KR20100108681A

KR20100108681A - 포자를 이용한 중금속 제거

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Publication number: KR20100108681A
Application number: KR1020090026805A
Authority: KR
Inventors: 정흥채; 반재구; 임성근; 류충민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2009-03-30
Publication date: 2010-10-08
Also published as: KR101583047B1

Abstract

본 발명은 (a) 포자의 표면에 4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드를 결합시키는 단계; 및 (b) 상기 포자를 중금속을 포함하는 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 포자를 이용한 중금속 제거방법, 그리고 중금속으로 오염된 토양에서의 식물 성장의 촉진방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 중금속이 오염된 다양한 시료로부터 포자를 이용하여 중금속을 효율적으로 제거할 수 있다. 특히, 본 발명의 포자를 이용하여 중금속이 오염된 토양을 처리하거나 또는 식물체(특히, 뿌리 부분)을 처리한 경우에는 중금속이 오염된 토양에서도 식물체의 성장을 촉진시킬 수 있다.

중금속, 오염, 흡착, 포자

Description

포자를 이용한 중금속 제거{Removal of Heavy Metals Using Spores}

본 발명은 포자를 이용한 중금속 제거방법 및 중금속으로 오염된 토양에서의 식물 성장의 촉진방법에 관한 것이다.

단일 유기체 표면에 원하는 펩타이드, 폴리펩타이드 등 단백질류를 표면에 부착하여 발현하는 표면 전시 기술은 발현된 단백질류의 성질에 따라, 또는 표면 전시될 숙주 단일 유기체의 성질에 따라 다양한 생물공학분야에 응용이 가능하다(Georgiou, G., et al., Practical applications of engineering Gram-negative bacterial cell surfaces. TIBTECH 11:6-10(1993); Georgiou, G., et al., Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms:From the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nature Biotechnology 15:29-34(1997); Schreuder, M.P., et al., Immobilizing on the surface of yeast cells. TIBTECH 14:115-120 (1996)).

이러한 표면 전시기술은 박테리오파아지, 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포 등 여러 가지 단일세포 유기체를 숙주 세포로 이용하여 개발되었다.

표면 전시기술은 표면에 전시된 단백질의 유전자가 숙주 유기체내에 포함되어 있기 때문에 표면발현된 숙주 유기체를 표면발현된 단백질의 성질을 이용하여 선택적으로 선별할 수 있고, 선별된 숙주 유기체로부터 원하는 유전자를 쉽게 확보할 수 있으므로, 단백질의 분자적 진화를 위한 강력한 수단을 제공한다는 특징이 있다(WO 98/49286, 미합중국 특허 제5837500호).

흡착 크로마토그라피에 사용되는 항체나 단백질을 적당한 담체에 고정화하기 위해서는, 발효를 통한 단백질의 생산, 순수한 상태로의 분리 및 정제 그리고 담체에로의 고정화 과정을 거쳐야 한다. 그러나, 대부분의 경우 이러한 바이오흡착제는 그 생산 공정이 단순치 않다.

흡착단백질을 미생물의 표면에 발현시켜, 세포전체를 일종의 흡착제로서 개발이 되었다. 가장 잘 공지된 전세포 흡착제는 포유류 항체의 Fc 도메인과 높은 친화성을 갖는 단백질 A가 표면에 자연적으로 발현된 Staphylococcus aureus이다. 또한, 최근에는 미생물 표면발현기술을 이용하여 메탈로티오네인(metallothionein), 또는 여러 개의 히스티딘 잔기와 같은 금속 흡착단백질을 세포표면에 대량 발현하여, 중금속의 제거 및 회수하는 새로운 방법이 발표되었다. 그러나 여전히 이러한 생흡착제의 안정성 및 효율성이 문제가 되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시된다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입됨으로써 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명이 보다 명확 하게 설명된다.

본 발명자들은 포자를 이용하여 중금속을 흡착제거할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 포자코트단백질을 이용하여 중금속 흡착펩타이드를 표면전시하거나 또는 포자의 표면에 가교결합제를 이용하여 중금속 흡착펩타이드를 공유결합시켜 포자를 제조하고 이 포자를 이용하여 중금속을 제거하는 경우에는 매우 효율적으로 중금속을 제거할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 포자를 이용한 중금속 제거방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 중금속으로 오염된 토양에서의 식물 성장의 촉진방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 포자를 이용한 중금속 제거방법을 제공한다:

(a) 포자의 표면에 4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드를 결합시키는 단계; 및

(b) 상기 포자를 중금속을 포함하는 시료에 접촉시키는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 중금속으로 오염된 토양에서의 식물 성장의 촉진방법을 제공한다:

(a) 포자의 표면에 4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드를 결합시키는 단계;

(b) 상기 포자를 중금속으로 오염된 토양 또는 식물체에 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 식물체를 성장시키는 단계.

본 발명자들은 포자를 이용하여 중금속을 흡착제거할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 포자코트단백질을 이용하여 중금속 흡착펩타이드(4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드)를 표면전시하거나 또는 포자의 표면에 가교결합제를 이용하여 중금속 흡착펩타이드를 공유결합시켜 포자를 제조하고 이 포자를 이용하여 중금속을 제거하는 경우에는 매우 효율적으로 중금속을 제거할 수 있음을 발견하였다.

본 발명에서 OPH의 고정화에 이용되는 포자는 다음과 같은 우수한 장점들을 가지고 있다: 1) 열에 대한 매우 안정하다; 2) 방사선에 대해 비교적 안정하다; 3) 독성에 대해 안정하다; 4) 산, 염기에 대해 매우 안정하다; 5) 리소자임에 안정하다; 6) 건조에 내성을 갖고 있다; 7) 유기용매에 대해 안정하다; 8)대사적 활성이 없다; 9) 용이하게 수 시간 안에 포자를 형성할 수 있다.

바람직하게는, 포자는 믹소코커스를 포함하는 포자형성 그람음성균; 클로스트리디움 속, 페니바실러스 속과 바실러스 속을 포함하는 포자형성 그람양성균; 포자형성 방선균; 사카로마이세스 세레비시애, 칸디다 (Candida) 속과 한세눌라 속을 포함하는 포자형성 효모; 포자형성 곰팡이 등으로부터 유래된 것이며, 보다 바람직하게는 포자형성 그람양성 박테리아, 보다 더 바람직하게는 바실러스 속 박테리아, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸러스 또는 바실러스 츄린겐시스로부터 유래된 것이다.

상기 포자 코트단백질 유전자는 바람직하게는 cotA, cotB, cotC, cotD (W. Donovan et al., J. Mol . Biol ., 196:1-10(1987)), cotE (L. Zheng et al., Genes & Develop ., 2:1047-1054(1988)), cotF (S. Cutting et al., J. Bacteriol ., 173:2915-2919(1991)), cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT (A. Aronson et al., Mol . Microbiol ., 3:437-444(1989)), cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ (J. Zhang et al., J. Bacteriol ., 175:3757-3766(1993)), spoIVA, spoVID 및 sodA 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상기 코트단백질 유전자는 cotE 또는 cotG를 이용하는 것이고, 가장 바람직하게는 cotG를 이용하는 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 코트단백질의 유전자와 중금속 흡착펩타이드의 유전자를 융합할 때, 코트단백질 유전자가 전체 또는 일부 또는 두번 이상 반복된 것을 이용할 수 있고, 또는 두번 이상 반복된 코트단백질 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것, 또는 중금속 흡착펩타이드 유전자가 하나이거나 두번 이상 반복된 것, 또는 두번 이상 반복된 중금속 흡착펩타이드 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것 등이 가능하고 상기한 어떠한 조합의 경우도 가능하다.

본 발명의 방법에서 제조되는 상기 유전자 조합체는 숙주세포 내에서 플라스미드내에 독립적으로 또는 숙주의 염색체에 끼여 들어가 존재할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 또한, 유전자 조합체에 있어서, 코트단백질 유전자 뒤에 목적 단백질 유전자가 연결되거나 또는 목적 단백질 유전자 뒤에 코트단백질 유전자가 연결되거나 또는 코트단백질 유전자 가운데 목적 단백질 유전자가 삽입될 수 있음도 당업자에게 자명한 것이다.

한편, 포자 코트단백질과 중금속 흡착펩타이드가 결합된 융합단백질의 발현 유도는 숙주세포에서 발현이 유도될 수 있는 코트단백질 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 숙주 박테리아에서 발현가능한 적절한 다른 프로모터에 의해 발현될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

중금속 흡착펩타이드의 캐리어로서의 포자는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수득할 수 있다. 예를 들어, 바실러스의 포자는 레노그라핀 밀도구배(renografin gradients) 방법(참조: C. R. Harwood, et al ., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 얻을 수 있다.

본 발명에서 이용되는 중금속 흡착펩타이드는 4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기, 가장 바람직하게는 6개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드이다.

본 발명의 방법에 있어서, 자연 상태의 포자를 활용하는 것도 가능하지만, 표면전시가 보다 효율적으로 이루어지도록 포자의 표면을 화학적으로 변형할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 가교결합제를 포자에 처리하여 화학적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 포자 표면을 화학적으로 변형하여 알드하이드기(-CHO) 또는 에폭사이드기로 유도하여 화학적으로 매우 높은 반응성을 갖도록 하여 외부에서 첨가된 목적물질, 예컨대 단백질분자들과 공유결합을 통해 고정화하는 기술을 적용할 수 있다. 이와 같이, 포자 표면을 화학적으로 변형하는 극한 화학 반응조건에서 안정하게 유지될 수 있는 포자의 특성이 유리하게 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 제거되는 중금속은 +2가 밸런스(valence)를 가질 수 있는 금속이온이고, 보다 바람직하게는 Co, Ni 또는 Cd이다.

본 발명에 따르면, 중금속이 오염된 다양한 시료로부터 포자를 이용하여 중금속을 효율적으로 제거할 수 있다. 특히, 본 발명의 포자를 이용하여 중금속이 오염된 토양을 처리하거나 또는 식물체(특히, 뿌리 부분)을 처리한 경우에는 중금속이 오염된 토양에서도 식물체의 성장을 촉진시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 포자 엔지니어링을 이용한 포자 흡착제 제조

프랑스국 파스테르 연구소의 F. Kunst 박사로부터 분양 받은 바실러스 서브틸리스 168 균주(Kunst F., et al., Nature, 390:249-256(1997))의 DNA를 칼만 등의 방법 (Kalman S., et al., Appl . Environ . Mirobiol. 59, 1131-1137(1993))으로 분리하고, 분리된 DNA를 주형으로 하고, cotG를 프라이머(aaaagacgtc gactttgtat ttctttttga cta 및 gcctttggat ccagtgtccc tagctccgag) 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 베링거만하임사로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 어닐링은 55℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분, 변성은 94℃에서 30초간으로 하여 총 35 사이클을 수행하였다.

이어, PCR 산물을 BamHI 및 SalI으로 절단하고, 플라스미드 pDG1730(Mitsuo Ogura and Teruo Tanaka, Journal of Bacteriology, February 2009, p. 949-958, Vol. 191, No. 3, 17. Guerout-Fleury, A.-M., Frandsen, N., and Stragier, P. (1996) Gene (Amst .) 180, 5761)의 BamHI과 S alI 위치에 삽입하여 코트단백질을 발현시킬 수 있는 pDG1730-CotG 벡터를 제작하였고, 또한 CotG의 C-말단에 6개의 His 잔기가 위치할 수 있도록 유전자 조작을 하여 pDG1730-CotG-6His를 제작하였다.

또한, Bacillus thuringiensis 포자 디스플레이용 벡터 pSD (Shite Sebastian, et al., Infect Immun. 2007 May; 75(5): 25912602; Matthew Wolfgang1, et al., The EMBO Journal (2000) 19, 64086418)를 조작하여 6개의 His 잔기를 발현할 수 있도록 pSD-6His을 제작하였다.

완성된 재조합 발현벡터 중 pDG1730-CotG-6His을 단백질 분해효소 중 7가지가 결핍된 WB700 균주(Ye, R., dt al., Biotechnology and Bioengineering, 62: 87-96(1999))에, pSD-6His을 Bacillus thuringiensis 4Q7 (Hyun-Woo Park, et al., Appl Environ Microbiol. 2003 February; 69(2): 13311334)에 자연도입법(C. R. Harwood, et al ., Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 형질전환하여, 다음과 같은 6종의 형질전환체를 얻었다: ① Bacillus subtilis WB700, ② Bacillus subtilis WB700/pDG1730-cotG, ③ Bacillus subtilis WB700/pDG1730-cotG-6His, ④ Bacillus thuringiensis 4Q7/pSD, ⑤ Bacillus thuringiensis 4Q7/pSD-6His, ⑥ Bacillus thuringiensis 4Q7(ΔinhA)/pSD-6His.

이어, 바실러스 균주를 각각 GYS 배지 ((NH₄)₂SO₄ 2 g/ℓ, 효모분말 2 g/ℓ, K₂HPO₄ 0.5 g/ℓ, 포도당 1 g/ℓ, MgSO₄H₂O 0.41 g/ℓ, CaCl₂2H₂O 0.08 g/ℓ, MnSO₄5H₂O 0.07 g/ℓ)에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)하였고, 그런 다음 레노그라핀 밀도구배 (renografin gradients) 방법 (C. R. Harwood, et al ., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley & Sons, New York, p.416(1990))으로 순수 포자만을 분리하였다.

실시예 2: 포자흡착제를 이용한 중금속 이온의 흡착 실험

실시예 1에서 제조한 포자흡착제가 중금속을 얼마나 많이 흡수 할 수 있는지 조사하기 위해 각각의 포자를 정제한 후 금속 결합 실험을 실시하였다. 본 실험에 사용한 중금속은 Co, Ni 및 Cd이다. 중금속을 흡착시킬 포자 매트릭스로는 WB700/pDG1730-CotG, WB700/pDG1730-CotG6His, BT4Q7/pSD, BT4Q7/pSD6His, BT4Q7(M)pSD6His가 발현된 포자이다.

1 M의 CoCl₂, NiCl₂, 및 CdCl₂ 스톡을 만든 뒤 각각의 포자흡착제가 있는 용액에 최종 5 mM를 넣고 일정 시간 반응 시킨 뒤 포자에 흡착된 금속 이온을 측정하였다. 50 mM Tris-HCl(pH 7.4)에 존재하는 OD₆₀₀=2의 각각의 포자흡착제에 각각 1 M CdCl₂ 5 ㎕(최종 5 mM), 1M CoCl₂ 5 ㎕ (최종 5 mM), 1M NiCl₂ 5 ㎕ (최종 5 mM)를 넣고 50 mM Tris-HCl(pH 7.4)로 최종 1 mL로 맞춘 뒤 상온에서 1시간 동안 교반시켰다. 이어, 0.8% NaCl이 들어 있는 50 mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충액 1 mL씩 넣고 3번을 세척하였다. 포자흡착제에서 수분을 제거 하기 위해 65℃에서 하룻밤 동안 말린 뒤 0.1 mL의 70% 니트르산을 넣고 재현탁시켰다. 그런 다음, 12000 rpm 으로 2 분간 원심분리 하여 펠릿을 제거 하였다. 중금속 이온이 들어 있는 상층액에 9.9 mL의 3차 증류수를 넣고 잘 섞은 뒤 원자흡광 스펙트로모토미터(SHIMADZU)로 중금속 이온의 양을 측정하였다. 그 결과 Co와 Cd은 BT4Q7에 6개 의 히스티딘 펩타이드를 표면전시한 매트릭스에서 가장 많은 양(Co의 경우는 20 μM, Cd의 경우는 89 μM)이 흡착된 반면 Ni의 경우는 WB700에 6개의 히스티딘 펩타이드를 표면전시한 매트릭스에서(Ni의 경우 0.75 μM) 가장 많이 흡착되었다.

WB700과 BT4Q7의 포자 매트릭스를 비교한 결과 BT4Q7 포자 매트릭스가 더 많은 양의 Co와 Cd를 흡착(Co의 경우 8.7배, Cd의 경우 2배)시키는 것을 알 수 있었다. 하지만 Ni의 경우 WB700 포자 매트릭스가 약 2배 정도 더 많이 흡착시켰다.

상기 실험 결과는 3가지의 중금속을 흡착시키는 흡착제로 박테리아의 포자를 사용 할 수 있음을 보여준다.

실시예 3: 중금속 이온흡착을 위한 6 xHis 펩타이드의 non - GMO 인택트 포자 표면전시

일반적으로 6개의 히스티딘잔기로 구성된 펩타이드는 니켈(Ni), 카드뮴(Cd), 코발트(Co) 등과 같은 2가의 금속이온과 높은 결합력을 가지고 있음에 따라, 포자 표면전시에 의해 부착된 6 x His 펩타이드는 저농도로 존재하는 중금속을 흡착농축제거할 수 있는 흡착제로 활용이 가능하다. 6개의 히스티딘(N-말단-His-His-His-His-His-His-C말단, 6 x His)으로 구성된 펩타이드를 합성하였다((주)펩트론). 6 x His 펩타이드의 표면 디스플레이용 스포아는 Bacillus subtilis DB104(Kawamura F. and Doi R. H., J. Bacteriol. 160: 442-444(1984)) 균주를 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 순수분리하였다. 순수분리된 포자를 600 nm에서의 세포현탁 흡광도가 1.0이 되도록 하고, 글루타알디하이드 (glutaraldehyde)를 농도 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1%, 2%, 5% (무게/부피)되도록 첨가하여 상온에서 30분 반응시켰다. PBS 완충용액으로 3번 세척하여 글루타알디하이드가 잔존하지 않도록 하였다. 낮은 농도의 글루타알디하이드에서는 포자 표면에 존재하는 아민기 (-NH₂)와 글루타알디하이드의 분자 양 끝에 있는 알드하이드 (-CHO)가 서로 공유결합을 통해 포자표면에서 가교결합(cross-linking)을 유도하지만 높은 농도의 글루타알디하이드 처리시에는 글루타알디하이드 분자 한쪽 끝의 카르복시기가 유리된 상태로 존재할 수 있다. 따라서 글루타알디하이드 반응이 끝난 경우 포자 표면은 화학적으로 반응성이 높은 알드하이드기가 유리되어 있어 외부에서 아민기를 갖는 물질를 접촉시키면 아마이드 결합 (-NH-CO-)과 같은 공유결합을 통해 부착할 수 있게 된다. 따라서 유전자조작을 통하지 않고도 중금속을 대량으로 결합할 수 있는 포자 흡착제를 개발할 수 있다.

실시예 4: 중금속 흡착 포자 흡착제를 활용한 식물의 증식효과

Cd 중금속이 오염된 토양에서 식물이 자랄 때 카드뮴 중금속을 흡착시킬 수 있는 흡착제로서 포자가 들어 있는 토양과 그렇지 않은 토양에서 식물이 자라는데 어떠한 영향을 주는지 실험하였다. 사용한 카드뮴의 농도는 토양 1 kg에 150 μmole (1 M CdCl₂ 150 ㎕)이었다. 중금속을 흡착시키기 위해 포자 흡착제로서 B. subtilis(WB700/pDG1730-CotG6His)와 B. thuringiensis(BT4Q7/pSD6His) 포자를 사용하였으며, 각각 OD₆₀₀ = 5 일 때 농도의 포자에 식물의 뿌리를 담군 뒤 빼서 바로 오염된 토양과 그렇지 않은 토양에 심고 3 주간 키우면서 증식하는 효과를 확인하였다(도 1).

실험결과, Cd 처리가 안 된 대조구의 경우 증식이 매우 왕성하게 되었다. Cd 처리가 된 토양에서는 식물의 증식이 느렸으며 잎이 노랗게 변해갔다. 그러나 포자 흡착제가 처리된 식물은 Cd이 처리가 안 된 대조구와 거의 비슷한 성장속도와 잎 색깔을 유지하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다

도 1은 Cd 중금속으로 오염된 토양에서 본 발명의 포자흡착제에 의한 중금속 독성 저감 효과를 보여주는 사진이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 포자를 이용한 중금속 제거방법:

(a) 포자의 표면에 4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드를 결합시키는 단계; 및

(b) 상기 포자를 중금속을 포함하는 시료에 접촉시키는 단계.
다음의 단계를 포함하는 중금속으로 오염된 토양에서의 식물 성장의 촉진방법:

(a) 포자의 표면에 4-10개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드를 결합시키는 단계;

(b) 상기 포자를 중금속으로 오염된 토양 또는 식물체에 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 식물체를 성장시키는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 포자 코트단백질에 상기 펩타이드를 융합된 상태로 발현시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 포자의 표면에 상기 펩타이드를 교호결합제(cross-linking agent)로 공유결합시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 포자는 포자형성 그람음성 박테리아, 포자형성 그람양성 박테리아, 포자형성 방선균, 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 포자는 바실러스 속 박테리아로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 중금속은 +2가의 금속이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 중금속은 Co, Ni 또는 Cd인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 펩타이드는 6개의 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.