CN114901800A - 苏云金芽孢杆菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，其不产生β‑外毒素，并且对草地贪夜蛾表现出杀虫活性，草地贪夜蛾是一种用目前市场上可用的基于Bt的产品控制很差或无效的昆虫。因此，基于该菌株的组合物可用作杀虫剂或用于制备杀虫剂，优选地使用的组合物是该菌株的孢子和晶体蛋白的组合。该菌株的基因组包含至少6个不同的cry基因和至少3个不同的vip基因的组合，尚未在其他Bt菌株中描述过并可用于对其进行鉴定。
Description
发明领域
本发明属于害虫防治领域，具体涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的害虫防治。更具体地，本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bt)的新型细菌菌株SVBS-1801，其已证明具有对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的杀虫活性。目前市场上可用的基于Bt的产品在控制草地贪夜蛾害虫方面要么无效要么效率低下。
发明背景
苏云金芽孢杆菌(Bt)是一种需氧和革兰氏阳性土壤细菌，由于其在缺乏营养物质的情况下具有孢子形成能力，因此在分类学上被归类为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。Bt以合成多种毒素而闻名，这些毒素靶向破坏栽培植物并显著降低其产量的的昆虫害虫和其他生物(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html)。几种Bt毒素是细菌合成的蛋白质聚集的结果。这发生在孢子形成阶段期间，并导致形成伴孢体(晶体)，它构成了Bt与同一分类群的其他物种相比的差异特征。该晶体包含
-内毒素Cry和Cyt，它们分别是昆虫靶向毒素和溶细胞蛋白。后者具有相当非特异性的活性并仅在少数Bt菌株中发现。形成晶体的蛋白质在其结构中含有二硫桥和疏水键，使它们具有蛋白酶抗性。因此，一旦孢子形成阶段结束，这些蛋白质可以在Bt营养细胞的细胞质内积累并促进高浓缩的活性化合物的释放。
Bt自其表征以来一直被认为是作物和储存产品的有效害虫防治剂。因此，过去几十年见证了全球范围内采样计划的开始，导致发现了具有不同杀虫特性的各种菌株。这些微生物最初是根据它们的鞭毛抗原进行分类的(Lecadet等人,1999)。然而，现在人们普遍认为，某种菌株的杀虫特性与其抗原H类型之间没有联系。每个Bt菌株都显示出独特的毒性模式，这取决于它产生的毒素的相对比例。一些Bt菌株可产生热稳定的分泌外毒素或β-外毒素，其与ATP竞争RNA聚合酶结合位点，因此，使其对多种物种有毒并阻止其被用作杀虫剂(Sebesta&Horská,1970)。
Schnepf和Whiteley首先通过在大肠杆菌中克隆和表达cry基因证明了Bt晶体的杀虫特性(Schnepf和Whiteley,1981)。从那时起，许多其他的cry和cyt基因已被证明对分类为鳞翅目(Baig等人,2010)、双翅目(Roh等人,2010)、鞘翅目(López-Pazos等人,2010)和膜翅目(Sharma等人,2008)的昆虫物种具有特定的杀虫活性。其他植物噬菌体(phytophage)，如螨虫(Frankenhuyzen,2009)和线虫(Hu等人,2010)也对此类Bt毒素易感。
有一些值得注意的毒素变体没有整合到Bt晶体中，但也表现出令人感兴趣的杀虫特性。蛋白质Cry1I、Vip(营养期杀虫蛋白)(Estruch等人,1996)和Sip(分泌的杀虫蛋白)(Donovan等人,2006)就是这种情况，它们在细胞营养生长期间分泌到培养基中。有趣的是，所有具有所述杀虫活性的毒素变体(Cry、Cyt、Vip、Sip)通常都编码在大约40kbp的质粒中，尽管在某些情况下，相应的基因也可能存在于细胞染色体中。
自从Carozzi及其同事(Carozzi等人,1991)首次引入聚合酶链反应(PCR)作为检测Bt杀虫基因的方法以来，它一直是对Bt集合进行分类的最广泛方法，直到最近(Cerón等人，1995；Ferrandis等人，1999)。然而，高通量测序的最新进展使得以合理的时间/成本比实现对某种Bt菌株的完整遗传表征成为可能。了解Bt菌株的完整染色体和质粒序列使得可以检测负责其杀虫特性的基因簇，这已经用作确定此类特定菌株的宿主的指南。尽管如此，这样的估计结果是不准确的，因为它没有考虑每个基因的表达模式，而这最终决定了在晶体中发现的或分泌到培养基中的毒素的相对比例。
可用杀生物剂基因的完整列表由1000多个不同的序列组成(Crickmore,N.等人,2018)，并按照Crickmore提出的标准(Crickmore等人1998)进行分类，这些标准基于核苷酸和氨基酸序列。该分类系统的工作方式如下：具有相同编号的所有cry基因(例如cry1)共享45％或更高的同一性百分比。如果它们也共享相同的大写字母(例如，cry1A)，则此类同一性必须为78％或更高。此外，如果后跟相同的小写字母(例如，cry1Aa)，则认为它们之间的同一性至少为95％。最后，为了区分编码具有95％或更高同一性的蛋白质的两个基因，可以在小写字母后添加另外的数字(例如，cry1Aa1)。
所描述的cry基因的数量在不断增长，其中一些基因显示出同一性百分比低于45％，表明它们是具有潜在独特杀虫特性的新候选基因。因此，对Bt毒素易感的宿主数量显著增加，包括新的昆虫、螨和线虫物种。尽管Bt的兴趣主要集中在害虫防治上，但新基因的发现使得发现其他研究领域的蛋白质成为可能。副孢菌素就是这样一个例子，它是被证明具有抗肿瘤药物的功效的蛋白质家族(Ohba等人，2009)。
1938年，法国制造了第一种基于Bt的配方产品，并且60年代，USA、URSS、法国和德国配制和生产了大量Bt工业产品(Milner，1994)。80年代，由于昆虫种群中出现了抗药性个体，化学杀虫剂已经开始显示出缺陷，人们对Bt衍生产品的兴趣急剧增加。然而，随着合成拟除虫菊酯的出现，这种兴趣很快就消失了。人们越来越有兴趣将化学合成的杀虫化合物替换为天然化合物，或甚至是能够控制害虫同时对农作物和/或脊椎动物(如人类)无害的活生物体，这使得人们对基于Bt的产品产生了新的兴趣。
如今，由于全球各地的采样计划，对Bt多样性及其杀虫基因分布的了解，将这种细菌描述为产生新杀虫剂的来源。对于要在发达国家使用这些类型的产品，它们必须适应当前的法规，这在大多数情况下要求Bt菌株不含β-外毒素。原因是这些外毒素表现出相当不特异性的广泛作用，可能对包括人类在内的其他生物体有害(Sebesta yHorská,1970)。
Bt菌株的杀虫特征在传统上是通过执行生物测定法来阐明的。然而，由于它们耗费资源时间的性质，它们已经被通过PCR鉴定cry基因得到部分地取代。然而，基因含量只能用作估计，因为它没有显示每个基因表达量的信息(Masson等人,1998)。晶体内的蛋白质相互作用也可能影响其杀虫特征，因此功能多样的Cry和/或Cyt蛋白质的混合物可能比预期的更有效(协同作用)或更无效(拮抗作用)(Tabashnik,1992)；因此，无法根据对单个内毒素的了解预测Bt蛋白混合物(通常，Bt菌株产生一组Cry蛋白)的毒性(Hilbeck和Otto,2015)。因此，仍然需要生物测定作为信息的补充来源，以充分表征Bt菌株。
因此，寻找针对特定昆虫或线虫害虫具有活性的新Bt菌株不仅因为每个Bt菌株表现出取决于其产生的毒素、它们的相对比例以及产生的毒素之间可能出现的不可预测的协同或拮抗作用的独特毒性模式而受到阻碍，也因为具有高度同源性的Cry蛋白可能在特异性和功能性方面表现出重要差异，因此很难尝试推断其活性来预测可由其他Bt菌株产生的同源蛋白的活性，产生与另一种Cry蛋白非常相似的Cry蛋白的Bt菌株可具有对同一组昆虫的活性或活性程度(同源Cry蛋白在与Bt菌株产生的蛋白质混合物中的其他Bt蛋白相互作用时可表现出)并非明显。
使寻找和鉴定对特定昆虫具有高活性的Bt菌株变得困难和不明显的附加复杂因素是，关于某些Cry蛋白的活性和特异性或关于一些已知Bt菌株的杀虫潜力的现有信息不完整，得不到实验数据支持或者基于测定，结果以相对不同于本领域技术人员通常处理的量值或单位表示，因此降低了已发布信息的实用性和适用性。
例如，在控制草地贪夜蛾的特殊情况下，可以找到一些不同的出版物，这些出版物涉及据说具有抗草地贪夜蛾活性的Bt菌株，但不包括确认其的测定法，或包括以不同于本领域技术人员用于表达杀虫活性的标准单位的单位表示的结果，使得难以评估其有效性程度。人们还可以找到一些出版物，这些出版物报告了一些Cry蛋白针对草地贪夜蛾的活性，这些活性不是基于对鳞翅目昆虫的分析，也不是基于对单个蛋白质进行的分析，这不允许推断所测定的蛋白质在与Bt菌株产生的其他蛋白质相互作用时可能具有的活性，或氨基酸序列变化可能导致的活性和特异性的差异，即使与其他Cry蛋白质保持高度同源，如上所述。
例如，欧洲专利申请EP-0366397-A1描述了一种据说具有针对鳞翅目害虫活性的Bt菌株(PS814)。然而，没有显示针对草地贪夜蛾的活性测定法。该菌株在其基因组中包含与称为cry1Ea7的基因序列具有100％的同一性并完全重叠的基因(数据库btnomenclature,http://www.btnomenclature.info中的登录号AY894137)，该基因在文件中以δ内毒素基因的形式呈现，该基因针对鳞翅目害虫具有活性，但没有测定法证明相应的Cry蛋白对任何昆虫害虫具有任何活性。
美国申请US2010/160231-A1公开了包括编码据说对应于杀虫多肽的氨基酸序列的编码序列的组合物，以及用于将杀虫活性赋予细菌和其他细胞和组织(包括种子)的方法。尤其是命名为axmi-150的δ-内毒素的编码序列，显示出与已知为cry1Nb1的基因序列的完全重叠和100％同一性(数据库btnomenclature,http://www.btnomenclature.info中的登录号KC156678)。尽管该文件包括可由包含该基因的重组菌株或包含该多肽基因产物的组合物控制的昆虫长列表，但仅对蛋白质AXMI-150的杀虫活性进行了测定并显示对四种害虫的杀虫活性，四种害虫中没有一种是灰翅夜蛾属(Spodoptera)的成员，尤其是四种害虫中没有一种是草地贪夜蛾：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、天鹅绒豆毛虫(Anticarsiagemmatalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)、西南玉米螟(Diatrella grandiosella)。
Polanczyk及其同事(Polanczyk等人,2000)报告了几种苏云金芽孢杆菌菌株针对草地贪夜蛾的测定法。上述文章的图1显示了每种受试菌株的草地贪夜蛾死亡率。效果最好的菌株属于aizawai血清型，与商用产品
中存在的菌株相同。结果以每单位体积的细菌(细胞数/ml)表示，这与制备商用杀虫剂中活性成分的其他标准单位(微克/ml)不同，因此很难评估和比较这种菌株与目前使用的商用杀虫剂的杀虫能力。提供的关于该菌株的数据并没有明显表明寻找具有更好杀虫能力的替代天然菌株来对抗草地贪夜蛾。
Capalbo及其同事(Capalbo等人,2001)公开了一种用于发酵Bt菌株Bt变种tolworthi的方法，该菌株先前被描述为具有针对草地贪夜蛾的活性。发酵是在固态中进行的，而不是在液体介质中。没有显示关于该菌株本身的具体数据，例如其cry基因含量或蛋白质。包括关于其有效性的测定法，显示0.37mg的生物量/mL为能够杀死50％的昆虫的致死浓度，即LC50，但该文献的材料和方法部分没有确定该值的方法，这使得难以评估和比较该菌株与其他Bt菌株的杀虫活性。
Barreto及其同事(Barreto等人,1999)公开了几种Bt菌株的Vip蛋白针对草地贪夜蛾的活性测定。该文献摘要提到了所有描述的菌株之间的显著差异，尽管它们都属于同一血清型(Berliner)。这突出表明，仅根据遗传和分子特征很难找到针对特定物种(如草地贪夜蛾)具有高活性的Bt菌株。在D5中，据说具有较高活性的所测得上清液可能含有β-外毒素(见第680页左栏末尾及其右栏的延续)，这是本发明目的不需要的遗传特征，因为它们不适用于生物杀虫剂，并且这在SBVS-1801菌株中不存在。在整个D5中，没有证据表明所述菌株与SBVS-1801、从其培养物中获得的成分或其用作杀虫剂或用于制备杀虫剂有关。
其他不同的已发表文献描述了来自Bt菌株(从中分离或通过天然蛋白突变获得)的单个δ-内毒素蛋白，据说这些菌株具有针对草地贪夜蛾的一定活性。然而，大多数所述文件教导或讨论了不完整或未经适当测定法证实的信息，这使得这些文献在搜索具有针对草地贪夜蛾具有高活性的新的、天然的Bt菌株方面的效用降低：例如，本领域技术人员将发现，例如一些文件没有公开来自几种Cry/Cyt蛋白组合的实验数据，因此，忽略了杀虫蛋白之间相互作用的影响，这是在天然条件下将由Bt菌株产生的结果，或者用于功效测试的蛋白质浓度不是由天然Bt菌株产生的，这取决于培养条件。还必须考虑到，Bt菌株产生特定多肽并不意味着该菌株将生成具有针对草地贪夜蛾的高活性的晶体。这些文献的某些特定方面如下：
以WO 2012/131495 A2公布的国际专利申请公开了天然δ-内毒素Cry1Ab的几种突变多肽。源自Cry1Ab的突变体是含有氨基酸取代的突变体。这些重组蛋白显示针对草地贪夜蛾的活性，其中一些甚至比天然多肽更高。虽然进行测定法的条件没有很好的描述，但实验仅涉及蛋白Cry1Ab及其衍生突变体作为活性成分。因此，WO2012/131495缺乏Cry蛋白之间的相互作用测定法，这可能会对整体杀虫效力产生显著影响。此外，使用的浓度是人为的，并因此很难预测它们是否与Bt菌株产生的浓度相当。此外，WO 2012/131495中提到的仅有微生物是那些用编码突变多肽的核酸转化的微生物。因此，上述国际申请很难被视为用于识别具有针对草地贪夜蛾的活性的新的天然和替代Bt菌株的适当信息来源。
中国专利CN 103333230 B描述了一种δ-内毒素，Cry1Da3，其由可在btnomenclature数据库以登录号HQ439784找到的DNA序列编码。尽管Cry1Da3针对小卷心菜蛾(Pieris brassicae)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的活性已被阐明，但并未提及夜蛾属的其他物种，特别是没有提及草地贪夜蛾及其可能的防治效果。
国际专利申请WO 95/04146A2公开了一种基因(cryET4)和一种蛋白质(CryET4)，该基因和蛋白质与被称为cry1Ja1的基因(在btnomenclature数据库中的登录号L32019)及其相应的编码蛋白质具有高同一性。值得注意的是，第5页的第一段强调了具有高度同一性的Cry蛋白如何可对个体昆虫物种显示不同量地的毒性。还描述了用cryET4基因转化的Bt菌株。WO 95/04146A2的实施例4表明纯化的CryET4蛋白显示出针对草地贪夜蛾的活性。然而，从中分离出该基因的Bt菌株的活性及其发酵后获得的晶体组分并未写明，这一信息对于确定其是否构成用于控制草地贪夜蛾的新的、天然和替代Bt菌株至关重要。
美国专利申请US 2009/005306公开了一种编码蛋白质Cry2Adshi的Bt基因，其具有具有针对几种昆虫害虫的杀虫活性。然而，上述美国申请的表1中显示的结果表明，该蛋白质针对草地贪夜蛾没有活性。这在实施例3的表3中得到进一步证实，表3表明针对秋季粘虫(草地贪夜蛾)检测到“无活性”。此外，所述美国申请中公开的发明的主要目的似乎是生成表达US 2009/005306中公开的基因的转基因植物，而不是鉴定具有针对草地贪夜蛾的高活性的新的天然Bt菌株。
美国专利申请US 2018/127771 A1公开了几种源自Bt菌株的蛋白质，这些蛋白质具有针对亚洲柑桔木虱(Diphorina citri)的活性，亚洲柑桔木虱缩写为ACP，属于不同于草地贪夜蛾(鳞翅目)的目(半翅目)。事实上，美国专利申请中甚至没有提到草地贪夜蛾。实施例1说明，该研究的总体目标是鉴定针对ACP具有毒性的Bt晶体毒素。此外，已鉴定的毒素旨在通过在转基因植物中的实施来控制植物y半翅目昆虫。
国际专利申请WO 2013/134734 A2公开了两种与已经提到的基因cry1Ab24和cry1Ja1编码的蛋白质具有高度同一性的蛋白质。然而，它们不是发明的主要目的。WO2013/134734 A2重点关注由几种多肽(其中一些具有杀虫特性)组合而成的多肽，以及它们在转基因植物中表达的改善。显示了与草地贪夜蛾控制相关的叶面生物测定法，采用喷雾干燥粉末进行，粉末中含有源自Bt蛋白的肽和抑制剂半胱氨酸结肽。但是，只是简单地提到了草地贪夜蛾作为控制所感兴趣的昆虫之一，而没有提供任何针对该物种的测定法。
因此，尽管在Bt菌株中发现了遗传多样性，但与仅基于遗传和分子特征很难找到针对特定物种(如草地贪夜蛾)具有高活性的Bt菌株一致，用于控制鳞翅目昆虫的市售生物杀虫剂仅依赖于来自kurstaki和aizawai血清型的少数。作为最广泛使用的产品之一，
采用了由来自菌株ABTS-351(血清型kurstaki)的孢子和晶体蛋白的组合而制成的活性成分。ABTS-351菌株产生的晶体包含蛋白质Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa，发现它们的相对比例取决于培养基的组成和生长条件。
以及其他基于ABTS-351菌株的商业配方产品可有效控制属于鳞翅目的广谱幼虫物种，包括来自棉铃虫属(Heliothis)、菜蛾属(Plutella)和花翅小卷蛾属(Lobesia)的物种。然而，普遍认为这些产品针对属于灰翅夜蛾属(Spodoptera)的昆虫物种效果不佳，包括草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾(S.littoralis)、甜菜夜蛾(S.exigua)等。由于这些物种损害作物，对经济造成严重负面影响，因此ABTS-1857(血清型aizawai)被选为杀虫毒素的新来源。
是目前最臭名昭著的基于ABTS-1857菌株的商用杀虫剂，携带蛋白质Cry1Ca、Cry1Da、Cry1Aa和Cry1Ab。尽管不能去除由于其他蛋白质的存在而产生的协同效应，但前两种蛋白质是对灰翅夜蛾有效的主要杀虫剂。
尽管市场上存在基于Bt的产品，但昆虫种群已经对它们产生了不同程度的抗性，寻找用于害虫控制的新Bt菌株的努力正在增加。需要鉴定具有更高杀虫效力和更广泛宿主范围的新Bt菌株。特别是出于本发明的目的，特别想要找到并鉴定具有针对草地贪夜蛾的改进杀虫活性的新Bt菌株。优选地，新的Bt菌株应该是从环境样品中分离的天然菌株。同样优选地，为了促进菌株或基于菌株的产品的使用，新的Bt菌株不应表达β-外毒素，以避免多种物种的细胞死亡风险。
本发明提供了这种问题的解决方案。
发明概述
本发明涉及一种新的苏云金芽孢杆菌菌株(本发明的苏云金芽孢杆菌菌株)，其特征在于是以登录号CECT 9753保藏于Colección
de Cultivos Tipo(CECT)的菌株SVBS-1801。
第二方面，本发明还涉及一种制备本发明苏云金芽孢杆菌菌株SBVS-1801的孢子和晶体的混合物的方法，包括以下步骤：
a)培养SBVS-1801细菌，直到超过95％的细菌细胞已经发生孢子形成、已经裂解并将其晶体和孢子释放到培养基中；
b)通过引起晶体和孢子从它们悬浮的培养基中沉降来纯化晶体和孢子，优选地通过离心，并收集沉淀物；
c)任选地，用蛋白酶抑制溶液洗涤沉淀物并再次引起晶体和孢子的沉降；
d)储存纯化的晶体和孢子：
a.在室温，在已经将步骤b)或c)中获得的沉淀物冻干后，或
b.在-18°至-20℃或更低的温度，在已经将b)或c)中获得的沉淀物重新悬浮在水或水溶液中后。
在第三方面，本发明涉及一种获得本发明的苏云金芽孢杆菌菌株SVBS-1801的纯化的晶体(伴孢晶体)的方法，该方法包括以下步骤：
i)用NaCl 1M洗涤SVBS-1801的晶体和孢子的混合物，并以9000g离心10min，
ii)收集团块并将其重新悬浮在PBS中，
iii)向步骤ii)中获得的悬浮液中加入己烷并涡旋；
iv)将iii)的悬浮液以6000g，4℃，离心10min，
v)重复步骤ii)至iv)至少3次，
vi)收集在v)中获得的晶体团块并在冷蒸馏水中洗涤三次。
晶体和孢子(用于获得纯化的晶体)的混合物可以是用于制备本发明苏云金芽孢杆菌菌株SBVS-1801孢子和晶体混合物的方法的步骤b)或c)后得到的混合物，这是本发明的第二方面。
在第四方面，本发明还涉及一种组合物，其包含以下组中的至少一种：本发明的苏云金芽孢杆菌菌株的a)营养细胞，b)含有孢子的细菌细胞，c)孢子，d)晶体(伴孢晶体)，e)孢子、晶体和晶体蛋白的混合物，f)不包含在晶体中的至少一种Cry蛋白，g)至少一种Vip蛋白，或其组合，其中组合物(如果a)至e)中定义的组成员不存在)i)当至少存在Cry蛋白时，至少存在Cry1Ja1样蛋白(SEQ ID NO:8)，和/或ii)Vip1Ca1(SEQ ID NO:14)、Vip2Ac1(SEQID NO:16)和Vip3Af3(SEQ ID NO:18)组的所有三种蛋白将存在于组合物中。这种组合物被认为是本发明的组合物。任选地，在与任何其他相容的实施方案中，组合物还可以另外包括在执行用于制备本发明的苏云金芽孢杆菌菌株的孢子和晶体的混合物的方法的步骤a)和b)之后获得的部分上清液。本发明组合物的优选实施方案是其中组合物包含至少以下任一项的那些：a)孢子和晶体的混合物；b)通过执行本发明一方面的制备菌株SBVS-1801的孢子和晶体混合物的方法步骤a)和b)获得的孢子、晶体和部分上清液的混合物；c)晶体；d)通过执行本发明一个方面的制备菌株SBVS-1801的孢子和晶体的混合物的方法步骤a)和b)获得的晶体和部分上清液。同样优选的是那些至少包含菌株SBVS-1801的孢子、晶体和晶体蛋白的混合物的组合物(它们是用于从Bt菌株的培养基制备杀虫剂的组合物的典型组分)。还优选的是那些包含不包含在晶体中的Cry蛋白的组合物，并且其中该组合物包含至少SEQ IDNO:4(Cry1Da3)、SEQ ID NO:6(Cry1Ea7)和SEQ ID NO:8(Cry1Ja1-like)的组中的所有Cry蛋白(不包含在晶体中)。本发明的组合物还可另外包含至少一种农业上可接受的赋形剂。
本发明的另一方面是本发明的苏云金芽孢杆菌菌株和/或本发明的组合物作为杀虫剂或用于制备杀虫剂的用途。优选地，它将用于防治草地贪夜蛾物种的昆虫害虫。还优选地，该组合物将用于保护植物免受害虫侵害。植物可以是玉米植物，如在实施例8中，或任何其他植物，例如棉花(另一种植物，其中草地贪夜蛾是重要损害的原因，并且之前已经使用表达Cry蛋白的转基因植物)、水稻、高粱、甘蔗等。
本发明的另一方面是用于鉴定本发明的苏云金芽孢杆菌菌株存在的方法，其包括确定以下任一者的步骤。
a)该菌株的基因组包括：
i)其序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7，或其组合的至少一个基因或DNA区域；和/或
ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQID NO:11的组中的至少所有基因或DNA区域，和/或
iii)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的组中的至少所有基因或DNA区域；和/或
iv)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的组中的所有基因或DNA区域；
或者
b)该菌株表达
i)其氨基酸序列选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8，或其组合的组的至少一种多肽，和/或
ii)其氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10或SEQ ID NO:12的多肽的组中的至少所有多肽，或
iii)其氨基酸序列为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的多肽的组中的至少所有多肽，
iv)其氨基酸序列为SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQID NO:10,SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的多肽的组中的所有多肽。
还可以认为本发明的另一方面是本发明的DNA分子，即，包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子：
a)选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的组的核苷酸序列；
b)编码包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8的组的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
c)编码与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8的组的氨基酸序列具有至少99％同一性且具有杀虫活性(例如，杀线虫和/或杀虫活性)的多肽的核苷酸序列。
因此，还可以认为本发明的另一方面(与前一方面紧密相连)是包含本发明DNA分子的表达载体。
同样的，还可以认为另一方面是包含本发明DNA分子的重组病毒、细菌、真菌或酵母、植物细胞或整个植物或植物的部分。DNA分子将优选地操作性地连接到启动子，并且任选地连接到一个或多个附加控制元件(例如增强子)，并且其整合到其基因组中。
附图简要说明
图1.SVBS-1801的形态学：A)营养细胞(VC)；B)在细胞裂解前含有完全形成的孢子和晶体的细菌细胞；和C)由于细菌细胞的裂解而已经释放的孢子和晶体。
图2.阳性对照菌株BT2(菌株Bt HD2)和样品菌株BT4(SVBS-1801)产生β外毒素的比较分析结果。
图3.ABTS-351
ABTS-1857
和SVBS-1801纯化的晶体的SDS-PAGE分析(分别为泳道2、泳道3和泳道4)。包括分子量标志物(通道1)。
图4.SVBS-1801cry1Ab24样基因(Sbjct)及其最相似参考基因cry1Ab24的核苷酸序列比对(Query)。
图5.SVBS-1801cry1Ja1样基因(Sbjct)及其最相似参考基因cry1Ja1的核苷酸序列比对(Query)。
图6.SVBS-1801Cry1Ab24样蛋白(Sbjct)及其最相似参考蛋白Cry1Ab24的氨基酸序列(Query)，其中可以观察到参考蛋白Cry1Ab24在SVBS-1801Cry1Ab24样蛋白序列(SEQID NO:2)的793和794位之间有26个额外氨基酸。
图7.SVBS-1801Cry1Ja1样蛋白(Sbjct)及其最相似的参考蛋白Cry1Ja1的氨基酸序列(Query)。
图8.使用100mg/L的孢子/晶体混合物，使用ABTS-1857和SVBS-1801菌株处理12、24或36小时后收集的草地贪夜蛾的死亡率百分比。
发明详述
本发明基于对苏云金芽孢杆菌的菌株SVBS-1801的发现、分离和表征，该菌株已证明对草地贪夜蛾幼虫具有杀虫活性。它分别包含至少6个cry基因和3个vip基因。
在该菌株中发现的两个cry基因(其编码序列分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7匹配)可被视为之前未分离和测序的新基因，因为它们的编码序列与任何已知的cry基因不相同，因此，测定所述两个基因中的任何一个或最好两个基因在基因组中的存在，可用于将苏云金芽孢杆菌细菌鉴定为该新菌株细菌。然而，它们与参考已知基因cry1Ab24和cry1Ja1的同一性程度分别较高(第一种情况下为98％，第二种情况下为94％)，因此它们没有被认为是完全不同的基因，分别被命名为cry1Ab24样和cry1Ja1样。
新菌株SVBS-1801具有一组6个cry基因和3个vip基因，与其他已知品种不同。所提到的每一组基因都可以被认为是这种新菌株的独特和特征，在其他苏云金芽孢杆菌菌株中没有描述过。
因此，确定6个cry基因或3个vip基因或者优选地9个基因的组同时存在，有助于鉴定菌株并将其与其他Bt菌株区分开来。用于鉴定苏云金芽孢杆菌菌株的任何方法(包括确定存在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的任何(或两者)基因，和/或同时存在SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的6个cry基因的组，和/或同时存在SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的3个vip基因的组，或同时存在两组基因，如果存在每个备选方案的上述基因，则得出该菌株为苏云金芽孢杆菌菌株SVBS-1801的结论)将被认为包括在本发明的范围内及其一个方面。检测由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7编码的至少一种蛋白质的表达，即分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8的蛋白质，也可用于鉴定SVBS-1801菌株。类似地，可通过确定由上述基因的组编码的多肽的表达来鉴定菌株，即，确定并证实其氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的多肽的组的至少所有多肽的表达(分别由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的基因的组编码的Cry蛋白的组，其同时存在于Bt基因组中是本发明的Bt菌株的特征)，和/或其氨基酸序列为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的多肽的组的至少所有多肽的表达(分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的基因的组编码的Vip蛋白的组，其同时存在于Bt基因组中是本发明的Bt菌株的特征)或其氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:18的多肽的组的所有多肽，可用于鉴定本发明的Bt菌株SVBS-1801的存在。
如在本申请中所使用，“鉴定存在”可理解为确定样品中Bt菌株SVBS-1801的存在或鉴定特定菌株为本发明的Bt菌株SVBS-1801。由于基因cry1Ab24样和cry1Ja1样是新的并且甚至与最相似的已知基因(cry1Ab24和cry1Ja1)不同，并且之前没有描述过它们同时存在于Bt菌株的基因组，它们还可用于定义本发明的新菌株，特别是cry1Ja1样或由其编码的蛋白质，因为其表现出针对草地贪夜蛾的活性。如上所述，之前没有报道过Bt菌株同时存在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的cry基因的组，也没有同时存在SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的vip基因的组，使得在其所有基因组中所述两组基因中的任何，或同时存在，也可用于通过所述菌株的特征和不明显或预期在特别是非实验室创建但从环境源分离的菌株中会发现的特征来定义本发明的Bt菌株。这一关于通过可发现的cry和vip基因的特定组合来定义菌株的实用性的评论可以扩展到由所述基因编码的蛋白质。
于2018年11月14日保藏在Colección 
de Cultivos Tipo(CECT)并获得登录号：CECT 9753的菌株SVBS-1801是本发明的一方面。
关于在SVBS-1801Bt菌株中发现的cry和/或vip基因编码的蛋白质，所有已鉴定的Cry蛋白质可存在于晶体中，而Vip蛋白应在生长阶段分泌后在生长培养基的上清液中发现。
值得注意的是，该菌株的毒性谱包括草地贪夜蛾，目前市场上的生物制品对其控制效果并不理想。以前没有知识表明显示上述基因组合的菌株可以具有针对草地贪夜蛾的活性，并特别是，以前没有知识表明具有这种特定基因组合的菌株具有针对草地贪夜蛾的活性高于用于制备目前用于针对这种害虫的商业杀虫剂的菌株，如下面的实施例所示。这一点尤其值得注意，因为根据遗传和分子特征发现对特定物种具有高活性的Bt菌株是一项困难且不明显的任务。如上所述，这些困难不仅源于具有高度同源性的Cry蛋白可能表现出针对害虫的不同活性和特异性的事实，而且尤其是因为无法预测Bt菌株产生的不同毒素之间可能会发生哪些组合效应，其类型(协同或拮抗)，以及组合效应可能对Bt菌株及其发酵产物的杀虫活性的影响程度。事实上，本申请公开了由SVBS-1801产生的三种Cry蛋白质之间的协同效应，该协同效应导致相对于由所述蛋白质中的每一种的活性的简单组合产生的预期活性的活性增加，这是一种完全出乎意料的组合效应。
因此，本发明提供了一种新的Bt菌株SVBS-1801，该菌株从环境来源分离并且缺乏β-外毒素的表达，可用于控制草地贪夜蛾害虫。本发明还包括制备包含SVBS-1801的晶体和孢子的混合物的组合物的方法(通常用于制备商用杀虫剂的组合物种类)、制备菌株的纯化的晶体的方法，包含由菌株产生或由其生长产生的不同组分的组合物：晶体和孢子的混合物，其中可能还存在其他组分，例如不包含在伴胞晶体中的Cry蛋白、营养细菌或Vip蛋白、具有不包括在晶体中的Cry蛋白的组合物、纯化的晶体或甚至具有纯化的晶体或具有晶体与孢子的混合物的组合物，其中，当培养菌株的液体培养基离心以将晶体和孢子从细菌生长的液体中分离出来时，获得部分上清液。本发明的范围还包括使用该菌株以及包含该菌株或者包含该菌株产生的或其在液体发酵培养基中生长产生的元素的组合物作为杀虫剂或用于制备杀虫剂，尤其是针对草地贪夜蛾的杀虫剂。
本发明还涵盖SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的新基因、由SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:7编码的蛋白质(即SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8的蛋白质)，以及包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8具有至少99％同一性的多肽且具有杀虫特性的蛋白质。本发明还涵盖可衍生自SVBS-1801的所有突变菌株，尤其是使用所述基因获得的重组细菌菌株(例如，可按照实施例4中所述的程序获得)或甚至酵母、真菌或甚至植物细胞的重组细胞，以及允许在其基因组中表达所述蛋白质或插入SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的基因的载体，例如质粒或重组病毒。在植物细胞的情况下，不仅插入SEQ ID NO:7的基因，而且插入SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:5的基因，或者，引入所有三个基因的表达载体可能是感兴趣的，因为当单独测试时，由上述三个基因表达的蛋白质显示出针对草地贪夜蛾的活性，但当组合测试时，它们也显示出协同效应。
苏云金杆菌菌株SVBS-1801具有以下特征：
生长：苏云金芽孢杆菌SVBS-1801优选在28-30℃的富盐培养基(例如本发明实施例1中描述和使用的CCY培养基)中生长。在这种条件下，孢子萌发并产生双锥晶体，其可以在光学显微镜下观察到(图1)。当在固体培养基(CCY或Luria-Bertani(LB)肉汤中培养，补充有琼脂)中生长时，菌落的形态与其他Bt菌株非常相似，圆形，边缘不规则，外观呈蜡状。当在适当的培养基：富盐培养基，如CCY培养基和温度条件(温度可以在15-45℃之间变化，但最佳范围为28至30℃)中使用时，SVBS-1801可以工业规模生长。还需要连续搅拌(例如220rpm)。
没有外毒素。如上所述，一些Bt菌株可产生分泌性的毒素，β-外毒素，其可以损害RNA聚合酶，导致多种物种的细胞死亡，并阻止使用该菌株或基于其的产品作为杀虫剂。如实施例2所示，SVBS-1801在发酵过程中不产生β-外毒素。因此，认为它具有广泛而不特定的作用范围。
Bt毒素/晶体蛋白：由本发明菌株SVBS-1801合成的Cry蛋白在孢子形成阶段聚集和结晶，产生伴胞晶体，在本申请中简称为“晶体”。它们在SDS-PAGE凝胶中的迁移模式可以描述为两条相互接近的带，大小约为120-135kDa(Cry1Ab、Cry1Da3、Cry1Ea7和Cry1Ja1)(图3)。来自基于菌株ABTS-351(血清型kurstaki的Bt菌株)的商业产品的晶体蛋白，
(Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1Ac y Cry2Aa)和基于ABTS-1857株(Bt血清型aizawai)的商业产品的晶体蛋白，
(Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ca和Cry1Da)迁移类似，带的大小与菌株SVBS-1801的相当(130-135)；然而，总蛋白质库为每个菌株产生独特的迁移模式。众所周知，
另外产生一条约70-75kDa的条带，对应于蛋白质Cry2Aa。
杀虫能力。如上所述，值得注意的是，SVBS-1801晶体蛋白比其
和
对应物更有效5.7倍和1235.4倍地针对草地贪夜蛾，如本申请的实施例中所示。因此，基于SVBS-1801菌株的产品(即，包含营养细胞、含有孢子的细菌细胞、孢子、晶体、Cry蛋白或Vip蛋白或其组合的组合物)可用作杀虫剂或用于制备杀虫剂。尤其优选的是，用于制备该杀虫剂组合物的活性成分是孢子和晶体蛋白的组合，其是在对培养物内容物(理解例如培养基和生长的细菌细胞、溶解细胞的残余物和细菌产物，如孢子、晶体、细菌蛋白质(不构成晶体一部分)和其他细菌产生的化合物)进行沉淀处理(优选通过离心)后获得的，其中SBVS-1801细菌一直生长直到形成孢子，其晶体和孢子溶解和释放，如实施例1所示：相当于用于制备基于Bt的商业杀虫剂产品(如
或
)的活性成分。
此类活性成分(AI)(菌株SVBS-1801)以及通常包括在其制备物中的晶体和孢子的混合物，可如实施例1所述或通过任何类似方法获得。作为本发明的一个方面，方法包括以下步骤：
a)培养SBVS-1801细菌，直到超过50％的细菌细胞已经发生孢子形成、已经裂解并将其晶体和孢子释放到培养基中；
b)通过引起晶体和孢子从它们悬浮的培养基中沉降来纯化晶体和孢子，优选地通过离心，并收集沉淀物；
c)任选地，用蛋白酶抑制溶液洗涤沉淀物并再次引起晶体和孢子的沉降；
d)储存纯化的晶体和孢子：
a.在室温，在已经将步骤b)或c)中获得的沉淀物冻干后，或
b.在-18°至-20℃或更低的间隔的温度，在已经将b)或c)中获得的沉淀物重新悬浮在水或水溶液中后。
此类AI包含晶体和孢子的混合物，其可重新配制为浓缩液体悬浮液形式的组合物或可湿性粉末，该组合物还可包含一种或多种赋形剂或添加剂，尤其是通常用于农业领域的赋形剂或添加剂。任何这种重新配制的形式都可以应用于田间，并可以用作杀虫剂，优选用于保护植物。如上文所述，它可用于控制害虫，例如草地贪夜蛾。
但值得注意的是，菌株SVBS-1801的优点之一是，本发明的发明人发现，具有由本发明的菌株SVBS-1801产生的不同元件的不同组合物也具有针对草地贪夜蛾的活性，在一些处理中观察到了活性，甚至高于通过上述本发明方法获得的晶体和孢子的混合物的活性。如LC50值所示，将通过相同方法获得的部分上清液添加到晶体和孢子的混合物中显著提高活性(见表5)。使用不含孢子的纯化的晶体进行的测定法也显示就晶体和孢子的混合物而言活性增加，当晶体与相同上清液混合时，活性甚至更高(LC50值更低)。这些结果有助于使用不同的组成来制备AI，每种具有从菌株SVBS-1801产生或来源的不同组分，即：a)孢子和晶体的混合物；b)通过执行制备菌株SBVS-1801的孢子和晶体的混合物的方法步骤a)和b)获得的孢子、晶体和部分上清液的混合物，这是本发明的一个方面；c)晶体；d)通过执行制备菌株SBVS-1801的孢子和晶体的混合物的方法步骤a)和b)获得的晶体和部分上清液，这是本发明的一个方面。
纯化的晶体可通过实施例8中使用的方法制备，这也是本发明的一个方面，但也可通过本领域技术人员已知的任何其他方法制备，例如蔗糖梯度上的超速离心(Thomas和Ellar,1983)，该方法通常为不连续蔗糖梯度(79-67％)，其中晶体被截留在相间，并且孢子可以从团块中收集。如果如本申请实施例8所述，通过制备物或组合物样品的共焦显微镜，或者通过类似方法检查孢子的存在，观察不到孢子，则晶体制备物或包含SBVS-1801晶体的组合物将被视为不含孢子或基本不含孢子。
当组合物中不需要孢子时，可通过添加杀菌剂来代替晶体的纯化。杀菌剂也可添加到具有纯化的晶体的组合物中，以通过消除晶体纯化后可能残留的任何可能的孢子来保证没有孢子。可通过将纯化的晶体悬浮液的稀释液接种到营养琼脂平板中，并验证没有菌落生长，从而检查不存在孢子，并因此晶体完全没有孢子且其纯度最高。如果添加，杀菌剂将优选地选择为与本发明的菌株和组合物的生态特性兼容。
在实施例8中获得的结果，其中孢子和晶体的混合物以及纯化的晶体都显示出针对草地贪夜蛾的活性，表明可以设想用所述元素的不同比例(例如，50:50或80:20晶体：孢子，或任何其他)制备孢子和晶体的混合物，可以将它们全部用于制备杀虫剂的活性成分。因此，例如，必须考虑在本发明中包含具有孢子和晶体的那些组合物，其中晶体是通过产生结晶的方法得到的，不是完全提纯的，但它们仅是，例如，80％纯化的(或任何其他百分比，如85％、90％或95％纯化)，因此，该制备物实际上将是也包含在本发明范围内的晶体和孢子的混合物。
同样在实施例8中，但在第8.3节中，显示了关于由本发明菌株合成的单个Cry蛋白的毒性的测定法。根据获得的结果(见表6和表7)，菌株SVBS-1801的伴胞晶体的杀虫活性可归因于Cry蛋白Cry1Da3、Cry1Ea7和Cry1Ja1样，当分别对针对草地贪夜蛾幼虫进行测试时，这些蛋白具有毒性。蛋白质Cry1Ja1样的活性显著，因为其由本申请中公开的一个基因cry1Ja1样(SEQ ID NO:7)编码，如上文所述，该基因与已知基因cry1Ja1存在一定差异。特别值得注意的是，事实上使用三种蛋白质的混合物进行的测定显示，对于三种蛋白质中任何一种的相同浓度，活性增加，表明三种蛋白质的混合物中的组合协同效应，这已在实施例8的同一部分中得到证实。从先前发表的文献的教导中未预期到所确定的协同效应，并支持没有预期具有SVBS-1801基因组合的菌株能够具有针对草地贪夜蛾的高活性(尤其是针对幼虫)，其活性高于目前使用的最有效的商用杀虫剂(针对该菌株)
(见实施例9至11)和Capalbo等人，(2001)描述的最有效菌株，在某种程度上缺乏对该文章中报告的测定法中用于测量LC50的方法的解释，可进行比较。
在用Cry蛋白的测定法中发现的结果使得也可以考虑包含蛋白Cry1Da3、Cry1Ea7和Cry1Ja1样(分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID No.8)的混合物的组合物作为本发明的组合物的可能实施方案，特别是如果它们以等摩尔比例。此类组合物还可用作杀虫剂或用于制备针对草地贪夜蛾的杀虫剂。
杀虫基因。如表2和表3所示，SVBS-1801的基因组(染色体+质粒)分别包含至少6个不同的cry基因和3个不同的vip基因。两个cry基因(cry1Ab24样和cry1Ja1样)与编码序列公开的最相似参考基因cry1Ab24(GenBank登录号HQ439778)和cry1Ja1(GenBank登录号L32019)不完全相同。因此，确定至少一个不同于其他已知Bt基因的所述基因的存在可足以鉴定菌株SVBS-1801。为此，值得注意的是，基因cry1Ab24样呈现的编码序列(SEQ ID NO:1)比cry1Ab24的编码序列短78个核苷酸(见图4)，这导致由cry1Ab24编码的蛋白质在由SEQID NO:1编码的多肽的793和794位之间长26个氨基酸(见图6的比对)。除了SEQ ID NO:1的906位置存在T而不是C之外，这种大小和序列的差异有助于区分cry1Ab24样和cry1Ab24(GenBank登录号HQ439778)。关于cry1Ja1样，如图5和图7所示，其编码序列在长度上与cry1Ja1的编码序列(GenBank登录号HQ439784)相同，但两个序列之间有两个不同的核苷酸。参考基因cry1Ja1分别在SEQ ID NO:7的位置987处呈现T而不是C，在SEQ ID NO:7的位置2345处呈现G而不是A。这些变异可用于区分属于SVBS-1801菌株的序列。
SVBS-1801菌株的鉴定可通过确定本发明人在SVBS-1801中发现的六个cry基因的组的存在，如表2所示(cry1Ab24、cry1Da3、cry1Ea7、cry1Ja1、cry1Nb1、cry2Ad1)来完成，或通过本发明人在SVBS-1801中发现的三个vip基因的组的存在，如表3所示(vip1Ca1、vip2Ac1、vip3Af3)来完成，或更优选地，通过同时存在至少九个杀虫基因，六个cry基因的组和三个vip基因的组来完成。对所选基因的存在进行鉴定可如下完成：如实施例3所示，可通过完整的DNA测序、重叠群组装和组装的重叠群的基因预测，或通过任何其他方法；类似于实施例3中使用的方法，或通过PCR扩增基因片段，如实施例4中所述，使用例如相同的引物对。基因的存在需要与数据库btnomenclature(http://www.btnomenclature.info，该数据库包含的苏云金芽孢杆菌基因也存在于Genbank中，并且可以使用相同的登录号访问)中的基因序列至少95％一致，因为它可能对应，但优选的是，当基因cry1Ab24或基因cry1Ja1是用于将菌株鉴定为SVBS-1801菌株的基因之一时，当相应DNA片段的序列分别为SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:7中的一个，即在菌株SVBS-1801中发现的所述基因的变体时，基因cry1Ab24或基因cry1Ja的存在被认为是阳性的。
基因及其用途。菌株SVBS-1801可作为基因源，在医药、兽医、生物技术等其他领域有着广泛的应用，并且它们可以随着它们的生物学特性转移到其他生物体中用于不同的目的。因此，编码序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的基因本身就是感兴趣的产物，因为它们编码杀虫蛋白。例如，可以使用所述基因(或组成它们的DNA片段或区域)，获得具有昆虫抗性的转基因植物(类似于国际专利申请WO1995/024493或美国专利申请公开US20080016596A1等文献中描述的植物)或线虫抗性的转基因植物(类似于国际专利申请WO2010/027793等文献中描述的植物)，例如，通过使用本领域技术人员熟知的此类文献中描述的技术。相同的DNA片段或区域可用于获得，例如，非人类转基因动物或重组细胞(动物、植物、真菌或细菌细胞)，前提是它们是构建体的部分，在该构建体中它们与适当的控制元件(启动子、增强子…)操作性连接，取决于需要它们得到表达的条件，或者对于转基因植物或动物，也取决于需要它们表达的组织。此类控制元件为本领域技术人员所熟知。所述构建物可整合于基因组中，或尤其对于细菌重组细胞而言，可为表达载体(例如质粒)的部分，所述表达载体可通过本领域技术人员熟知的方法引入细胞中。这种转化的细胞或高等生物可用于产生对线虫或昆虫等害虫(例如，灰翅夜蛾属昆虫，如草地贪夜蛾)具有抗性的植物，或可用于任何其他目的(医学、兽医、一般研究…)。
因此，必须将其视为包含在本发明范围内的任何核酸分子，该核酸分子包含其核苷酸序列为：a)本发明任何新基因的序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7)，b)编码多肽的任何核苷酸序列，该多肽包含为所述基因编码的任何蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:8的氨基酸序列，它们是本发明的蛋白质)，以及也编码包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:8的多肽片段序列的蛋白质但由于遗传密码的兼并性质不同于SEQ ID NO:1和SEQID NO:7的核苷酸序列)或包含在序列和活性上与本发明类似但不能分类为不同蛋白质的多肽片段的蛋白质，即：c)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98,5％(或至少99％、99,5％、99,90％、99,95％或99,99％)的同一性的序列片段，或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少99,85％(或至少99,90％、99,95％或99,99％)的同一性且具有杀害虫活性(杀虫、杀线虫或两者兼有)。杀害虫活性可通过多肽本身或其裂解形式表现，如通常发生在Cry蛋白中，其昆虫毒性活性在蛋白质在昆虫肠道中裂解成两个片段后出现。
因此，含有本发明的任何此类核酸分子的构建体，尤其是表达载体(例如质粒或重组病毒)(其中本发明的核酸分子操作性地连接到启动子和任选地一个或多个控制序列，取决于需要蛋白质得到表达的条件和/或取决于需要的表达水平而选择)，也都包含在本发明的范围内。
本发明范围的另一部分是包含作为异源DNA片段的本发明核酸分子或包含其表达载体的任何细胞(细菌、真菌、酵母或植物细胞)。核酸片段可以整合在基因组中(或者，在细菌的情况下，整合在细菌染色体中)，或者可以是其他核酸元件，例如质粒或非整合病毒的部分。细菌细胞甚至可以来自另一种苏云金芽孢杆菌菌株，例如，一个非天然包含以下一个或多个基因的菌株：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17，其杀虫或杀线虫活性可通过表达一种或多种与序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO:8匹配的蛋白质而得到增加或修改。这可通过使用盒来转化菌株而实现，该盒包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的DNA片段(或编码序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的多肽的任何其他核苷酸序列)操作性地连接到允许该多肽在菌株中组成型或在所选条件下表达的启动子。此外，那些重组苏云金芽孢杆菌细胞，在其基因组(包括染色体和质粒)修饰后，包含至少一组基因，其编码区匹配序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17，或者包含这两组基因，因为它将成为具有菌株SVBS-1801的特征基因组的Bt菌株，这都包括在本发明中。
因此，包含本发明的DNA分子的任何植物将包含在本发明的范围内，特别是当DNA分子或片段是构建体的部分时，其中它与一个或多个控制元件(启动子、增强子、终止序列…)操作性地连接，所述控制元件允许或促进DNA分子编码的多肽在植物或动物的一个或多个组织中组成型或在一定条件下表达，包括植物或动物发育过程中的不同时期。对于转基因植物，(例如Shah等人,2015所综述的)，通常使用组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S，但通过使用可诱导启动子来限制所需转基因基因的表达也很有趣，如番茄HMGR2基因的伤口诱导启动子、PR-1a启动子(由病原体感染和苯并噻二唑等化学诱导子诱导)或玉米In2-2(可诱导基因2-2)启动子(由苯磺酰胺类安全剂诱导，作为提高植物耐除草剂性的农用化学品)。其他感兴趣的可诱导元件可以是空间上调节在不同部位的基因表达的顺式作用调节序列，或由菜豆蛋白基因启动子编码的两个上游激活序列，UAS1(-295至-109)和UAS2(-468至-391)。此外，针对特定组织的靶向表达对于增值作物的未来发展变得越来越重要，因此，如ACC氧化酶基因的启动子(从转录开始范围为21966到21159bp)能够驱动基因在水果(如番茄果实)中的tipening-特异性表达，正如Shah等人,2015所综述的那样。其他不同的启动子和控制元件可在所述版本和本领域技术人员可得的其他文献中找到。
现在将结合下面包括的实施例和附图进一步详细地解释本发明。
实施例
下节提供实施例，说明本发明可用于促进SVBS-1801工业开发的过程。
实施例1-Bt菌株SVBS-1801的分离与生长
1.1.SVBS-1801菌株的分离
从来自巴达霍兹市郊区的农业土壤样品(用于该市城市化“圣加布里埃尔住宅”花园的建设)中获得SVBS-1801菌株。上述土壤样品于2016年12月采集，并在冷藏条件(4℃)下保存，直至处理完成(2017年1月)。为了进行SVBS菌株的分离和鉴定，在去除第一层后，从土壤中收集样品，与蒸馏水混合并在70℃下加热15min。将10倍稀释的体积(15μl)涂布到CCY培养基上并在28℃下培养72h。通过相差显微镜检查阳性Bt菌落(Iriarte等人,1998)。
1.2.在促进孢子形成的培养基中生长
SVBS-1801样品培养在1L CCY培养基中(Stewart等人,1981)。CCY是促进孢子形成的最小培养基，最终导致晶体和孢子的形成(图1)。通过按适当比例混合缓冲成分(溶液1)和碳源成分(溶液2)而制备。混合完成后，在高压灭菌器内对培养基进行灭菌，并补充1ml先前过滤的盐溶液(溶液3)。
表1.CCY培养基(Stewart等人,1981)
通过将100μl的SVBS-1801过夜(ON)预接种液转移到CCY培养基(1:l)中启动细菌生长。细菌在30℃和220rpm下培养48-72小时。95％的SVBS-1801细胞(已经经过孢子形成过程)裂解并释放其晶体和孢子后，发酵过程结束。为验证已达到该阶段，应在光学显微镜下分析1ml培养物样品。
为了纯化已产生的晶体和孢子，将培养物的内容物离心，然后用NaCl 1M/EDTA10mM的10％溶液洗涤沉淀物。该溶液用于防止蛋白酶降解蛋白质晶体。随后，再次离心培养物，并将团块冻干并在室温下储存，直到配制或重新悬浮在KCl 10mM(10ml/l初始培养物)中，并在-20℃下储存。
实施例2-菌株SVBS-1801的特性：确定菌株SVBS-1801是否产生β-外毒素的程序
为了确定特定的Bt菌株是否为β-外毒素阳性，应分析生长培养基的上清液。为此，采用了Hernández等人，2003采用的程序。因此，将Bt SVBS-1801和HD-2菌株(用作阳性对照)的集落在30℃和220rpm在10ml CCY中培养48小时。接下来，培养物在9000xg离心10min，将其上清液转移到新试管中，并在120℃和1atm在高压灭菌器中灭菌20min。
为了检测β-外毒素的存在，进行HPLC。KH2PO4(50mM，pH3)以2ml/min的流速构成流动相，并与灭菌的上清液一起通过0.45μm的尼龙膜进行过滤。在μ–Bondapak C18柱中，在25-30℃和260nm下分析20μl上清液。如果存在β-外毒素，则应出现两个清晰的峰，表明其磷酸化和去磷酸化形式。在本情况下，如图2所示，未检测到此类峰。
实施例3-菌株SVBS-1801的特征：DNA提取、序列和基因组序列处理
3.1.DNA提取、序列和基因组序列处理
使用组分并按照
基因组DNA纯化试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)提供的革兰氏阳性细菌DNA分离方案来分离SVBS-1801的总DNA。提取的DNA样品用于制备DNA文库，并随后在Genomics Research Hub laboratory(Cardiff school of Biosciences,UK)使用Illumina NextSeq500测序仪进行测序。
使用CLC Genomics Workbench 10.1.1对生成的原始序列数据进行分析。通过删除低质量或不明确的读数，对原始序列数据进行质量过滤。丢弃短于50bp的读数。使用至少95bp读取重叠和95％同一性的严格标准重头组装读数。使用GeneMark.hmm原核3.25对组装的重叠群进行基因预测。使用BLASTP将获得的预测蛋白质序列与根据Bt毒素列表建立的数据库http://www.btnomenclature.info(Crickmore等人,2018)进行比较。
这种生物信息学分析使本发明人能够鉴定杀虫基因的完整基因序列。无论如何，鉴定出一些cry和vip基因片段，如下所述。
3.2.鉴定的杀虫基因
表2包括在SVBS-1801中鉴定的所有cry基因片段(编码序列)的完整列表，表明它们与之前在http://www.btnomenclature.info中描述的密切相关的杀虫基因的同一性程度(％id.)。还指出了比较中包括的已鉴定序列的覆盖率(％cov.)，以及SVBS-1801中鉴定的序列和数据库中存在的序列的核苷酸数量(Ntd.)。
表2.SVBS-1801cry基因含量
*数据库:http://www.btnomenclature.info
类似地，表3包含在SVBS-1801菌株中鉴定的所有vip或sip基因片段的完整列表，表明它们与之前在http://www.btnomenclature.info中描述的密切相关的杀虫基因的同一性程度。
表3.SVBS-1801vip基因含量
*数据库:http://www.btnomenclature.info
3.3.SVBS-1801杀虫基因的分子特征
使用BLAST(Altschul等人，1990)分析SVBS-1801cry基因的核苷酸序列，结果表明它们与先前描述的Bt菌株的基因cry1Ab24(HQ439778)、cry1Da3(HQ439784)、cry1Ea7(AY894137)、cry1Ja1(L32109)、cryNb1(KC156678)和cry2Ad1(AF200816)(http://www.btnomenclature.info)具有最高程度的同一性。类似地，发现SVBS-1801vip基因序列更接近先前表征的vip1Ca1(AY245547)、vip2Ac1(AY245547)和vip3Af3(HM117634)。如表2和3所示，除了cry1Ab24和cry1Ja1的情况之外，同一性的百分比是100％，但是同一性的百分比(接近95％)足够高，不考虑SVBS-1801基因cry1Ab24和cry1Ja1样的不同基因(根据苏云金芽孢杆菌基因命名的常用规则)。
实施例4-克隆：杀虫cry基因的PCR扩增
根据Bt菌株的测序结果，设计了包括用于克隆的限制性位点在内的特定寡核苷酸引物对，以扩增cry1Ab24、cry1Da3、cry1Ea7、cry1Ja1、cry1Nb1和cry2Ad1基因的开放阅读框(ORF)。所述引物对的序列如下表4所示，其中第二列中的信息表明，对于每个引物，它是正向(Fwd)引物还是反向(Rev)引物，以及拟用于克隆的限制性内切酶。每个引物的下划线片段对应于酶裂解位点。
表4：用于扩增已鉴定的SVBS-1801基因的引物对
将从菌株SVBS-1801提取的DNA用作模板，在含有10μl反应缓冲液5x HF、1μl dNTP混合物100mM、1μl每个正向和反向引物10μM、0.5U高保真DNA聚合酶(NEB)和100ng总DNA的50μl反应混合物中。PCR循环谱为：在C1000 Touch热循环仪(Bio-Rad)中，1个初始变性循环为98℃持续30秒，30个扩增循环为98℃持续10秒、55℃持续1分钟和72℃持续3分钟30秒，然后在72℃持续10分钟的最终延伸。通过在TAE缓冲液(40mM Tris、20mM乙酸和1mM EDTA；pH8)中的1％琼脂糖凝胶上以100V电泳30分钟分析PCR产物。
使用NucleoSpin Gel和PCR纯化试剂盒(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)从琼脂糖凝胶中纯化对应于cry1Ab、cry1Da、cry1Ea、cry1Ja、cry1Nb和cry2Ad CDS的PCR产物，并钝端克隆到pJET载体中(CloneJET PCR Cloning Kit,Fermentas,Canada)以获得pJET-protoxin构建体(pJET-1Ab、pJET-1Da、pJET-1Ea、pJET-1Ja、pJET-1Nb和p-JET-2Ad)。大肠杆菌XL1-Blue的转化按照标准方案(Sambrook等人，1989)进行，用于生产含有每个cry基因CDS的重组质粒。通过PCR在20μl反应混合物中检查推定的阳性克隆，该反应混合物含有2μl反应缓冲液10xNH4、1μl MgCl2 50mM、1μldNTP混合物100mM、1μl每个正向和反向引物10μM和0,2μlBioTaq聚合物(Bioline)。携带pJET构建体的大肠杆菌XL1-Blue细胞在补充有氨苄青霉素(100mg/mL)的5ml LB肉汤中，在37℃和200rpm下培养过夜。根据制造商的方案，使用NucleoSpin质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)提取重组质粒，并通过使用每个基因的中间正向引物和pJET载体的反向引物(StabVida,Caparica,Portugal)的测序进行验证。使用Geneious R8将cry基因核苷酸和蛋白质序列与GenBank数据库中可用的毒素序列进行比对。图4和图6分别显示了cry1Ab24样和cry1Ab24基因的序列与其对应蛋白序列的比对；类似地，cry1Ja1样和cry1Ja1序列的比对如图5所示，而它们相应蛋白质序列的比对如图7所示。
实施例4的重组pJET-原毒素构建体的消化用相应的限制酶组合(ThermoScientific)进行，随后的纯化消化产物(之前在琼脂糖凝胶中分离)用NucleoSpin Gel和PCR净化试剂盒(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)进行。之前用相应的限制酶消化的表达pSTAB载体(Park等人，1998)用作插入片段的受体，使用Rapid DNA连接试剂盒(ThermoScientific)以获得具有pSTAB原毒素构建体的重组质粒。如前所述，用连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue细胞，并在质粒提取前通过菌落PCR检查推定的阳性克隆。无结晶Bt菌株BMB171(Li等人，2000)用作在根据先前作者(Cucarella等人，2001)进行的转化过程中的受体。通过菌落PCR检查推定的阳性克隆的蛋白质产量。
实施例5-蛋白质表达
将实施例4的BMB171原毒素构建物在补充有20μg/ml红霉素的50ml CCY培养基中在旋转摇动器中在28℃和200rpm下培养2-3天，直到观察到95％细胞的孢子形成和裂解。在x1000放大倍数下通过相差显微镜观察包涵体。然后将孢子和晶体混合物在4℃下以9000g离心10min。将团块在1M NaCl中洗涤三次，在冷水中洗涤六次，最后在10mM KCl中重新悬浮。
对于蛋白质定量，在37℃下，通过温和搅拌2h，将每种重组蛋白质的量(100μl)溶解于1000μl的50mM Na2CO3(pH 11.3)和10mM二硫苏糖醇(DTT)溶液中。通过在4℃下以9000g离心10min，移除非溶解晶体。等分试样(500μl)用于通过Bradford测定法(Bradford，1976)(Bio-Rad)的蛋白质定量，使用牛血清白蛋白(BSA)为标准。
实施例6-SVBS-1801晶体蛋白的分子量
晶体蛋白的分子量通常通过SDS-PAGE(Laemmli,1970)进行测定。为此，必须首先进行晶体蛋白的纯化。纯化可以通过不同的方法来实现，包括Thomas和Ellar在1983年提出的梯度方法。一旦回收晶体蛋白，将10μl等分试样与5μl的30×还原剂(体积的1/10)和3×SDS样品缓冲液(1倍体积)(New England Biolabs)混合并在100℃下变性5分钟。然后将混合物装入10％聚丙烯酰胺凝胶并在36mA下运行1小时。接下来，使用50％(v/v)乙醇、10％(v/v)乙酸和0.1％考马斯蓝R 250的溶液对凝胶进行染色。
如图3所示，SVBS-1801呈现出两条约130和133kDa的条带，这是Cry1蛋白对应的大小。而Cry2蛋白的大小为633kDa。在对应于这种大小的区域中不存在条带可能表明蛋白质Cry2Ad1可能不会在实施例1中使用的生长条件下表达。
实施例7-获得SVBS-1801活性成分(AI)的程序
可以通过在促进孢子形成的培养基，例如CCY(Stewart等人，1981)中培养菌株SVBS-1801获得AI，如实施例1的1.2节所述。当95％的孢子形成细菌细胞天然地裂解后，对培养基的内容物进行离心。产生的团块应包含孢子和晶体的混合物，这些孢子和晶体在孢子形成细胞裂解期间释放到培养基中。物理脱水浓缩可通过使用连续离心以>8.000g运行以产生固体含量为12-15％的浆液，该浆液是体积减少50倍的发酵产物，其中孢子和晶体的混合物更浓缩，但也包括上清液中的部分液体和细菌产物。上清液含有Vip3A蛋白但不含Cry蛋白，因为分泌到培养基中的唯一Cry蛋白是Cry1I；由于菌株SVBS-1801的基因组中不存在cry1I基因，所述菌株不能合成Cry1I蛋白并且它们不存在于上清液。
离心以获得浆液之后可以进行配制和喷雾干燥成粉末或直接配制成可流动的。
实施例8-从SVBS-1801培养物或蛋白质获得的不同制备物对新生草地贪夜蛾幼虫的杀虫特性
8.1.用于SVBS-1801活性成分体内毒性测定的草地贪夜蛾饮食广泛用于饲养草地贪夜蛾的标准饮食是Hoffman和Lawson(1964)的烟草天蛾饮食的改良版本。饮食制备如下：将成分加入烧杯中并充分混合，然后加热灭菌(121℃，20分钟)。当混合物冷却至50℃时，必须补充抗生素(链霉素、金霉素)、维生素混合物、抗坏血酸和胆碱。完整的饮食可以用厨房搅拌机混合。最后，将饮食倒入400ml(17×10×2.5cm)的无菌容器中，使其在室温下固化。
8.2.从SVBS1801全培养物中获得的不同细菌制备物对新生草地贪夜蛾幼虫的杀
虫特性
为了确定浓度-死亡率应答，用从Bt菌株SVBS-1801培养物中获得的不同细菌制备物处理昆虫(表5)。每种处理都制备并测试了七个浓度。处理是：
-如实施例7所示，包含孢子和晶体(S+C)混合物的水溶液通常构成基于Bt的产品的活性成分，因此测试了七种浓度的此类水溶液。
-此外，对存在上清液的制备物测试孢子和晶体混合物与培养基中可能存在的分泌毒素之间可能的相互作用。
-此外，由于Bt菌株的杀虫毒性主要归因于构成伴孢晶体的δ内毒素，因此将晶体从孢子中分离出来，并在回收晶体后，对含有纯化的晶体的处理进行测试，以确定其在没有孢子的情况下的效力。
-此外，评估了纯化的晶体与上清液之间可能的相互作用
-还测试了含有孢子、上清液以及两者的混合物、孢子和上清液的制备物。
处理的制备
对于所有处理，从先前定量的等分试样制备总共七种浓度的杀虫蛋白，范围为0.3至300ng/μl，以确定Bt菌株和菌株本身或菌株培养产生的不同产物的毒性。
孢子和晶体的混合物(S+C)的水溶液。为了确定Bt菌株的毒性，从先前定量的等分式样(实施例5)制备了总共七种浓度的杀虫蛋白，范围为0.3至300ng/μl。
具有上清液的孢子和晶体的混合物(S+C)。离心相应量的孢子和晶体混合物，并在上清液中重新悬浮所得团块。对S+C处理所述的相同系列稀释液进行了测试。
从孢子中分离伴孢晶体及制备伴有纯化的晶体的处理。为了从样品中获得纯化的晶体，采用了Mounsef等人，2014描述的改进方案。将一定体积(200μl)的孢子和晶体混合物用NaCl 1M洗涤三次，并以9000g离心10min。然后将团块重新悬浮在900μl PBS 1x中，并添加100μl己烷。将试管涡旋1min，并以6000g，4℃下离心10min。丢弃上清液，并对所得团块进行至少三次相同程序。晶体在冷蒸馏水中清洗三次，并在x1000放大倍数下通过相差显微镜检查不存在孢子。如实施例5末尾所述，对纯化的晶体进行定量。制备含有相当于S+C系列稀释液杀虫蛋白浓度(0.3至300ng/μl)的纯化的晶体量的处理。
上清液中的纯化的晶体。纯化的晶体和上清液之间可能的相互作用通过在上清液中重新悬浮上一段所述的相应量的伴孢晶体进行评估。
孢子的纯化悬浮液。为了获得孢子纯化的悬浮液，通过添加含有50mM Na2CO3(pH11.3)和10mM二硫苏糖醇(DTT)的溶液并在37℃下轻轻搅拌2h，对孢子和晶体的混合物的混合物进行溶解。通过在4℃下以9000g离心10min，去除上清液中的溶解晶体。此过程重复五次。在x1000放大倍数下，通过相差显微镜检查不存在晶体。纯化的孢子在Petroff-Hausser室进行计数。
上清液中的孢子。通过添加上清液，从根据前段获得的纯化的孢子制备不同稀释的处理。
生物测定表现
所有生物测定法，包括下文第8.3节中设置的那些，均使用28个个体化的草地贪夜蛾新孵化(<12h)幼虫的组，在人工饮食表面喷洒相应的细菌制备物来进行。使用独立的制备物在不同的日期重复毒性试验至少三次，并在25+1℃的受控环境室内进行为期5天的16小时光照/8小时暗循环，并检查死亡率。在POLO-PC程序(Le Ora Software,1987)中，将浓度-死亡率数据汇总并进行概率回归分析(Finney,1971)。如果95％基准限不重叠，则认为平均致死浓度(LC50)值存在显著差异。
表5显示了在存在和不存在上清液作用的情况下，含有孢子和晶体混合物以及纯化的晶体的不同制备物的浓度-死亡率响应结果。
表5.从Bt菌株SVBS-1801的培养物中获得的不同细菌制备物对新孵化的草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性的相对效力。
与表5中处理所得回归线对应的参数表明，孢子和晶体混合物的LC50值存在显著差异，在存在上清液的情况下毒性增加2.39倍。在没有孢子的情况下，纯化的晶体的活性显著提高，这表明在一起接种时会产生不利影响。然而，当纯化的晶体与上清液组合时，与孢子和晶体混合物的水溶液制备物相比，报告了28.19倍高的有效处理，证明了协同效应。
含有孢子、上清液或两者的组合的细菌制备物没有报告活性。
8.3.SVBS-1801Cry蛋白对新生草地贪夜蛾幼虫的杀虫特性
如上所述，Bt菌株的杀虫毒性主要归因于构成伴胞晶体的δ内毒素。但并不是所有菌株都对特定的昆虫表现出活性或相同程度的活性。因此，按照第8.2节中描述的相同方法，进行单个浓度(100ng/μl)生物测定法，以确定伴胞晶体中所含单个蛋白质的活性。由于在实施例6的SDS-PAGE测定法中获得的结果，蛋白质Cry2Ad1未包含在测定法中，这似乎表明该蛋白质不能在本申请实施例1中使用的细菌生长条件下表达。
表6显示了当以单一浓度的杀虫蛋白(100ng/μl)施用时，每种单独的Cry蛋白的单独活性。它表明在五种蛋白质中，由于Cry1Ab1和Cry1Nb1对新孵化的草地贪夜蛾幼虫缺乏活性，因此伴孢晶体的杀虫活性应归因于Cry1Da3、Cry1Ea7和Cry1Ja1样。
表6.单独蛋白质对草地贪夜蛾新孵化幼虫的毒性。
随后，进一步评估了毒性蛋白质并估计了平均致死浓度(LC50)。最后，通过测试含有等摩尔浓度的先前重组蛋白的混合物来评估蛋白质相互作用。
表7显示了当单独评估时以及在包含所有三种相同比例的等摩尔混合物中进行评估时，对应于三种报告的毒性蛋白质(Cry1Da3、Cry1Ea7和Cry1Ja1样)所获得的回归线的参数。
表7.三种单独的蛋白质(Cry1Da、Cry1Ea和Cry1Ja样)和以1:1:1的比例包含所有三种蛋白质的人工等摩尔混合物对草地贪夜蛾新生幼虫的杀虫效力。
从表7中可以看出，草地贪夜蛾幼虫对Cry1Da3和Cry1Ja1样非常敏感，其毒性分别比Cry1Ea7高10.34倍和8.25倍。Cry1Ea7的相对效力的基准限(FL)之间没有重叠清楚地表明，与Cry1Da3或Cry1Ja样相比，差异具有统计学显著性。当三种蛋白质在等摩尔混合物中组合时，LC50值降低至1.09ng/μl，与三种单独的毒素相比，效力明显更强，表明它们之间存在协同作用。
为了计算协同因子，根据混合物中Cry1Da3(ra)、Cry1Ea7(ra)和Cry1Ja1样(rc)的相对比例，混合物相对于三种单一蛋白质的预期平均致死浓度(LC50)必须进行计算(Tabashnik,1992)并与获得的混合物LC50进行比较(表7)。
对于新孵化的草地贪夜蛾幼虫，Cry1Da3、Cry1Ea7和Cry1Ja1样的混合物获得了3.63的协同因子。
实施例9-确定SVBS-1801菌株相对于商业菌株Dipel(ABTS-351)和XenTari(ABTS-1875)在草地贪夜蛾二龄幼虫中杀虫效力的毒性试验
9.1.获取SVBS-1801活性成分(AI)的程序
获得SVBS-1801活性成分的程序如实施例7所述。
9.2.商业产品Bt菌株活性成分的制备
为了比较从SVBS-1801菌株和产生商业产品的Bt菌株制备的活性成分的活性(对于
为ABTS-351,对于
为ABTS-1857),苏云金芽孢杆菌菌株ABTS-351和ABTS-1857分别直接从在欧盟销售的商业产品
DF(Kenogard,ValentBioScience Corporation；生产批次261-355-PG；生产日期2016年1月)和
GD(Kenogard,Valent BioScience Corporation；生产批次264-637-PG；生产日期2016年4月)中分离。每种细菌菌株在28℃的无菌CCY培养基中培养72h(Stewart等人，1981)，并且对这些菌株也遵循实施例5中解释的过程，直到为任何菌株获得固体含量为12-15％的浆液，这被认为是AI，以与从菌株SVBS-1801获得的AI进行比较。
9.3.使用来自ABTS-351 
ABTS-1857 
和SVBS-1801菌 株的晶体和孢子混合物的液滴喂食法在草地贪夜蛾二龄幼虫中的毒性测定。
为了进行毒性测定，需要以下材料：28孔水泡、人工饮食(见第8.1节)和草地贪夜蛾新蜕皮二龄幼虫。晶体和孢子的混合物应使用3到5的稀释因子稀释五次，这将产生下一步测试AI的6种不同浓度。同样，应准备缺乏AI但保留其余组分的阴性对照。按照液滴喂食方法(Hughes和Wood,1981)，给草地贪夜蛾新蜕皮二龄幼虫喂食6种不同浓度的AI中的一种。将喂食的幼虫放入含有1.5cm3人工饮食的28孔水泡的单个孔中。
在这项研究中，共有28个新蜕皮二龄幼虫接受了每种蛋白质浓度的处理，每种Bt菌株使用了5种浓度的范围。生物测定法进行了三次。对照昆虫饲喂不含毒素的人工饮食。多孔板在25℃、60％R.H.和14h/10h(光/暗)光周期下孵育。6天后记录死亡率。在POLO-PC程序(LeOra Software,1987)中，浓度-死亡率数据进行probit回归分析(Finney,1971)。
用三种Bt菌株(从
分离的ABTS-351、从
分离的ABTS-1857和SVBS-180)1在二龄草地贪夜蛾幼虫中获得的浓度-死亡率应答结果见表8、9和10。三个Bt分离株的拟合回归线斜率范围为ABTS-351的0.51到SVBS-1801的1.47。斜率值差异很大，不允许平行以共同的斜率调整三条回归线。因此，为了估计三种Bt菌株之间的相对效力，有必要对回归线进行二对二的比较。
表8显示了对应于从
分离得到的Bt菌株ABTS-351、从
分离得的ABTS-1857获得的回归线的参数。在表4中，可以看出，菌株ABTS-1857对草地贪夜蛾二龄幼虫的效力是菌株ABTS-351的217.2倍。两种菌株相对效力的基准限(FL)之间没有重叠，这清楚地表明观察到的差异是统计学显著的。
表8.ABTS-1857相对于ABTS-351对草地贪夜蛾二龄的LC50值和相对效力。
表9显示了对应于从
分离的Bt菌株ABTS-351和SVBS-1801获得的回归线的参数。表9反映菌株SVBS-1801对草地贪夜蛾二龄幼虫的效力是菌株ABTS-351的1235.4倍。两种菌株的相对效力的基准限(FL)之间没有重叠，这清楚地表明观察到的差异是统计学显著的。
表9.SVBS-1801相对于ABTS-351对草地贪夜蛾二龄的LC50值和相对效力。
表10显示了对应于从
分离的Bt菌株ABTS-1857和SVBS-1801获得的回归线的参数。SVBS-1801对草地贪夜蛾幼虫的效力是ABTS-351的5.7倍。两种菌株相对效力的基准限(FL)之间没有重叠，这清楚地表明差异是统计学显著的。
表10.SVBS-1801与ABTS-1857相比对草地贪夜蛾二龄的LC50值和相对效力。
实施例10-SVBS-1801活性成分相对于ABTS-351
和ABTS-1857
活性成分对草地贪夜蛾二龄幼虫的杀虫效力
如例9.3所示，ABTS-351
ABTS-1857
和SVBS-1801 AI的毒性通过液滴喂食法进行评估(Hughes andWood，1981)。ABTS-351(苏云金芽孢杆菌ser.kurstaki)被广泛接受为几种鳞翅目物种的国际参考，并构成商业产品如
2x(Abbot)的AI。类似地，ABTS-1857(从
分离)通常作为旨在测试产品针对夜蛾属鳞翅目的杀虫效力的生物测定法中的参考AI。
SVBS-1801杀虫蛋白相对于ABTS-351
和ABTS-1857
杀虫蛋白的效力是根据Dulmage(1981)所述用作参考的商业产品标签中指示的效力(参考效力)计算的。
公式
IU：国际单位
相对于ABTS-351
的SVBS-1801效力：
效力产生32000IU/mg
相对于ABTS-1857
的SVBS-1801效力：
效力产生15000IU/mg：
实施例11-SVBS-1801相对于HD1和ABTS-1857
对半田间玉米植株中草地贪夜蛾二龄幼虫的杀虫效力
在物候期V3(5-6片，30-35厘米高)的玉米植株上寄生有草地贪夜蛾卵(150个卵/株)，这些卵可在24小时内孵化。一旦幼虫出现，就对其进行监测，直到达到二龄。接下来，用晶体和孢子的混合物处理植物(对于ABTS-1857和SVBS-1801菌株，晶体和孢子的浓度相当于100mg/L)。使用压缩空气手动喷雾器(Matabi
Antzuola,Guipuzcoa,Spain)进行应用，其中包括0.05％Agral湿润剂贴纸。排放10ml喷雾处理，相当于该地区玉米作物使用的标准喷雾量(约1000liters/Ha)。
在施用后20、30和40小时，用手从每个地块的植物中随机采集28只草地贪夜蛾幼虫，并在实验室中在25℃用人工饲料在25ml塑料杯中饲养，直至死亡或化蛹。每天记录死亡率。计算每种处理的死亡率百分比，通过反正弦变换归一化，并在SPSS ver.12.0(SPSS，Chicago，IL)中进行重复测量方差分析(ANOVA)。通过应用Mauchly球度检验，对该分析和所有后续多元分析的方差-协方差矩阵的特征进行了检验。结果如图8所示。
生物材料的保藏
菌株SVBS-1801，已保藏在Colección 
de Cultivos Tipo(CECT)(Parque Científico de la Universidad de Valencia；calle Catedrático AgustínEscardino,9；46980Paterna,Valencia,Spain)，其根据1997年5月12日第664/1997号皇家法令接受细菌菌株保藏。SVBS-1801已按照《布达佩斯条约指南》为专利目的进行保藏。
该菌株的原始保藏收据(BP/4)和存活证明(BP/9)反映了以下相关数据：
-最终保藏日期：2018年11月8日，
-菌株参考号(登录号)：CECT 9753。
-保藏人：Serena Valley Biological Systems S.L.(Paseo Universidad 49,31192Mutilva,Navarra,Spain)。保藏人与申请人不同。
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序列表
<110> Bioinsectis S.L.
<120> 苏云金芽孢杆菌菌株
<130> PCT-977
<150> EP19382497.6
<151> 2019-06-14
<160> 30
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 3456
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3456)
<223> /注:苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的 cry1Ab24样基因的CDS，与基因cry1Ab24的CDS 98%同一性，基因cry1Ab24的GenBank登录号HQ439778
<220>
<221> misc_差异
<222> (906)..(906)
<223> C替代T于cry1Ab24样基因中，GenBank登录号HQ439784
<220>
<221> misc_差异
<222> (2379)..(2380)
<223> 登录号HQ439778的基因cry1Ab24展现78个额外的核苷酸的点
<400> 1
atg gat aac aat ccg aac atc aat gaa tgc att cct tat aat tgt tta 48
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
agt aac cct gaa gta gaa gta tta ggt gga gaa aga ata gaa act ggt 96
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
tac acc cca atc gat att tcc ttg tcg cta acg caa ttt ctt ttg agt 144
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
gaa ttt gtt ccc ggt gct gga ttt gtg tta gga cta gtt gat ata ata 192
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
tgg gga att ttt ggt ccc tct caa tgg gac gca ttt ctt gta caa att 240
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
gaa cag tta att aac caa aga ata gaa gaa ttc gct agg aac caa gcc 288
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
att tct aga tta gaa gga cta agc aat ctt tat caa att tac gca gaa 336
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
tct ttt aga gag tgg gaa gca gat cct act aat cca gca tta aga gaa 384
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
gag atg cgt att caa ttc aat gac atg aac agt gcc ctt aca acc gct 432
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
att cct ctt ttt gca gtt caa aat tat caa gtt cct ctt tta tca gta 480
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
tat gtt caa gct gca aat tta cat tta tca gtt ttg aga gat gtt tca 528
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
gtg ttt gga caa agg tgg gga ttt gat gcc gcg act atc aat agt cgt 576
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
tat aat gat tta act agg ctt att ggc aac tat aca gat tat gct gta 624
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val
195 200 205
cgc tgg tac aat acg gga tta gag cgt gta tgg gga ccg gat tct aga 672
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
gat tgg ata aga tat aat caa ttt aga aga gaa tta aca cta act gta 720
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
tta gat atc gtt tct cta ttt ccg aac tat gat agt aga acg tat cca 768
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
att cga aca gtt tcc caa tta aca aga gaa att tat aca aac cca gta 816
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
tta gaa aat ttt gat ggt agt ttt cga ggc tcg gct cag ggc ata gaa 864
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
gga agt att agg agt cca cat ttg atg gat ata ctt agc agt ata acc 912
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Ser Ser Ile Thr
290 295 300
atc tat acg gat gct cat aga gga gaa tat tat tgg tca ggg cat caa 960
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
ata atg gct tct cct gta ggg ttt tcg ggg cca gaa ttc act ttt ccg 1008
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
cta tat gga act atg gga aat gca gct cca caa caa cgt att gtt gct 1056
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
caa cta ggt cag ggc gtg tat aga aca tta tcg tcc act tta tat aga 1104
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
aga cct ttt aat ata ggg ata aat aat caa caa cta tct gtt ctt gac 1152
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
ggg aca gaa ttt gct tat ggg acc tcc tca aat ttg cca tcc gct gta 1200
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
tac aga aaa agc gga acg gta gat tcg ctg gat gaa ata cca cca cag 1248
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
aat aac aac gtg cca cct agg caa gga ttt agt cat cga tta agc cat 1296
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
gtt tca atg ttt cgt tca ggc ttt agt aat agt agt gta agt ata ata 1344
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
aga gct cct atg ttc tct tgg ata cat cgt agt gct gaa ttt aat aat 1392
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn
450 455 460
ata att cct tca tca caa att aca caa ata cct tta aca aaa tct act 1440
Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr
465 470 475 480
aat ctt ggc tct gga act tct gtc gtt aaa gga cca gga ttt aca gga 1488
Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
gga gat att ctt cga aga act tca cct ggc cag att tca acc tta aga 1536
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg
500 505 510
gta aat att act gca cca tta tca caa aga tat cgg gta aga att cgc 1584
Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg
515 520 525
tac gct tct act aca aat tta caa ttc cat aca tca att gac gga aga 1632
Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg
530 535 540
cct att aat cag ggg aat ttt tca gca act atg agt agt ggg agt aat 1680
Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn
545 550 555 560
tta cag tcc gga agc ttt agg act gta ggt ttt act act ccg ttt aac 1728
Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn
565 570 575
ttt tca aat gga tca agt gta ttt acg tta agt gct cat gtc ttc aat 1776
Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn
580 585 590
tca ggc aat gaa gtt tat ata gat cga att gaa ttt gtt ccg gca gaa 1824
Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu
595 600 605
gta acc ttt gag gca gaa tat gat tta gaa aga gca caa aag gcg gtg 1872
Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val
610 615 620
aat gag ctg ttt act tct tcc aat caa atc ggg tta aaa aca gat gtg 1920
Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val
625 630 635 640
acg gat tat cat att gat caa gta tcc aat tta gtt gag tgt tta tca 1968
Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser
645 650 655
gat gaa ttt tgt ctg gat gaa aaa caa gaa gtg tcc gag aaa gtc aaa 2016
Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Gln Glu Val Ser Glu Lys Val Lys
660 665 670
cat gcg aag cga ctt agt gat gag cgg aat tta ctt caa gat cca aac 2064
His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn
675 680 685
ttc aga ggg atc aat aga caa cta gac cgt ggc tgg aga gga agt acg 2112
Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr
690 695 700
gat att acc atc caa gga ggc gat gac gta ttc aaa gag aat tac gtt 2160
Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val
705 710 715 720
aca cta cca ggt acc ttt gat gag tgc tat cca acg tat tta tat caa 2208
Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln
725 730 735
aaa ata gat gag tcg aaa tta aaa gcc tat acc cgt tat caa tta aga 2256
Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg
740 745 750
ggg tat atc gag gat agt caa gac tta gaa atc tat tta att cgc tac 2304
Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr
755 760 765
aat gca aaa cat gaa aca gta aat gtg cca ggt acg ggt tcc tta tgg 2352
Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp
770 775 780
ccg ctt tca gcc caa agt cca atc gga aag tgt gcc cat cat tcg cat 2400
Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Ala His His Ser His
785 790 795 800
cat ttc tcc tta gac att gat gtt gga tgt aca gac tta aat gag gac 2448
His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp
805 810 815
cta ggt gta tgg gtg atc ttt aag att aag acg caa gat ggg cac gca 2496
Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala
820 825 830
aga cta ggg aat cta gag ttt ctc gaa gag aaa cca tta gta gga gaa 2544
Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu
835 840 845
gcg cta gct cgt gtg aaa aga gcg gag aaa aaa tgg aga gac aaa cgc 2592
Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg
850 855 860
gaa aaa ttg gaa tgg gaa aca aat atc gtt tat aaa gag gca aaa gaa 2640
Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu
865 870 875 880
tct gta gat gct tta ttt gta aac tct caa tat gat caa tta caa gcg 2688
Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala
885 890 895
gat acg aat att gcc atg att cat gcg gca gat aaa cgt gtt cat agc 2736
Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser
900 905 910
att cga gaa gct tat ctg cct gag ctg tct gtg att ccg ggt gtc aat 2784
Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn
915 920 925
gcg gct att ttt gaa gaa tta gaa ggg tgt att ttc act gca ttc tcc 2832
Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Cys Ile Phe Thr Ala Phe Ser
930 935 940
cta tat gat gcg aga aat gtc att aaa aat ggt gat ttt aat aat ggc 2880
Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly
945 950 955 960
tta tcc tgc tgg aac gtg aaa ggg cat gta gat gta gaa gaa caa aac 2928
Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn
965 970 975
aac cac cgt tcg gtc ctt gtt gtt ccg gaa tgg gaa gca gaa gtg tca 2976
Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser
980 985 990
caa gaa gtt cgt gtc tgt ccg ggt cgt ggc tat atc ctt cgt gtc aca 3024
Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr
995 1000 1005
gcg tac aag gag gga tat gga gaa ggt tgc gta acc att cat gag 3069
Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu
1010 1015 1020
atc gag aac aat aca gac gaa ctg aag ttt agc aac tgc gta gaa 3114
Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu
1025 1030 1035
gag gaa atc tat cca aac aac acg gta acg tgt aat gat tat act 3159
Glu Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr
1040 1045 1050
gta aat caa gaa gaa tac gaa ggt gcg tac act tct cgt aat cga 3204
Val Asn Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg
1055 1060 1065
gga tat aac gaa gct cct tcc gta cca gct gat tat gca tca gtc 3249
Gly Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val
1070 1075 1080
tat gaa gaa aaa tcg tat aca gat gga cga aga gag aat cct tgt 3294
Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys
1085 1090 1095
gaa ttt aac aga ggg tat agg gat tac acg cta cta cca gtt ggt 3339
Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Leu Pro Val Gly
1100 1105 1110
tat gtg aca aaa gaa tta gaa tac ttc cca gaa acc gat aag gta 3384
Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val
1115 1120 1125
tgg att gag att gga gaa acg gaa gga aca ttt atc gtg gac agc 3429
Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser
1130 1135 1140
gtg gaa tta ctc ctt atg gag gaa taa 3456
Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1145 1150
<210> 2
<211> 1151
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 2
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser
35 40 45
Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile
50 55 60
Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala
85 90 95
Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu
100 105 110
Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu
115 120 125
Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala
130 135 140
Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val
145 150 155 160
Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser
165 170 175
Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val
195 200 205
Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg
210 215 220
Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro
245 250 255
Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val
260 265 270
Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu
275 280 285
Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Ser Ser Ile Thr
290 295 300
Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln
305 310 315 320
Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro
325 330 335
Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala
340 345 350
Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg
355 360 365
Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln
405 410 415
Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His
420 425 430
Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn
450 455 460
Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr
465 470 475 480
Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly
485 490 495
Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg
500 505 510
Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg
515 520 525
Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg
530 535 540
Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn
545 550 555 560
Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn
565 570 575
Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn
580 585 590
Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu
595 600 605
Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val
610 615 620
Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val
625 630 635 640
Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser
645 650 655
Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Gln Glu Val Ser Glu Lys Val Lys
660 665 670
His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn
675 680 685
Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr
690 695 700
Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val
705 710 715 720
Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln
725 730 735
Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg
740 745 750
Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr
755 760 765
Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp
770 775 780
Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Ala His His Ser His
785 790 795 800
His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp
805 810 815
Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala
820 825 830
Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu
835 840 845
Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg
850 855 860
Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu
865 870 875 880
Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala
885 890 895
Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser
900 905 910
Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn
915 920 925
Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Cys Ile Phe Thr Ala Phe Ser
930 935 940
Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly
945 950 955 960
Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn
965 970 975
Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser
980 985 990
Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr
995 1000 1005
Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu
1010 1015 1020
Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu
1025 1030 1035
Glu Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr
1040 1045 1050
Val Asn Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg
1055 1060 1065
Gly Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val
1070 1075 1080
Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys
1085 1090 1095
Glu Phe Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Leu Pro Val Gly
1100 1105 1110
Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val
1115 1120 1125
Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser
1130 1135 1140
Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1145 1150
<210> 3
<211> 3495
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3495)
<223> /注: SVBS-1801的基因的CDS，与GenBank登录号HQ439784的基因cry1Da3的CDS 100%同一性
<400> 3
atg gaa ata aat aat caa aac caa tgt gtg cct tac aat tgt tta agt 48
Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
aat cct aag gag ata ata tta ggc gag gaa agg cta gaa aca ggg aat 96
Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn
20 25 30
act gta gca gac att tca tta ggg ctt att aat ttt cta tat tct aat 144
Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu Tyr Ser Asn
35 40 45
ttt gta cca gga gga gga ttt ata gta ggt tta cta gaa tta ata tgg 192
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu Leu Ile Trp
50 55 60
gga ttt ata ggg cct tcg caa tgg gat att ttt tta gct caa att gag 240
Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala Gln Ile Glu
65 70 75 80
caa ttg att agt caa aga ata gaa gaa ttt gct agg aat cag gca att 288
Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile
85 90 95
tca aga ttg gag ggg cta agc aat ctt tat aag gtc tat gtt aga gcg 336
Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr Val Arg Ala
100 105 110
ttt agc gac tgg gag aaa gat cct act aat cct gct tta agg gaa gaa 384
Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu
115 120 125
atg cgt ata caa ttt aat gac atg aat agt gct ctc ata acg gct att 432
Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile Thr Ala Ile
130 135 140
cca ctt ttt aga gtt caa aat tat gaa gtt gct ctt tta tct gta tat 480
Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
gtt caa gcc gca aac tta cat tta tct att tta agg gat gtt tca gtt 528
Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val
165 170 175
ttc gga gaa aga tgg gga tat gat aca gcg act atc aat aat cgc tat 576
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr
180 185 190
agt gat ctg act agc ctt att cat gtt tat act aac cat tgt gtg gat 624
Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp
195 200 205
acg tat aat cag gga tta agg cgt ttg gaa ggt cgt ttt ctt agc gat 672
Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Ser Asp
210 215 220
tgg att gta tat aat cgt ttc cgg aga caa ttg aca att tca gta tta 720
Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu
225 230 235 240
gat att gtt gcg ttt ttt cca aat tat gat att aga aca tat cca att 768
Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile
245 250 255
caa aca gct act cag cta acg agg gaa gtc tat ctg gat tta cct ttt 816
Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe
260 265 270
att aat gaa aat ctt tct cct gca gca agc tat cca acc ttt tca gct 864
Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala
275 280 285
gct gaa agt gct ata att aga agt cct cat tta gta gac ttt tta aat 912
Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn
290 295 300
agc ttt acc att tat aca gat agt ctg gca cgt tat gca tat tgg gga 960
Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly
305 310 315 320
ggg cac ttg gta aat tct ttc cgc aca gga acc act act aat ttg ata 1008
Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile
325 330 335
agg tcc cct tta tat gga agg gaa gga aat aca gag cgc ccc gta act 1056
Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr
340 345 350
att acc gca tca cct agc gta cca ata ttt aga aca ctt tca tat att 1104
Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile
355 360 365
aca ggc ctt gac aat tca aat cct gta gct gga atc gag gga gtg gaa 1152
Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu
370 375 380
ttc caa aat act ata agt aga agt atc tat cgt aaa agc ggt cca ata 1200
Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile
385 390 395 400
gat tct ttt agt gaa tta cca cct caa gat gcc agc gta tct cct gca 1248
Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala
405 410 415
att ggg tat agt cac cgt tta tgc cat gca aca ttt tta gaa cgg att 1296
Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile
420 425 430
agt gga cca aga ata gca ggc acc gta ttt tct tgg aca cac cgt agt 1344
Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser
435 440 445
gcc agc cct act aat gaa ata agt cca tct aga att aca caa att cca 1392
Ala Ser Pro Thr Asn Glu Ile Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro
450 455 460
tgg gta aag gcg cat act ctt gcg tct ggt gcc tcc gtc att aaa ggt 1440
Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly
465 470 475 480
cct gga ttt aca ggt gga gat att ctg act agg aat agt atg ggc gag 1488
Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu
485 490 495
ctg ggg acc tta cga gta acc ttc aca gga aga tta cca caa agt tat 1536
Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr
500 505 510
tat ata cgt ttc cgt tat gct tcg gta gca aat agg agt ggt aca ttt 1584
Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr Phe
515 520 525
aga tat tca cag cca cct tcg tat gga att tca ttt cca aaa act atg 1632
Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met
530 535 540
gac gca ggt gaa cca cta aca tct cgt tcg ttc gct cat aca aca ctc 1680
Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu
545 550 555 560
ttc act cca ata acc ttt tca cga gct caa gaa gaa ttt gat cta tac 1728
Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr
565 570 575
atc caa tcg ggt gtt tat ata gat cga att gaa ttt att cca gtt act 1776
Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr
580 585 590
gca aca ttt gag gca gaa tat gat tta gaa aga gcg caa aag gcg gtg 1824
Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val
595 600 605
aat gcc ctg ttt acg tct aca aac caa cta ggg cta aaa aca aat gta 1872
Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val
610 615 620
acg gat tat cat att gat caa gtg tcc aat tta gtt gcg tgt tta tcg 1920
Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu Ser
625 630 635 640
gat gaa ttt tgt ctg gat gaa aag cga gaa ttg tcc gag aaa gtt aaa 1968
Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys
645 650 655
cat gcc aag cga ctc agt gat gag cgg aat tta ctt caa gat cca aac 2016
His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn
660 665 670
ttc aga ggg gtc aat agg caa cca gac cgt ggc tgg aga gga agt acg 2064
Phe Arg Gly Val Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr
675 680 685
gat att acc atc caa gga gga gat gat gta ttc aaa gag aat tac gtc 2112
Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val
690 695 700
aca cta cca ggt acc ttt gat gag tgc tat cca acg tat tta tat caa 2160
Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln
705 710 715 720
aaa ata gat gag tcg aag tta aaa gcc tat acc cgt tat caa tta aga 2208
Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg
725 730 735
ggg tat atc gag gat agt caa gac tta gaa atc tat tta att cgc tac 2256
Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr
740 745 750
aat gca aaa cac gaa aca gta aac gtg cca ggt aca gga tcc tta tgg 2304
Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp
755 760 765
cca ctt tca gcc gaa agt cca atc gga aag tgc gga gaa ccg aat cga 2352
Pro Leu Ser Ala Glu Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg
770 775 780
tgc gcg cca cac ctt gaa tgg aat cct gat tta cac tgt tcc tgc aga 2400
Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu His Cys Ser Cys Arg
785 790 795 800
gac ggg gaa aaa tgt gca cat cat tct cat cat ttc tct ttg gac att 2448
Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile
805 810 815
gat gtt gga tgt aca gac tta cat gat gac tta ggt gta tgg gtg ata 2496
Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu His Asp Asp Leu Gly Val Trp Val Ile
820 825 830
ttc aag att aag acg caa gat ggc cac gca cga cta ggg aat cta gag 2544
Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu
835 840 845
ttt ctc gaa gag aaa cca tta gta gga gaa gca cta gct cgt gtg aaa 2592
Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys
850 855 860
aga gcg gag aaa aaa tgg aga gac aaa cgc gaa aca tta caa ttg gaa 2640
Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Thr Leu Gln Leu Glu
865 870 875 880
aca act atc gtt tat aaa gag gca aaa gaa tct gta gat gct tta ttt 2688
Thr Thr Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe
885 890 895
gta aac tct caa tat gat aga tta caa gcg gat acg aac atc gcg atg 2736
Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met
900 905 910
att cat gcg gca gat aaa cgc gtt cat aga att cga gaa gcg tat ctg 2784
Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu
915 920 925
ccg gag ctg tct gtg att ccg ggt gtc aat gcg gct att ttt gaa gaa 2832
Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu
930 935 940
tta gaa ggg cgt att ttc act gca ttt tcc cta tat gat gcg aga aat 2880
Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn
945 950 955 960
att att aaa aat ggc gat ttc aat aat ggc tta ttg tgc tgg aac gtg 2928
Ile Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Leu Cys Trp Asn Val
965 970 975
aaa ggg cat gta gag gta gaa gaa caa aac aat cac cgt tca gtc ctg 2976
Lys Gly His Val Glu Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu
980 985 990
gtt atc cca gaa tgg gag gca gaa gtg tca caa gag gtt cgt gtc tgt 3024
Val Ile Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys
995 1000 1005
cca ggt cgt ggc tat atc ctt cgt gtc aca gcg tac aaa gag gga 3069
Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly
1010 1015 1020
tat gga gag ggc tgc gta acg atc cat gag atc gaa gac aat aca 3114
Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr
1025 1030 1035
gac gaa ctg aaa ttc agc aac tgt gta gaa gaa gca tat cca aac 3159
Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Ala Tyr Pro Asn
1040 1045 1050
aac acg gta acg tgt aat gat tat acg acg aac caa gat aga tgt 3204
Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Thr Asn Gln Asp Arg Cys
1055 1060 1065
gcg ggt gtg cac act tct cgt aat cgc gga tat gac gaa gcc tat 3249
Ala Gly Val His Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Ala Tyr
1070 1075 1080
gga aac aac cct tcc gta cca gtt gat tat gcg cca gtt tat aag 3294
Gly Asn Asn Pro Ser Val Pro Val Asp Tyr Ala Pro Val Tyr Lys
1085 1090 1095
gaa gaa gcg tat aca gag gta cga aga gat aat tct tgt gaa tct 3339
Glu Glu Ala Tyr Thr Glu Val Arg Arg Asp Asn Ser Cys Glu Ser
1100 1105 1110
aac aga ggg tat ggg aat tat acg cca tta cca gct ggt tat gtg 3384
Asn Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val
1115 1120 1125
aca aaa gaa tta gag tac ttc cca gaa acc gat aag gta tgg att 3429
Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile
1130 1135 1140
gag att gga gaa acg gaa gga aca ttc atc gtg gat agt gtg gaa 3474
Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu
1145 1150 1155
tta ctc ctc atg gag gaa tag 3495
Leu Leu Leu Met Glu Glu
1160
<210> 4
<211> 1164
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 4
Met Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly Asn
20 25 30
Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu Tyr Ser Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu Leu Ile Trp
50 55 60
Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala Gln Ile Glu
65 70 75 80
Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile
85 90 95
Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr Val Arg Ala
100 105 110
Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu
115 120 125
Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile Thr Ala Ile
130 135 140
Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser Val
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg Tyr
180 185 190
Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val Asp
195 200 205
Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Ser Asp
210 215 220
Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro Phe
260 265 270
Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser Ala
275 280 285
Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu Asn
290 295 300
Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp Gly
305 310 315 320
Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu Ile
325 330 335
Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val Thr
340 345 350
Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Ile
355 360 365
Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val Glu
370 375 380
Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro Ile
385 390 395 400
Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro Ala
405 410 415
Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg Ile
420 425 430
Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser
435 440 445
Ala Ser Pro Thr Asn Glu Ile Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile Pro
450 455 460
Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys Gly
465 470 475 480
Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly Glu
485 490 495
Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser Tyr
500 505 510
Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr Phe
515 520 525
Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr Met
530 535 540
Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr Leu
545 550 555 560
Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu Tyr
565 570 575
Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Thr
580 585 590
Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val
595 600 605
Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val
610 615 620
Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Ala Cys Leu Ser
625 630 635 640
Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys
645 650 655
His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn
660 665 670
Phe Arg Gly Val Asn Arg Gln Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr
675 680 685
Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val
690 695 700
Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln
705 710 715 720
Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Arg
725 730 735
Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr
740 745 750
Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp
755 760 765
Pro Leu Ser Ala Glu Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg
770 775 780
Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu His Cys Ser Cys Arg
785 790 795 800
Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile
805 810 815
Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu His Asp Asp Leu Gly Val Trp Val Ile
820 825 830
Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu
835 840 845
Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys
850 855 860
Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Thr Leu Gln Leu Glu
865 870 875 880
Thr Thr Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe
885 890 895
Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met
900 905 910
Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu
915 920 925
Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu
930 935 940
Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn
945 950 955 960
Ile Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Leu Cys Trp Asn Val
965 970 975
Lys Gly His Val Glu Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu
980 985 990
Val Ile Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys
995 1000 1005
Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly
1010 1015 1020
Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr
1025 1030 1035
Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Ala Tyr Pro Asn
1040 1045 1050
Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Thr Asn Gln Asp Arg Cys
1055 1060 1065
Ala Gly Val His Thr Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Ala Tyr
1070 1075 1080
Gly Asn Asn Pro Ser Val Pro Val Asp Tyr Ala Pro Val Tyr Lys
1085 1090 1095
Glu Glu Ala Tyr Thr Glu Val Arg Arg Asp Asn Ser Cys Glu Ser
1100 1105 1110
Asn Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile
1130 1135 1140
Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu
1145 1150 1155
Leu Leu Leu Met Glu Glu
1160
<210> 5
<211> 3516
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3516)
<223> /注: 苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的基因的CDS，与基因cry1Ea7的CDS 100%同一性，基因cry1Ea7的GenBank登录号AY894137
<400> 5
atg gag ata gtg aat aat cag aat caa tgc gtg cct tat aat tgt tta 48
Met Glu Ile Val Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
aat aat cct gaa aat gag ata tta gat att gaa agg tca aat agt act 96
Asn Asn Pro Glu Asn Glu Ile Leu Asp Ile Glu Arg Ser Asn Ser Thr
20 25 30
gta gca aca aac atc gcc ttg gag att agt cgt ctg ctc gct tcc gca 144
Val Ala Thr Asn Ile Ala Leu Glu Ile Ser Arg Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
act cca ata ggg ggg att tta tta gga ttg ttt gat gca ata tgg ggg 192
Thr Pro Ile Gly Gly Ile Leu Leu Gly Leu Phe Asp Ala Ile Trp Gly
50 55 60
tct ata ggc cct tca caa tgg gat tta ttt tta gag caa att gag cta 240
Ser Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu Leu
65 70 75 80
ttg att gac caa aaa ata gag gaa ttc gct aga aac cag gca att tct 288
Leu Ile Asp Gln Lys Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser
85 90 95
aga tta gaa ggg ata agc agt ctg tac gga att tat aca gaa gct ttt 336
Arg Leu Glu Gly Ile Ser Ser Leu Tyr Gly Ile Tyr Thr Glu Ala Phe
100 105 110
aga gag tgg gaa gca gat cct act aat cca gca tta aaa gaa gag atg 384
Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Lys Glu Glu Met
115 120 125
cgt act caa ttt aat gac atg aac agt att ctt gta aca gct att cct 432
Arg Thr Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ile Leu Val Thr Ala Ile Pro
130 135 140
ctt ttt tca gtt caa aat tat caa gtc cca ttt tta tca gta tat gtt 480
Leu Phe Ser Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Phe Leu Ser Val Tyr Val
145 150 155 160
caa gct gca aat tta cat tta tcg gtt ttg aga gat gtt tca gtg ttt 528
Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe
165 170 175
ggg cag gct tgg gga ttt gat ata gca aca ata aat agt cgt tat aat 576
Gly Gln Ala Trp Gly Phe Asp Ile Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn
180 185 190
gat ctg act aga ctt att cct ata tat aca gat tat gct gta cgc tgg 624
Asp Leu Thr Arg Leu Ile Pro Ile Tyr Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp
195 200 205
tac aat acg gga tta gat cgc tta cca cga act ggt ggg ctg cga aac 672
Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg Leu Pro Arg Thr Gly Gly Leu Arg Asn
210 215 220
tgg gca aga ttt aat cag ttt aga aga gag tta aca ata tca gta tta 720
Trp Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Ile Ser Val Leu
225 230 235 240
gat att att tct ttt ttc aga aat tac gat tct aga tta tat cca att 768
Asp Ile Ile Ser Phe Phe Arg Asn Tyr Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Ile
245 250 255
cca aca agc tcc caa tta acg cgg gaa gta tat aca gat ccg gta att 816
Pro Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Val Ile
260 265 270
aat ata act gac tat aga gtt ggc ccc agc ttc gag aat att gag aac 864
Asn Ile Thr Asp Tyr Arg Val Gly Pro Ser Phe Glu Asn Ile Glu Asn
275 280 285
tca gcc att aga agc ccc cac ctt atg gac ttc tta aat aat ttg acc 912
Ser Ala Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Phe Leu Asn Asn Leu Thr
290 295 300
att gat acg gat ttg att aga ggt gtt cac tat tgg gca ggg cat cgt 960
Ile Asp Thr Asp Leu Ile Arg Gly Val His Tyr Trp Ala Gly His Arg
305 310 315 320
gta act tct cat ttt aca ggt agt tct caa gtg ata aca acc cct caa 1008
Val Thr Ser His Phe Thr Gly Ser Ser Gln Val Ile Thr Thr Pro Gln
325 330 335
tat ggg ata acc gca aat gcg gaa cca aga cga act att gct cct agt 1056
Tyr Gly Ile Thr Ala Asn Ala Glu Pro Arg Arg Thr Ile Ala Pro Ser
340 345 350
act ttt cca ggt ctt aac cta ttt tat aga aca tta tca aat cct ttc 1104
Thr Phe Pro Gly Leu Asn Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asn Pro Phe
355 360 365
ttc cga aga tca gaa aat att act cct acc tta ggg ata aat gta gta 1152
Phe Arg Arg Ser Glu Asn Ile Thr Pro Thr Leu Gly Ile Asn Val Val
370 375 380
cag gga gta ggg ttc att caa cca aat aat gct gaa gtt cta tat aga 1200
Gln Gly Val Gly Phe Ile Gln Pro Asn Asn Ala Glu Val Leu Tyr Arg
385 390 395 400
agt agg ggg aca gta gat tct ctt aat gag tta cca att gat ggt gag 1248
Ser Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Glu Leu Pro Ile Asp Gly Glu
405 410 415
aat tca tta gtt gga tat agt cat cga tta agt cat gtt aca cta acc 1296
Asn Ser Leu Val Gly Tyr Ser His Arg Leu Ser His Val Thr Leu Thr
420 425 430
agg tcg tta tat aat act aat ata act agc ctg cca aca ttt gtt tgg 1344
Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Ser Leu Pro Thr Phe Val Trp
435 440 445
aca cat cac agt gct act aat aca aat aca att aat cca gat att att 1392
Thr His His Ser Ala Thr Asn Thr Asn Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile
450 455 460
aca caa ata cct tta gtg aaa gga ttt aga ctt ggt ggt ggc acc tct 1440
Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Leu Gly Gly Gly Thr Ser
465 470 475 480
gtc att aaa gga cca gga ttt aca gga ggg gat atc ctt cga aga aat 1488
Val Ile Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn
485 490 495
acc att ggt gag ttt gtg tct tta caa gtc aat att aac tca cca att 1536
Thr Ile Gly Glu Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile
500 505 510
acc caa aga tac cgt tta aga ttt cgt tat gct tcc agt agg gat gca 1584
Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala
515 520 525
cga att act gta gcg ata gga gga caa att aga gta gat atg acc ctt 1632
Arg Ile Thr Val Ala Ile Gly Gly Gln Ile Arg Val Asp Met Thr Leu
530 535 540
gaa aaa acc atg gaa att ggg gag agc tta aca tct aga aca ttt agc 1680
Glu Lys Thr Met Glu Ile Gly Glu Ser Leu Thr Ser Arg Thr Phe Ser
545 550 555 560
tat acc aat ttt agt aat cct ttt tca ttt agg gct aat cca gat ata 1728
Tyr Thr Asn Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile
565 570 575
att aga ata gct gaa gaa ctt cct att cgt ggt ggt gag ctt tat ata 1776
Ile Arg Ile Ala Glu Glu Leu Pro Ile Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Ile
580 585 590
gat aaa att gaa ctt att cta gca gat gca aca ttt gaa gaa gaa tat 1824
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Glu Glu Tyr
595 600 605
gat ttg gaa aga gca cag aag gcg gtg aat gcc ctg ttt act tct aca 1872
Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr
610 615 620
aat caa cta ggg cta aaa aca gat gtg acg gat tat cat att gat caa 1920
Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln
625 630 635 640
gtt tcc aat tta gtt gag tgt tta tcg gat gaa ttt tgt ctg gat gaa 1968
Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu
645 650 655
aag aga gaa tta tcc gag aaa gtc aaa cat gcg aag cga ctc agt gat 2016
Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp
660 665 670
gaa cgg aat tta ctt caa gat cca aac ttc aga ggg atc aat agg caa 2064
Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln
675 680 685
cca gac cgt ggc tgg aga gga agc acg gat att act atc caa ggt gga 2112
Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly
690 695 700
gat gac gta ttc aaa gag aat tac gtc aca tta ccg ggt acc ttt gat 2160
Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp
705 710 715 720
gag tgc tat cca acg tat tta tat caa aaa ata gat gag tcg aag tta 2208
Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu
725 730 735
aaa gct tat acc cgc tat gaa tta aga ggg tat atc gag gat agt caa 2256
Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln
740 745 750
gac tta gaa atc tat tta att cgc tac aat gca aaa cac gag aca gta 2304
Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val
755 760 765
aac gtg cca ggt acg ggt tcc tta tgg ccg ctt tca gcc caa agt cca 2352
Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro
770 775 780
atc gga aag tgt gga gaa ccg aat cga tgc gcg cca cac ctt gaa tgg 2400
Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp
785 790 795 800
aat cct aat cta gat tgc tcc tgc aga gac ggg gaa aaa tgt gcc cat 2448
Asn Pro Asn Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His
805 810 815
cat tcc cat cat ttc tcc ttg gac att gat gtt gga tgt aca gac tta 2496
His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu
820 825 830
aat gag gac tta ggt gta tgg gtg ata ttc aag att aag aca caa gat 2544
Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp
835 840 845
ggc tat gca aga cta gga aat cta gag ttt ctc gaa gag aaa cca cta 2592
Gly Tyr Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu
850 855 860
tta ggg gaa gca cta gct cgt gtg aaa aga gcg gag aaa aaa tgg aga 2640
Leu Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg
865 870 875 880
gac aaa tgc gaa aaa ttg gaa tgg gaa aca aat att gtt tat aaa gag 2688
Asp Lys Cys Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu
885 890 895
gca aaa gaa tct gta gat gct tta ttt gta aac tct caa tat gat aga 2736
Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg
900 905 910
tta caa gcg gat acg aat atc gcg atg att cat gcg gca gat aaa cgc 2784
Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg
915 920 925
gtt cat agc att cga gaa gcg tat ctg cca gag ctg tct gtg att ccg 2832
Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro
930 935 940
ggt gtc aat gcg gct att ttt gaa gaa tta gaa ggg cgt att ttc act 2880
Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr
945 950 955 960
gca ttc tcc cta tat gat gcg aga aat gtc att aaa aat ggc gat ttc 2928
Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe
965 970 975
aat aat ggc tta tca tgc tgg aac gtg aaa ggg cat gta gat gta gaa 2976
Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu
980 985 990
gaa cag aac aac cat cgt tcg gtc ctt gtt gtt cca gaa tgg gaa gca 3024
Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala
995 1000 1005
gaa gtg tca caa gaa gtt cgt gtt tgt ccg ggt cgt ggc tat atc 3069
Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile
1010 1015 1020
ctt cgt gtt aca gcg tac aaa gag gga tat gga gag ggc tgt gta 3114
Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val
1025 1030 1035
acg att cat gag atc gaa gac aat aca gac gaa ctg aaa ttc agc 3159
Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser
1040 1045 1050
aac tgt gta gaa gag gaa gta tat cca aac aac acg gta acg tgt 3204
Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys
1055 1060 1065
aat aat tat act gcg act caa gaa gaa cat gag ggt acg tac act 3249
Asn Asn Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu His Glu Gly Thr Tyr Thr
1070 1075 1080
tcc cgt aat cga gga tat gac gaa gcc tat gaa agc aat tct tct 3294
Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser
1085 1090 1095
gta cat gcg tca gtc tat gaa gaa aaa tcg tat aca gat aga cga 3339
Val His Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Arg Arg
1100 1105 1110
aga gag aat cct tgt gaa tct aac aga gga tat ggg gat tac aca 3384
Arg Glu Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr
1115 1120 1125
cca cta cca gct ggc tat gtg aca aaa gaa tta gag tac ttc cca 3429
Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro
1130 1135 1140
gaa acc gat aag gta tgg att gag atc gga gaa acg gaa gga aca 3474
Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr
1145 1150 1155
ttc atc gtg gac agc gtg gaa tta ctt ctt atg gag gaa taa 3516
Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1160 1165 1170
<210> 6
<211> 1171
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 6
Met Glu Ile Val Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu
1 5 10 15
Asn Asn Pro Glu Asn Glu Ile Leu Asp Ile Glu Arg Ser Asn Ser Thr
20 25 30
Val Ala Thr Asn Ile Ala Leu Glu Ile Ser Arg Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
Thr Pro Ile Gly Gly Ile Leu Leu Gly Leu Phe Asp Ala Ile Trp Gly
50 55 60
Ser Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Leu Phe Leu Glu Gln Ile Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ile Asp Gln Lys Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser
85 90 95
Arg Leu Glu Gly Ile Ser Ser Leu Tyr Gly Ile Tyr Thr Glu Ala Phe
100 105 110
Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Lys Glu Glu Met
115 120 125
Arg Thr Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ile Leu Val Thr Ala Ile Pro
130 135 140
Leu Phe Ser Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Phe Leu Ser Val Tyr Val
145 150 155 160
Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe
165 170 175
Gly Gln Ala Trp Gly Phe Asp Ile Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn
180 185 190
Asp Leu Thr Arg Leu Ile Pro Ile Tyr Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp
195 200 205
Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg Leu Pro Arg Thr Gly Gly Leu Arg Asn
210 215 220
Trp Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Ile Ser Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Ile Ser Phe Phe Arg Asn Tyr Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Ile
245 250 255
Pro Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Val Ile
260 265 270
Asn Ile Thr Asp Tyr Arg Val Gly Pro Ser Phe Glu Asn Ile Glu Asn
275 280 285
Ser Ala Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Phe Leu Asn Asn Leu Thr
290 295 300
Ile Asp Thr Asp Leu Ile Arg Gly Val His Tyr Trp Ala Gly His Arg
305 310 315 320
Val Thr Ser His Phe Thr Gly Ser Ser Gln Val Ile Thr Thr Pro Gln
325 330 335
Tyr Gly Ile Thr Ala Asn Ala Glu Pro Arg Arg Thr Ile Ala Pro Ser
340 345 350
Thr Phe Pro Gly Leu Asn Leu Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asn Pro Phe
355 360 365
Phe Arg Arg Ser Glu Asn Ile Thr Pro Thr Leu Gly Ile Asn Val Val
370 375 380
Gln Gly Val Gly Phe Ile Gln Pro Asn Asn Ala Glu Val Leu Tyr Arg
385 390 395 400
Ser Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Asn Glu Leu Pro Ile Asp Gly Glu
405 410 415
Asn Ser Leu Val Gly Tyr Ser His Arg Leu Ser His Val Thr Leu Thr
420 425 430
Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Ser Leu Pro Thr Phe Val Trp
435 440 445
Thr His His Ser Ala Thr Asn Thr Asn Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile
450 455 460
Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Leu Gly Gly Gly Thr Ser
465 470 475 480
Val Ile Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Asn
485 490 495
Thr Ile Gly Glu Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile Asn Ser Pro Ile
500 505 510
Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Ser Arg Asp Ala
515 520 525
Arg Ile Thr Val Ala Ile Gly Gly Gln Ile Arg Val Asp Met Thr Leu
530 535 540
Glu Lys Thr Met Glu Ile Gly Glu Ser Leu Thr Ser Arg Thr Phe Ser
545 550 555 560
Tyr Thr Asn Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile
565 570 575
Ile Arg Ile Ala Glu Glu Leu Pro Ile Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Ile
580 585 590
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Glu Glu Tyr
595 600 605
Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr
610 615 620
Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln
625 630 635 640
Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu
645 650 655
Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp
660 665 670
Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln
675 680 685
Pro Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly
690 695 700
Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp
705 710 715 720
Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu
725 730 735
Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln
740 745 750
Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val
755 760 765
Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro
770 775 780
Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp
785 790 795 800
Asn Pro Asn Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His
805 810 815
His Ser His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu
820 825 830
Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp
835 840 845
Gly Tyr Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu
850 855 860
Leu Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg
865 870 875 880
Asp Lys Cys Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu
885 890 895
Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg
900 905 910
Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg
915 920 925
Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro
930 935 940
Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr
945 950 955 960
Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe
965 970 975
Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu
980 985 990
Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala
995 1000 1005
Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile
1010 1015 1020
Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val
1025 1030 1035
Thr Ile His Glu Ile Glu Asp Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser
1040 1045 1050
Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys
1055 1060 1065
Asn Asn Tyr Thr Ala Thr Gln Glu Glu His Glu Gly Thr Tyr Thr
1070 1075 1080
Ser Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Glu Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser
1085 1090 1095
Val His Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Arg Arg
1100 1105 1110
Arg Glu Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr
1115 1120 1125
Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro
1130 1135 1140
Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr
1145 1150 1155
Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1160 1165 1170
<210> 7
<211> 3504
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3504)
<223> /注: 苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的 cry1Ja1样基因的CDS，与基因cry1Ja1的CDS 94%同一性，基因cry1Ja1的GenBank登录号L32019
<220>
<221> misc_差异
<222> (987)..(987)
<223> T替代C于基因cry1Ja1中，GenBank登录号L32019，其导致SEQ ID NO:8的位置329处Leu取代由cry1Ja1基因的CDS编码的蛋白质中的Phe
<220>
<221> misc_差异
<222> (2345)..(2345)
<223> G替代A于基因cry1Ja1中，GenBank登录号L32019，其导致SEQ ID NO:8的位置782处Tyr取代由cry1Ja1基因的CDS编码的蛋白质中的Cys
<400> 7
atg gag ata aat aat cag aag caa tgc ata cca tat aat tgc tta agt 48
Met Glu Ile Asn Asn Gln Lys Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
aat cct gag gaa gta ctt ttg gat ggg gag agg ata tta cct gat atc 96
Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Leu Pro Asp Ile
20 25 30
gat cca ctc gaa gtt tct ttg tcg ctt ttg caa ttt ctt ttg aat aac 144
Asp Pro Leu Glu Val Ser Leu Ser Leu Leu Gln Phe Leu Leu Asn Asn
35 40 45
ttt gtt cca ggg gga ggc ttt att tca gga tta gtt gat aaa ata tgg 192
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Ser Gly Leu Val Asp Lys Ile Trp
50 55 60
ggg gct ttg aga cca tct gaa tgg gac tta ttt ctt gca cag att gaa 240
Gly Ala Leu Arg Pro Ser Glu Trp Asp Leu Phe Leu Ala Gln Ile Glu
65 70 75 80
cgg ttg att gat caa aga ata gaa gca aca gta aga gca aaa gca atc 288
Arg Leu Ile Asp Gln Arg Ile Glu Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Ile
85 90 95
act gaa tta gaa gga tta ggg aga aat tat caa ata tac gct gaa gca 336
Thr Glu Leu Glu Gly Leu Gly Arg Asn Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ala
100 105 110
ttt aaa gaa tgg gaa tca gat cct gat aac gaa gcg gct aaa agt aga 384
Phe Lys Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asp Asn Glu Ala Ala Lys Ser Arg
115 120 125
gta att gat cgc ttt cgt ata ctt gat ggt cta att gaa gca aat atc 432
Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Ile Glu Ala Asn Ile
130 135 140
cct tca ttt cgg ata att gga ttt gaa gtg cca ctt tta tcg gtt tat 480
Pro Ser Phe Arg Ile Ile Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
gtt caa gca gct aat cta cat ctc gct cta ttg aga gat tct gtt att 528
Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Leu Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
ttt gga gag aga tgg gga ttg acg aca aaa aat gtc aat gat atc tat 576
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Lys Asn Val Asn Asp Ile Tyr
180 185 190
aat aga caa att aga gaa att cat gaa tat agc aat cat tgc gta gat 624
Asn Arg Gln Ile Arg Glu Ile His Glu Tyr Ser Asn His Cys Val Asp
195 200 205
acg tat aac aca gaa cta gaa cgt cta ggg ttt aga tct ata gcg cag 672
Thr Tyr Asn Thr Glu Leu Glu Arg Leu Gly Phe Arg Ser Ile Ala Gln
210 215 220
tgg aga ata tat aat cag ttt aga aga gaa cta aca cta act gta tta 720
Trp Arg Ile Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
gat att gtc gct ctt ttc ccg aac tat gac agt aga ctg tat ccg atc 768
Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Ile
245 250 255
caa act ttt tct caa ttg aca aga gaa att gtt aca tcc cca gta agc 816
Gln Thr Phe Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Val Thr Ser Pro Val Ser
260 265 270
gaa ttt tat tat ggt gtt att aat agt ggt aat ata att ggt act ctt 864
Glu Phe Tyr Tyr Gly Val Ile Asn Ser Gly Asn Ile Ile Gly Thr Leu
275 280 285
act gaa cag cag ata agg cga cca cat ctt atg gac ttc ttt aac tcc 912
Thr Glu Gln Gln Ile Arg Arg Pro His Leu Met Asp Phe Phe Asn Ser
290 295 300
atg atc atg tat aca tca gat aat aga cgg gaa cat tat tgg tca gga 960
Met Ile Met Tyr Thr Ser Asp Asn Arg Arg Glu His Tyr Trp Ser Gly
305 310 315 320
ctt gaa atg acg gct tat ttt aca gga ctt gca gga gct caa gtg tca 1008
Leu Glu Met Thr Ala Tyr Phe Thr Gly Leu Ala Gly Ala Gln Val Ser
325 330 335
ttc cct tta gtc ggg act aga ggg gag tca gct cca cca tta act gtt 1056
Phe Pro Leu Val Gly Thr Arg Gly Glu Ser Ala Pro Pro Leu Thr Val
340 345 350
aga agt gtt aat gat gga att tat aga ata tta tcg gca ccg ttt tat 1104
Arg Ser Val Asn Asp Gly Ile Tyr Arg Ile Leu Ser Ala Pro Phe Tyr
355 360 365
tca gcg cct ttt cta ggc acc att gta ttg gga agt cgt gga gaa aaa 1152
Ser Ala Pro Phe Leu Gly Thr Ile Val Leu Gly Ser Arg Gly Glu Lys
370 375 380
ttt gat ttt gcg ctt aat aat att tca cct ccg cca tct aca ata tac 1200
Phe Asp Phe Ala Leu Asn Asn Ile Ser Pro Pro Pro Ser Thr Ile Tyr
385 390 395 400
aga cat cct gga aca gta gat tca cta gtc agt ata ccg cca cag gat 1248
Arg His Pro Gly Thr Val Asp Ser Leu Val Ser Ile Pro Pro Gln Asp
405 410 415
aat agc gta cca ccg cac agg gga tct agt cat cga tta agt cat gtt 1296
Asn Ser Val Pro Pro His Arg Gly Ser Ser His Arg Leu Ser His Val
420 425 430
aca atg cgc gca agt tcc cct ata ttc cat tgg acg cat cgc agc gca 1344
Thr Met Arg Ala Ser Ser Pro Ile Phe His Trp Thr His Arg Ser Ala
435 440 445
acc act aca aat aca att aat cca aat gct att atc caa ata cca cta 1392
Thr Thr Thr Asn Thr Ile Asn Pro Asn Ala Ile Ile Gln Ile Pro Leu
450 455 460
gta aaa gca ttt aac ctt cat tca ggt gcc act gtt gtt aga gga cca 1440
Val Lys Ala Phe Asn Leu His Ser Gly Ala Thr Val Val Arg Gly Pro
465 470 475 480
ggg ttt aca ggt ggt gat atc ctt cga aga acg aat act ggc aca ttt 1488
Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe
485 490 495
gca gat atg aga gta aat att act ggg cca tta tcc caa aga tat cgt 1536
Ala Asp Met Arg Val Asn Ile Thr Gly Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg
500 505 510
gta aga att cgc tat gct tct acg aca gat tta caa ttt ttc acg aga 1584
Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe Phe Thr Arg
515 520 525
atc aat gga act tct gta aat caa ggt aat ttc caa aga act atg aat 1632
Ile Asn Gly Thr Ser Val Asn Gln Gly Asn Phe Gln Arg Thr Met Asn
530 535 540
aga ggg gat aat tta gaa tct gga aac ttt agg act gca gga ttt agt 1680
Arg Gly Asp Asn Leu Glu Ser Gly Asn Phe Arg Thr Ala Gly Phe Ser
545 550 555 560
acg cct ttt agt ttt tca aat gcg caa agt aca ttc aca ttg ggt act 1728
Thr Pro Phe Ser Phe Ser Asn Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu Gly Thr
565 570 575
cag gct ttt tca aat cag gaa gtt tat ata gat cga att gaa ttt gtc 1776
Gln Ala Phe Ser Asn Gln Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val
580 585 590
ccg gca gaa gta aca ttc gag gca gaa tct gat tta gaa aga gcg caa 1824
Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln
595 600 605
aag gcg gtg aat gcc ctg ttt act tct aca aac caa cta ggg cta aaa 1872
Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys
610 615 620
aca gat gtg acg gat tat cag att gat caa gtg tcc aat tta gta gaa 1920
Thr Asp Val Thr Asp Tyr Gln Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu
625 630 635 640
tgt tta tca gat gaa ttt tgt ctg gat gaa aag aga gaa ttg tcc gag 1968
Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu
645 650 655
aaa gtc aaa cat gca aag cga ctt agt gat aag cgg aac cta ctt caa 2016
Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Lys Arg Asn Leu Leu Gln
660 665 670
gat cca aac ttc aca tct atc aat aga caa cta gac cgt gga tgg aga 2064
Asp Pro Asn Phe Thr Ser Ile Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg
675 680 685
gga agt acg gat att acc atc caa gga gga aat gac gta ttc aaa gag 2112
Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asn Asp Val Phe Lys Glu
690 695 700
aat tac gtc aca cta cca ggt acc ttt gat gag tgt tat cca acg tat 2160
Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr
705 710 715 720
ttg tat caa aaa ata gat gag tca aaa tta aaa gcc tat act cgc tat 2208
Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr
725 730 735
gaa tta aga ggg tat att gaa gat agt caa gat tta gaa gtc tat ttg 2256
Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val Tyr Leu
740 745 750
att cgt tac aat gcg aaa cat gaa aca gta aat gtt ccc ggt aca ggg 2304
Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly
755 760 765
tcc tta tgg ccg ctt tca gtc gaa agc cca atc gga agg tac gga gaa 2352
Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro Ile Gly Arg Tyr Gly Glu
770 775 780
ccg aat cga tgt gtg cca cat att gaa tgg aat cct gat tta gat tgt 2400
Pro Asn Arg Cys Val Pro His Ile Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys
785 790 795 800
tcg tgt agg gat ggg gag aag tgt gcc cat cat tcg cat cat ttc tct 2448
Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser
805 810 815
cta gat att gat gtt gga tgt aca gac cta aat gag gac cta ggt gta 2496
Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val
820 825 830
tgg gtg atc ttt aag att aaa acg cag gat ggc cat gca aga tta gga 2544
Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly
835 840 845
aat cta gag ttt ctc gaa gag aaa cca ttg tta gga gaa gcg tta gct 2592
Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ala
850 855 860
cgt gtg aaa aga gcg gag aaa aaa tgg aga gac aaa cgc gaa caa ttg 2640
Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Gln Leu
865 870 875 880
cag ttt gaa acg aat atc gtt tac aaa gag gca aaa gaa tct gta gat 2688
Gln Phe Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp
885 890 895
gct tta ttc gta gat tct cac tat aat aga tta caa gcg gat acg aac 2736
Ala Leu Phe Val Asp Ser His Tyr Asn Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn
900 905 910
att acg atg att cat gcg gca gat aaa cgc gtt cat cga atc cga gag 2784
Ile Thr Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu
915 920 925
gct tat ctt ccg gaa tta tcc gtt atc cca ggt gta aat gcg gac att 2832
Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Asp Ile
930 935 940
ttt gaa gaa tta gaa ggt ctt att ttc act gca ttc tcc cta tat gat 2880
Phe Glu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp
945 950 955 960
gcg aga aat atc att aaa aac ggt gat ttc aat aat ggt tta tcg tgt 2928
Ala Arg Asn Ile Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys
965 970 975
tgg aac gtg aaa ggg cat gta gat ata caa cag aat gat cat cgt tct 2976
Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Ile Gln Gln Asn Asp His Arg Ser
980 985 990
gtc ctc gtt gtc ccg gaa tgg gaa tca gag gta tca caa gaa gtc cgc 3024
Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ser Glu Val Ser Gln Glu Val Arg
995 1000 1005
gta tgt cca ggt cgt ggc tat att ctt cgt gtc aca gcg tac aaa 3069
Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys
1010 1015 1020
gag ggc tac gga gaa gga tgc gta acg atc cat gag atc gaa gac 3114
Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp
1025 1030 1035
aat aca gac gaa ttg aag ttt agt aac tgc ata gaa gag gaa gtc 3159
Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Ile Glu Glu Glu Val
1040 1045 1050
tat cca acg gat aca ggt aat gat tat act gca cac caa ggt aca 3204
Tyr Pro Thr Asp Thr Gly Asn Asp Tyr Thr Ala His Gln Gly Thr
1055 1060 1065
aca gga tgc gca gat gca tgt aat tcc cgt aat gtt gga tat gag 3249
Thr Gly Cys Ala Asp Ala Cys Asn Ser Arg Asn Val Gly Tyr Glu
1070 1075 1080
gat gga tat gaa ata aat act aca gca tct gtt aat tac aaa ccg 3294
Asp Gly Tyr Glu Ile Asn Thr Thr Ala Ser Val Asn Tyr Lys Pro
1085 1090 1095
act tat gaa gaa gaa atg tat aca gat gta cga aga gat aat cat 3339
Thr Tyr Glu Glu Glu Met Tyr Thr Asp Val Arg Arg Asp Asn His
1100 1105 1110
tgt gaa tat gac aga gga tat ggg aac cat aca ccg tta cca gct 3384
Cys Glu Tyr Asp Arg Gly Tyr Gly Asn His Thr Pro Leu Pro Ala
1115 1120 1125
ggt tat gta aca aaa gaa tta gag tac ttc cct gaa aca gat aca 3429
Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Thr
1130 1135 1140
gta tgg ata gag att gga gaa acg gaa gga aca ttc atc gta gat 3474
Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp
1145 1150 1155
agt gtg gaa tta ctc ctc atg gag gaa taa 3504
Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
1160 1165
<210> 8
<211> 1167
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 8
Met Glu Ile Asn Asn Gln Lys Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Leu Pro Asp Ile
20 25 30
Asp Pro Leu Glu Val Ser Leu Ser Leu Leu Gln Phe Leu Leu Asn Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Ser Gly Leu Val Asp Lys Ile Trp
50 55 60
Gly Ala Leu Arg Pro Ser Glu Trp Asp Leu Phe Leu Ala Gln Ile Glu
65 70 75 80
Arg Leu Ile Asp Gln Arg Ile Glu Ala Thr Val Arg Ala Lys Ala Ile
85 90 95
Thr Glu Leu Glu Gly Leu Gly Arg Asn Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ala
100 105 110
Phe Lys Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asp Asn Glu Ala Ala Lys Ser Arg
115 120 125
Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Ile Glu Ala Asn Ile
130 135 140
Pro Ser Phe Arg Ile Ile Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr
145 150 155 160
Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Leu Leu Arg Asp Ser Val Ile
165 170 175
Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Lys Asn Val Asn Asp Ile Tyr
180 185 190
Asn Arg Gln Ile Arg Glu Ile His Glu Tyr Ser Asn His Cys Val Asp
195 200 205
Thr Tyr Asn Thr Glu Leu Glu Arg Leu Gly Phe Arg Ser Ile Ala Gln
210 215 220
Trp Arg Ile Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Ile
245 250 255
Gln Thr Phe Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Val Thr Ser Pro Val Ser
260 265 270
Glu Phe Tyr Tyr Gly Val Ile Asn Ser Gly Asn Ile Ile Gly Thr Leu
275 280 285
Thr Glu Gln Gln Ile Arg Arg Pro His Leu Met Asp Phe Phe Asn Ser
290 295 300
Met Ile Met Tyr Thr Ser Asp Asn Arg Arg Glu His Tyr Trp Ser Gly
305 310 315 320
Leu Glu Met Thr Ala Tyr Phe Thr Gly Leu Ala Gly Ala Gln Val Ser
325 330 335
Phe Pro Leu Val Gly Thr Arg Gly Glu Ser Ala Pro Pro Leu Thr Val
340 345 350
Arg Ser Val Asn Asp Gly Ile Tyr Arg Ile Leu Ser Ala Pro Phe Tyr
355 360 365
Ser Ala Pro Phe Leu Gly Thr Ile Val Leu Gly Ser Arg Gly Glu Lys
370 375 380
Phe Asp Phe Ala Leu Asn Asn Ile Ser Pro Pro Pro Ser Thr Ile Tyr
385 390 395 400
Arg His Pro Gly Thr Val Asp Ser Leu Val Ser Ile Pro Pro Gln Asp
405 410 415
Asn Ser Val Pro Pro His Arg Gly Ser Ser His Arg Leu Ser His Val
420 425 430
Thr Met Arg Ala Ser Ser Pro Ile Phe His Trp Thr His Arg Ser Ala
435 440 445
Thr Thr Thr Asn Thr Ile Asn Pro Asn Ala Ile Ile Gln Ile Pro Leu
450 455 460
Val Lys Ala Phe Asn Leu His Ser Gly Ala Thr Val Val Arg Gly Pro
465 470 475 480
Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Asn Thr Gly Thr Phe
485 490 495
Ala Asp Met Arg Val Asn Ile Thr Gly Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg
500 505 510
Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe Phe Thr Arg
515 520 525
Ile Asn Gly Thr Ser Val Asn Gln Gly Asn Phe Gln Arg Thr Met Asn
530 535 540
Arg Gly Asp Asn Leu Glu Ser Gly Asn Phe Arg Thr Ala Gly Phe Ser
545 550 555 560
Thr Pro Phe Ser Phe Ser Asn Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu Gly Thr
565 570 575
Gln Ala Phe Ser Asn Gln Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val
580 585 590
Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln
595 600 605
Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys
610 615 620
Thr Asp Val Thr Asp Tyr Gln Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Glu
625 630 635 640
Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu
645 650 655
Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Lys Arg Asn Leu Leu Gln
660 665 670
Asp Pro Asn Phe Thr Ser Ile Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg
675 680 685
Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asn Asp Val Phe Lys Glu
690 695 700
Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr
705 710 715 720
Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr
725 730 735
Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Val Tyr Leu
740 745 750
Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr Gly
755 760 765
Ser Leu Trp Pro Leu Ser Val Glu Ser Pro Ile Gly Arg Tyr Gly Glu
770 775 780
Pro Asn Arg Cys Val Pro His Ile Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys
785 790 795 800
Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Ser
805 810 815
Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val
820 825 830
Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly
835 840 845
Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ala
850 855 860
Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Gln Leu
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885 890 895
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900 905 910
Ile Thr Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His Arg Ile Arg Glu
915 920 925
Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Asp Ile
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Phe Glu Glu Leu Glu Gly Leu Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp
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Ala Arg Asn Ile Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys
965 970 975
Trp Asn Val Lys Gly His Val Asp Ile Gln Gln Asn Asp His Arg Ser
980 985 990
Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ser Glu Val Ser Gln Glu Val Arg
995 1000 1005
Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys
1010 1015 1020
Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asp
1025 1030 1035
Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Ile Glu Glu Glu Val
1040 1045 1050
Tyr Pro Thr Asp Thr Gly Asn Asp Tyr Thr Ala His Gln Gly Thr
1055 1060 1065
Thr Gly Cys Ala Asp Ala Cys Asn Ser Arg Asn Val Gly Tyr Glu
1070 1075 1080
Asp Gly Tyr Glu Ile Asn Thr Thr Ala Ser Val Asn Tyr Lys Pro
1085 1090 1095
Thr Tyr Glu Glu Glu Met Tyr Thr Asp Val Arg Arg Asp Asn His
1100 1105 1110
Cys Glu Tyr Asp Arg Gly Tyr Gly Asn His Thr Pro Leu Pro Ala
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Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Thr
1130 1135 1140
Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp
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Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu
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<210> 9
<211> 2016
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2016)
<223> /注: 苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的CDS，与基因cry1Nb1的CDS 100%同一性，基因cry1Nb1的GenBank登录号KC156678
<400> 9
atg aac tca aat gaa cat gat tat ttg aaa gtt tgt gat gat tta agt 48
Met Asn Ser Asn Glu His Asp Tyr Leu Lys Val Cys Asp Asp Leu Ser
1 5 10 15
gaa act aat atg gag agg ttt gac aaa aat gat gca ctg gag att ggt 96
Glu Thr Asn Met Glu Arg Phe Asp Lys Asn Asp Ala Leu Glu Ile Gly
20 25 30
atg tct att gta tct gaa ctt ctt ggc atg att cca ggc gga gca gcc 144
Met Ser Ile Val Ser Glu Leu Leu Gly Met Ile Pro Gly Gly Ala Ala
35 40 45
tta caa ttt gtg ttt aat caa ttg tgg tcg cgt tta ggt gat tct gga 192
Leu Gln Phe Val Phe Asn Gln Leu Trp Ser Arg Leu Gly Asp Ser Gly
50 55 60
tgg agt gca ttc atg gaa cat gtt gaa gaa tta att gat act aaa ata 240
Trp Ser Ala Phe Met Glu His Val Glu Glu Leu Ile Asp Thr Lys Ile
65 70 75 80
gaa ggg tat gca aaa aat aaa gcc tta tct gag tta gca ggt atg cac 288
Glu Gly Tyr Ala Lys Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Ala Gly Met His
85 90 95
aga aat ctt gaa aca tat ata aaa ttg ctt aat gaa tgg gaa aat aat 336
Arg Asn Leu Glu Thr Tyr Ile Lys Leu Leu Asn Glu Trp Glu Asn Asn
100 105 110
act gga agt tca aaa gca caa ggt aga gta gct aat tat ttt gaa agt 384
Thr Gly Ser Ser Lys Ala Gln Gly Arg Val Ala Asn Tyr Phe Glu Ser
115 120 125
ctt gag cag gcg gtt gaa aga ggt atg cct caa ttc gca gtt ggt aat 432
Leu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Met Pro Gln Phe Ala Val Gly Asn
130 135 140
ttc gaa ata ccc ctt tta act gtt tat gta caa gct gct aac ctt cat 480
Phe Glu Ile Pro Leu Leu Thr Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His
145 150 155 160
tta ttg tta tta aga gat gtt tca gtt tat gga aaa cgc tgg gga tgg 528
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Val Ser Val Tyr Gly Lys Arg Trp Gly Trp
165 170 175
tca gat cag aaa att aag att tat tat gag aaa caa gtt aag tat act 576
Ser Asp Gln Lys Ile Lys Ile Tyr Tyr Glu Lys Gln Val Lys Tyr Thr
180 185 190
cat gaa tac acc aat cat tgt tcg act tgg tat aat aga gga cta gat 624
His Glu Tyr Thr Asn His Cys Ser Thr Trp Tyr Asn Arg Gly Leu Asp
195 200 205
aaa ttg aaa aat aag ggt tct tct tac caa gat tgg tac aac tat aat 672
Lys Leu Lys Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Gln Asp Trp Tyr Asn Tyr Asn
210 215 220
cgt ttc cgt aga gaa att act ctt act gtt cta gat atc gtc gct gta 720
Arg Phe Arg Arg Glu Ile Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ala Val
225 230 235 240
ttc cca cac tat gat gtg aaa gct tat cca att caa aca gtt ggc caa 768
Phe Pro His Tyr Asp Val Lys Ala Tyr Pro Ile Gln Thr Val Gly Gln
245 250 255
tta aca agg gaa gtt tat aca gac cct tta att aat ttt aat ccg caa 816
Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn Phe Asn Pro Gln
260 265 270
cta gat tct gta tct caa tta cct act ttt agt gat atg gaa aat gca 864
Leu Asp Ser Val Ser Gln Leu Pro Thr Phe Ser Asp Met Glu Asn Ala
275 280 285
aca att aga acc cca cat ctg atg gag ttt tta aga atg cta aca atc 912
Thr Ile Arg Thr Pro His Leu Met Glu Phe Leu Arg Met Leu Thr Ile
290 295 300
tat aca gat tgg tat agt gtg gga aga aac tat tat tgg gga gga cat 960
Tyr Thr Asp Trp Tyr Ser Val Gly Arg Asn Tyr Tyr Trp Gly Gly His
305 310 315 320
cga gtg act tct tac cgt gta gga gga gaa aat ata acc tcc cct tta 1008
Arg Val Thr Ser Tyr Arg Val Gly Gly Glu Asn Ile Thr Ser Pro Leu
325 330 335
tat gga agt gag gca aat caa gag ctg cct aga caa ctg tat ttt tat 1056
Tyr Gly Ser Glu Ala Asn Gln Glu Leu Pro Arg Gln Leu Tyr Phe Tyr
340 345 350
ggg ccg gtt ttt aga aca tta tca aat cct act tta aga tac tta cag 1104
Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr Leu Arg Tyr Leu Gln
355 360 365
caa cct gcg cca gct ccg ccg ttt gct tta cgt cgc tta gaa gga gta 1152
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Pro Phe Ala Leu Arg Arg Leu Glu Gly Val
370 375 380
gaa ttt cac acc act aca ggt act gat atg tat cgt gaa aga gga tcg 1200
Glu Phe His Thr Thr Thr Gly Thr Asp Met Tyr Arg Glu Arg Gly Ser
385 390 395 400
gta gat tct ttt aat gag cta ccg cct ttt aat cca gtt gga cta cct 1248
Val Asp Ser Phe Asn Glu Leu Pro Pro Phe Asn Pro Val Gly Leu Pro
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cgt aat gca tat agt cac cgt tta tgt cat gca acg ttt gtc cgt aaa 1296
Arg Asn Ala Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Val Arg Lys
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Ser Gly Thr Pro Tyr Leu Ile Thr Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His
435 440 445
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Arg Ser Ala Glu Glu Thr Asn Thr Ile Asp Ser Asn Arg Ile Thr Gln
450 455 460
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Ile Pro Leu Val Lys Ala Tyr Gln Ile Ser Ser Gly Thr Thr Val Arg
465 470 475 480
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Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Gly Pro
485 490 495
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Gly Thr Phe Gly Asp Ile Lys Leu Asn Ile Asn Ser Pro Leu Ser Gln
500 505 510
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Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asp Leu Gln Phe
515 520 525
ttc acg aat att aat gga act acc att aat atg ggt aat ttc cca aaa 1632
Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Thr Ile Asn Met Gly Asn Phe Pro Lys
530 535 540
acc gtg aat aat tcg agt tct gaa ggc tat aga act gta tca ttt agt 1680
Thr Val Asn Asn Ser Ser Ser Glu Gly Tyr Arg Thr Val Ser Phe Ser
545 550 555 560
act cca ttt agc ttt tca aat gca caa agt ata ttt aga tta ggt ata 1728
Thr Pro Phe Ser Phe Ser Asn Ala Gln Ser Ile Phe Arg Leu Gly Ile
565 570 575
caa gct ttt tct gga gtc cac gag att cac gtt gat aga att gaa ttt 1776
Gln Ala Phe Ser Gly Val His Glu Ile His Val Asp Arg Ile Glu Phe
580 585 590
gtc ccg gca gag gta aca ttt gag gca gag tat gat tta gaa agg gcg 1824
Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala
595 600 605
caa aag gcg gta aat gca cta ttt aca tct aca aat cca aaa gat atg 1872
Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Pro Lys Asp Met
610 615 620
aaa aca tat gtg aca gaa tct cag att gac caa gtg ttc aat cta gta 1920
Lys Thr Tyr Val Thr Glu Ser Gln Ile Asp Gln Val Phe Asn Leu Val
625 630 635 640
gag tgc tta tcg gac gag gtc tgt ctc gat gag aag aga gaa tta ttc 1968
Glu Cys Leu Ser Asp Glu Val Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Phe
645 650 655
aag aaa gta aaa tac gcg aag caa ctc aat att gag cgt aac atg tag 2016
Lys Lys Val Lys Tyr Ala Lys Gln Leu Asn Ile Glu Arg Asn Met
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<210> 10
<211> 671
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
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Met Asn Ser Asn Glu His Asp Tyr Leu Lys Val Cys Asp Asp Leu Ser
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Glu Thr Asn Met Glu Arg Phe Asp Lys Asn Asp Ala Leu Glu Ile Gly
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Met Ser Ile Val Ser Glu Leu Leu Gly Met Ile Pro Gly Gly Ala Ala
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Leu Gln Phe Val Phe Asn Gln Leu Trp Ser Arg Leu Gly Asp Ser Gly
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Trp Ser Ala Phe Met Glu His Val Glu Glu Leu Ile Asp Thr Lys Ile
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Glu Gly Tyr Ala Lys Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Ala Gly Met His
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Arg Asn Leu Glu Thr Tyr Ile Lys Leu Leu Asn Glu Trp Glu Asn Asn
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Thr Gly Ser Ser Lys Ala Gln Gly Arg Val Ala Asn Tyr Phe Glu Ser
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Leu Glu Gln Ala Val Glu Arg Gly Met Pro Gln Phe Ala Val Gly Asn
130 135 140
Phe Glu Ile Pro Leu Leu Thr Val Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His
145 150 155 160
Leu Leu Leu Leu Arg Asp Val Ser Val Tyr Gly Lys Arg Trp Gly Trp
165 170 175
Ser Asp Gln Lys Ile Lys Ile Tyr Tyr Glu Lys Gln Val Lys Tyr Thr
180 185 190
His Glu Tyr Thr Asn His Cys Ser Thr Trp Tyr Asn Arg Gly Leu Asp
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Lys Leu Lys Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Gln Asp Trp Tyr Asn Tyr Asn
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Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Ile Asn Phe Asn Pro Gln
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Leu Asp Ser Val Ser Gln Leu Pro Thr Phe Ser Asp Met Glu Asn Ala
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Lys Lys Val Lys Tyr Ala Lys Gln Leu Asn Ile Glu Arg Asn Met
660 665 670
<210> 11
<211> 1902
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1902)
<223> /注: 苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的基因的CDS，与基因Cry2Ad1的CDS 100%同一性，基因Cry2Ad1的GenBank登录号AF200816
<400> 11
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1 5 10 15
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20 25 30
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Leu Gly Ser Leu Ile Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn Leu
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Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Glu Asp Ile Leu Arg Glu
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Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Leu Phe
275 280 285
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ggt tct aat ttt aat caa aat ttt aat tgc aac acg ata tcg cca cct 1104
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ttg tca acg tca ttt gtt aga agt tgg cta gat tcg ggt tca gat cga 1152
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act tca ggt tta agg tgt ggt gct ttt aca cct cgt ggt aat tcg aac 1248
Thr Ser Gly Leu Arg Cys Gly Ala Phe Thr Pro Arg Gly Asn Ser Asn
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450 455 460
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<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1389)
<223> /注: 苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的基因的CDS，与基因vip2Ac1的CDS 100%同一性，基因vip2Ac1的GenBank登录号AY245547
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225 230 235 240
cat gta gat aag gtg tca aaa gtg gta aaa aaa ggg gtg gag tgc tta 768
His Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu
245 250 255
caa gtt gaa ggg act tta aaa aag agt ctt gat ttt aaa aat gat ata 816
Gln Val Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile
260 265 270
aat gct gga gcg cat agc tgg ggt atg aag aat tat gaa gag tgg gct 864
Asn Ala Gly Ala His Ser Trp Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala
275 280 285
aaa gat tta acc gat tta caa agg gaa gct tta gat ggg tat gct agg 912
Lys Asp Leu Thr Asp Leu Gln Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg
290 295 300
caa gat tat aaa gaa atc aat aat tat tta cga aat caa ggc gga aat 960
Gln Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gln Gly Gly Asn
305 310 315 320
gga aat gaa aaa cta gat gct caa ata aaa aat att tct gat gct tta 1008
Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gln Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu
325 330 335
ggg aag aaa cca ata ccg gaa aat att act gtg tat aga tgg tgt ggc 1056
Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly
340 345 350
atg ccg gaa ttt ggt tat caa att agt gat ccg tta cct tct tta aaa 1104
Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gln Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys
355 360 365
gat ttt gaa gaa caa ttt tta aat aca atc aaa gaa gac aaa gga tat 1152
Asp Phe Glu Glu Gln Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr
370 375 380
atg agt aca agc tta tcg agt gaa cgt ctt gca gct ttt gga tct aga 1200
Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg
385 390 395 400
aaa att ata tta cga tta caa gtt ccg aaa gga agt acg ggt gcg tat 1248
Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gln Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr
405 410 415
tta agt gcc ata ggt gga ttt gca aat gaa aaa gag ata cta ctt gat 1296
Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala Asn Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp
420 425 430
aaa gat agt aaa tat cat att gat aaa gta aca gag gta att att aaa 1344
Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys
435 440 445
ggt gtt aag cga tat gta gtg gat gca aca tta tta aca aat taa 1389
Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
450 455 460
<210> 16
<211> 462
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 16
Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Thr Lys Leu Gln
1 5 10 15
Ala Val Thr Lys Ala Val Leu Leu Ser Thr Val Leu Ser Ile Ser Leu
20 25 30
Leu Asn Asn Glu Val Ile Lys Ala Glu Gln Leu Asn Met Asn Ser Gln
35 40 45
Asn Lys Tyr Thr Asn Phe Glu Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu
50 55 60
Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn
85 90 95
Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr
100 105 110
Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu
115 120 125
Ile Asp Lys Ile Phe Asp Lys Ala Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ile Thr
130 135 140
Tyr Lys Asn Val Glu Pro Ala Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
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Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gln Phe Lys Glu Gln
165 170 175
Phe Leu Asp Arg Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu
180 185 190
Thr Val Gln Gln Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val Lys
195 200 205
Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Ile Ile
210 215 220
Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met Val
225 230 235 240
His Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu
245 250 255
Gln Val Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile
260 265 270
Asn Ala Gly Ala His Ser Trp Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala
275 280 285
Lys Asp Leu Thr Asp Leu Gln Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg
290 295 300
Gln Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gln Gly Gly Asn
305 310 315 320
Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gln Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu
325 330 335
Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly
340 345 350
Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gln Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys
355 360 365
Asp Phe Glu Glu Gln Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr
370 375 380
Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg
385 390 395 400
Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gln Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr
405 410 415
Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala Asn Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp
420 425 430
Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys
435 440 445
Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
450 455 460
<210> 17
<211> 2367
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2367)
<223> /注: 苏云金芽孢杆菌SVBS-1801的基因的CDS，与基因vip3Af3的CDS 100%同一性，基因vip3Af3的GenBank登录号HM117634
<400> 17
atg aat atg aat aat act aaa tta aac gca agg gcc cta ccg agt ttt 48
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
att gat tat ttt aat ggc att tat gga ttt gcc act ggt atc aaa gac 96
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
att atg aat atg att ttt aaa acg gat aca ggt ggt aat cta acc tta 144
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
gac gaa atc cta aag aat cag cag tta cta aat gag att tct ggt aaa 192
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
ttg gat ggg gta aat ggg agc tta aat gat ctt atc gca cag gga aac 240
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
tta aat aca gaa tta tct aag gaa atc tta aaa att gca aat gaa cag 288
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
aat caa gtc tta aat gat gtt aat aac aaa ctc gat gcg ata aat acg 336
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
atg ctt cat ata tat cta cct aaa att aca tct atg tta agt gat gta 384
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
atg aag caa aat tat gcg cta agt ctg caa ata gaa tac tta agt aag 432
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
caa ttg caa gaa att tct gat aaa tta gat att att aac gta aat gtt 480
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
ctt att aac tct aca ctt act gaa att aca cct gca tat caa cgg att 528
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
aaa tat gtg aat gaa aaa ttt gaa gaa tta act ttt gct aca gaa acc 576
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
act tta aaa gta aaa aag gat agc tcg cct gct gat att ctt gat gag 624
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
tta act gaa tta act gaa cta gcg aaa agt gtt aca aaa aat gac gtt 672
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210 215 220
gat ggt ttt gaa ttt tac ctt aat aca ttc cac gat gta atg gta gga 720
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
aat aat tta ttc ggg cgt tca gct tta aaa act gct tca gaa tta att 768
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
gct aaa gaa aat gtg aaa aca agt ggc agt gaa gta gga aat gtt tat 816
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
aat ttc tta att gta tta aca gct cta caa gca aaa gct ttt ctt act 864
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
tta aca aca tgc cga aaa tta tta ggc tta gca gat att gat tat act 912
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
tct att atg aat gaa cat tta aat aag gaa aaa gag gaa ttt aga gta 960
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
aac atc ctt cct aca ctt tct aat act ttt tct aat cct aat tat gca 1008
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
aaa gtt aaa gga agt gat gaa gat gca aag atg att gtg gaa gct aaa 1056
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
cca gga cat gca ttg gtt ggg ttt gaa atg agc aat gat tca atc aca 1104
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
gta tta aaa gta tat gag gct aag cta aaa caa aat tat caa gtt gat 1152
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
aag gat tcc tta tcg gag gtt att tat ggt gat acg gat aaa tta ttt 1200
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe
385 390 395 400
tgt cca gat caa tct gaa caa ata tat tat aca aat aac ata gta ttc 1248
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
cca aat gaa tat gta att act aaa att gat ttc act aaa aaa atg aaa 1296
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
act tta aga tat gag gta aca gcg aat ttt tat gat tct tct aca gga 1344
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
gaa att gac tta aat aag aaa aaa gta gaa tca agt gaa gcg gag tat 1392
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
aga acg tta agt gct aat gat gat gga gtg tat atg cca tta ggt gtc 1440
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
atc agt gaa aca ttt ttg act ccg ata aat ggg ttt ggc ctc caa gct 1488
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
gat gaa aat tca aga tta att act tta aca tgt aaa tca tat tta aga 1536
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
gaa cta ctg cta gca aca gac tta agc aat aaa gaa act aaa ttg atc 1584
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
gtc cca cca agt ggt ttt att agc aat att gta gag aac ggg tcc ata 1632
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
gaa gag gac aat tta gag ccg tgg aaa gca aat aat aag aat gcg tat 1680
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
gta gat cat aca ggc gga gtg aat gga act aaa gct tta tat gtt cat 1728
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
aag gac gga gga ttt tca caa ttt att gga gat aag tta aaa ccg aaa 1776
Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
act gag tat gta atc caa tat act gtt aaa gga aaa cct tct att cat 1824
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
tta aaa gat gaa aat act gga tat att cat tat gaa gat aca aat aat 1872
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
aat tta aaa gat tat caa act att act aaa cgt ttt act aca gga act 1920
Asn Leu Lys Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
gat tta aag gga gtg tat tta att tta aaa agt caa aat gga gat gaa 1968
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
gct tgg gga gat aaa ttt aca att tta gaa att aag cct gcg gag gat 2016
Ala Trp Gly Asp Lys Phe Thr Ile Leu Glu Ile Lys Pro Ala Glu Asp
660 665 670
tta tta agc cca gaa tta att aat ccg aat tct tgg att acg act cca 2064
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro
675 680 685
ggg gct agc att tca gga aat aaa ctt ttc att aac ttg ggg aca aat 2112
Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn
690 695 700
ggg acc ttt aga caa agt ctt tca tta aac agt tat tca act tat agt 2160
Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser
705 710 715 720
ata agc ttt act gca tca gga cca ttt aat gtg acg gta aga aat tct 2208
Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser
725 730 735
agg gaa gta tta ttt gaa cga agc aac ctt atg tct tca act agt cat 2256
Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His
740 745 750
att tct ggg aca ttc aaa act gaa tcc aat aat acc gga tta tat gta 2304
Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val
755 760 765
gaa ctt tcc cgt cgc tct ggt ggt ggt ggt cat ata tca ttt gaa aac 2352
Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn
770 775 780
gtt tct att aaa taa 2367
Val Ser Ile Lys
785
<210> 18
<211> 788
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 18
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
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275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
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305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
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370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
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595 600 605
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610 615 620
Asn Leu Lys Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser
705 710 715 720
Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His
740 745 750
Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val
755 760 765
Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn
770 775 780
Val Ser Ile Lys
785
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增cry1Ab24样基因的正向-Sal引物
<400> 19
ggtcgacggt atcttaataa aagagatgga g 31
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增cry1Ab24样基因的反向- PaeI引物
<400> 20
gcatgcttat tcctccataa ggagtaattc cac 33
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Da3的正向引物
<400> 21
ggtcgacgga ctttagtaat ttaataaaaa aaggg 35
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Da3的反向引物
<400> 22
gcatgcttat tcctccataa ggagtaattc cac 33
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Ea7的正向引物
<400> 23
gtgtcgacca gtaccaaatt ataagaactt tgg 33
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Ea7的反向引物
<400> 24
gcatgcttat tcctccataa ggagtaattc cac 33
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Ja1样的正向引物
<400> 25
ggtcgacaac caaagagaaa ggggtaac 28
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Ja1样的反向引物
<400> 26
ggcatgcgtt acagagatta gacgactac 29
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Nb1的正向引物
<400> 27
gtcgacctaa aaataatgaa tattggagga aag 33
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry1Nb1的反向引物
<400> 28
ctgcagctac atgttacgct caatattgag 30
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry2Ad1的正向引物
<400> 29
gtgtcgaccc taatatttaa ggaggaattt tatatg 36
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增基因cry2Ad1的反向引物
<400> 30
gcgcatgcct caaactttaa taaagtggtg 30
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.一种苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株，其特征在于：
所述菌株是菌株SVBS-1801，其保藏在Colección
de Cultivos Tipo(CECT)，保藏参考号为CECT 9753。
2.一种制备包含权利要求1的SVBS-1801菌株的晶体和孢子的混合物的组合物的方法，其包括以下步骤：
a)培养SBVS-1801细菌，直到超过50％的细菌细胞已经发生孢子形成、已经裂解并将其晶体和孢子释放到培养基中；
b)通过引起晶体和孢子从它们悬浮的培养基中沉降来纯化晶体和孢子，优选地通过离心来纯化，并收集沉淀物；
c)任选地，用蛋白酶抑制溶液洗涤沉淀物并再次引起晶体和孢子的沉降；
d)在以下条件储存纯化的晶体和孢子：
a.在室温，在已经将步骤b)或c)中获得的沉淀物冻干后，或
b.在-18°至-20℃或更低的间隔的温度，在已经将b)或c)中获得的沉淀物重新悬浮在水或水溶液中后。
3.一种获得权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的纯化的晶体的方法，其包括以下步骤：
i)用1M NaCl洗涤权利要求1的菌株的晶体和孢子的混合物，并以9000g离心10min，
ii)收集团块并将其重新悬浮在PBS中，
iii)向步骤ii)中获得的悬浮液中加入己烷并涡旋；
iv)将iii)的悬浮液以6000g，4℃，离心10min，
v)重复步骤ii)至iv)至少三次，
vi)收集在v)中获得的晶体团块并在冷蒸馏水中洗涤3次。
4.一种组合物，其包含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的：
a)营养细胞，
b)含有孢子的细菌细胞，
c)孢子，
d)晶体，
e)孢子、晶体和晶体蛋白的混合物，
f)不包含在晶体中的Cry蛋白，
g)至少一种Vip蛋白，
或其组合，
其中，当a)至e)中定义的组中的成员不存在时，
a.组合物包含至少一种不包含在晶体中的Cry蛋白，并且至少SEQ ID NO:8的蛋白质存在于组合物中，
和/或
b.SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的蛋白质的组中的所有三种Vip蛋白质都存在于组合物中。
5.根据权利要求4的组合物，其中组合物另外包含在权利要求2的方法的步骤b)中获得的部分上清液。
6.根据权利要求4或5的组合物，其至少包含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的以下之一：
a)孢子和晶体的混合物，
b)在权利要求2的方法的步骤b)中获得的孢子、晶体和部分上清液的混合物，
c)晶体，
d)在权利要求2的方法的步骤b)中获得的晶体和部分上清液。
7.根据权利要求6的组合物，其包含权利要求2的方法的步骤b)中获得的晶体或晶体和部分上清液的混合物，其中晶体已经通过权利要求3的方法预先纯化并且组合物基本上不含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的孢子。
8.根据权利要求4的组合物，其至少包含权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株的孢子、晶体和晶体蛋白的混合物。
9.根据权利要求4的组合物，其包含不包含在晶体中的Cry蛋白，并且其中组合物包含
不包含在晶体中的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的组中的至少所有Cry蛋白。
10.权利要求4至8中任一项的组合物，其另外包含孢子萌发的抑制剂。
11.权利要求4至10中任一项的组合物，其另外包含至少一种农业上可接受的赋形剂。
12.权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株或权利要求4至11任一项的组合物作为杀虫剂或制备杀虫剂的用途。
13.权利要求12的用途，用于控制草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)物种的昆虫害虫。
14.权利要求12至13中任一项的用途，以保护植物。
15.一种鉴定权利要求1的苏云金芽孢杆菌菌株存在的方法，其包括确定以下任一者的步骤：
a)所述菌株的基因组包括：
i)其序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7，或其组合的至少一个基因或DNA区域；和/或
ii)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:11的组中的至少所有基因或DNA区域，和/或
iii)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的组中的至少所有基因或DNA区域；和/或
iv)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的组中的所有基因或DNA区域；
或者
b)所述菌株表达
i)其氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8，或其组合的至少一种多肽，和/或
ii)其氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:12的多肽的组中的至少所有多肽，或
iii)其氨基酸序列为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的多肽的组中的至少所有多肽，
iv)其氨基酸序列为SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的多肽的组中的所有多肽。
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