(왼쪽)와 형광하(오른쪽)의 공초점현미경 사진이다.
도 5b는 발현벡터 pTCHP6로 형질전환된 재조합 대장균을 Ni-NTA-아가로오스 비드에 흡착시켜 촬영한 광하(왼쪽)와 형광하(오른쪽)의 공초점현미경 사진이다.
도 6은 발현벡터 pTCHP(n)으로 형질전환된 재조합 대장균의 카드늄 흡착능을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 성공적인 세포 표면 발현을 위해서는 표면 발현 모체는 매우 효율적인 분비 신호 서열을 가지고 있고, 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목표신호(targeting signal)를 갖추며, 동시에 큰 크기를 가지고 있는 외래 단백질도 전달이 가능하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있어야 한다는 가정아래, 이와 같은 표면 발현 모체의 대상으로서 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)를 선택하였다. 대장균의 주 포린 단백질(major porin protein)인 세포외막 단백질 C의 경우, 21개의 분비신호 서열을 포함하여 367개 아미노산으로 구성되어 있으며, 세포외막 단백질 F(OmpF)와 더불어 배지내의 삼투압(osmolarity)에 반응하여 발현되는 단백질로서, 단위 세포당 약 105개의 분자가 발현될 만큼 많이 발현되는 세포외막 단백질이다(참조: Mizuno, T.,et al., J. Biol. Chem.,258:6932-6940, 1983).
살모넬라 티피(Salmonella typhi)에서 유래한 세포외막 단백질 C의 세포막 토폴로지(membrane topology)를 보면, 단백질의 N-말단과 C-말단이 주변세포질에 존재하며 8개의 루프(loop)가 세포외막 바깥쪽으로 나와 있으며, 7개의 루프가 주변세포질쪽으로 나와 있다(참조: Puente, J.,et al., Gene,156:1-9, 1995). 살모넬라 티피(Salmonella typhi)에서 유래한 세포외막 단백질 C의 경우, 세포 외막 바깥쪽으로 나와 있는 7개의 루프 중 4번째와 6번째 루프에 각각 로타바이러스(rotavirus) VP4 캡시드 단백질 에피토프(epitope) RV160(22개의 아미노산)와 RV252(28개의 아마노산)을 성공적으로 세포 외막에 발현시켰다(참조: Puente, J.,et al., Gene,156:1-9, 1995).
이에, 본 발명자들은 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C의 구조를 살모넬라 티피(Salmonella typhi)에서 유래한 세포외막 단백질 C의 구조와 비교하여 그 구조를 예측하고, 세포외막 바깥쪽으로 나와 있는 8개의 루프 중 가장 가능성이 클것으로 예상되는 7번째 루프에 외래 단백질을 삽입시키고자 하였다.
우선, 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C 유전자를 확보하기 위해서, 대장균 MC4100(F- araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150(strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR)의 염색체를 표적 DNA로 사용하여, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이렇게 증폭된 약 1100 bp 크기의 DNA 절편을 아가로즈 젤 전기영동하여 얻고, 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A(참조: Amann, E.,Gene,69:301-309, 1988)에 삽입하여, 재조합 플라스미드 pTrcC를 제조하였다.
전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pTrcC는 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C가 trc 프로모터의 유도에 발현되어진다. 한편, 세포 표면에 발현될 모델 단백질은 세포외막 바깥쪽으로 나와 있는 8개의 루프 중 7번째 루프에 있는 제한효소 PstI 절단 부위에 삽입하고자 하였다. 그러나, 대장균에서 유래한 세포외막 단백질 C의 7번째 루프와 C-말단에 각각 1개씩의 PstI 절단부위가 존재하기 때문에, 세포 표면에 발현코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 있어 불편한 점을 가지고 있다.
이에, 세포 외막 단백질의 C-말단에 존재하는 제한효소 PstI 절단부위를 제거시켜, 재조합 발현벡터 pTCdP를 제조하였다. 본 발명자들은 전기 재조합 발현벡터 pTCdP를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 제조한 다음, 전기 형질전환된 대장균을 'Escherichia coli MC4100/pTCdP'라 명명하고, 이를 1999년 2월 3일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB)유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 'KCTC 0576BP'로 기탁하였다. 전기 재조합 발현벡터 pTCdP는 세포 표면에 발현코자 하는 외래 단백질을 제한효소 PstI 절단부위를 이용하여 매우 용이하게 삽입시킬 수 있는 벡터이다.
한편, 예시적으로 대장균 세포 표면에 발현시킬 대상 펩타이드로 6개의 히스티딘으로 구성된 폴리-히스티딘(poly-His) 링커(linker) 펩타이드를 사용하였다. 이 대상 펩타이드는 Cd2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Pb2+등과 같은 2가 메탈 이온에 대한 좋은 킬레이터(chelator)이기 때문에, 중금속 제거를 위한 생물흡착제로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 6개로 구성되는 히스티딘 링커의 갯수를 증가시켜 세포외막 단백질 C에 삽입시킬 수 있는 사이즈를 쉽게 알아 볼 수 있기 때문이다. 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭된 DNA를 아가로오스 젤 전기영동법으로 약 72 bp 크기의 DNA 절편을 얻은 후, 재조합 발현벡터 pTCdP의 제한효소 PstI 절단부위에 삽입시켜 폴리-히스티딘 링커가 1개 삽입된 pTCHP1 재조합 발현벡터를 얻었다. 이와 같은 방법으로 폴리-히스티딘 링커가 2개, 3개, 6개가 각각 삽입된 재조합 발현벡터 pTCHP2, pTCHP3, pTCHP6를 제조하였다.
상기에서 제조된 재조합 발현벡터 pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3 또는 pTCHP6를 대장균 MC4100 균주에 도입하고, 이 형질전환체를 배양하여, 발현유도인자, 예를 들면 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 배양액을 일정량 채취하여 세포 외막 단백질을 분획하였다. 분획한 단백질들은 SDS-PAGE(sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 젤 전기영동으로 분석한 결과, 대장균 유래 세포외막 단백질 C에 (6His)n이 성공적으로 삽입되어 세포 표면에 발현시켰음을 확인하였으며, 전체 세포외막 단백질 중에서 (6His)n 단백질이 삽입된 세포외막 단백질 C의 비율이 약 30 내지 40%로서 매우 높음을 알 수 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 재조합 발현벡터 pTCHP6에 의하여 형질전환된 대장균을 'Escherichia coli MC4100/pTCHP6'라 명명하고, 이를 1999년 2월 3일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 'KCTC 0577BP'로 기탁하였다.
또한, 재조합 발현벡터 pTCHP(n)로 형질전환되어 성공적으로 세포외막에 발현된 (6His)n 대상 단백질이 활성을 가지는지 여부를 니켈-니트로트리아세트산-아가로오스(Ni-NTA-agarose) 비드를 이용하여 전세포 흡착능을 이용하여 확인하였다. OmpC-(6His)n으로 융합된 단백질을 세포 표면에 발현시킨 경우 아가로오스 비드 주변에 있는 니켈 이온에 모두 결합하였다. 이는 세포외막에 발현된 (6His)n 대상 단백질이 모두 세포 표면에서 바깥쪽으로 발현이 되었다는 것을 의미한다. 특히, pTCHP6 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 대장균의 경우, 84개의 아미노산으로 구성된 대상 단백질이 삽입되어 성공적으로 표면에 발현되었음을 알 수 있었다. 이는 지금까지 샌드위치 융합으로 삽입시킬 수 있는 외래 단백질의 크기가 약 60 내지 70 개의 아미노산으로 제한된다는 것에 비교하면, 본 발명에서 개발한 대장균 세포외막 단백질 C가 매우 효율적인 표면 발현 모체임을 알 수 있다(참조: Georgiou,G.,et al, Nature Biotechnol.,15:29-34, 1997; Stahl, S.,et al., Trends Biotechnol., 15:185-192, 1997).
한편, 재조합 발현벡터 pTCHP(n)을 가지는 재조합 대장균 MC4100이 실제로 중금속을 얼마나 흡착할 수 있는지를 카드뮴(Cd2+)을 흡착시킨 후, 원자 분석 시스템(atomic analysis system)을 이용하여 분석하였다. pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3, pTCHP6 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균 MC4100은 각각 단위 그램 세포 건조 중량당 18.9, 23.9, 26.1, 32μmol의 Cd2+이온을 흡착하였다. 이와 같은 결과는 과거 소사(Sousa) 등이 보고한 카드뮴 흡착결과와 비교할 때, 약 두 배까지의 높은 효율로 카드늄을 흡착함을 알 수 있다(참조: Sousa, C.,et al., Nature Biotechnol., 14:1017-1020, 1996). 따라서, 본 발명에서 개발한 재조합 대장균을 이용하여 폐수나 쓰레기 등에 있는 중금속을 제거하는데 이용할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 발현벡터 pTCdP는 OmpC 유전자를 포함하는 발현벡터의 하나의 예시로서, 외부 유전자로서 하기 실시예에서 기술하고 있는 폴리-히스티딘 링커 유전자 뿐만 아니라, 각종 외래 단백질이나 펩타이드의 유전자를 도입하여 그의 발현에 이용될 수 있다. 따라서, 재조합 발현벡터 pTCdP를 비롯하여, OmpC 유전자를 포함하며 외래 단백질이 OmpC와 융합된 형태로 발현될 수 있도록 구성된 다양한 발현벡터에 각종 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터 또한 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.
실시예 1: 재조합 발현벡터 pTCdP의 제조
대장균이 갖고 있는 세포 외막 단백질 C(OmpC) 유전자를 확보하기 위하여, 대장균(E.coli) MC4100(F- araD 139Δ(araF-lac) U169 rpsL150(Strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR;ATCC35695)의 염색체(choromosomal DNA)를 표적 DNA(template DNA)로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 이 중합효소 연쇄 반응에 이용한 개시절편(primer)은 5'-CTGCGCCTGGTCTCACATGAAAGTTAAAGTACTG-3'(서열번호 1)과 5'-CCGGGATCCTTATTAGAACTG GTAAACCAG-3'(서열번호 2)으로 제작하여 사용하였다. 첫 번째 변성은 94℃에서 7분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡은 44℃에서 2분간, 연장은 72℃에서 3분간씩 수행하였으며, 이를 33회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 한번 수행하였다. 이 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 젤 전기영동법으로 약 1100bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소 BsaI과 BamHI으로 절단하였다. 이와 동시에 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A(참조: Amann,Gene,69:301-309, 1988)를 두가지의 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여 T4 DNA 리가아제(ligase)로 연결시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균(E.coli) XL1-Blue에 형질전환하였다. 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTrcC 재조합 플라스미드를 수득하였다(참조: 도 1).
상기에서 제조한 pTrcC 재조합 플라스미드는 세포 표면 발현 모체로서 사용되어질 세포 외막 단백질 C 유전자가 강력하고 유도가능한 trc 프로모터에 의해 발현되어진다. 이 pTrcC 재조합 플라스미드의 멀티클로닝 사이트(multicloning site)에는 제한효소 PstI 절단부위가 존재한다. 한편, 세포 표면에 발현시킬 대상 단백질은 세포 외막 단백질 C의 세포막으로 나온 8개의 루프(loop) 중 7번째 루프에 있는 제한효소 PstI 절단부위에 삽입된다. 따라서, 세포 표면에 발현코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 많은 불편이 초래된다.
이를 보다 간편하게 하기 위해서, 재조합 플라스미드 pTrcC를 제한효소 XbaI과 HindIII로 절단한 후에 DNA 중합효소 I을 이용하여 평활말단화(blunt end)하고, T4 DNA 리가아제로 연결시켜 재조합 발현벡터 pTCdP를 제조하고, 상기 재조합 발현벡터를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균(E.coli) XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 엠피실린(ampicillin, 50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTCdP 재조합 발현벡터를 수득하였다. 이 재조합 발현벡터 pTCdP의 유전자 지도를 도 2에 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 전기 pTCdP 발현벡터를 대장균(E.coli) MC4100에 형질전환시켜 형질전환체를 제조한 다음, 전기 형질전환된 대장균을 'Escherichia coli MC4100/pTCdP'라 명명하고, 이를 1999년 2월 3일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 'KCTC 0576BP'로 기탁하였다.
실시예 2: 재조합 발현벡터 pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3, pTCHP6의 제조
세포 표면에 발현시킬 모델 단백질로 폴리-히스티딘(poly-His) 펩타이드를 사용하였다. 1개의 링커(linker) 세트(set)는 6개의 히스티딘으로 구성되어 있다. 이 6개의 히스티딘을 가지고 있는 폴리-히스티딘 펩타이드 1개의 세트로 구성된 유전자를 얻기 위해 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응에 이용한 개시절편은 5'-GATAGATATCCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCAT-3'(서열번호 3)과 5'-CCAACTGCAGGATATCCTCGAGACCAGAATGGTGATGATGGTGATG-3'(서열번호 4)으로 제작하여 사용하였다. 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 30초간, 교잡은 56℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 10회 반복한 후 다시 변성은 94℃에서 30초간, 교잡은 68℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며 이를 20회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 한번 수행하였다. 이 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 젤 전기영동법으로 약 72bp 크기의 DNA 절편을 분리하였다. 이 폴리-히스티딘 펩타이드 유전자의 5'-말단에는 제한효소 PstI과 SalI 사이트가 존재하며, 3'-말단에는 XhoI과 PstI 사이트가 존재한다. 이렇게 얻어진 DNA 단편을 PstI 제한효소로 절단하였다. 이와 동시에 실시예 1에서 제조한 pTCdP 재조합 발현벡터를 제한효소 PstI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결시키고, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균(E.coli) XL1-Blue를 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTCHP1 재조합 발현벡터를 수득하였다. 이 재조합 발현벡터 pTCHP1은 6개의 히스티딘으로 구성된 폴리-히스티딘 펩타이드 1개의 세트를 구성하는 유전자를 가지고 있다.
폴리-히스티딘 펩타이드 2개의 세트를 구성하는 유전자를 가진 재조합 발현벡터 pTCHP2를 제조하기 위해서, 전기에서 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 DNA 단편을 제한효소 SalI과 XhoI으로 절단하였다. 이와 동시에 pTCHP1 재조합 발현벡터를 제한효소 SalI으로 절단한 다음, 이를 앞의 DNA 절편과 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결시키고, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균(E.coli) XL1-Blue를 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pTCHP2 재조합 발현벡터를 수득하였다. 이 재조합 발현벡터 pTCHP2는 6개의 히스티딘으로 구성된 폴리-히스티딘 펩타이드 2개의 세트를 구성하는 유전자를 가지고 있다.
상기와 같은 방법으로 각각 폴리-히스티딘 펩타이드 3개의 세트를 구성하는 유전자와 6개의 세트를 구성하는 유전자를 가진 재조합 발현벡터 pTCHP3과 pTCHP6을 제조하였다. 이 재조합 발현벡터 pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3, pTCHP6의 유전자 지도 및 이를 구성하는 아미노산 서열을 도 3에 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 전기 폴리-히스티딘 발현벡터 pTCHP6로 대장균(E.coli) MC4100을 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였으며, 형질전환된 대장균을 'Escherichia coli MC4100/pTCHP6'라 명명하고, 이를 1999년 2월 3일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원(KIST) 부설 생명공학연구소(KRIBB) 유전자은행(KCTC, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 기탁번호 'KCTC 0577BP'로 기탁하였다.
실시예 3: OmpC-(6His)n 융합 단백질의 발현
실시예 2에서 제작된 재조합 발현벡터 pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3, 또는 pTCHP6로 형질전환된 대장균(E.coli) MC4100(F- araD139 Δ(argF-lac)U169 rpsL150(strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR)에서 모델 단백질이 융합된 대장균 세포 외막 단백질 C의 발현을 SDS-PAGE 방법을 이용하여 확인하였다. 즉, OmpC-(6His)n 융합 단백질의 발현 정도를 조사하기 위하여 재조합 대장균들을 LB 액체 배지 50㎖이 담긴 250㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 30℃에서 배양하였다. pTCHP(n) 재조합 발현벡터는 trc 프로모터를 가지고 있어, IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 유전자 발현을 유도한다. 유전자 발현 유도 (induction)는 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.6일 때 0.01mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다. 유도발현후 2시간 후에 배양액 3㎖씩을 채취하여 세포 외막 단백질을 다음과 같은 방법으로 분획하였다: 배양액 3㎖을 4℃에서 6000rpm으로 5분동안 원심분리한 후 상층액을 버리고, 1㎖의 Na2HPO4(pH 7.2) 완충용액으로 한번 세척한 후에 다시 4℃에서 6000rpm으로 5분 동안 원심분리하고 Na2HPO4(pH 7.2) 완충용액 0.5㎖에 현탁하였다. 현탁한 용액은 초음파 처리(sonication)를 하여 현탁액 속의 모든 세포를 파쇄한 후, 실온에서 12000rpm으로 2분동안 원심분리하여 세포 파편(debris)가 제거된 상층액을 얻었다. 세포막 단백질 분획은 이 상층액을 실온에서 12000rpm으로 30분동안 원심분리한 후, 0.5㎖의 0.5%(w/v) sarcosyl/10mM Na2HPO4(pH 7.2) 완충용액에 현탁하여 얻었다. 이 세포막 단백질 용액을 37℃에서 30분동안 반응한 후에 4℃에서 12000rpm으로 30분동안 원심분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획을 10mM Na2HPO4(pH 7.2) 완충용액으로 세척한 후에 50㎕ PBS(0.274M NaCl, 0.041M Na2HPO4, 0.047M KH2PO4, 0.005M KCl, pH 7.4) 용액에 현탁하여 세포 외막 단백질 분획 시료 용액을 얻었다(참조: Puenete, J.L.,et al., Gene,156:1-9, 1995). 얻어진 단백질들에서 64㎕씩 취하여 SDS-PAGE 시료 완충용액(Tris-HCl 60 mM: 25% 글리세롤: 2% SDS: 2-머캡토에탄올 14.4 mM: 0.1% 브로모페놀 블루) 16㎕와 혼합하고 10분간 끓였다. 이를 12% 분리젤에서 SDS-PAGE 젤 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 젤은 염색 용액(Coomassie brilliant blue R 0.25 g/L: 메탄올 40%, 아세트산 10%)에 2시간 이상 담가두어 염색하고, 다시 탈색 용액(메탄올 40%: 아세트산 7%)에 2시간 이상씩 두 번 담가두어 탈색하였다(참조: 도 4). 도 4에서 레인 M은 단백질 표준 분자량(200kDa, 97.4kDa, 68kDa,43kDa, 29kDa 및 18.4kDa)을 나타내고; 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균(E.coli) MC4100의 세포외막 단백질 분획을 나타내며; 레인 2 내지 6은 유도발현 후 2시간이 경과한 다음에 pTCdP, pTCHP1, pTHCP2, pTHCP3 또는 pTHCP6 발현벡터로 형질전환된 대장균(E.coli) MC4100의 세포외막 단백질 분획을 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 36 kDa 크기를 가진 대장균의 세포외막 단백질 C(OmpC)를 나타낸다. 도 4에서 보는 바와 같이, 세포외막 단백질에 (6His)n은 성공적으로 대장균 세포외막 단백질 C에 삽입되어 대장균의 세포외막에 발현되었음을 알 수 있다. 아울러, 상기 SDS-PAGE 젤 전기영동 결과는 덴시토메터를 이용한 단백질의 정량에 이용하여, 세포외막 단백질 중에서 (6His)n 단백질이 삽입된 세포외막 단백질의 비율을 결정하였는 바, 그 비율이 약 30 내지 40%정도로서 매우 높음을 알 수 있다.
실시예 4: 재조합 발현벡터 pTCHP(n)을 가지는 재조합 대장균의 Ni-NTA-아가
로오스 비드에 대한 전세포 흡착능 비교
히스티딘이 Cd2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Pb2+등과 같은 2가 메탈 이온에 대한 좋은 킬레이터(chelator)인 점을 이용하여, 6개의 히스티딘으로 구성된 폴리-히스티딘(Poly-His) 펩타이드가 대장균의 세포외막에 성공적으로 발현되었는지 여부를 니켈-니트로트리아세트산-아가로오스(Ni-nitrotriacetic acid-agarose; Ni-NTA-agarose)(Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 비드에 대한 전세포 흡착능을 이용하여 확인하였다. 실시예 3과 동일한 조건으로, 재조합 발현벡터 pTCHP6으로 형질전환된 세포를 배양하였다. 발현 유도후 2시간이 경과하면 배양액 1㎖을 4℃에서 6000rpm으로 5분동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000rpm으로 5분 동안 원심분리하고 0.5㎖의 0.85%(w/v) NaCl 용액에 현탁하였다. 현탁한 용액은 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 한번 세척한 니켈-니트로트리아세트산-아가로오스 0.05㎖과 잘 혼합하였다. 세포-비드 혼합액은 2㎍/㎖의 프로피디움 아이오다이드(propiodium iodide)로 염색한 후에, 레이저 스케닝 컨포컬 현미경(laser scanning confocal microscopy; Carl Zeiss LSM 410, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다(참조: 도 5a 및 도 5b). 시료는 543nm 헬륨/네온 레이저에 의해서 여기되었고, 이미지는 580nm 필터에 의해 걸러졌다. 도 5a는 세포외막 단백질 C에 폴리-히스티딘 펩타이드가 융합되지 않은 재조합 발현벡터 pTCdP에 형질전환된 대장균(E.coli) MC4100의 광하(왼쪽)와 형광하(오른쪽)의 공초점 현미경 사진이다. 사진에서 보는 바와 같이 비드는 형광하에서 보이지 않는다. 반면, OmpC-(6His)6으로 융합된 단백질을 세포 외막에 발현시키는 대장균의 경우, 비드 주변이 매우 밝게 보임을 도 5b에서 확인할 수 있다. 이는 프로피디움 아이오다이드로 염색된 재조합 대장균이 니켈이온을 가지고 있는 아가로오스 비드와 결합함을 의미한다. 따라서, 세포외막 단백질 C에 융합된 폴리-히스티딘 펩타이드가 대장균의 세포외막에 성공적으로 발현되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 재조합 발현벡터 pTCHP(n)을 가지는 재조합 대장균의 중금속
(카드늄) 흡착능비교
재조합 발현벡터 pTCHP(n)을 가지는 재조합 대장균(E.coli) MC4100이 실제로 중금속을 얼마나 흡착할 수 있는지 비교하였다. 실시예 3과 동일한 조건으로, 세포를 배양하여 유도 발현한 후 2시간이 경과하면 세포를 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 2번 세척한 후, 세포의 최종 농도가 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 5.0이 되도록 0.85%(w/v) NaCl 용액에 농축하였다. 여기에 같은 부피의 50ppm(0.85%(w/v) NaCl 용액, pH 5.8) 농도를 가진 카드늄클로라이드(CdCl2)를 첨가한 후, 이 혼합 용액을 25℃에서 교반하며 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후에 다시 세포를 0.85%(w/v) NaCl 용액으로 2번 세척한 후, 실온에서 70%(w/v) 질산(nitric acid) 용액으로 완전히 분해시켰다. 이렇게 얻어진 시료는 원자 분석 시스템(atomic analysis system; Perkin-Elmer 3100, Norwalk, CT, USA)으로 용액속의 카드늄 농도를 정량하였다(참조: 도 6). 이때 사용한 파장은 228.2nm이고 슬릿 폭(slit width)은 0.7nm 이었다. 도 6에서 보는 바와 같이, pTCHP1, pTCHP2, pTCHP3, 또는 pTCHP6 재조합 발현벡터로 형질 도입된 대장균(E.coli) MC4100은 각각 단위 그램 세포 건조 중량당 18.9, 23.9, 26.1, 32μmol의 Cd2+이온을 흡착하였다. 이로써 6개의 히스티딘을 가지고 있는 폴리-히스티딘 펩타이드 1개의 세트로 구성된 유전자 세트의 수가 증가함에 따라 흡착되는카드늄 이온의 농도가 높아짐을 알 수 있었다. 반면, 폴리-히스티딘 펩타이드가 융합되지 않은 재조합 발현벡터 pTCdP로 형질전환된 대장균은 15.3μmol/g 의 흡착능을 보였다. 이와 같은 결과로써, 과거 소사(Sousa) 등(참조: Sousa, C.,et al., Nature Biotechnol., 14:1017-1020, 1996)이 보고한 16.5μmol/g와 비교할 때, 본 발명의 형질전환된 대장균이 매우 높은 효율로 카드늄을 흡착함을 알 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 대장균에서 유래한 세포 외막 단백질 C(OmpC)를 세포 표면 발현 모체로 사용하여 외래 단백질이나 펩타이드를 세포 표면에 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터, 전기 발현벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 그를 이용하여 외래 단백질을 박테리아의 세포 표면에 효율적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 표면 발현 모체인 대장균 유래 OmpC의 유전자 및 폴리-히스티딘 링커 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의하여 형질전환되어, 세포 표면에 폴리-히스티딘을 발현하는 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 중금속 제거제를 제공한다. 본 발명의 신규 개발된 표면 발현벡터를 이용하여 세포 외막에 외래 단백질을 발현시키면, 삽입되는 외래 유전자에 따라 재래식 백신보다 훨씬 지속적이고 강력하게 면역 반응을 나타내어 줄 수 있는 재조합 생백신, 여러 펩타이드나 항체의 선별, 중금속 제거 또는 폐수 처리에 응용할 수 있는 전세포 흡착제, 생물학적 전환에 이용되는 효소를세포 표면에 안정적으로 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성의 감소 없이 안정되게 사용할 수 있는 전세포 생물전환 등의 목적에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 세포 표면발현 모체(cell surface anchoring motif)인 대장균(Escherichia coli) 유래 세포외막 단백질 C(OmpC)의 유전자를 포함하며, 도 2와 같은 유전자 지도를 가지는 것을 특징으로 하는 발현벡터 pTCdP.
  2. 제 2항의 발현벡터 pTCdP에 의하여 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC4100/pTCdP(KCTC 0576BP).
  3. 제 2항의 발현벡터 pTCdP에 6개 세트의 폴리-히스티딘 링커 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터 pTCHP6에 의하여 형질전환된 대장균(Escherichia coli) MC4100/pTCHP6(KCTC 0577BP).
  4. 다음의 각 단계를 포함하는 미생물 세포 표면에 외래 단백질을 발현시키는 방법:
    (a) 제 2항의 발현벡터 pTCdP에 외래단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 외래단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하는 단계;
    (b) 전기 제조된 발현벡터로 미생물 세포를 형질전환시키는 단계; 및,
    (c) 전기 형질전환된 미생물 세포를 배양하여 전기 외래 단백질을 발현시키는 단계.
  5. 제 5항에 있어서,
    미생물 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는
    미생물 세포 표면에 외래 단백질을 발현시키는 방법.
  6. 세포 표면발현 모체(cell surface anchoring motif)인 대장균(Escherichia coli) 유래 세포외막 단백질 C(OmpC)의 유전자 및 폴리-히스티딘 링커 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 pTCHP6에 의하여 형질전환된 대장균((Escherichia coli) MC4100/pTCHP6(KCTC 0577BP))을 유효성분으로 포함하는 중금속 제거제.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100743973B1 (ko) 2006-04-27 2007-07-30 한국과학기술원 목적단백질 및 코펙터를 재생시키는 효소를 동시에 세포표면에 표면발현시키는 방법
WO2013100217A1 (ko) * 2011-12-27 2013-07-04 동양대학교 산학협력단 대장균 yiat 단백질을 이용한 목적단백질의 표면발현 방법
KR101874236B1 (ko) * 2017-03-15 2018-07-03 울산대학교 산학협력단 망간 및 코발트 결합 펩티드의 표면 발현 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1343894A4 (en) * 2000-11-02 2005-05-04 Univ Singapore AOPB GENE, PROTEIN, HOMOLOGISTS, FRAGMENTS AND VARIANTS THEREOF, AND THE USE THEREOF FOR PRESENTATION ON THE CELL SURFACE
KR100447530B1 (ko) * 2001-08-14 2004-09-08 한국과학기술원 ＯｍｐＦ를 이용하여 목적 단백질을 대장균 세포외로분비생산하는 방법
KR100462832B1 (ko) * 2002-04-11 2004-12-20 한국과학기술원 세포표면 발현용 유전자
KR100690948B1 (ko) * 2004-06-17 2007-03-09 한국과학기술원 대장균의 외막 단백질을 이용한 목적 단백질의 미생물표면발현 방법
DE102007003577A1 (de) 2007-01-24 2008-08-07 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Zwei-Komponentensystem zur Programmierung bakterieller Membranen
KR101145911B1 (ko) * 2008-12-22 2012-05-15 한국화학연구원 대장균의 외막단백질 ＯｍｐＷ를 이용한 목적단백질의 표면발현 방법
AU2016353453B2 (en) 2015-11-11 2022-08-11 Serimmune Inc. Methods and compositions for assessing antibody specificities
CN111778201B (zh) * 2020-07-10 2022-07-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生物鲁棒性提高的大肠杆菌底盘细胞及其构建方法与应用
CN114736843B (zh) * 2022-06-13 2022-08-09 北京质肽生物医药科技有限公司 一种大肠杆菌重组菌株、其制备方法和应用
CN115896150B (zh) * 2022-09-20 2023-08-01 吉林农业大学 无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pCXa-vp6-pfc-S及其制备方法和应用
CN115850390A (zh) * 2022-12-29 2023-03-28 深圳安吉康尔医学检验实验室 一种将过表达蛋白锚定于细胞膜的微小蛋白及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5356797A (en) 1991-11-15 1994-10-18 Board Of Regents, The University Of Texas Membrane expression of heterologous genes
GB9518323D0 (en) 1995-09-07 1995-11-08 Steidler Lothar Materials and methods relating to the attachment and display of substances on cell surfaces
WO1998049286A2 (en) 1997-05-01 1998-11-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100743973B1 (ko) 2006-04-27 2007-07-30 한국과학기술원 목적단백질 및 코펙터를 재생시키는 효소를 동시에 세포표면에 표면발현시키는 방법
WO2013100217A1 (ko) * 2011-12-27 2013-07-04 동양대학교 산학협력단 대장균 yiat 단백질을 이용한 목적단백질의 표면발현 방법
KR101874236B1 (ko) * 2017-03-15 2018-07-03 울산대학교 산학협력단 망간 및 코발트 결합 펩티드의 표면 발현 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물

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