JP2022536185A - バチルス・チューリンゲンシス株 - Google Patents

Abstract

本発明は、β外毒素を産生せず、かつ、現在市場で入手できるＢｔベースの製品ではその防除が不十分であるかまたは効果がない昆虫であるスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に対して殺虫活性を示す、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂｔ）株を提供する。したがって、この株に基づく組成物は、殺虫剤として、または殺虫剤の調製のために使用することができ、好ましくは、使用される組成物は、該株の芽胞および結晶タンパク質の組合せである。該株のゲノムは、少なくとも６つの異なるｃｒｙ遺伝子および少なくとも３つの異なるｖｉｐ遺伝子の組合せを含み、それらは他のＢｔ株では報告されておらず、またそれらはその同定のために使用することができる。

Description

本発明は、有害生物防除の分野、具体的には、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）による有害生物防除に関する。より詳しくは、本発明は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に対して殺虫活性を有することが証明された、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂｔ）の新規な菌株（ＳＶＢＳ－１８０１）に関する。今日市場で市販されているＢｔベースの製品は、スポドプテラ・フルギペルダ害虫を防除する際に効果がないか、または十分に効率的でない。

バチルス・チューリンゲンシス（Ｂｔ）は、好気性およびグラム陽性の土壌細菌であり、栄養分が不足する場合に芽胞を形成する能力を有することから、それは分類学上、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のグループ細菌として分類されてきた。Ｂｔは、栽培された植物に損害を与え、また著しくそれらの収穫を減少させる害虫および他の生物を標的とする、多種多様な毒素を合成することで知られている（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html）。いくつかのＢｔ毒素は、バクテリアによって合成されるタンパク質の凝集の結果物である。これは、芽胞形成段階中に発生し、結果として、同じ分類学上のグループの他の種と比較して、Ｂｔの特異的な特徴を構成する副芽胞小体（結晶）の形成がなされる。その結晶は、δ－エンドトキシンＣｒｙおよびＣｙｔを含み、それらは、それぞれ、昆虫を標的とする毒素および細胞溶解性タンパク質である。後者はむしろ非特異的な活性を有し、それは数種類のＢｔ株において見出されるだけである。結晶形成性のタンパク質は、それらの構造中に、それらをプロテアーゼ抵抗性にするジスルフィド架橋および疎水結合を含む。したがって、これらのタンパク質は、Ｂｔ栄養細胞の細胞質中で蓄積されることができ、芽胞形成段階の終了した際、高度に濃縮された活性化合物の放出を可能にする。

Ｂｔは、その特徴解析から、作物のための有効な有害生物防除剤および貯蔵材料であると伝統的に考えられていた。その結果、過去数十年にわたり、地球上の全体にわたって、サンプリングプログラムが行われその結果、様々に異なる殺虫特性を有する多種多様な株が発見された。かかる微生物は最初に、それらのべん毛抗原に従って分類された（Ｌｅｃａｄｅｔ ｅｔ ａｌ．、１９９９）。しかしながら、特定の株の殺虫特性とその抗原Ｈタイプとの関連がないことが広く現在認められている。各Ｂｔ株は、それが産生する毒素の相対的な比率に依存して、固有の毒性パターンを示す。いくつかのＢｔ株は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位についてＡＴＰと競合する熱安定性の分泌される外毒素またはβ外毒素を産生するものも存在し、したがって、多種多様な種に対する毒性から、殺虫剤として使われることを妨げている（Ｓｅｂｅｓｔａ及びＨｏｒｓｋａ、１９７０）。

ＳｃｈｎｅｐｆおよびＷｈｉｔｅｌｅｙは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるｃｒｙ遺伝子のクローニングおよび発現によって、Ｂｔ結晶の殺虫特性を最初に示した（ＳｃｈｎｅｐｆおよびＷｈｉｔｅｌｅｙ（１９８１））。それ以来、多くの他のｃｒｙおよびｃｙｔ遺伝子が、以下の順で分類される昆虫種に対して特異的な殺虫活性を有することが証明された：鱗翅目（Ｂａｉｇ ｅｔ ａｌ．、２０１０）、双翅目（Ｒｏｈ ｅｔ ａｌ．、２０１０）、甲虫目（Ｌｏｐｅｚ－Ｐａｚｏｓ ｅｔ ａｌ．、２０１０）および膜翅目（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．、２００８）。ダニ（Ｆｒａｎｋｅｎｈｕｙｚｅｎ、２００９）および線虫（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．、２０１０）のような他の植物害虫も、かかるＢｔ毒素に感受性を有する。

Ｂｔ結晶を封入しないものの、興味深い殺虫特性を示すいくつかの注目すべき毒素バリアントが存在する。かかるタンパク質としては、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｖｉｐ（栄養成長期殺虫性タンパク質）（Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９６）およびＳｉｐ（分泌型殺虫性タンパク質）（Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．、２００６）が挙げられ、それらは細胞の栄養成長の間、培地に分泌される。興味深いことに、報告されている殺虫活性（Ｃｒｙ、Ｃｙｔ、Ｖｉｐ、Ｓｉｐ）を有する全ての毒素バリアントは、約４０ｋｂｐのプラスミドにおいてコードされることが多いが、いくつかの場合には、対応する遺伝子は細胞染色体に存在することもある。

Ｃａｒｏｚｚｉおよび同僚（Ｃａｒｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｂｔ殺虫性遺伝子を検出する方法として最初に紹介して以降、最近までそれがＢｔコレクションを分類するための最も広範囲にわたる方法であった（Ｃｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５；Ｆｅｒｒａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９９９）。しかしながら、近年のハイスループットなシークエンシングの向上は、合理的な期間／コスト比で、特定のＢｔ株の完全な遺伝子の特徴解析の実施を可能にした。Ｂｔ株の全染色体およびプラスミドの配列についての知識は、それらの殺虫特性に関与する遺伝子のクラスターの検出を可能にし、かかる特定の株の宿主を決定するためのガイドラインとして、それはしばしば用いられていた。それにもかかわらず、結晶として存在する、または培地に分泌される毒素の相対的な比率を最終的に決定する各遺伝子の発現パターンを考慮しないため、かかる評価は結果的には不正確となる。

利用できる殺生物剤遺伝子の完全なリストは、１０００を超える異なる配列（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ、Ｎ．ｅｔ ａｌ．、２０１８）により形成され、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅの提案する基準に従って分類されているが（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ． １９９８）、それはヌクレオチドおよびアミノ酸の配列に基づくものである。この分類システムの方法は、以下の通りである：同じ番号の全てのｃｒｙ遺伝子（例えばｃｒｙ１）は、４５％以上の同一性パーセンテージを共有する。また、それらが同じ大文字を共有する（例えばｃｒｙ１Ａ）ときは、かかる同一性は、７８％以上でなければならない。さらに、同じ小文字が追記される（例えばｃｒｙ１Ａａ）ときは、それらの間の同一性は、少なくとも９５％であるものとする。９５％以上の同一性を有するタンパク質をコードする２つの遺伝子を区別するためには、最後に、更なる数字を、小文字の後に追記しうる（例えばｃｒｙ１Ａａ１）。

報告されるｃｒｙ遺伝子の数は、常に増大しており、一部は４５％未満の同一性パーセンテージを示すが、それらは潜在的なユニークな殺虫特性を有する新たな候補として考えられている。その結果、Ｂｔ毒素に感受性のある宿主の数は著しく拡大し、そこには新しい昆虫、ダニおよび線虫種が含まれる。Ｂｔの関心は、主に有害生物防除を目標とするものであるにもかかわらず、新規な遺伝子の発見は、他の研究分野におけるそのタンパク質の利用可能性も見出されている。かかるものとして、副芽胞の場合であるが、抗腫瘍薬剤としての有効性を有することが証明されたタンパク質のファミリーが存在する（Ｏｈｂａ ｅｔ ａｌ．２００９）。

Ｂｔに基づく最初の調製された製品は、１９３８年にフランスにおいて製造され、６０年代の間に、相当な量のＢｔ工業製品が、米国、ソビエト連邦、フランスおよびドイツにおいて調製され、製造された（Ｍｉｌｎｅｒ、１９９４）。８０年代において、化学殺虫剤が、既に昆虫集団中の抵抗性個体の出現による不具合を示し始めたため、Ｂｔ由来の製品に対する関心は劇的に高まった。しかしながら、合成ピレスロイドの出現により、かかる関心は間もなく失われた。作物および／またはヒトなどの脊椎動物に対し有害でない、天然化合物によって、または、同時に、有害生物の防除が可能な生体系の利用により、化学合成された殺虫化合物を置き換えることに対する関心の増加は、Ｂｔベースの製品に対する全く新しい関心を高めるに至った。

今日、Ｂｔ多様性およびその殺虫性遺伝子の分布についての知見は、地球全体にわたるサンプリングプログラムのおかげで、この細菌を新規な殺虫剤の給源として扱っている。先進国において用いられるこの種の製品の場合には、それらは現行の規制基準に適応しなければならず、それはほとんどの場合、Ｂｔ株がβ外毒素フリーであることを要件とする。この理由は、かかる外毒素が、ヒトを含む他の生物に有害となりうる作用をむしろ非特異的に広範囲に拡大し得るということである。（Ｓｅｂｅｓｔａ ｙ Ｈｏｒｓｋａ、１９７０）。

Ｂｔ株の殺虫特性の解析は伝統的に、バイオアッセイを行うことによって行われていた。しかしながら、それらは時間がかかるという性質を有するため、ＰＣＲによるｃｒｙ遺伝子の同定で部分的に置き換えられた。しかしながら、それは各遺伝子の発現の含量に関する情報を示さないため、遺伝子の含有に関する評価としてのみ用いられていた（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。結晶内のタンパク相互作用は、その殺虫性特徴に影響を与え得、その結果、機能的に多様なＣｒｙおよび／またはＣｙｔタンパク質の混合物が、予想されるよりも効果的であり得（相乗作用）、または、より効果が減少することもあり得（拮抗作用）（Ｔａｂａｓｈｎｉｋ、１９９２）、したがって、Ｂｔタンパク質の混合物（通常、Ｂｔ株は、一群のＣｒｙタンパク質を産生する）の毒性は、個々のエンドトキシンについての知識から予測することができない（ＨｉｌｂｅｃｋおよびＯｔｔｏ、２０１５）。したがって、完全にＢｔ株を特徴解析する補完的な情報源として、バイオアッセイが未だ必要である。

このように、各Ｂｔ株が、その生産する毒素、その相対的割合、生産する毒素間で起こりうる予測不可能な相乗効果や拮抗効果に依存する独特の毒性パターンを示すという事実によって妨げられるだけでなく、他のＢｔ株によって産生され得る相同なタンパク質の活性を推定し、活性を予測するのが困難であるために、相同性の高いＣｒｙタンパク質が特異性および機能において重要な違いを示すかもしれず、その結果、別の株と非常に類似するＣｒｙタンパク質を産生するＢｔ株が同じ昆虫グループに対して活性を有するか否か、または、Ｂｔ株によって産生されるタンパク質が混合物中の他のＢｔタンパク質と相互作用するとき、相同なＣｒｙタンパク質が示しうる活性の程度が明らかではなくなることから、特定の害虫や線虫に対して活性を示す新規なＢｔ株の探索が妨げられている。

特定の昆虫に対して高い活性を有するＢｔ株の探索および同定を困難かつ明確でないなものにする更なる複雑な問題は、いくつかのＣｒｙタンパク質の活性および特異性や、いくつかのすでに公知のＢｔ株の殺虫可能性について、利用できる情報が不完全であることであり、これらは実験データでサポートされないか、または通常当業者によって扱われるものと異なる単位または規模で表されているアッセイおよび結果に基づいているため、発表された情報の有用性および適用性は高くない。

例えば、スポドプテラ・フルギペルダを防除する特定の場合において、いくつかの異なる刊行物がＢｔ株についてＳ．フルギペルダに対して活性を有するものとして言及しているが、それを確認するアッセイを含まないか、または当業者が用いる標準的な単位と異なる単位として表される殺虫活性として表された結果を含むことが見出されたときには、当業者が有効性の程度を評価することが困難となる。当業者はまた、Ｓ．フルギペルダに対するいくつかのＣｒｙタンパク質の活性を報告する刊行物を見出すこともあるだろうが、それらはこの鱗翅目に対するアッセイに基づかないこともあり、または、個々のタンパク質によって行われたアッセイに基づくものであり得、それらは、Ｂｔ株によって産生される他のタンパク質との相互作用や、アミノ酸配列の変更から生じうる活性および特異性の相違を有するときには、アッセイされたタンパク質の活性の推定としては適切でなく、これは、前述したように、高い相同性が他のＣｒｙタンパク質に関して維持される場合であっても当てはまる。

欧州特許出願公開第０３６６３９７Ａ１明細書は、例えば、鱗翅目の害虫に対して活性を有すると言われるＢｔ株（ＰＳ８１４）を記載している。しかしながら、Ｓ．フルギペルダに対する活性のアッセイは示されていない。その株は、ｃｒｙ１Ｅａ７（データベース ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏの受託番号ＡＹ８９４１３７）として公知の遺伝子の配列と１００％の同一性を有し、完全に重複する遺伝子をそのゲノムにおいて含み、その文献中では、鱗翅目の害虫に対して活性であるδエンドトキシン遺伝子として記載されているが、対応するＣｒｙタンパク質の害虫に対する活性を示すアッセイはない。

米国特許出願公開第２０１０／１６０２３１Ａ１明細書は、殺有害生物性ポリペプチドに対応するといわれるアミノ酸配列をコードするコーディング配列を含む組成物、ならびに、細菌、および他の細胞、および種子などの組織に殺有害生物活性を付与する方法を開示している。特に、ａｘｍｉ－１５０という名称を付されたδ－エンドトキシンのコーディング配列は、ｃｒｙ１Ｎｂ１として公知の遺伝子の配列（データベースｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ）の受託番号ＫＣ１５６６７８）との完全な重複および１００％の同一性を示す。この文献は、該遺伝子を含む組換え型菌株またはポリペプチド遺伝子産物を含む組成物によって防除できる昆虫の長大なリストを含むにもかかわらず、ｐｒｏｔｅｉｎＡＸＭＩ－１５０の殺虫活性については、４種の有害生物に対するアッセイ結果を示すに過ぎず、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属のメンバー、特にＳ．フルギペルダ、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、アワノメイガ（Ｄｉａｔｒｅｌｌａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）についての結果ではない。

Ｐｏｌａｎｃｚｙｋおよび共同研究者は、スポドプテラ・フルギペルダに対するいくつかのバチルス・チューリンゲンシス株によるアッセイを報告している（Ｐｏｌａｎｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．、２０００）。この文献の図１は、各試験株によるＳ．フルギペルダの死亡率を示している。最善の有効性を有する株は、市販製品Ｘｅｎｔａｒｉ（登録商標）に存在するもののように、血液型亜型ａｉｚａｗａｉに属する。しかしその結果は、単位統一当たりの細菌（細胞／ｍｌ）として示され、それは市販の殺虫剤の活性成分の調製における標準的な単位（μｇ／ｍｌ）とは異なり、かかる株の殺虫効力を評価し、また現在使用される市販の殺虫剤のそれと比較することを困難にしている。その株について提供されるデータからは、Ｓ．フルギペルダに対してより良好な殺虫効力を有する代替となる天然株の探索が自明であるとはいえない。

Ｃａｐａｌｂｏおよび共同研究者（Ｃａｐａｌｂｏ ｅｔ ａｌ．、２００１）は、Ｓ．フルギペルダに対して活性であると前述したＢｔ株（Ｂｔ ｖａｒ．ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ）の培養方法を開示している。その培養は、液体培地ではなく固相培地において実施されている。株自体の具体的なデータ、例えばそのｃｒｙ遺伝子またはタンパク質の含有の如何については示されていない。その効果についてのアッセイは含まれており、昆虫の５０％を殺すことが可能な致死濃度（ＬＣ_５０）として０．３７ｍｇバイオマス／ｍＬを示しているが、かかる値の測定方法は、その文献の材料および方法のセクションに記載されておらず、それにより、その株の殺虫活性を評価し、他のＢｔ株のそれと比較することを困難にしている。

Ｂａｒｒｅｔｏおよび共同研究者（Ｂａｒｒｅｔｏ ｅｔ ａｌ．、１９９９）は、いくつかのＢｔ株のＶｉｐタンパク質によるＳ．フルギペルダに対する活性のアッセイを開示している。その文献の要旨では、記載されている全ての株が同じ血液型亜型（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ）に属するにもかかわらず顕著に異なることについて言及している。これは、遺伝子的および分子的な特徴のみに基づいては、特異的な種（例えばＳ．フルギペルダ）に対して高い活性を有するＢｔ株を発見することが困難であることを強調する。Ｄ５において、高い活性を有する分析された上清は、おそらくβ外毒素を含むであろうと述べられているが（６８０ページの左カラムの終わり～右カラムのその続きを参照）、それらはバイオ殺虫剤に適用できず、また株ＳＢＶＳ－１８０１に存在しないものであるため、本発明の目的においては望ましくない遺伝子的特徴である。Ｄ５の全体にわたって、報告された株がＳＢＶＳ－１８０１と関連することを示す証拠がなく、またその培養物から得られる組成物、または殺虫剤の調製のための、もしくは殺虫剤としての使用についても開示されていない。

他の様々な公表された文献は、Ｓ．フルギペルダに対して特定の活性を有すると報告されているＢｔ株からの（そこから単離されたか、または天然タンパク質の変異によって得られた）個々のδ－エンドトキシンタンパク質を記載している。しかしながら、ほとんどのかかる文献は、不完全であるか、または適切なアッセイによって捕捉されない情報を教示または議論しており、ゆえにそれらの文献は、Ｓ．フルギペルダに対する高い活性を有する新規な、天然の、Ｂｔ株の探索のための有用性が低いものとなる。当業者であれば、かかる文献のいくつかが、例えば、いくつかのＣｒｙ／Ｃｙｔタンパク質の組合せによる実験データを開示せず、したがって、天然条件でＢｔ株によって産生される場合に生じうる殺虫性タンパク質間の相互作用による効果について言及しておらず、または、有効性試験において採用したタンパク質濃度が天然Ｂｔ株によって産生されるそれではなく、培養条件にすこぶる依存するものであることを理解するであろう。同様に、Ｂｔ株による特異的なポリペプチドの産生が、その株がＳ．フルギペルダに対して高い活性を有する結晶を生じさせることを意味しないことも考慮に入れなければならない。かかる文献の具体的な態様のいくつかを、以下に示す。

国際特許出願に係る国際公開第２０１２／１３１４９５Ａ２号パンフレットは、天然δ－エンドトキシン（Ｃｒｙ１Ａｂ）のいくつかの変異体ポリペプチドを開示している。そのＣｒｙ１Ａｂに由来する変異体は、アミノ酸置換を含むバリアントである。かかる組換え型タンパク質は、スポドプテラ・フルギペルダに対して活性を示し、一部のものは天然ポリペプチドのそれよりも活性が高い。アッセイが行われた条件はあまり記載されていないが、その実験は活性成分としてタンパク質Ｃｒｙ１Ａｂおよびその由来の変異体を含むのみである。したがって、国際公開第２０１２／１３１４９５Ａ２号は、殺虫効力全体に大きな影響を与えうるＣｒｙタンパク質の間の相互作用に関するアッセイが欠如している。また、使用する濃度は人為的であり、したがって、それらがＢｔ株から産生されるそれらと互換性を持つか否かを推定するのが困難である。さらに、国際公開第２０１２／１３１４９５Ａ２号に記載の唯一の微生物は、変異体ポリペプチドをコードする核酸によって形質転換されたものである。したがって、前述の国際出願は、Ｓ．フルギペルダに対して活性を有する新規な天然および代替のＢｔ株を同定するための適切な情報源と考えるのが困難である。

中国特許第１０３３３３２３０Ｂ号明細書は、δ－エンドトキシン（Ｃｒｙ１Ｄａ３）を記載しており、それは、受託番号ＨＱ４３９７８４としてｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅデータベースに登録されているＤＮＡ配列によってコードされる。小型のコナガ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）およびシロイチモンジヨトウガの幼虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）に対するＣｒｙ１Ｄａ３の活性について言及されているが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属の他の種については言及されておらず、特に、Ｓ．フルギペルダおよびそれに対する実現可能な効果については何ら記載されていない。

国際特許出願である国際公開第９５／０４１４６号Ａ２パンフレットには、ｃｒｙ１Ｊａ１（ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅデータベースの受託番号Ｌ３２０１９）として公知の遺伝子およびその対応するコードされるタンパク質と高い同一性を有する遺伝子（ｃｒｙＥＴ４）およびタンパク質（ＣｒｙＥＴ４）が開示されている。注目すべきは、その５ページ目の第１段落が、高い同一性を有するＣｒｙタンパク質が、個々の昆虫種に対して量的に異なる毒性を示しうることを強調していることである。ｃｒｙＥＴ４遺伝子によって形質転換されたＢｔ株も記載されている。国際公開第９５／０４１４６号Ａ２は、実施例４において、精製されたＣｒｙＥＴ４タンパク質がＳ．フルギペルダに対して活性を示すことを示している。にもかかわらず、それから遺伝子を単離し、その後の培養により結晶含有組成物を取得した、肝心のＢｔ株の活性については、すなわちＳ．フルギペルダを防除するための新規な、天然および代替のＢｔ株を構成するか否かを決定するために重要な情報については言及していない。

米国特許出願公開第２００９／００５３０６号明細書は、いくつかの害虫に対して殺虫活性を有するタンパク質（Ｃｒｙ２Ａｄｓｈｉ）をコードするＢｔ遺伝子を開示している。しかしながら、その米国特許出願の表１に示される結果は、そのタンパク質がＳ．フルギペルダに対して活性を有さないことを示している。これは実施例３の表３において、ツマジロクサヨトウ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に対して「活性なし」と示されていることから、さらに確認される。さらに、前記米国出願において開示される主要な本発明の目的は、米国特許出願公開第２００９／００５３０６号明細書において開示される遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製であって、Ｓ．フルギペルダに対する高い活性を有する新規な天然のＢｔ株の同定でないと考えられる。

米国特許出願公開第２０１８／１２７７７１Ａ１号は、Ｓ．フルギペルダ（鱗翅目）とは異なる目（半翅目）に属するミカンキジラミ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ）（略してＡＣＰ）に対して活性を有するＢｔ株から誘導されるいくつかのタンパク質を開示している。実際に、Ｓ．フルギペルダはその米国特許出願において言及されていない。実施例１では、試験の全体の目的が、ＡＣＰに対して毒性を有するＢｔ結晶毒素を同定することであったと述べている。さらに、同定された毒素は、トランスジェニック植物におけるそれらの実施によって、植物における半翅目昆虫の防除に用いられることを目的としている。

国際特許出願に係る国際公開第２０１３／１３４７３４Ａ２号パンフレットには、上記で言及したｃｒｙ１Ａｂ２４およびｃｒｙ１Ｊａ１遺伝子によってコードされる、高いタンパク質同一性を有する２つのタンパク質が開示されている。しかしながら、それらは発明の主要な目的ではない。国際公開第２０１３／１３４７３４Ａ２号はむしろ、いくつかのペプチド（一部は殺虫特性を有する）の組合せの結果得られる複数のポリペプチド、およびそれらのトランスジェニック植物における発現の改善に着目している。Ｓ．ｅｘｉｇｕａの防除に関しては、Ｂｔタンパク質およびＩｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｋｎｏｔペプチドから誘導されるペプチドを含む乾燥粉末が噴霧された葉を用いたバイオアッセイが示されている。しかしながら、Ｓ．フルギペルダについては、防除の対象となりうる昆虫の１つとして単に言及されるのみで、この種に対するいかなるアッセイも行われていない。

このように、Ｂｔ株において見出される遺伝的多様性にもかかわらず、しかし、Ｓ．フルギペルダなどの特異的な種に対して高い活性を有するＢｔ株を遺伝子的および分子的特徴にのみ基づいて発見することが一貫して困難を伴うことから、鱗翅目を防除する市販のバイオ殺虫剤は血液型亜型ｋｕｒｓｔａｋｉおよびａｉｚａｗａｉに由来するごく少数のものに依存している。最も普及している製品の１つであるＤｉｐｅｌ（登録商標）は、株ＡＢＴＳ－３５１（血液型亜型ｋｕｒｓｔａｋｉ）由来の芽胞および結晶タンパク質の組合せから製造される活性成分を利用するものである。株ＡＢＴＳ－３５１によって産生される結晶は、タンパク質Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａａを含み、培地の組成および成長する条件に依存して、一定の相対比率においてそれらは存在する。Ｄｉｐｅｌ（登録商標）ならびに株ＡＢＴＳ－３５１に基づく他の市販の調製品は、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ、ＰｌｕｔｅｌｌａおよびＬｏｂｅｓｉａ属由来の種を含む鱗翅目に属する幼虫種の広いスペクトラムを防除することに関しては効果的である。しかしながら、Ｓ．フルギペルダ、Ｓ．リットラリス（ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．エキシグア（ｅｘｉｇｕａ）などを含むＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ属に属する昆虫種に対して、かかる製品が十分に効果的でないことは広く知られている。これらの種が農業経済にとり顕著な負の効果で作物に損害を与えるため、株ＡＢＴＳ－１８５７（血液型亜型ａｉｚａｗａｉ）は、殺虫性毒素の新規な給源として選択されている。Ｘｅｎｔａｒｉ（登録商標）は、現在ＡＢＴＳ－１８５７株に基づく最も有名な市販の殺虫剤であり、タンパク質Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１ＡａおよびＣｒｙ１Ａｂを含む。最初の２つのタンパク質は、主にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ種に対する効果を確実にもたらす殺虫性薬剤であるが、他のタンパク質の存在による相乗効果を無視することはできない。

市場にはＢｔベースの製品が存在するにもかかわらず、昆虫の集団は、すでにそれらに対する様々な程度の抵抗性を身につけており、有害生物防除のための新規なＢｔ株を発見することに対する努力がさらに行われている。より高い殺虫効力およびより広い宿主域を有する、新規なＢｔ株を同定することが必要とされている。特に本発明のためには、スポドプテラ・フルギペルダに対して改良された殺虫活性を有する新規なＢｔ株を発見し、同定することが可能となる場合、それは特に興味深いだろう。好ましくは、新規なＢｔ株は天然株であり、環境サンプルから単離されたものであるべきである。また好ましくは、株の、またはそれに基づく製品の使用を可能にするためには、新規なＢｔ株は、多様な種に対する細胞死亡率のリスクを回避するために、β外毒素を発現すべきではない。

本発明は、かかる課題に対する解決手段を提供する。

本発明は、Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ （ＣＥＣＴ）に寄託参照番号ＣＥＣＴ９７５３として寄託されたＳＶＢＳ－１８０１株であることを特徴とする、」新規なバチルス・チューリンゲンシスの株（本発明のＢ．チューリンゲンシスの株）に関する。

第２の態様において、本発明はまた、本発明のＢ．チューリンゲンシス株ＳＢＶＳ－１８０１の芽胞および結晶の混合物を調製するための方法であって、
ａ）ＳＢＶＳ－１８０１細菌を、細菌細胞の９５％超が芽胞形成し、溶解し、培養培地にそれらの結晶および芽胞を放出するまで増殖させるステップと、
ｂ）結晶および芽胞が懸濁している培養培地から、好ましくは遠心分離によって結晶および芽胞の沈降を誘発し、沈殿物を回収することによって、結晶および芽胞を精製するステップと、
ｃ）任意選択的に、プロテアーゼ阻害溶液により沈殿物を洗浄し、再び結晶および芽胞の沈降を誘発するステップと、
ｄ）精製された結晶および芽胞を、
ａ．ステップｂ）またはｃ）において得られた沈殿物を凍結乾燥した後に、室温で、または
ｂ．ｂ）またはｃ）において得られた沈殿物を水のまたは水溶液中に再懸濁させた後に、－１８℃～－２０℃の間またはそれ以下の温度で
保存するステップと
を含む方法に関する。

第３の態様において、本発明は、本発明のＢ．チューリンゲンシス株ＳＶＢＳ－１８０１の精製された結晶（副芽胞結晶）を得るための方法であって、
ｉ）ＳＶＢＳ－１８０１の結晶および芽胞の混合物を、１ＭのＮａＣｌで洗浄し、９０００ｇで１０分間、遠心分離するステップと、
ｉｉ）ペレットを回収し、ＰＢＳ中に再懸濁させるステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた懸濁液にヘキサンを添加し、それをボルテックスするステップと、
ｉｖ）ｉｉｉ）の懸濁液を６０００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離するステップと、
ｖ）ステップｉｉ）～ｉｖ）を少なくとも３回繰り返すステップと、
ｖｉ）ｖ）で得られた結晶のペレットを回収し、冷却した蒸留水で３回洗浄するステップと
を含む方法に関する。

精製された結晶を得るために用いる結晶および芽胞の混合物は、上記の本発明の第２の態様である方法のステップｂ）またはｃ）の後で得られる混合物とすることができ、それにより、本発明のＢ．チューリンゲンシス株ＳＢＶＳ－１８０１の芽胞および結晶の混合物が調製される。

第４の態様において、本発明はまた、本発明のＢ．チューリンゲンシス株のａ）栄養細胞、ｂ）芽胞を含有する細菌細胞、ｃ）芽胞、ｄ）結晶（副芽胞結晶）、ｅ）芽胞、結晶および結晶タンパク質の混合物、ｆ）結晶に含有されない少なくとも１つのＣｒｙタンパク質、ｇ）少なくともＶｉｐタンパク質、またはそれらの組合せ、の群のうちの少なくとも１つを含む組成物であって、ａ）～ｅ）において定義される群のメンバーが存在しない場合、ｉ）少なくともＣｒｙタンパク質が存在する場合、少なくともタンパク質Ｃｒｙ１Ｊａ１様（配列番号８）が存在し、および／またはｉｉ）該組成物に、Ｖｉｐ１Ｃａ１（配列番号１４）、Ｖｉｐ２Ａｃ１（配列番号１６）およびＶｉｐ３Ａｆ３（配列番号１８）の群のうちの３つ全てのタンパク質が存在する組成物に関する。かかる組成物は、本発明の組成物と考えられる。任意選択的に、他のいかなるものとも互換性を有する実施形態において、組成物はさらに、本発明のＢ．チューリンゲンシス株の芽胞および結晶の混合物を調製するための方法のステップａ）およびｂ）を行った後に得られる一部の上清を含むこともできる。本発明の組成物の好ましい実施形態は、該組成物が、ａ）芽胞および結晶の混合物；ｂ）本発明の一態様であるＳＢＶＳ－１８０１株の芽胞および結晶の混合物を調製する方法のステップａ）およびｂ）を行うことによって得られた芽胞、結晶および上清の一部の混合物；ｃ）結晶；ｄ）本発明の一態様であるＳＢＶＳ－１８０１株の芽胞および結晶の混合物を調製する方法のステップａ）およびｂ）を行うことによって得られた結晶および上清の一部、の少なくともいずれかを含む形態である。また、好ましくは、（Ｂｔ株の培養培地から殺虫剤を調製するために用いる、組成物の典型的成分である）株ＳＢＶＳ－１８０１の芽胞、結晶および結晶タンパク質の混合物を少なくとも含む上記組成物である。また、好ましくは、結晶に含まれないＣｒｙタンパク質を含む上記組成物であり、該組成物は、結晶に含まれない、少なくとも配列番号４（Ｃｒｙ１Ｄａ３）、配列番号６（Ｃｒｙ１Ｅａ７）および配列番号８（Ｃｒｙ１Ｊａ１様）の群の全てのＣｒｙタンパク質を含む。本発明の組成物は、少なくとも１つの農業上許容できる賦形剤をさらに含むこともできる。

本発明のさらに別の態様は、殺虫剤としての、または殺虫剤の調製のための、本発明のバチルス・チューリンゲンシス株、およびまたは本発明の組成物の使用である。好ましくは、それはＳ．フルギペルダ種の害虫の防除のために使用される。また好ましくは、組成物は、植物を有害生物から保護するために使用される。例えば、植物は、実施例８に記載のようにトウモロコシ植物、または例えば綿花（Ｓ．フルギペルダが重要な経済的損失の原因であり、これまでＣｒｙタンパク質を発現するトランスジェニック植物の使用の前例がある他の植物）、米、モロコシ、サトウキビなどの他のいかなる植物であってもよい。

本発明の別の態様は、本発明のＢ．チューリンゲンシス株の存在を同定するための方法であって、
ａ）該株のゲノムが、
ｉ）少なくとも、配列番号１または配列番号７またはそれらの組合せの群から選択される配列を有する遺伝子またはＤＮＡ領域、および／または
ｉｉ）少なくとも、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の群のうちの全ての遺伝子またはＤＮＡ領域、および／または
ｉｉｉ）少なくとも、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の群のうちの全ての遺伝子またはＤＮＡ領域、および／または
ｉｖ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の群のうちの全ての遺伝子またはＤＮＡ領域
を含むこと、または
ｂ）該株が、
ｉ）少なくとも、配列番号２または配列番号８またはそれらの組合せの群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および／または
ｉｉ）少なくとも、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの群のうちの全てのポリペプチド、および／または
ｉｉｉ）少なくとも、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの群のうちの全てのポリペプチド、
ｉｖ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの群の全てのポリペプチド
を発現すること
を決定するステップを含む方法である。

本発明の更なる態様は、本発明のＤＮＡ分子、すなわち、
ａ）配列番号１および配列番号７の群から選択されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２および配列番号８の群のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号２および配列番号８の群のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有し、殺有害生物活性（例えば、殺線虫活性および／または殺虫活性）を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
の群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子であるとも考えられる。

したがって、本発明の別の態様は、前述のものと密接に関連するが、本発明のＤＮＡ分子を含む発現ベクターであるとも考えられる。

同様の考えによると、別の態様は、本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え型ウイルス、バクテリア、真菌または酵母、植物細胞、または全植物体または植物の一部であると考えることもできる。該ＤＮＡ分子は、好ましくはプロモーターに、および任意選択的に、１つ以上の更なる調節エレメント（例えばエンハンサー）に作動可能に連結され、それはそのゲノムにおいて取り込まれる。

ＳＶＢＳ－１８０１の形態：Ａ）栄養細胞（ＶＣ）、Ｂ）細胞溶解の直前に完全に形成された芽胞および結晶を含む細菌細胞、および、Ｃ）細菌細胞の溶解によりすでに放出された芽胞および結晶を示す。 陽性対照株ＢＴ２（株Ｂｔ ＨＤ２）およびサンプル株ＢＴ４（ＳＶＢＳ－１８０１）による、β外毒素産生の比較解析の結果を示す。 ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標））、ＡＢＴＳ－１８５７（Ｘｅｎｔａｒｉ（登録商標））およびＳＶＢＳ－１８０１の精製された結晶のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す（それぞれレーン２、３および４）。分子量マーカーも含む（レーン１）。 ＳＶＢＳ－１８０１ ｃｒｙ１Ａｂ２４様遺伝子（サブジェクト）およびその最も類似する参照遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４（クエリー）のヌクレオチド配列アラインメントを示す。 ＳＶＢＳ－１８０１ ｃｒｙ１Ｊａ１様遺伝子（サブジェクト）およびその最も類似する参照遺伝子ｃｒｙ１Ｊａ１（クエリー）のヌクレオチド配列アラインメントを示す。 ＳＶＢＳ－１８０１ Ｃｒｙ１Ａｂ２４様タンパク質（サブジェクト）およびその最も類似する参照タンパク質Ｃｒｙ１Ａｂ２４（クエリー）のアミノ酸配列を示し、図中、参照タンパク質Ｃｒｙ１Ａｂ２４は、ＳＶＢＳ－１８０１ Ｃｒｙ１Ａｂ２４様タンパク質の配列の位置７９３と７９４との間に、さらに２６個のアミノ酸を有する（配列番号２）ことが観察できる。 ＳＶＢＳ－１８０１ Ｃｒｙ１Ｊａ１様タンパク質（サブジェクト）およびその最も類似する参照タンパク質Ｃｒｙ１Ｊａ１（クエリー）のアミノ酸配列を示す。 ＡＢＴＳ－１８５７およびＳＶＢＳ－１８０１株による、芽胞／結晶混合物１００ｍｇ／Ｌを用い、処理後１２、２４または３６時間に集計した、Ｓ．フルギペルダ幼虫の死亡率（パーセンテージ）を示す。

本発明は、Ｂ．チューリンゲンシス株ＳＶＢＳ－１８０１の発見、単離および特徴解析に基づくものであり、それにより、Ｓ．フルギペルダ幼虫に対する殺虫活性が証明された。それは、それぞれ、少なくとも６つのｃｒｙ遺伝子および３つのｖｉｐ遺伝子を含む。

この株において発見された２つのｃｒｙ遺伝子（コーディング配列は、配列番号１および配列番号７にそれぞれ対応する）は、それらがコーディング配列においていかなる公知のｃｒｙ遺伝子とも同一でないため、これまで単離および配列決定されていない新規な遺伝子と考えられ、そのため、上記２つの遺伝子のいずれか１つ、または好ましくは両方の、ゲノム中での存在決定が、この株を新規なＢ．チューリンゲンシス細菌株として同定するために使用され得る。しかしながら、それらの参照公知遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４およびｃｒｙ１Ｊａ１との同一性の程度は、それぞれ高く（前者の場合９８％、後者の場合９４％）、そのため、それらは厳密には異なる遺伝子と考えられておらず、それぞれ、それらはｃｒｙ１Ａｂ２４様およびｃｒｙ１Ｊａ１様という名称を付されていた。

新規な株ＳＶＢＳ－１８０１は、他の公知の種類のものと異なる一組の６つのｃｒｙ遺伝子および３つのｖｉｐ遺伝子を有する。上記の遺伝子の各セットは独特であり、この新規な株において特徴的であると考えられ、また他のＢ．チューリンゲンシス株においても報告されていない。

したがって、６つのｃｒｙ遺伝子のセットのまたは３つのｖｉｐ遺伝子の、または、好ましくは９つの遺伝子の、同時の存在の決定は、上記株を同定し、上記株と他のＢｔ株とを区別するために有用である。Ｂ．チューリンゲンシス株を同定するいずれかの方法は、配列番号１および配列番号７の遺伝子のいずれか（または両方）の存在、および／または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の６つのｃｒｙ遺伝子のセットの同時の存在、および／または配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の３つのｖｉｐ遺伝子のセットの同時の存在、または、遺伝子の２つのセットの同時の存在、の決定を含み、各選択肢において上記の遺伝子が存在する場合、その株がＢ．チューリンゲンシス株ＳＶＢＳ－１８０１であると結論づけることは、本発明およびその態様の範囲内に含まれると考えられる。配列番号１および配列番号７によってコードされるタンパク質（すなわち、配列番号２および配列番号８のタンパク質）の少なくとも１つの発現の検出は、それぞれ、ＳＶＢＳ－１８０１株を同定するために用いることもできる。同様に、上記の遺伝子のセットによってコードされるポリペプチドの発現を決定することによって、株を同定することができ、すなわち、少なくともアミノ酸配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２であるポリペプチドの群の全てのポリペプチドの発現（それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の遺伝子のセットによってコードされるＣｒｙタンパク質のセットであり、Ｂｔゲノムにおける同時の存在が本発明のＢｔ株に特徴的である）、および／または少なくともアミノ酸配列が配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８であるポリペプチドの群の全てのポリペプチドの発現（それぞれ、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の遺伝子のセットによってコードされるＶｉｐタンパク質のセットであり、Ｂｔゲノムにおける同時の存在が本発明のＢｔ株に特徴的である）、または、アミノ酸配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８であるポリペプチドの群の全てのポリペプチドの発現、を決定し、確認することは、本発明のＢｔ株ＳＶＢＳ－１８０１の存在を同定するために用いることができる。

本願において用いられる「存在を同定する」とは、サンプル中におけるＢｔ株ＳＶＢＳ－１８０１の存在を決定すること、または特定の株が本発明のＢｔ株ＳＶＢＳ－１８０１であると同定することとして理解することができる。遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４様およびｃｒｙ１Ｊａ１様が新規であり、最も類似する公知の遺伝子（ｃｒｙ１Ａｂ２４およびｃｒｙ１Ｊａ１）とさえ異なり、また、Ｂｔ株のゲノムにおけるそれらの遺伝子の同時存在が過去に報告されていないために、それらの遺伝子がＳ．フルギペルダに対して活性を示すことから、本発明の新規な株、特にｃｒｙ１Ｊａ１様またはそれによってコードされるタンパク質を定義するために用いることもできる。上記で述べたように、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１のｃｒｙ遺伝子のセットの同時の存在も、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７のｖｉｐ遺伝子のセットの同時の存在も、Ｂｔ株に関して過去に報告されておらず、そのため、かかる遺伝子の２つのセットのいずれかまたはその全部の、ゲノムにおける同時の存在はまた、上記の株、特に実験室において作製したのではなく、環境から単離された株として特徴的であり、明らかでないまたは発見を予想できなかった特徴であるため、本発明のＢｔ株を定義するのに使用できる。ｃｒｙおよびｖｉｐ遺伝子の特異的な組合せによって株を定義する有用性に関するこの記載内容は、上記の遺伝子によってコードされるタンパク質にも拡張できる。

２０１８年１１月１４日にＣｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（ＣＥＣＴ）に寄託し、受託番号ＣＥＣＴ９７５３を受領した株ＳＶＢＳ－１８０１は、本発明の一態様である。

ＳＶＢＳ－１８０１ Ｂｔ株において存在するｃｒｙおよび／またはｖｉｐ遺伝子によってコードされるタンパク質に関して、全ての同定されたＣｒｙタンパク質は結晶に存在してもよい一方で、Ｖｉｐタンパク質は、増殖段階の間、分泌された後に増殖培地の上清に存在すべきである。

この株の毒性スペクトラムが、現在市販され生物学的に利用できる製品によっては満足に制御できないＳ．フルギペルダを含むことは注目に値する。上記の遺伝子の組合せを示す株がＳ．フルギペルダに対して活性を示すことができることには従来知られておらず、特に、下記の実施例に示されるように、遺伝子のかかる特別な組合せを有する株が、現在この有害生物に対して使用される市販の殺虫剤を調製するために用いられる株よりも高い活性をスポドプテラ・フルギペルダに対して示すことができることについては、従来知られていなかった。また、遺伝子的および分子的な特徴に基づいて、特異的な種に対する高い活性を有するＢｔ株を発見することが困難であり、自明でない作業であるため、これは特に顕著である。上記のように、かかる困難性は、高い相同性を有するＣｒｙタンパク質が有害生物に対して異なる活性および特異性を示しうるという事実のみならず、特に、いかなる組合せ効果が、Ｂｔ株によって産生される毒素の違い、その組合せのタイプ（相乗的または拮抗的）、および組合せの効果がＢｔ株の殺虫活性およびその培養生成物に影響する程度、により生じうるかが予測不可能である、という事実からも生じる。事実、本願は、ＳＶＢＳ－１８０１によって産生される３つのＣｒｙタンパク質の相乗効果、すなわち、上記タンパク質の個々の活性の単純な組合せから生じると予想される活性よりも高い活性がもたらされることを開示しており、それは、全く予想外の組合せ効果である。

したがって、本発明は、β外毒素の発現を欠き、スポドプテラ・フルギペルダ害虫の防除の際に使用できる、環境中から単離された新規なＢｔ株（ＳＶＢＳ－１８０１）を提供する。本発明にはまた、ＳＶＢＳ－１８０１の結晶および芽胞の混合物を含む組成物（通常、市販の殺虫剤を調製するために用いるような組成物）を調製するための方法、その株の精製された結晶を調製するための方法、その株によって産生される、またはその増殖から生じる様々な成分、すならち、副芽胞結晶に含まれないＣｒｙタンパク質、栄養増殖細菌またはＶｉｐタンパク質などの他の成分をさらに含み得る、結晶および芽胞の混合物を含む組成物、結晶に含まれないＣｒｙタンパク質、精製された結晶を有する組成物、またはさらには、精製された結晶もしくは結晶および芽胞の混合物を有する組成物であって、当該株を増殖させた液体培養培地を遠心分離して、細菌が増殖している液体から結晶および芽胞を分離した場合に得られる上清の一部を有する組成物も包含される。殺虫剤としての、または特にＳ．フルギペルダに対する殺虫剤を調製するための、上記株の、および、それを含むかまたはその株によって産生されるかもしくはその液体培地で増殖させることから生じる成分を含む組成物の使用も、本発明の範囲に含まれる。

本発明にはまた、配列番号１および配列番号７の新規な遺伝子、配列番号１および配列番号７によってコードされるタンパク質（すなわち、配列番号２および配列番号８のタンパク質）、ならびに、少なくとも配列番号２または配列番号８と９９％の同一性を有するポリペプチドを含み、殺虫特性を有するタンパク質も包含される。ＳＶＢＳ－１８０１に由来しうる全ての変異体株、特に上記の遺伝子によって（例えば、実施例４に記載されている手順に従い）得られる組換え細菌株、または、組換え酵母、菌類または植物細胞さえも、ならびに、上記のタンパク質の発現または配列番号１または配列番号７の遺伝子のゲノムへの挿入を可能にするベクター、例えばプラスミドまたは組換え型ウイルスも、本発明に包含される。植物細胞の場合、配列番号７の遺伝子の挿入のみならず、配列番号３および配列番号５の遺伝子の挿入、または、上記３つの遺伝子によって発現されるタンパク質を個別試験したときもＳ．フルギペルダに対して活性を示したが、併用して試験したときに、それらが相乗効果も示したことから、それら３つの全ての遺伝子の発現ベクターへの導入も関心対象となろう。

Ｂ．チューリンゲンシス株ＳＶＢＳ－１８０１は、以下の特徴を示す。
増殖。Ｂ．チューリンゲンシスＳＶＢＳ－１８０１は、好ましくは、２８～３０℃で、塩の豊富な培地（例えば本発明の実施例１において記載され、使用されるＣＣＹ培地）中で増殖する。かかる条件において、芽胞は、光学顕微鏡の下で観察できる両錐型結晶を成長させ、産生する（図１）。固体培地（ＣＣＹまたはＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（アガーを添加））において増殖するときは、他のＢｔ株と、コロニーの形態（不規則な端部およびワックス様の外観の丸いコロニー）が非常に類似している。適切な培地（塩の豊富な培地（例えばＣＣＹ培地））および温度条件（最適範囲が２８～３０℃だが、１５～４５℃の間で変化してもよい）を採用するときには、ＳＶＢＳ－１８０１は工業的規模で増殖させることができる。連続的撹拌（例えば２２０ｒｐｍ）も必要である。

外毒素の不存在。前述したように、いくつかのＢｔ株は、分泌される外毒素、すなわちβ外毒素を産生する場合もあり、それらは、ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、多様な種に対して細胞の死をもたらし、それにより、その株またはそれに基づく製品の殺虫剤としての使用ができなくなる。実施例２に示すように、ＳＶＢＳ－１８０１は、培養工程の間、β外毒素を産生しない。このために、広く、かつ非特異的な範囲で作用を発揮できると考えられる。

Ｂｔ毒素／結晶タンパク質。本発明のＳＶＢＳ－１８０１株によって合成されるＣｒｙタンパク質は、芽胞形成期の間、凝集し、結晶化し、本願では単に「結晶」と呼ばれる副芽胞結晶を生じさせる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によるそれらの移動パターンは、約１２０～１３５ｋＤａ（Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｄａ３、Ｃｒｙ１Ｅａ７およびＣｒｙ１Ｊａ１）の分子量を有する各々隣接する２つのバンドとして現れる（図３）。株ＡＢＴＳ－３５１（血液型亜型ｋｕｒｓｔａｋｉのＢｔ株）、すなわちＤｉｐｅ（登録商標）（Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ ｙ Ｃｒｙ２Ａａ）、および、ＡＢＴＳ－１８５７株（Ｂｔ血液型亜型ａｉｚａｗａｉ）、すなわちＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）（Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｄａ）に基づく市販の製品由来の結晶タンパク質は、同様に泳動し、その際、株ＳＶＢＳ－１８０１（１３０～１３５）のそれらに対する相当する分子量のバンドを示すが、しかしながら、総タンパク質のプールは、各株に固有の泳動パターンを生じさせる。Ｄｉｐｅｌ（登録商標）は、タンパク質Ｃｒｙ２Ａａに対応する約７０～７５ｋＤａのバンドをさらに生じさせることが知られている。

殺虫効力。上記したように、ＳＶＢＳ－１８０１結晶タンパク質が、本願の実施例に示すように、対応するＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）およびＤｉｐｅｌ（登録商標）より、それぞれ、Ｓ．フルギペルダに対して５．７および１２３５．４倍の効力を有することは注目に値する。したがって、ＳＶＢＳ－１８０１株に基づくＳＢＶＳ－１８０１関連の生成物（すなわち、栄養細胞、芽胞を含有する細菌細胞、芽胞、結晶、Ｃｒｙタンパク質またはＶｉｐタンパク質、またはそれらの組合せを含む組成物）は、殺虫剤として、または殺虫剤の調製のために用いることができる。かかる殺虫剤組成物を調製するために用いる活性成分は、実施例１に記載のように、ＳＢＶＳ－１８０１細菌を、芽胞形成し、溶解し、結晶および芽胞を放出するまで増殖させた培養物の内容物（培養培地および増殖した細菌細胞、溶解された細胞の残骸および細菌による生成物、例えば芽胞、結晶、結晶部分を形成しない細菌タンパク質およびその他の細菌による生成化合物であると理解される）を沈殿工程（好ましくは、遠心分離）に供した後に得られた芽胞および結晶タンパク質の組合せであることが特に好ましく、それは、Ｂｔベースの市販の殺虫剤製品、例えばＤｉｐｅｌ（登録商標）またはＸｅｔａｒｉ（登録商標）の調製のために使用される活性成分と同等物である。

かかる活性成分（ＡＩ）（株ＳＶＢＳ－１８０１）および通常その製剤に含まれる結晶および芽胞の混合物は、実施例１で述べたように、またはいずれかの類似する方法によっても得ることができる。
ａ）ＳＢＶＳ－１８０１細菌を、細菌細胞の５０％超が芽胞形成し、溶解し、培養培地にそれらの結晶および芽胞を放出するまで増殖させるステップと、
ｂ）結晶および芽胞が懸濁している培養培地から、好ましくは遠心分離によって結晶および芽胞を沈殿させ、沈殿物を回収することによって、結晶および芽胞を精製するステップと、
ｃ）任意選択的に、プロテアーゼ阻害剤溶液により沈殿物を洗浄し、再び結晶および芽胞の沈降を誘発すること、
ｄ）精製された結晶および芽胞を
ａ．ステップｂ）またはｃ）で得られた沈殿物を凍結乾燥した後に、室温で、または
ｂ．ｂ）またはｃ）で得られる沈殿物を水または水溶液中に再懸濁させた後、－１８℃～－２０℃の間またはそれ以下の温度で、
保存するステップと
を含む方法は、本発明の一態様である。

かかるＡＩは、濃縮液懸濁液の形態、または水和可能な粉末の形態の組成物として再調製することができる、結晶および芽胞の混合物を含み、その組成物は、１つ以上の賦形剤または添加剤、特に農業分野で慣用されるものを含むこともできる。かかる再調製された形態を用いて、圃場に適用することができ、好ましくは、植物を保護するための殺虫剤として使用することができる。上記のように、それは有害生物、例えばＳ．フルギペルダを防除するために使用することができる。

しかしながら、株ＳＶＢＳ－１８０１の顕著な利点の１つとして、本発明の発明者らは、本発明の株ＳＶＢＳ－１８０１によって産生される様々な要素を有する様々な組成物が、Ｓ．フルギペルダに対して活性を有し、しかもその観察された活性が、いくつかの処理では、上記の本発明の方法によって得られた結晶および芽胞の混合物の活性よりも高いことを見出したことが挙げられる。結晶および芽胞の混合物に、上記の方法によって得られた一部の上清を添加することは、ＬＣ_５０値によって示される活性の顕著な上昇をもたらす（表５を参照）。また、芽胞フリーの精製された結晶によって行われるアッセイもまた、結晶および芽胞の混合物よりも高い活性を示し、さらにその結晶が同じ上清と混合されたときに、それがさらに高くなる（低いＬＣ_５０値）。すなわち、これらの結果は、ＡＩの調製のための様々な組成物の使用を容易にするものであり、それぞれが、株ＳＶＢＳ－１８０１から産生されるかまたは誘導される、以下のような様々な成分を有する：ａ）芽胞および結晶の混合物；ｂ）本発明の一態様であるＳＢＶＳ－１８０１株の芽胞および結晶の混合物を調製する方法のステップａ）およびｂ）を行うことによって得られた芽胞、結晶および上清の一部の混合物；ｃ）結晶；ｄ）本発明の一態様であるＳＢＶＳ－１８０１株の芽胞および結晶の混合物を調製する方法のステップａ）およびｂ）を行うことによって得られた結晶および上清の一部。

精製された結晶は、実施例８において使用する方法によって調製することができ、それは本発明の態様でもあるが、当業者に公知の他のいずれかの方法、例えばショ糖密度勾配超遠心（ＴｈｏｍａｓおよびＥｌｌａｒ（１９８３））によっても調製でき、それは、通常不連続なスクロース勾配（７９～６７％）を用い、結晶が界面にトラップされて、芽胞をペレットから回収することができる。結晶調製物またはＳＢＶＳ－１８０１結晶を含む組成物は、本願の実施例８にて説明されるように調製物または組成物のサンプルの共焦点顕微鏡検査したとき、または、類似する方法によって芽胞の存在を確認したときに、芽胞が観察されない場合に、芽胞を含まないか、または実質的に含まないと考えられる。

芽胞が組成物において必要とされないとき、結晶の精製は、殺菌剤の添加と置き換えることができる。結晶の精製の後に残留するかもしれないあらゆる芽胞を除去することによって芽胞の不存在を保証するために、精製された結晶を有する組成物に殺菌剤を添加することもできる。芽胞の不存在は、栄養アガープレート上に精製された結晶の懸濁液の希釈剤を播種し、コロニーが生成しないことを確認することによって検査することができ、それにより、結晶は完全に芽胞フリーであり、その純度が最大であることとなる。殺菌剤は、添加する場合、好ましくは株の生態学的な特性および本発明の組成物との適合性を担保できるものが選択される。

実施例８において得られた、芽胞および結晶および精製された結晶の混合物がＳ．フルギペルダに対して活性を示す結果は、異なる比率での芽胞および結晶の混合物（例えば、結晶：芽胞＝５０：５０または８０：２０、または他のもの）を調製することにより、殺虫剤の活性成分の調製においてその全部を使用することが可能であることを想起させるものである。したがって例えば、本発明における芽胞および結晶を含む組成物を考慮するときは、結晶を生成させる方法によって得られた結晶が、完全には精製されず、例えば、８０％の精製度（または、他のいずれかのパーセンテージ（例えば８５％、９０％または９５％の精製度））に過ぎず、その結果、その調製物は実際には、本発明の範囲内に含まれる結晶および芽胞の混合物でもある。

また、実施例８のセクション８．３において、本発明の株によって合成される個々のＣｒｙタンパク質の毒性についてのアッセイを示す。得られた結果（表６および７を参照）によると、株ＳＶＢＳ－１８０１の副芽胞結晶の殺虫活性は、Ｃｒｙタンパク質であるＣｒｙ１Ｄａ３、Ｃｒｙ１Ｅａ７およびＣｒｙ１Ｊａ１様に起因しており、Ｓ．フルギペルダ幼虫に対して個々に試験したとき、それらは毒性を示す。タンパク質Ｃｒｙ１Ｊａ１様の活性は、それが本願において開示されるｃｒｙ１Ｊａ１様遺伝子（配列番号７）によってコードされることから、顕著であり、それは、上記のように、すでに公知の遺伝子ｃｒｙ１Ｊａ１とは具体的に相違するものである。特に注目に値する事実は、３つのタンパク質の混合物によって行われたアッセイが、３つのタンパク質のいずれかの同じ濃度と比較し、活性の上昇を示すことであり、すなわち、実施例８の同じセクションにおいて確認されたように、３つのタンパク質の混合物が組合せによる相乗効果を示すということである。確認された相乗効果は、既に公開された文献の教示からは予想できないものであり、また、ＳＶＢＳ－１８０１の遺伝子の組合せを有する株が、Ｓ．フルギペルダに対して、特に幼虫に対して、高い活性を有し得ることは予想外であり、その活性が、この株に対して現在使用される最も強力な市販の殺虫剤であるＸｅｎｔａｒｉ（登録商標）よりも高く（実施例９～１１参照）、また、Ｃａｐａｌｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）によって記載されている最も強力な株について、その文献においてＬＣ_５０アッセイで用いる方法論についての説明がないことを考慮する限りにおいて比較した場合であっても高いことを裏付けるものである。

Ｃｒｙタンパク質を用いるアッセイにおいて得られた結果から、タンパク質Ｃｒｙ１Ｄａ３、Ｃｒｙ１Ｅａ７およびＣｒｙ１Ｊａ１様（それぞれ配列番号４、配列番号６および配列番号８）の混合物を含む組成物が、特にそれらが等モル比率において存在する場合、本発明の組成物の使用可能な実施形態であると考えられる。かかる組成物は、殺虫剤としての使用、またはＳ．フルギペルダに対する殺虫剤の調製において有用である。

殺虫性遺伝子。表２および３に示すように、ＳＶＢＳ－１８０１のゲノム（染色体＋プラスミド）は、少なくとも６つの異なるｃｒｙ遺伝子および３つの異なるｖｉｐ遺伝子をそれぞれ含む。２つのｃｒｙ遺伝子（ｃｒｙ１Ａｂ２４様およびｃｒｙ１Ｊａ１様）は、コーディング配列が一般公開されている最も類似の参照遺伝子（ｃｒｙ１Ａｂ２４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＱ４３９７７８）およびｃｒｙ１Ｊａ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３２０１９））と完全に同一でない。したがって、少なくとも１つの上記遺伝子（他の公知のＢｔ遺伝子と異なる）の存在の決定は、株ＳＶＢＳ－１８０１を同定するのに十分であると考えられる。その目的においては、遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４様が、ｃｒｙ１Ａｂ２４のコーディング配列より７８ヌクレオチド短いコーディング配列（配列番号１）を示し（図４を参照）、それにより、ｃｒｙ１Ａｂ２４によってコードされるタンパク質が、配列番号１によってコードされるポリペプチドの７９３および７９４の位置において２６アミノ酸だけ長い（図６のアラインメントを参照）ことが注目に値する。配列番号１の位置９０６のＣの代わりにＴが存在することに加えて、かかるサイズおよび配列の違いは、ｃｒｙ１Ａｂ２４様をｃｒｙ１Ａｂ２４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＱ４３９７７８）と区別するために有用であり得る。ｃｒｙ１Ｊａ１様に関しては、図５および７に示すように、そのコーディング配列はｃｒｙ１Ｊａ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＱ４３９７８４）のコーディング配列と、長さにおいて同一であるが、２つの異なるヌクレオチドが両配列間には存在する。参照遺伝子ｃｒｙ１Ｊａ１は、それぞれ、配列番号７の位置９８７においてＣの代わりにＴを有し、また配列番号７の位置２３４５のＡの代わりにＧを有する。これらは、株ＳＶＢＳ－１８０１に属する配列を区別するために用いることができる変異である。

ＳＶＢＳ－１８０１株の同定は、表２に示すように、本発明の発明者によってＳＶＢＳ－１８０１において発見された６つのｃｒｙ遺伝子（ｃｒｙ１Ａｂ２４、ｃｒｙ１Ｄａ３、ｃｒｙ１Ｅａ７、ｃｒｙ１Ｊａ１、ｃｒｙ１Ｎｂ１、ｃｒｙ２Ａｄ１）のセットの存在、または、表３に示すように、本発明の発明者によってＳＶＢＳ－１８０１において発見された３つのｖｉｐ遺伝子（ｖｉｐ１Ｃａ１、ｖｉｐ２Ａｃ１、ｖｉｐ３Ａｆ３）のセットの存在、または、より好ましくは６つのｃｒｙ遺伝子のセットおよび３つのｖｉｐ遺伝子のセットからなる少なくとも９つの殺虫性遺伝子の同時の存在を決定することによって実施できる。選択された遺伝子の存在の同定は、実施例３のように、完全なＤＮＡ塩基配列決定、コンティグの組立ておよび組立てられたコンティグの遺伝子予測によって、または実施例３で使用されるに類似する他のいずれかの方法によって、または実施例４のように例えば同一のプライマー対を使用してＰＣＲによって遺伝子断片を増幅することによって、実施することができる。遺伝子の存在は、データベースｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ、バチルス・チューリンゲンシスの遺伝子のデータベースであるが、それらはＧｅｎｂａｎｋにも存在し、同じ受託番号によってアクセスできる）中の、対応すると考えられる遺伝子の配列と少なくとも９５％の同一性を必要とするが、好ましくは、遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４または遺伝子ｃｒｙ１Ｊａ１のいずれか１つを、ある株をＳＶＢＳ－１８０１株として同定するために用いる遺伝子とする場合に、対応するＤＮＡ断片の配列が配列番号１または配列番号７であるときには、それぞれ遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４または遺伝子ｃｒｙ１Ｊａの、すなわち、株ＳＶＢＳ－１８０１における上記遺伝子のバリアントの存在が肯定されると考えられる。

遺伝子およびそれらの使用。株ＳＶＢＳ－１８０１は、薬学、獣医学、生物工学などの他の分野の多様な用途における遺伝子給源として用いてもよく、またそれらは、生物的性質はそのままで、異なる目的で、他の生物に輸送されてもよい。すなわち、コーディング配列が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７のものである遺伝子は、それらが殺虫性タンパク質をコードするため、単独で目的の製品である。上記遺伝子（または、それらが含まれるＤＮＡ断片または領域）は、例えば、昆虫耐性を有するトランスジェニック植物（例えば国際公開第１９９５／０２４４９３号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００８／００１６５９６Ａ１号明細書として公開される米国出願）に記載されるような植物）、または、線虫耐性を有するトランスジェニック植物（例えば国際公開第２０１０／０２７７９３号パンフレット）に記載されるような植物）を、例えば、かかる文献に記載されている当業者に公知の技術を用いて得るために用いることができる。上記のＤＮＡ断片または領域は、例えば、ヒト以外のトランスジェニック動物または組換え細胞（動物、植物、真菌または細菌細胞）を得るために用いることができるが、ただしそれらは、適切な制御エレメント（プロモーター、エンハンサー等）に作動可能に連結される構築物の部分であり、それらの発現は、好ましい条件の存在、または、トランスジェニック植物または動物の場合には、それらの発現が求められる組織に依存する。かかる調節エレメントは、当業者に公知である。構築物は、ゲノムに取り込まれることもでき、または、特に組換え細菌細胞の場合は、プラスミドなどの発現ベクターの一部であることもでき、それらは当業者に周知の方法によって細胞に導入することができる。かかる形質転換された細胞または高等生物は、有害生物、例えば線虫または昆虫（例えば、Ｓ．フルギペルダなどのスポドプテラ属の昆虫など）に対する耐性を有する植物を作製するために有用であり得、または他の何らかの目的（医療用、獣医学用、一般的な研究用、等）にも使用できる。

すなわち、ヌクレオチド配列が以下の断片を含むいかなる核酸分子も、本発明の範囲内に含まれるものと考えるべきである。
ａ）本発明の新規な遺伝子のいずれかの配列（配列番号１および配列番号７）、
ｂ）上記のいずれかの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列（本発明のタンパク質である配列番号２および配列番号８のアミノ酸配列）を含むポリペプチドをコードするいずれかのヌクレオチド配列であって、配列番号２または配列番号８のポリペプチド断片配列を含むタンパク質をコードするが、配列番号１および配列番号７のヌクレオチド配列と、遺伝暗号の多様的性質のために異なるヌクレオチド配列、
または、配列および活性において本発明のそれらとして類似するポリペプチド断片を含むが、異なるタンパク質であるとは分類されないタンパク質、すなわち、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９８．５％（または、少なくとも９９％、９９．５％、９９．９０％、９９．９５％または９９．９９％）同一の、または、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９９．８５％（または、少なくとも９９．９０％、９９．９５％または９９．９９％）同一の、配列断片を有し、殺有害生物活性（殺虫性、殺線虫性、または両方）を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。殺有害生物活性は、そのままのポリペプチドによって示されることもあり、またはその切断様式によって示されることもあるが、Ｃｒｙタンパク質では通常、該タンパク質が昆虫の腸内において２つの断片に切断された後で、昆虫毒性活性が現れる。

したがって、本発明のかかる核酸分子のいずれかを含む構築物、特に、本発明の核酸分子がプロモーターに作動可能に連結され、任意選択的に、タンパク質の望ましい発現条件に依存し、および／または望ましい発現レベルに依存し選択される１つ以上の制御配列に連結された発現ベクター（例えばプラスミドまたは組換えウイルス）は、いずれも本発明の範囲に含まれる。

また、本発明の範囲の一部は、異種ＤＮＡ断片として本発明の核酸分子を含む、またはその発現ベクターを含む、任意の細胞（細菌、菌類、酵母または植物細胞）である。核酸断片は、ゲノムにおいて（または細菌の場合、細菌染色体において）取り込まれてもよく、または、他の核酸エレメント（例えばプラスミドまたは非取り込みウイルス）の一部であってもよい。細菌細胞は、他のＢ．チューリンゲンシス株に由来することもでき、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の遺伝子の１つ以上を本来含まず、その殺虫性または殺線虫性の活性が、配列番号２および配列番号８の配列にマッチングする１つ以上のタンパク質の発現によって上昇または改変しうるものとすることもできる。これは、配列番号１または配列番号７の（または配列番号２または配列番号８のポリペプチドをコードする他のいずれかのヌクレオチド配列の）ＤＮＡ断片を含み、構成的に、または選択された条件下で、株においてポリペプチドを発現させるプロモーターに作動可能に連結されたカセットにより株を形質転換することによって実施し得る。さらに、それらの組換えＢ．チューリンゲンシス細胞は、そのゲノム（染色体およびプラスミド含む）の修飾後に、コーディング領域が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１にマッチングする遺伝子のセット、または、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７のセット、の少なくとも一つ、または、両方の遺伝子のセット、を含み、株ＳＶＢＳ－１８０１を特徴付けるゲノムを有するＢｔ株になったため、本発明に含まれる。

また、したがって、本発明のＤＮＡ分子を含むいかなる植物も、特に、ＤＮＡ分子または断片が、植物または動物の１つ以上の組織において、該ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドを構成的にまたは特定の条件（植物または動物の成長過程の異なる時間を含む）において発現させる１つ以上の調節エレメント（プロモーター、エンハンサー、終結配列等）に作動可能に連結される構築物の一部であるとき、本発明の範囲内に含まれる。トランスジェニック植物（例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．、（２０１５）によって総括される）の場合、カリフラワーモザイク（ＣａＭＶ）３５Ｓなどの構成的プロモーターが一般的に用いられるが、誘導的プロモーターを用いて所望のトランスジェニック遺伝子の発現を制限することが可能であることも興味深く、例えば、トマトＨＭＧＲ２遺伝子の創傷誘導プロモーターであるＰＲ－１ａプロモーター（例えば、病原体への感染およびベンゾチアジアゾールなどの化学誘導物質によって誘導される）、またはトウモロコシＩｎ２－２（誘導性遺伝子２－２）プロモーター（植物の除草剤耐性増強用の農芸化学的物質として作用するベンゼンスルホンアミド毒性緩和剤によって誘導される）が挙げられる。他の利用可能な誘導性エレメントは、異なる部分で遺伝子の発現を空間的に制御するシス活性制御配列、または、ファゼオリン遺伝子のプロモーターによってコードされる２つの上流活性化配列であるＵＡＳ１（－２９５～－１０９）およびＵＡＳ２（－４６８～－３９１）とすることができる。また、特異的な組織に対する標的発現は、将来における付加価値を有する作物の開発にとってより重要であり、ＡＣＣオキシダーゼ遺伝子の１つのプロモーター（転写の開始から２１９６６～２１１５９ｂｐの範囲）の場合、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．、（２０１５）によっても概説されるように、果物（例えばトマト果物）における遺伝子の成熟特異的な発現を生じさせることが可能である。他の様々なプロモーターおよび調節エレメントは、上記の改変、および当業者が利用できる他の文献により見出すことができる。

以下に示す実施例および図面を用いて、本発明をより詳細に説明する。

以下のセクションは、ＳＶＢＳ－１８０１の産業的な開発を促進するために、本発明が適用されうる手順を例示する実施例を示す。

［実施例１：Ｂｔ株ＳＶＢＳ－１８０１の単離および増殖］
＜１．１ 株ＳＶＢＳ－１８０１の単離＞
ＳＶＢＳ－１８０１株は、バダホス市郊外の農地からの、同市の都市化地区「レジデンシャル・サン・ガブリエル」の庭園建築に使用された土壌のサンプルから得た。前記土壌サンプルは、２０１６年１２月に採取し、処理（２０１７年１月）の瞬間まで、冷蔵条件（４℃）下で保存した。ＳＶＢＳ株の単離および同定を行う際、サンプルを土壌から回収し、第１の層を除去した後に、蒸留水と混合し、１５分間７０℃で加熱した。１０倍希釈体積（１５μｌ）をＣＣＹ培地上へ塗布し、７２時間２８℃でインキュベートした。Ｂｔ陽性のコロニーを、位相差顕微鏡法（Ｉｒｉａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８）によって検査した。

＜１．２ 芽胞形成を促進する培養培地中での増殖＞
ＳＶＢＳ－１８０１のサンプルを、１ＬのＣＣＹ培地（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８１）において増殖させる。ＣＣＹは芽胞形成を促進する最少培地であり、最終的に結晶および芽胞の形成をもたらす（図１）。ＣＣＹ培地は、適切な比率のバッファ成分（溶液１）および炭素源成分（溶液２）を混合することによって調製される。混合物を調製した後、培地をオートクレーブ滅菌し、事前にフィルタ処理した塩溶液（溶液３）１ｍｌを補充する。

ＳＶＢＳ－１８０１の終夜（ＯＮ）前播種液から１００μｌを採取し、ＣＣＹ培地（１：１）に移すことによって、細菌の増殖を開始させる。細菌を、４８～７２時間、３０℃かつ２２０ｒｐｍで増殖させる。培養工程を、ＳＶＢＳ－１８０１細胞の９５％が、芽胞形成段階に入り、溶菌し、それらの結晶および芽胞を放出したときに終了させる。かかる段階に達したことを確認するためには、１ｍｌの培養サンプルを光学顕微鏡下で解析すべきである。

産生された結晶および芽胞を精製するために、培養液の内容物を遠心分離し、次に沈殿物を１ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡの１０％溶液によって洗浄する。かかる溶液を利用することにより、プロテアーゼによるタンパク質結晶の分解を防止する。続いて、培養液を再度遠心分離し、ペレットを凍結乾燥し、調製するまで室温で保存するか、または１０ｍＭのＫＣｌ（１０ｍｌ／ｌの最初の培養液）中に再懸濁して－２０℃で保存する。

［実施例２：ＳＶＢＳ－１８０１株の特徴解析：株ＳＶＢＳ－１８０１がβ外毒素を産生するか否かの判定手順］
特定のＢｔ株がβ外毒素について陽性であるか否かを判定するためには、増殖培地の上清を解析すべきである。この目的のために、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．、２００３により用いられた手順を用いた。すなわち、Ｂｔ ＳＶＢＳ－１８０１およびＨＤ－２株（陽性対照として使用）のコロニーを、４８時間、３０℃かつ２２０ｒｐｍで、１０ｍｌのＣＣＹ中で増殖させる。次に、１０分間、９０００ｘｇで培養液を遠心分離し、それらの上清を新しいチューブへ移し、２０分間、１２０℃および１気圧でオートクレーブ滅菌する。

β外毒素の存在を検出するためには、ＨＰＬＣを実施する。ＫＨ_２ＰＯ_４（５０ｍＭ、ｐＨ３）を、２ｍｌ／分の流速で、移動相として用い、０．４５μｍのナイロン膜により、滅菌された上清と一緒に濾過する。２０μｌの上清を、２５～３０℃および２６０ｎｍでμ－Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラムにおいて分析する。β外毒素が存在するのであれば、そのリン酸化されたおよび脱リン酸化された態様を示す２つのピークが現れるはずである。本実施例の場合、図２に示すように、そのようなピークは検出されなかった。

［実施例３：ＳＶＢＳ－１８０１株の特徴解析：ＤＮＡ抽出、配列およびゲノム配列の処理］
＜３．１ ＤＮＡ抽出、配列およびゲノム配列の処理＞
ＳＶＢＳ－１８０１の全ＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）において供給されるグラム陽性菌からのＤＮＡ単離のためのコンポーネントを使用し、プロトコールに従って単離した。抽出されたＤＮＡサンプルは、ＤＮＡライブラリを調製するために用い、その後、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｕｂ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｒｄｉｆｆ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）においてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて配列決定した。

得られた未処理の配列データの分析は、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ １０．１．１を使用して実施した。未処理の配列データは、低品質または曖昧な読み出しを除去することによって品質フィルタリングを行った。５０ｂｐより短い読み出しは除去した。読み出しは、少なくとも９５ｂｐの重なりの読み出し、および９５％の同一性、という厳格な基準を使用して新規に組立てた。組立てられたコンティグ上の遺伝子予測は、ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ３．２５を用いて行った。得られた予測タンパク質配列は、Ｂｔ毒素リストｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．、２０１８）から構築されたデータベースに対し、ＢＬＡＳＴＰを使用して比較した。

このバイオインフォマティクス分析法によって、本発明の発明者は、殺虫性遺伝子の完全遺伝子配列を同定することができた。にもかかわらず、いくつかのｃｒｙおよびｖｉｐ遺伝子断片は、後述するように同定された。

＜３．２ 殺虫性遺伝子の同定＞
表２は、ＳＶＢＳ－１８０１において同定された全てのｃｒｙ遺伝子断片（コーディング配列）の全リストを含み、それらは、過去にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ．において報告された密接に関連する殺虫性遺伝子とのそれらの同一性（％同上）の程度を示す。比較に含まれる同定された配列の網羅するパーセンテージ（％ｃｏｖ．）、ＳＶＢＳ－１８０１において同定された配列およびならびにデータベースに存在する配列のヌクレオチドの数（Ｎｔｄ．）も示す。

同様に、表３は、ＳＶＢＳ－１８０１株において同定された全てのｖｉｐまたはｓｉｐ遺伝子断片の完全なリストを含み、それらは、過去にｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ．において報告された密接に関連する殺虫性遺伝子とのそれらの同一性（％同上）の程度を示す。

＜３．３ ＳＶＢＳ－１８０１殺虫性遺伝子の分子的特徴＞
ＳＶＢＳ－１８０１ｃｒｙ遺伝子のヌクレオチド配列を、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、１９９０）を用いて分析し、その結果、それらは、過去に報告された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ）Ｂｔ株からの、遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４（ＨＱ４３９７７８）、ｃｒｙ１Ｄａ３（ＨＱ４３９７８４）、ｃｒｙ１Ｅａ７（ＡＹ８９４１３７）、ｃｒｙ１Ｊａ１（Ｌ３２０１９）、ｃｒｙＮｂ１（ＫＣ１５６６７８）およびｃｒｙ２Ａｄ１（ＡＦ２００８１６）との間で、最も高い同一性を示した。同様に、ＳＶＢＳ－１８０１ ｖｉｐ遺伝子配列は、過去に特徴づけられたｖｉｐ１Ｃａ１（ＡＹ２４５５４７）、ｖｉｐ２Ａｃ１（ＡＹ２４５５４７）およびｖｉｐ３Ａｆ３（ＨＭ１１７６３４）に近いことがわかった。表２および３に反映されるように、同一性のパーセンテージはｃｒｙ１Ａｂ２４およびｃｒｙ１Ｊａ１の場合を除いて１００％であったが、ＳＶＢＳ－１８０１の遺伝子ｃｒｙ１Ａｂ２４様およびｃｒｙ１Ｊａ１様は、Ｂ．チューリンゲンシス遺伝子に使用する通常の命名規則によると、異なる遺伝子とは考えられない程に十分高い同一性パーセンテージ（約９５％）を有した。

［実施例４：クローニング 殺虫性ｃｒｙ遺伝子のＰＣＲ増幅］
Ｂｔ株のシークエンシング結果に基づき、ｃｒｙ１Ａｂ２４、ｃｒｙ１Ｄａ３、ｃｒｙ１Ｅａ７、ｃｒｙ１Ｊａ１、ｃｒｙ１Ｎｂ１およびｃｒｙ２Ａｄ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅するための特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対を、クローニングのための制限酵素部位を含むよう設計した。前記プライマー対の配列を下記の表４に示すが、表中、第２カラムの情報は、プライマーごとに、それがフォワード（Ｆｗｄ）またはリバース（Ｒｅｖ）のいずれのプライマーであるか、および、クローニングのために用いる制限酵素を示す。各プライマーの下線を引かれた断片は、酵素切断部位に対応する。

ＳＶＢＳ－１８０１株から抽出したＤＮＡを、１０μｌの反応緩衝液５×ＨＦ、１μｌのｄＮＴＰ混合物１００ｍＭ、１μｌの各フォワードおよびリバースプライマー１０μＭ、０．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－フィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および１００ｎｇの全ＤＮＡを含む５０μｌの反応混合物中で、鋳型として用いた。ＰＣＲサイクルのプロファイルは、以下の通りとした：９８℃で３０秒間、最初の変性１サイクル、９８℃で１０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で３分３０秒間、増幅３０サイクル、続いて７２℃で１０分間、最終的な伸張ステップ、これをＣ１０００ Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ）において実施する。ＰＣＲ産物は、３０分間、１００Ｖで、ＴＡＥバッファ（４０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭの酢酸および１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ８）中、１％アガロースゲル電気泳動によって解析した。

ｃｒｙ１Ａｂ、ｃｒｙ１Ｄａ、ｃｒｙ１Ｅａ、ｃｒｙ１Ｊａ、ｃｒｙ１Ｎｂおよびｃｒｙ２Ａｄ ＣＤＳに対応するＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社、ベツレヘム、ＰＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、ｐＪＥＴベクター（ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｃａｎａｄａ）に、平滑末端でクローニングし、ｐＪＥＴ－プロトキシン構築物（ｐＪＥＴ－１Ａｂ、ｐＪＥＴ－１Ｄａ、ｐＪＥＴ－１Ｅａ、ｐＪＥＴ－１Ｊａ、ｐＪＥＴ－１Ｎｂおよびｐ－ＪＥＴ－２Ａｄ）を得た。各ｃｒｙ遺伝子のＣＤＳを含む組換えプラスミド作製のための標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）に従って、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅの形質転換を行った。推定の陽性クローンを、２μｌの反応バッファ１０×ＮＨ４、１μｌのＭｇＣｌ_２ ５０ｍＭ、１μｌのｄＮＴＰｓ混合物 １００ｍＭ、１μｌの各フォワードおよびリバースプライマー １０μＭおよび０．２μｌのＢｉｏＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含む２０μｌの反応混合物中におけるＰＣＲによって試験した。アンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）で補充した５ｍｌのＬＢブロスで、ｐＪＥＴ構築物を有する大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を、終夜、３７℃および２００ｒｐｍで培養した。組換えプラスミドを、製造業者のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎプラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社、ベツレヘム、ＰＡ）で抽出し、各遺伝子に対する中間のフォワードプライマー、およびｐＪＥＴベクター（ＳｔａｂＶｉｄａ、Ｃａｐａｒｉｃａ、Ｐｏｒｔｕｇａｌ）に対するリバースプライマーを用いたシークエンシングによって試験した。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｒ８を使用して、ｃｒｙ遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質の配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて利用可能な毒素のそれらとアラインさせた。図４および６は、それぞれ、ｃｒｙ１Ａｂ２４様およびｃｒｙ１Ａｂ２４遺伝子の配列およびそれらの対応するタンパク質配列のアラインメントを示し、同様に、ｃｒｙ１Ｊａ１様およびｃｒｙ１Ｊａ１の配列のアラインメントを図５に示し、一方、それらの対応するタンパク質配列のアラインメントを図７に示す。

実施例４の組換えｐＪＥＴ－プロトキシン構築物の消化は、制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の対応する組合せによって行い、その次の、アガロースゲルにおいて分離させた消化物の精製は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社、ベツレヘム、ＰＡ）で行った。事前に対応する制限酵素によって消化した発現ｐＳＴＡＢベクター（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、１９９８）を挿入断片のための受容体として用い、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡライゲーションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｐＳＴＡＢ－プロトキシン構築物を有する組換え型プラスミドを得た。上記のように、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞をライゲーション産物で形質転換し、推定の陽性クローンを、プラスミド抽出前にコロニーＰＣＲによって試験した。先行技術の著者（Ｃｕｃａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．、２００１）の方法に従い、形質転換プロセスの受容体として、非芽胞形成性のＢｔ株（ＢＭＢ１７１）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２０００）を用いた。推定上の陽性クローンを、コロニーＰＣＲによりタンパク質産生に関して試験した。

［実施例５：タンパク質の発現］
２～３日間、２８℃かつ２００ｒｐｍで設定した回転振とう装置において、２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを添加した５０ｍｌのＣＣＹ培地中で、実施例４のＢＭＢ１７１－プロトキシン構築物を培養し、細胞の９５％の芽胞形成および溶解が観察されるまでそれを行った。封入体を、ｘ１０００の倍率で位相差顕微鏡法によって観察した。芽胞および結晶の混合物を次に、９０００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離した。ペレットを、１ＭのＮａＣｌで３回、および冷水で６回洗浄し、最後に１０ｍＭのＫＣｌ中に再懸濁させた。

タンパク質定量化のために、一定の体積（１００μｌ）の各組換えタンパク質を、３７℃で２時間、１０００μｌの５０ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３（ｐＨ１１．３）および１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液中において穏やかに撹拌して可溶化した。非可溶性の結晶は、９０００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離して除去した。標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）（ＢｉｏＲａｄ）によって、アリコート（５００μｌ）を用いてタンパク質の定量を行った。

［実施例６：ＳＶＢＳ－１８０１結晶タンパク質の分子量］
結晶タンパク質の分子量は、通常ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）で測定される。そのためには、結晶タンパク質の精製は、最初に実施しなければならない。精製は、ＴｈｏｍａｓおよびＥｌｌａｒ（１９８３）によって提唱されるグラジェント方法など、様々な方法論によって実施しうる。結晶タンパク質を取得した後、１０μｌのアリコートを、５μｌの３０×還元剤（体積の１／１０）および３×ＳＤＳサンプルバッファ（１体積）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合し、１００℃で５分間変性させる。混合物を次に１０％ポリアクリルアミドゲルにロードし、３６ｍＡで１時間泳動させる。次に、ゲルを、５０％（ｖ／ｖ）のエタノール、１０％（ｖ／ｖ）の酢酸および０．１％のクーマシーブルーＲ２５０の溶液を用いて染色する。

図３に示すとおり、ＳＶＢＳ－１８０１は約１３０および１３３ｋＤａの２つのバンドを示し、それはＣｒｙ１タンパク質に対応するサイズである。一方、Ｃｒｙ２タンパク質は、６３３ｋＤａのサイズを有する。かかるサイズに対応する領域にバンドが存在しないということは、タンパク質Ｃｒｙ２Ａｄ１が、実施例１において用いた増殖条件では発現しないと考えられることを示している。

［実施例７：ＳＶＢＳ－１８０１の活性成分（ＡＩ）を得るための手順」
ＡＩは、実施例１のセクション１．２のような芽胞形成を促進する培地（例えばＣＣＹ（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８１））中で増殖させた株ＳＶＢＳ－１８０１によって得られる。芽胞形成性細菌細胞の９５％が自然に溶解するときに、培地の内容物を遠心分離する。得られるペレットは、芽胞形成性細胞の溶解の際に培地に放出された芽胞および結晶の混合物を含むはずである。物理的脱水による濃縮を、＞８，０００ｇで連続的な遠心装置の操作により実施し、１２～１５％の固形含量を有するスラリーを調製した。スラリーは、培養物を５０分の１の体積に減少させたものであり、芽胞および結晶の混合物が濃縮されているが、上清に含まれる液体の一部および細菌生成物も含む。上清はＣｒｙタンパク質でなくＶｉｐ３Ａタンパク質を含むが、その理由は、培地に分泌される唯一のＣｒｙタンパク質はＣｒｙ１Ｉであるが、遺伝子ｃｒｙ１Ｉは株ＳＶＢＳ－１８０１のゲノムには存在せず、ゆえに上記の株はＣｒｙ１Ｉタンパク質を合成できず、それらは上清には存在し得ないからである。

スラリーを得るための遠心分離を行った後、製剤化および噴霧乾燥による粉末化、または流動可能な調製物への直接的な製剤化を行うことができる。

［実施例８：新生スポドプテラ・フルギペルダ幼虫に対する、ＳＶＢＳ－１８０１培養物またはタンパク質から得られる様々な調製物の殺虫特性］
＜８．１ ＳＶＢＳ－１８０１活性成分のインビボ毒性アッセイのための、スポドプテラ・フルギペルダに用いる餌料＞
Ｓ．フルギペルダの飼育に広く使用される標準的な餌料は、ＨｏｆｆｍａｎおよびＬａｗｓｏｎ（１９６４）のスズメガの幼虫の餌料を変更させたバージョンである。餌料は、以下の通りに調製する：成分をビーカーに添加し、十分に混合し、その後加熱滅菌（１２１℃、２０分）する。混合物を５０℃まで冷却させたとき、抗生物質（ストレプトマイシン、クロルテトラサイクリン）、ビタミン混合物、アスコルビン酸およびコリンを補充しなければならない。完成した餌料は、調理用ミキサーにより混合することができる。最後に、餌料を４００ｍｌ（１７×１０×２．５ｃｍ）の滅菌容器に注入し、室温で固化させる。

＜８．２ 新生スポドプテラ・フルギペルダ幼虫に対する、ＳＶＢＳ－１８０１の全培養物から得られる様々な細菌調製物の殺虫特性＞
濃度－死亡率応答を判定するために、Ｂｔ株ＳＶＢＳ－１８０１の培養物から得られる様々な細菌調製物で昆虫を処理した（表５）。処理ごとに７つの濃度を調製し、試験した。処理は、以下の通り行った：
・実施例７に示すように、通常Ｂｔベースの製品の活性成分を構成する芽胞および結晶（Ｓ＋Ｃ）混合物を含む水溶液を用い、その水溶液において７つの濃度を試験した。
・さらに、芽胞と結晶の混合物と、培養培地に存在しうる分泌された毒素との間の相互作用の有無を解析するため、上清を存在させた調製物を試験した。
・さらに、Ｂｔ株の殺虫毒性が主に副芽胞結晶を構成するδエンドトキシンに起因するため、結晶を芽胞から分離し、結晶を回収した後に、精製された結晶を含む形で処理を行い、芽胞不在におけるそれらの効力を判定するために試験した。
・また、精製された結晶と上清との間の相互作用の有無も評価した。
・芽胞、上清および両方の混合物（芽胞および上清）を含む調製物も試験した。

（処理剤の調製）
全ての処理において、殺虫性タンパク質の０．３～３００ｎｇ／μｌの範囲の合計７つの濃度を、事前に定量したアリコートから調製し、Ｂｔ株および株自体または株の培養から生じる様々な生成物の毒性を測定した。

芽胞および結晶の混合物（Ｓ＋Ｃ）の水溶液。事前に定量化した（実施例５）アリコートから、殺虫性タンパク質の０．３～３００ｎｇ／μｌの範囲の合計７つの濃度を調製し、Ｂｔ株の毒性を測定した。

芽胞および結晶の混合物（Ｓ＋Ｃ）と上清。対応する含量の芽胞および結晶の混合物を遠心分離し、得られたペレットを上清に再懸濁した。Ｓ＋Ｃ処理について記載するのと同じ系列希釈を試験した。

芽胞からの副芽胞結晶の分離、および精製された結晶を有する処理剤の調製。Ｍｏｕｎｓｅｆ ｅｔ ａｌ．、２０１４に記載のプロトコルの変更バージョンを適用し、サンプルから精製された結晶を得た。所定の体積（２００μｌ）の芽胞および結晶の混合物をＮａＣｌ １Ｍで３回洗浄し、９０００ｇで１０分間、遠心分離した。ペレットを次に９００μｌのＰＢＳ １×に再懸濁し、ヘキサン１００μｌを添加した。チューブを１分間ボルテックスし、６０００ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。上清を除去し、得られたペレットを少なくとも３回同じ処理に供した。結晶を冷却した蒸留水で３回洗浄し、芽胞の不存在を×１０００の倍率で位相差顕微鏡法によって検査した。実施例５の最後に記載されるように、精製された結晶の定量を行った。殺虫性タンパク質のＳ＋Ｃ系列希釈の濃度（０．３～３００ｎｇ／μｌ）に対応する含量の精製された結晶を含む処理剤を調製した。

上清中の精製された結晶。対応する含量の副芽胞結晶（上清中、前の段落で述べたように精製）を再懸濁することによって、精製された結晶と上清との間の相互作用の有無を評価した。

精製された芽胞の懸濁液。精製された芽胞の懸濁液を得るために、芽胞および結晶の混合物の混合物に、５０ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３（ｐＨ１１．３）および１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む溶液を添加し、３７℃で２時間穏やかに撹拌させることにより可溶化を行った。上清中の可溶化した結晶は、９０００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離して除去した。この工程を５回繰り返した。結晶の不存在を、ｘ１０００の倍率で位相差顕微鏡法によって観察した。精製された芽胞を、Ｐｅｔｒｏｆｆ－Ｈａｕｓｓｅｒチャンバーにて計数した。

上清中の芽胞。得られた精製された芽胞から、以前の段落の方法に従い、上清を添加することによって、処理剤の様々な希釈系列を調製した。

（バイオアッセイの実施）
下記のセクション８．３において設定されるものも含む全てのバイオアッセイは、孵化直後（＜１２時間）の２８匹の個々のＳ．フルギペルダ幼虫のグループを使用し、対応する細菌調製物を人工餌料の表面に吹き付けることによって実施した。毒性実験では、その都度得た調製物を使用し、５日間、１６時間の明／８時間の暗のサイクル、２５＋１℃で、環境を制御されたチャンバーにおいて維持し、日を別にして少なくとも３回追試し、死亡率を試験した。濃度－死亡率のデータをプールし、ＰＯＬＯ－ＰＣプログラム（Ｌｅ Ｏｒａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、１９８７）のプロビット回帰分析（Ｆｉｎｎｅｙ、１９７１）に供した。それらの９５％の信頼限界が重複しない場合、平均致死濃度（ＬＣ_５０）値は有意に異なるものとした。

芽胞および結晶の混合物および精製された結晶を含む様々な調製物について得られた、濃度－死亡率応答の結果を、上清により提供される効果の有無と共に表５に示す。

表５の処理剤について得られた回帰曲線に対応するパラメーターは、芽胞および結晶の混合物についてのＬＣ_５０値の有意差を示し、上清の存在において２．３９倍毒性が高い。精製された結晶は芽胞の不存在で顕著な活性を示し、一緒に播くときに悪影響が生じることを示唆する。しかしながら、精製された結晶が上清と組み合わせられるとき、相乗効果が明らかに示され、芽胞および結晶の混合物の水溶液中の調製物と比較したとき、２８．１９倍高い効力の調製物であることを示す。

芽胞、上清または両方の組合せを含む細菌調製物では、活性は示されなかった。

＜８．３ 新生スポドプテラ・フルギペルダ幼虫に対するＳＶＢＳ－１８０１ Ｃｒｙタンパク質の殺虫特性＞
上記のように、Ｂｔ株の殺虫性毒性は副芽胞結晶を構成するδエンドトキシンに主に起因する。しかしながら、その全部において、特定の昆虫に対して同程度の活性の活性を示すわけではない。したがって、副芽胞結晶に含まれる単一のタンパク質の活性を測定するために、単一の濃度（１００ｎｇ／μｌ）でのバイオアッセイを行い、その際、セクション８．２に記載されている同じ方法論に従った。タンパク質Ｃｒｙ２Ａｄ１は、実施例６のＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイにおいて得られた結果（そのタンパク質が本願の実施例１において使用した細菌増殖条件では発現されないことが示されたと解釈できること）を考慮し、アッセイに含めなかった。

表６は、単一の殺虫性タンパク質の濃度（１００ｎｇ／μｌ）で投与したときの個々のＣｒｙタンパク質の個別的な活性を示す。これは、孵化直後のＳ．フルギペルダ幼虫に対してＣｒｙ１Ａｂ１およびＣｒｙ１Ｎｂ１では活性がなかったことから、副芽胞結晶の殺虫活性は、５つのタンパク質のうち、Ｃｒｙ１Ｄａ３、Ｃｒｙ１Ｅａ７およびＣｒｙ１Ｊａ１様他に起因するはずであることを立証するものである。

次に、毒性タンパク質をさらに評価し、平均致死濃度（ＬＣ_５０）を推定した。最後に、上記の組換えタンパク質の等モル濃度を含む混合物を試験することによって、タンパク相互作用を評価した。

表７は、３つの報告された毒性タンパク質（Ｃｒｙ１Ｄａ３、Ｃｒｙ１Ｅａ７およびＣｒｙ１Ｊａ１様）について個々に評価したとき、および同比率で３つ全てを含む等モル混合物について評価したとき、得られた回帰曲線に対応するパラメーターを示す。

表７から明らかなように、Ｓ．フルギペルダ幼虫は、Ｃｒｙ１Ｄａ３およびＣｒｙ１Ｊａ１様に、それぞれ非常に感受性が高く、Ｃｒｙ１Ｅａ７より１０．３４および８．２５倍高い毒性である。Ｃｒｙ１Ｅａ７の相対的な効力の信頼限界（ＦＬ）との共通部分がないということは、Ｃｒｙ１Ｄａ３またはＣｒｙ１Ｊａ様と比較したときに、統計的に有意な差が存在することを明らかに示すものである。３つのタンパク質を等モル混合物として組み合わせたとき、ＬＣ_５０値は１．０９ｎｇ／μｌに減少し、３つの個々の毒素と比較したとき、顕著に強力であり、すなわちそれら間の相乗効果を示唆する。

相乗効果係数を算出するためには、混合物におけるＣｒｙ１Ｄａ３（ｒａ）、Ｃｒｙ１Ｅａ７（ｒａ）およびＣｒｙ１Ｊａ１様（ｒｃ）の相対的な比率に基づき、混合物の予想される平均致死濃度（ＬＣ_５０）を、３つの単一タンパク質のそれとの比較において算出し（Ｔａｂａｓｈｎｉｋ、１９９２）、および混合物により得られたＬＣ_５０と比較しなければならない（表７）。

３．６３の相乗効果係数は、孵化直後のＳ．フルギペルダ幼虫に対する、Ｃｒｙ１Ｄａ３、Ｃｒｙ１Ｅａ７およびＣｒｙ１Ｊａ１様の混合物について得た。

［実施例９：Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ二齢幼虫に対する、市販のＤｉｐｅｌ（ＡＢＴＳ－３５１）およびＸｅｎＴａｒｉ（ＡＢＴＳ－１８７５）の株と比較した、ＳＶＢＳ－１８０１株の殺虫性力価を測定する毒性アッセイ］
＜９．１ ＳＶＢＳ－１８０１の活性成分（ＡＩ）を得るための手順＞
ＳＶＢＳ－１８０１活性成分を得るための手順は、実施例７にて説明したとおりである。

＜９．２ 市販製品のＢｔ株からの活性成分の調製＞
ＳＶＢＳ－１８０１株から調製される活性成分と、市販製品のＢｔ株のそれとの間で活性を比較するために（Ｄｉｐｅｌ（登録商標）の場合にはＡＢＴＳ－３５１、ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）の場合にはＡＢＴＳ－１８５７）、Ｂ．チューリンゲンシスＡＢＴＳ－３５１株、およびＡＢＴＳ－１８５７株を、それぞれ、欧州において販売されている市販製品ＤｉＰｅｌ（登録商標）ＤＦ（Ｋｅｎｏｇａｒｄ、Ｖａｌｅｎｔ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社；製造バッチ２６１－３５５－ＰＧ；製造年月日０１／２０１６）、およびＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）ＧＤ（Ｋｅｎｏｇａｒｄ、Ｖａｌｅｎｔ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社；製造バッチ２６４－６３７－ＰＧ；製造年月日０４／２０１６）から直接単離した。各菌株は、滅菌したＣＣＹ培地（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８１）中、７２時間２８℃において増殖させ、１２～１５％の固形分含量を有するスラリーが株のいずれにおいても得られるまで、実施例５において説明される工程をこれらの株にも適用し、株ＳＶＢＳ－１８０１から得られるＡＩと比較するＡＩとした。

＜９．３ Ｓ．フルギペルダの２齢幼虫における、ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標））、ＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標））およびＳＶＢＳ－１８０１株から得た結晶および芽胞の混合物を用いた、液滴フィード方法による毒性アッセイ＞
毒性アッセイを行うため、以下の材料を用いた：２８ウェルのブリスター人工餌料（セクション８．１を参照）および脱皮直後のＳ．フルギペルダの２齢幼虫。結晶および芽胞の混合物を３～５の間の希釈比を用いて５回希釈するものとし、それにより、次のステップで試験するＡＩの濃度は６つの異なる濃度となる。同様に、ＡＩを含まない、残りの成分は維持されている陰性対照も調製するものとする。液滴フィード方法（ＨｕｇｈｅｓおよびＷｏｏｄ（１９８１））に従い、脱皮直後の２齢幼虫であるＳ．フルギペルダを、６つの異なる濃度のうちの１つのＡＩで液滴フィードした。フィードされた幼虫を、１．５ｃｍ^３の人工餌料を含む２８ウェルブリスターから個別のウェルに移した。

この試験では、合計２８匹の脱皮直後の２齢幼虫を、各タンパク質濃度で処理し、５つの濃度範囲を各Ｂｔ株に用いた。バイオアッセイは３回行った。対照昆虫には、毒素を含まない人工餌料を与えた。マルチウェルプレートを、２５℃、６０％のＲ．Ｈ．および１４時間／１０時間（明／暗）の光周期においてインキュベートした。死亡率を６日後に記録した。濃度－死亡率のデータを、ＰＯＬＯ－ＰＣプログラム（Ｌｅ Ｏｒａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、１９８７）のプロビット回帰分析（Ｆｉｎｎｅｙ、１９７１）に供した。

３つのＢｔ株である、ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標）から単離）、ＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）から単離）およびＳＶＢＳ－１８０１から得た、２齢のＳ．フルギペルダ幼虫に対する濃度－死亡率応答の結果を、表８、９および１０に示す。単離した３つのＢｔについてのフィットさせた回帰曲線の勾配は、ＡＢＴＳ－３５１の０．５１からＳＶＢＳ－１８０１の１．４７の範囲であった。勾配の値の相違が大きかったため、共通の勾配として、平行する３本の回帰曲線を作成することができなかった。したがって、相対的な効力を推定するために、３つのＢｔ株のうちの２つずつの回帰曲線を比較する必要があった。

表８は、Ｂｔ株ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標）から単離）およびＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）から単離）から得た回帰曲線に対応するパラメーターを示す。表４において、株ＡＢＴＳ－１８５７は、Ｓ．フルギペルダ２齢幼虫に対して、株ＡＢＴＳ－３５１より２１７．２倍強力であることが解る。両株の相対的な効力の信頼限界（ＦＬ）の重複部分がないということは、観察される差が統計的に有意であることを明らかに示す。

表９は、Ｂｔ株ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標）から単離）およびＳＶＢＳー１８０１から得た回帰曲線に対応するパラメーターを示す。表９において、株ＳＶＢＳ－１８０１は、Ｓ．フルギペルダ２齢幼虫に対して、株ＡＢＴＳ－３５１より１，２３５．４倍強力であることが解る。両株の相対的な効力の信頼限界（ＦＬ）の重複部分がないということは、観察される差が統計的に有意であることを明らかに示す。

表１０は、Ｂｔ株ＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）から単離）およびＳＶＢＳ－１８０１から得た回帰曲線に対応するパラメーターを示す。ＳＶＢＳ－１８０１株は、Ｓ．フルギペルダ２齢幼虫に対して、ＡＢＴＳ－３５１より１，２３５．４倍強力であることが理解される。両株の相対的な効力の信頼限界（ＦＬ）の重複部分がないことは、観察される差が統計的に有意であることを明らかに示す。

［実施例１０：Ｓ．フルギペルダ２齢幼虫に対する、ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標））およびＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標））と比較した、ＳＶＢＳ－１８０１活性成分の殺虫効力］
実施例９．３に示すように、液滴フィード方法（ＨｕｇｈｅｓおよびＷｏｏｄ（１９８１））により、ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標））、ＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標））およびＳＶＢＳ－１８０１ ＡＩの毒性を評価した。ＡＢＴＳ－３５１（Ｂ．チューリンゲンシス ｓｅｒ．ｋｕｒｓｔａｋｉ）は、いくつかの鱗翅目の種に関する国際的参照として広く受け入れられており、市販製品（例えばＤｉｐｅｌ（登録商標）２ｘ（Ａｂｂｏｔ））のＡＩを構成する。同様に、ＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標）から単離）も、しばしばバイオアッセイの参照ＡＩとして、スポドプテラ属の鱗翅目昆虫に対する製品の殺虫効力の試験において用いられる。

Ｄｕｌｍａｇｅ（１９８１）に記載の、参照として用いる市販製品に表示の効力（参照効力）に関して、ＡＢＴＳ－３５１（Ｄｉｐｅｌ（登録商標））およびＡＢＴＳ－１８５７（ＸｅｎＴａｒｉ（登録商標））のそれらと比較した、ＳＶＢＳ－１８０１殺虫性タンパク質の効力を算出した。

［実施例１１：半圃場におけるトウモロコシ植物における、Ｓ．フルギペルダ２齢幼虫に対する、ＨＤ１およびＡＢＴＳ－１８５７（Ｘｅｎｔａｒｉ（登録商標））と比較したＳＶＢＳ－１８０１の殺虫効力］
生物季節学的段階Ｖ３（５～６枚の葉および３０～３５ｃｍの高さ）のトウモロコシ植物を、２４時間以内に孵化しそうなＳ．フルギペルダの卵（１５０卵／植物）で曝露し、幼虫の出現後、第２齢に達するまでそれらをモニターした。次に、植物を、結晶および芽胞の混合物（ＡＢＴＳ－１８５７およびＳＶＢＳ－１８０１株について、１００ｍｇ／Ｌに対応する結晶および芽胞の濃度）で処理した。圧縮空気式の手動噴霧機（Ｍａｔａｂｉ ７（登録商標）Ａｎｔｚｕｏｌａ、Ｇｕｉｐｕｚｃｏａ、Ｓｐａｉｎ）を用いて、０．０５％のＡｇｒａｌ湿潤剤－増粘剤と共に、処理を行った。１０ｍｌのスプレー処理を行い、それは圃場のトウモロコシ作物において使用するスプレー処理の標準的な体積（約１０００リットル／Ｈａ）に相当するものである。

２８匹のＳ．フルギペルダ幼虫を、ランダムに処理後２０、３０および４０時間に各プロットの植物から手作業で採取し、死または蛹化まで、実験室中、２５ｍｌのプラスチックカップ中、２５℃で、人工餌料により飼育した。死亡率を毎日記録した。パーセンテージ死亡率は、処理ごとに算出し、アークサイン変換によって正規化し、ＳＰＳＳ ｖｅｒ．１２．０（ＳＰＳＳ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を繰り返し行った。分散－共分散行列の特徴は、Ｍａｕｃｈｌｙの真球度試験を適用することによって、これの、および続く全ての多変量解析に供した。結果を図８にまとめる。

［生物学的材料の寄託］
ＳＶＢＳ－１８０１株は、Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（ＣＥＣＴ）（Ｐａｒｑｕｅ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ ｄｅ ｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ； ｃａｌｌｅ Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ，９； ４６９８０ Ｐａｔｅｒｎａ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｓｐａｉｎ）に寄託し、１９９７年５月１２日の勅令６６４／１９９７に従い、菌株寄託として受理された。ＳＶＢＳ－１８０１は、ブタペスト条約のガイドラインに従い、特許出願の目的で寄託された。

かかる株の寄託証書の原本（ＢＰ／４）および生存証明書（ＢＰ／９）に記載の関連するデータは以下のとおりである：
最終寄託日：２０１８年１１月８日
株の参照番号（受託番号）：ＣＥＣＴ９７５３
寄託者：Ｓｅｒｅｎａ Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓ．Ｌ．（Ｐａｓｅｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ４９，３１１９２ Ｍｕｔｉｌｖａ，Ｎａｖａｒｒａ，Ｓｐａｉｎ）寄託者は、出願人と異なる。

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Claims (15)

1. Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ（ＣＥＣＴ）に寄託参照番号ＣＥＣＴ９７５３として寄託されたＳＶＢＳ－１８０１株であることを特徴とする、バチルス・チューリンゲンシス株。
2. 請求項１に記載のＳＶＢＳ－１８０１株の結晶および芽胞の混合物を含む組成物を調製するための方法であって、
   ａ）ＳＢＶＳ－１８０１細菌を、細菌細胞の５０％超が芽胞形成し、溶解し、培養培地にそれらの結晶および芽胞を放出するまで増殖させるステップと、
   ｂ）前記結晶および芽胞が懸濁している前記培養培地から、好ましくは遠心分離によって結晶および芽胞の沈降を誘発し、沈殿物を回収することによって、前記結晶および芽胞を精製するステップと、
   ｃ）任意選択的に、プロテアーゼ阻害溶液により前記沈殿物を洗浄し、再び前記結晶および芽胞の沈降を誘発するステップと、
   ｄ）精製された結晶および芽胞を、
   ａ．ステップｂ）もしくはｃ）で得られた前記沈殿物を凍結乾燥した後に、室温で、または
   ｂ．ｂ）またはｃ）で得られた前記沈殿物を水または水溶液中に再懸濁させた後に、－１８℃～－２０℃の間またはそれ以下の温度で、
   保存するステップと
   を含む方法。
3. 請求項１に記載のＢ．チューリンゲンシス株の精製された結晶を得るための方法であって、
   ｉ）請求項１に記載の株の結晶および芽胞の混合物を、１ＭのＮａＣｌで洗浄し、９０００ｇで１０分間、遠心分離するステップと、
   ｉｉ）ペレットを回収し、ＰＢＳ中に再懸濁させるステップと、
   ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた懸濁液にヘキサンを添加し、それをボルテックスするステップと、
   ｉｖ）ｉｉｉ）の前記懸濁液を６０００ｇ、４℃で１０分間、遠心分離するステップと、
   ｖ）ステップｉｉ）～ｉｖ）を少なくとも３回繰り返すステップと、
   ｖｉ）ｖ）で得られた結晶のペレットを回収し、冷却した蒸留水で３回洗浄するステップと
   を含む方法。
4. 請求項１に記載のバチルス・チューリンゲンシス株の
   ａ）栄養細胞、
   ｂ）芽胞を含有する細菌細胞、
   ｃ）芽胞、
   ｄ）結晶、
   ｅ）芽胞、結晶および結晶タンパク質の混合物、
   ｆ）結晶に含有されないＣｒｙタンパク質、
   ｇ）少なくともＶｉｐタンパク質、
   またはそれらの組合せ
   を含む組成物であって、
   ａ）～ｅ）に定義される群のメンバーが存在しない場合、
   ａ．前記組成物が、結晶に含まれない少なくともＣｒｙタンパク質を含み、前記組成物に、少なくとも配列番号８のタンパク質が存在し、および／または
   ｂ．前記組成物に、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のタンパク質の群のうちの３つ全てのＶｉｐタンパク質が存在する、組成物。
5. 請求項２に記載の方法のステップｂ）で得られた一部の上清をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
6. 請求項１に記載のバチルス・チューリンゲンシス株の、
   ａ）芽胞および結晶の混合物、
   ｂ）請求項２に記載の方法のステップｂ）で得られた芽胞、結晶および上清の一部の混合物、
   ｃ）結晶、
   ｄ）請求項２に記載の方法のステップｂ）で得られた結晶および上清の一部
   の少なくともいずれかを含む、請求項４または５に記載の組成物。
7. 請求項２に記載の方法のステップｂ）で得られた結晶または結晶および上清の一部の混合物を含み、前記結晶が、請求項３に記載の方法によって事前に精製され、前記組成物が、請求項１に記載のバチルス・チューリンゲンシス株の芽胞を実質的に含まない、請求項６に記載の組成物。
8. 少なくとも、請求項１に記載のバチルス・チューリンゲンシス株の芽胞、結晶および結晶タンパク質の混合物を含む、請求項４に記載の組成物。
9. 結晶に含まれないＣｒｙタンパク質を含み、かつ
   結晶に含まれない、配列番号４、配列番号６および配列番号８の全てのＣｒｙタンパク質を少なくとも含む、請求項４に記載の組成物。
10. 芽胞の発芽の阻害剤をさらに含む、請求項４～８のいずれか１項に記載の組成物。
11. 少なくとも１つの農業上許容できる賦形剤をさらに含む、請求項４～１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 請求項１に記載のＢ．チューリンゲンシス株または請求項４～１１のいずれか１項に記載の組成物の、殺虫剤としての、または殺虫剤の調製のための、使用。
13. スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）種である害虫を防除するための、請求項１２に記載の使用。
14. 植物を防御するための、請求項１２または１３に記載の使用。
15. 請求項１に記載のＢ．チューリンゲンシス株の存在を同定するための方法であって、
    ａ）前記株のゲノムが、
    ｉ）少なくとも、配列番号１または配列番号７またはそれらの組合せの群から選択される配列を有する遺伝子またはＤＮＡ領域、および／または
    ｉｉ）少なくとも、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１の群の全ての遺伝子またはＤＮＡ領域、および／または
    ｉｉｉ）少なくとも、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の群の全ての遺伝子またはＤＮＡ領域、および／または
    ｉｖ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の群の全ての遺伝子またはＤＮＡ領域
    を含むこと、または
    ｂ）前記株が、
    ｉ）少なくとも、配列番号２または配列番号８またはそれらの組合せであるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および／または
    ｉｉ）少なくとも、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの群の全てのポリペプチド、または
    ｉｉｉ）少なくとも、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの群の全てのポリペプチド、
    ｉｖ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８であるアミノ酸配列を有するポリペプチドの群の全てのポリペプチド
    を発現すること
    を決定するステップを含む方法。
    

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