MX2008004990A - Gen cry7bai que codifica una proteina cristalina insecticida de bacillus thuringiensis. - Google Patents
Gen cry7bai que codifica una proteina cristalina insecticida de bacillus thuringiensis.Info
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Abstract
La presente invención describe el aislamiento, donación y uso de genes de proteínas cristalinas insecticidas de Badiius thuringiensis; la presente invención aísla un gen cry7Bal novedoso de proteína cristalina insecticida de B. thuringiensis subespecie huazhongensis, cepa YBT-978, y dicho gen codifica una proteína cristalina insecticida novedosa Cry7BaI, que muestra actividad insecticida contra insectos lepidópteros; la presente invención también describe la secuencie de genes de la proteína cristalina insecticida novedosa, usa vectores de expresión adecuados para transformar microorganismos, a fin de expresar el producto Cry7Bal codificado por el gen y hacerlo ejercer la actividad insecticida de la proteína contra las plagas de lepidópteros.
Description
GEN CRY7BAI QUE CODIFICA UNA PROTEINA CRISTALINA INSECTICIDA DE Bacillus thuríngiensis
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a la ingeniería genética de microorganismos. En particular, la presente invención se refiere a la separación y clonación de proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuríngiensis. La presente invención se refiere a la ingeniería genética de plaguicidas biológicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El Bacillus thuríngiensis es una bacteria Gram positiva formadora de endosporas en forma de bastoncillo, que existe ampliamente en varios medios ecológicos. Durante la fase de formación de espora, B. thuríngiensis forma cristales parasporales que consisten en proteínas cristalinas insecticidas (ICP's) que tienen una toxicidad especifica contra insectos, y actividades biológicas específicas para mas de 500 especies de insectos de 10 órdenes que pertenecen a la clase de Insecta, que incluyen Lepidoptera, Díptera, Coleóptera, Hymenoptera, Homoptera, etc, así como también para algunas variedades nocivas de Protozoa, Nematomorpha, Platyhelminthes (Schnepf, HE., Crickmore, N., Rie, J. V., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D. R. y Dean, D. H., 1998, "Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins", Microbio! Mol Biol Rev 62, 775-806). Las cepas de B. thuringiensis de tipo silvestre normalmente tienen genes que codifican proteínas cristalinas insecticidas, y cada cepa usualmente tiene múltiples copias de dichos genes. En 1981 , Schnepf y otros clonaron el primer gen que codifica proteína cristalina insecticida de ß. thuringiensis subespecie kurstaki, cepa HD1 , y dedujeron la secuencia de aminoácidos de la primera proteína cristalina insecticida de B. thuringiensis, basándose en la secuencia de bases del ADN (Schnepf HE, Wong HC, Whiteley HR, "The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence", J Biol Chem. 25 de mayo de 1985; 260(10):6264-6272). Posteriormente, se han buscado activamente genes nuevos que codifiquen proteínas cristalinas insecticidas con estudios de B. thuringiensis. Se han identificado, clonado y secuenciado muchos genes nuevos que codifican diferentes proteínas cristalinas insecticidas. Por lo tanto, en 995 fue fundado el Comité de Nomenclatura de Proteínas Cristalinas Plaguicidas de B. thuringiensis por investigadores, incluyendo a Crickmore en el Congreso Anual de la Society for Invertebrate Pathology. En 1996 se propuso formalmente un nuevo sistema de clasificación para las proteínas cristalinas insecticidas de ß. thuringiensis, basado en homologías de secuencias de aminoácidos, y se establecieron reglas de nomenclatura y el principio de clasificación, en donde se estipula que: el gen cry es un gen insecticida de ß. thuringiensis que codifica proteína cristalina parasporal, o cualquier gen que tenga similitud de secuencia obvia con un gen cry conocido; el gen cyt es un gen que codifica una proteína cristalina parasporal de B. thuringiensis que exhibe actividad hemolítíca, o cualquier gen que codifica una proteina que tenga similitud de secuencia obvia con una proteína Cyt conocida. Se clasifican en 4 categorías basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos deducida del gen de longitud completa. Los límites entre cada categoría representan aproximadamente 95%, 78% y 45% de identidad de secuencia. Los genes de la proteína cristalina insecticida se clasifican en 4 categorías. En agosto de 2005, el número de genes de proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis había alcanzado 319, representando variedades de 48 tipos (Crickmore, N., D.R. Zeigler, J. Feítelson, E. Schnepf, J. Van Ríe, D. Lereclus, J. Baum, y D. H. Dean, 1998, "Revisión of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins" Microbiol Mol Biol Rev 62:807-813; véase por ejemplo el sitio de internet lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html en la web). Al comienzo, los plaguicidas basados en B. thuringiensis se produjeron con cepas de tipo silvestre seleccionadas. Con el avance de la biología molecular, los investigadores han alterado gradualmente las cepas de tipo silvestre por medio de ingeniería genética. Al mismo tiempo, han proseguido a transformar genes de proteínas cristalinas insecticidas de B. thuringiensis en plantas y han producido plantas transgénicas que son resistentes a las plagas agrícolas.
Sin embargo, con el desarrollo de plaguicidas de B. thuringiensis y el uso cada vez mayor de estos plaguicidas, los científicos han descubierto continuamente resistencia en las plagas objetivo. Los investigadores han estudiado extensamente la resistencia contra los plaguicidas de B. thuringiensis en las plagas objetivo. Las proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis tienen que pasar por el siguiente proceso para dar los efectos insecticidas: la solubilización de los cristales y la activación de los cristales de protoxina, la unión de los fragmentos de toxina a los receptores sobre los revestimientos epiteliales en el intestino medio, y la inserción en la membrana para crear poros, en donde el espectro de actividad y la toxicidad dependen principalmente del reconocimiento e interacción de los fragmentos de toxina con los receptores específicos en los revestimientos epiteliales del intestino medio de los insectos. Además, el desarrollo de resistencia contra los plaguicidas de ß. thuringiensis en los insectos se relaciona estrechamente con el reconocimiento y unión al receptor del plaguicida. Por lo tanto, la clonación y aplicación de nuevos genes, especialmente novedosos, de proteínas cristalinas insecticidas, se han hecho muy importantes para prevenir y controlar la resistencia contra los plaguicidas de B. thuringiensis en las plagas objetivo, y es el problema central en varias estrategias de control de insectos. En los últimos años, la búsqueda y clonación de genes novedosos de proteínas cristalinas insecticidas ha sido el área más activa de estudio de B. thuringiensis. El significado de la presente invención se basa en esto. En 1996, en China se ha separado y caracterizado una nueva subespecie, la cepa YBT-978, que es una subespecie de B. thuringiensis, que pertenece a la subespecie huazhongensis, serotipo H40 (para la fuente de la cepa véase Dai J y otros, 1996, "Bacillus thuringiensis subsp. huazhongensis, serotype H40, isolated from soils in the People's Republic of China", Letters in Applied Microbiology 22(1 ):42-45). Se encontró que las proteínas cristalinas parasporales tienen una actividad insecticida altamente eficiente contra insectos que incluyen Plutella xylostella, mediante la extracción de dichas proteínas cristalinas parasporales y sometiéndolas a bioensayos.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
El objeto de la presente invención es aislar y clonar genes de proteínas cristalinas insecticidas de B. thuringiensis que tienen alta potencia tóxica, y proveer un uso para los mismos. El esquema técnico de la presente invención se muestra en la figura 1. Para obtener el objeto anteriormente mencionado, la presente invención aisla, de Bacillus thuringiensis sub. huazhongensis, serotipo H40, cepa YBT-978 (para la fuente de la cepa véase Dai J y otros, 1996, "Bacillus thuringiensis subsp huazhongensis, serotype H40, isolated from soils in the People's Republic of China" Letters in Applied Microbiology 22(1 ):42-45), un gen de proteína cristalina insecticida novedoso, cuya región codificadora consiste en 3465 bases y tienen la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID N0:1. El gen cry7Bal de la presente invención codifica la proteína Cry7Bal, que consiste en 1 154 residuos de aminoácido y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2. El gen cry7Bal de la presente invención es expresado en microorganismos como la proteína Cry7Bal, que posee actividad insecticida contra insectos del orden Lepidoptera. La homología mas alta entre la proteína Cry7Bal de la presente invención y cualquiera de las proteínas que han sido descubiertas es de 58.2%. Además, la homología mas alta entre la secuencia de la mitad N-terminal de la proteína Cry7Bal de la presente invención (aminoácidos 1 al 658 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2), y cualquiera de las proteínas que se han descubierto, es de 37.1 %. La presente invención provee la secuencia de gen anteriormente mencionada, que es un gen novedoso de proteína cristalina insecticida que tiene actividad insecticida. Dicho gen se puede usar para transformar microorganismos o plantas para impartir actividad contra las plagas de Lepidoptera, así como también para vencer y retrasar la resistencia de las plagas contra los insecticidas modificados genéticamente y las plantas transgénicas. Las siguientes descripciones y ejemplos revelan la solución técnica en mayor detalle. Se debe notar que los procedimientos estándares y los reactivos usados en el ADN son de acuerdo con la "Guide for Molecular Cloning Experiments" (véase J. Sambrook y otros (2002), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 3a. edición, traducido por Jin Dong-yan y otros, Science Press. Beijing).
1. Secuenciación de los aminoácidos N-terminales de la proteína cristalina Cry7Bal en 5. thurinpiensis YBT-978. La presente invención utiliza 8. thuringiensis YBT-978 como cepa fuente de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal. La B. thuringiensis YBT-978 es una cepa estándar de B. thuringiensis, serotipo H40, cuya fuente fue citada por Dai J y otros, 1996. La cepa puede formar los cristales típicos en forma de rombo, y el peso molecular del componente principal de la proteína cristalina Cry7Bal es de aproximadamente 130 kDa. Los pasos específicos para determinar la secuencia N-terminal de aminoácidos de Cry7Bal son de la siguiente manera: (1 ) Cultivo de las cepas bacterianas y manipulación del cultivo. La 8. thuringiensis YBT-978 se inocula sobre 5ml de LB (1 % de
NaCI, 1 % de peptona, 0.5% de extracto de levadura, pH 7.0) usando una asa de inoculación bajo condiciones estériles, y se incuba durante la noche a 30°C en un agitador a 200 rpm. Después se transfieren bajo condiciones estériles 350 µ? del cultivo a 35 mi de medio de cultivo ICPM (0.6% de peptona, 0.5% de glucosa, 0.1 % de CaC03, 0.1 % de MgSO4.7H2O, 0.05% de KH2P04, pH 7.0), y se incuba a 30°C en un agitador a 200 rpm, hasta que precipiten completamente cristales de gema y parasporales. El cultivo se recoge y se centrifuga durante un minuto a 8000 rpm. Se desecha el sobrenadante. Se usa una solución de NaCI al 0.5% y agua desionizada esterilizada para enjuagar los precipitados tres veces separadamente. (2) Electroforesis SDS-PAGE de las proteínas cristalinas y transferencia de la membrana de blotting de PVDF. Los precipitados enjuagados se resuspenden en agua desionizada a una relación de precipitado: agua deionizada = 1 :5 v/v, y se añade un volumen igual de amortiguador de carga 2x. Se mezcla y después de incuba en un baño de ebullición durante 3 a 5 minutos; se centrifuga a 12000 rpm durante 5 minutos y se corre una electroforesis SDS-PAGE del sobrenadante. Para la formulación de amortiguador de carga 2x y el procedimiento para realizar la electroforesis SDS-PAGE, véase el método descrito por Laemmli (Laemmli, UK. 1970. "Digestión of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature (Londres) 227:680-685). Después, las muestras de proteínas del gel se transfieren a una membrana PVDF utilizando Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BIO-RAD), usando el método estándar (véase Cook RG. 1994. "Amino acid sequence analysis of blotted proteins", p. 207-220, en. B.S. DunBar (ed.), "Protein Blotting: A practical Approach", Oxford University Press, Nueva York). (3) Determinación de la secuencia N-terminal de aminoácidos de la proteína cristalina. Se usa un secuenciador de aminoácidos N-terminales de proteína (número de modelo: ABI 491 Protein Sequence, ABI Procise) para determinar la secuencia N-terminal de aminoácidos. El resultado de secuenciación es extremo N--MDIRNQNKYEWYPA— extremo C (SEQ ID NO:3).
2. Adquisición de la secuencia del fragmento de ADN del extremo 5' del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal Se realiza una amplificación usando PCR de adaptador-ligación. Los principios y pasos de la PCR de adaptador-ligación se describen en Slebert P.D. y otros (Slebert P D y otros, 1995. "An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA" Nucleic Acids Research 23:1087-1088). Los pasos específicos son de la siguiente manera: 1 ) Extracción del ADN total de B. thuringiensis YBT-978 La ß. thuringiensis YBT-978 se inocula sobre 5 mi de medio de cultivo LB utilizando un asa de inoculación bajo condiciones estériles y se cultiva durante la noche a 30°C en un agitador a 200 rpm. Después, se transfiere bajo condiciones estériles 50 µ? del cultivo a 5 mi de medio de cultivo LB nuevo, y se incuba bajo las mismas condiciones hasta la fase de crecimiento logarítmico. Se recogen las bacterias después de centrifugar a 5000 rpm durante 3 minutos. Se enjuaga una vez con 1 mi de STE. Se añaden 100 µ? de solución I, y 10 µ? de lisozima (50 mg/ml), y se dejan actuar durante 30 minutos o más. Se añaden 200 µ? de SDS al 2% y se incuba en un baño de agua a 50-60°C durante 30 minutos. Se agregan 200 µ? de NaCI 5 mol/L y se mezclan. Se agregan 500 µ? de fenol/cloroformo/alcohol isopentílico (25:24:1 v/v), y se centrifuga durante 5 minutos a 12000 rpm. Se recoge el sobrenadante y se repite la extracción una vez o dos veces. Se transfiere la solución de ADN de la capa superior a tubos de Eppendorf y después se agregan volúmenes iguales de etanol al 95%. Se ponen a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se centrifugan durante 5 minutos a 12000 rpm. Se utilizan 200 pl de etanol al 70% para enjuagar los precipitados una vez y secar por congelación los precipitados, y después se disuelven los precipitados secados en congelación en 50 µ? de solución de TE. 2) Digestión enzimática del ADN total con endonucleasa de restricción y ligación con adaptador. (1 ) Se digiere enzimáticamente ADN total preparado de Bacillus thuringiensis con la enzima Hpal a 37°C durante la noche (el sistema de digestión enzimática es de 50 µ?, que comprende aproximadamente 1 pg de ADN total); (2) Agregar 50 µ? de producto de digestión enzimática en 250 µ? de fenol: cloroformo: alcohol isopentílico (25:24:1 v/v), centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos, transferir la solución de ADN de la capa superior a tubos de Eppendorf, agregar volúmenes iguales de etanol al 95%, poner a temperatura ambiente durante 5 minutos, y después centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos. El precipitado se enjuaga una vez con 200 µ? de etanol al 70% y después se seca por congelación y se disuelve en 50 µ? de agua esterilizada; se mezcla con un volumen igual de adaptadores largo y corto (50 µ?) (la secuencia del adaptador largo es: GCTCGAGTCGACCGTGGTACGCGTGTGTGAGCTCCCGGGATCCGGT-3' (SEQ ID NO:4); la secuencia del adaptador corto es 5 ACCGGATC-NH2-3'), para dar 4 µ? de solución, que se incuban a 70°C durante 10 minutos; (4) se agregan 4 µ? de solución de adaptador (25 µ?), 10 µ? de la solución del producto de digestión enzimática del ADN total (que contiene aproximadamente 0.5 µ? de ADN), 81) de ligasa T4, 2 µ? de amortiguador de ligasa T4, y agua para hacer un sistema de 20 µ?. Se liga a 16°C durante 12 horas; (5) Después de calentar a 60°C durante 5 minutos, el sistema de ligación se usa como molde para amplificación de PCR; 3) PCR anidada y secuenciación Se efectúan dos rondas de amplificación de PCR con el producto de ligación anteriormente mencionado. Basándose en la secuencia de aminoácidos N-terminal determinada, se diseñan iniciadores sintéticos específicos de gen que se abrevian como 130P1 y 130P2. Además, se diseñan iniciadores de adaptadores sintéticos, abreviados como AP1 y AP2, basándose en la secuencia del adaptador largo. Las secuencias de los iniciadores son de la siguiente manera: 130P1 : 5-ATGGATATHMGNAATCARAAYAARTAYG-3 (SEQ ID
NO: 5) 130P2: 5-AATAAATATGARGTWGTNTAYCCNGC-3 (SEQ ID
NO: 6) API: 5-GCTCGAGTCGACCGTGGTA-3 (SEQ ID NO:7) AP2:5-GTACGCGTGTGTGAGCTCC-3 (SEQ ID NO:8) (H=A, C o T; M-A o C; N=A, G,C, o T; R=A o G; Y=C o T; W=A o
T) (A) Primera ronda de PCR. Veinticinco microlitros del sistema de reacción contienen: 2.5 µ? de amortiguador de reacción de PCR 10x, 1 µ? de dNTP (2.5 mM cada uno ), 0.5 µ? de iniciador de adaptador AP1 (20 mM), 0.5 µ? del iniciador especifico 130P1 (20 mM), 1 µ? de molde (el producto de ligación anterior), 0.5 µ? de la enzima ExTaq. Se agrega agua desionizada esterilizada para hacer 25 µ?. Las condiciones de PCR son: 94°C, 1 minuto por 1 ciclo; 94°C, 1 minuto, 52°C, 1 minuto, 72°C, 1 .5 minutos por 25 ciclos; 72°C, 5 minutos por cada ciclo. El producto de la primera ronda de PCR se diluye 50 veces para dar el molde de amplificación para la segunda ronda de PCR. (B) Segunda ronda de PCR. Cincuenta microlitros del sistema de reacción contienen: 5 µ? del amortiguador de reacción de PCR 10x, 2 µ? de dNTP (2.5 mM cada uno ), 1 µ? de iniciador de adaptador AP2 (20 mM), 1 µ? del iniciador especifico 130P2 (20 mM), 1 µ? de molde (el producto de la primera ronda de PCR), 1 µ? de la enzima ExTaq. Se agrega agua desionizada esterilizada para hacer 50 µ?. Las condiciones de reacción de PCR son las mismas anteriormente mencionadas, excepto que la temperatura de apareamiento es de 56 °C. (C) Los productos de la segunda ronda de PCR se recuperan mediante un equipo de recuperación de producto de PCR (comprado a Veta-Gene Company), y después se ligan al vector T. El producto de ligación se usa para transformar E. Coli E.DH5a. Se realiza una amplificación de PCR para seleccionar los transformantes usando AP2 y 130P2 como iniciadores y usando bacterias de una sola colonia como molde. Se realiza secuenciación de los fragmentos exógenos en el vector T transformado positivo. El resultado de la secuenciación es la secuencia entre la posición 19 y 491 del nucleótido de SEQ ID NO:1 . Se diseñan iniciadores específicos abreviados como 130S1 y 30A1 -2, basándose en el resultado de secuenciación anterior. Se utilizan para seleccionar una colección genómica de BAC que contiene el gen para la proteína cristalina y varios transformantes positivos, y el tamaño del producto de amplificación es de 434 p.b. La secuencia de los iniciadores es: 130S1 -2: TTCTAATACAACATCAAAGTATCCACTC (SEQ ID
NO:9) 30 A 1 -2:GGTATCGTTCCAATACTAATTCTAAAC (SEQ ID NO:10)
3. Clonación del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal de B. thurinpiensis YBT-978 1 ) Construcción de la colección de BAC genómico de B. thuringiensis, cepa bacteriana YBT-978 Se usa el vector de colección de BAC pBeloBACH (como se muestra en la figura 2), para construir la colección de BAC genómico de ß. thuringiensis YBT-978, de acuerdo con el método descrito por Luo y Wing, 2003 (véase Luo y Wing, 2003, "An improved method for plant BAC library construction", p. 3-19 en Grotewold, Erich, "Plant functional genomic: methods and protocols", Scientific and medical publishers/Humana Press, Totowa, EE. UU.). Esto es, se desarrolla B. thuringiensis YBT-978 en medio de cultivo LB hasta la fase de crecimiento semilogarítmico, y después las bacterias se recogen por centrifugación a 10000 rpm durante 1 minuto en tubos de centrifugación de 50 mi limpios y estériles. A las bacterias recogidas se les agrega 1 mi de amortiguador TE (1 mM de EDTA, 10mM de Tris base, pH 8.0), y después se dispersan ligeramente sobre un vibrador. Se agregan 40 mi de amortiguador TE, se dejan reposar durante 5 minutos y se recolectan las bacterias por centrifugación a 10000 rpm durante un minuto. Se pone un tubo de centrifugación de 50 mi que contiene las bacterias en agua caliente a 50°C y se le agregan 1 .5 mi de TE25S (0.3 M de sacarosa, 25 mM de EDTA, 25 mM de Tris base, pH 8.0); después se mezcla bien y se agrega 1.5 mi de gel caliente al 2% (que es un gel de bajo punto de fusión y es especializado para hacer un bloque de incrustación, 0.1 g de dicho gel se disuelven en 5 mi de TE25S). Se mezcla bien usando una autopipeta y se agrega la mezcla en moldes para hacer bloques de incrustación, que después se enfrían en un refrigerador a 4°C para fijar los bloques de incrustación. Los pasos restantes, que incluyen la digestión enzimática de YBT-978 en los bloques de incrustación con Hind\\\, y la recuperación de los productos de la digestión enzimática, la preparación del vector de colección de BAC pBeloBACH , la ligación de los productos de digestión enzimática con los vectores y la calificación de las colecciones de DH10B y BAC transformadas, son idénticas a los métodos reportados por Luo y Wing (2003). 2) Selección de la colección genómica de BAC y clonación del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal. (A) Examen de la colección genómica de BAC y selección La amplificación de PCR se efectúa usando 130S1 y 130A1 como iniciadores y usando como molde bacterias de una sola colonia de la colección de BAC. El sistema de reacción es de 25 µ?, cuya formulación es idéntica a la anteriormente mencionada. Las condiciones de reacción son las mismas anteriormente mencionadas, excepto que la temperatura de apareamiento es de 55°C. Se selecciona la clona positiva EMB0491 . Se extrae el plásmido recombinante pBMB0491 de acuerdo con el método descrito por J. Sambrook y otros (J. Sambrook y otros (2002), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a edición, traducido por Jin Dong-Yan y otros, Science Press, Beijing). El resultado de la digestión enzimática indica que pBMB0491 contiene un fragmento de aproximadamente 60 kb del genoma YBT-978. B) Adquisición del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal. Se utiliza Hind\\\ para una digestión enzimática completa del fragmento genómico YBT-978 en las clonas positivas. El producto de digestión enzimática se liga con el vector de clonación pUC18 (véase la figura 3) que también se digiere enzimáticamente por completo por medio de Hind\\\. El producto de ligación se usa para transformar E. coli DH5a. Los iniciadores numerados como 130S1 -2 y 130A1-2 nuevamente se usan como iniciadores, y las bacterias de una sola colonia transformada se usan como molde para realizar una amplificación de PCR y seleccionar EMB0493 transformado positivo. Se extrae el plásmido recombinante pBMB0492 de EMB0493. El resultado de la digestión enzimática indica que pBMB0492 contiene un fragmento de aproximadamente 16 kb del genoma YBT-978. Un análisis ulterior mostró que el gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal se localiza en el fragmento Xho\ de 5kb. (C) Análisis de secuencia sobre el gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal y la proteína cristalina insecticida CryTBal Se analiza la secuencia de nucleótidos del fragmento Xho\ de 5kb en el cual se localiza el gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal y se obtiene una secuencia que compre 5235 p.b., en donde 3465 p.b. son la región codificadora. La secuencia codificadora se muestra como SEQ ID NO:1. Dicha secuencia codificadora puede codificar un polipéptido que consiste en 1 54 aminoácidos, es decir, la proteína cristalina insecticida Cry7Bal, cuyo peso molecular deducido es de 30558 Da. Buscando y comparando este polipéptido con secuencias de aminoácidos de otras proteínas Cry y Cyt conocidas en la base de datos de genes GenBank en la web, en el sitio ncbi.nlm.nih.gov, se descubrió que entre todas las proteínas descubiertas públicamente, la única que es más cercana a la proteína cristalina insecticida Cry7Bal es la proteína cristalina insecticida Cry7Ab2 (No. de registro GenBank: U04368), y Cry7Ab1 (No. de registro GenBank: U04367), y CryAal (No. de registro GenBank: M64478), cuya homología es de 58.2%, 57.9% y 57.1 %, respectivamente. La homología de la secuencia en la mitad N-terminal (posición de aminoácidos 1 a 658 en SEQ ID NO:2) es muy baja, que es la homología de 37.1 %, 37.0% y 36.4%, respectivamente. Dicha mitad es la parte responsable de la actividad insecticida y es esencial y adecuada para ejercer actividad insecticida (Schnepf H E, Crickmore N, Rie J V, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler D R, Dean D H. 1998, "B. thuringiensis and its pesticidal crystal proteins" Microbio! Mol Biol Rev, 62:775-806). De esto se puede ver que el gen insecticida es un gen insecticida novedoso. Por lo tanto, el Comité Internacional de Nomenclatura de Genes de B. thuringiensis denominó a dicho gen de proteína cristalina insecticida como cry7Bal, que se determinó que es un gen modelo del gen cry7B. Además, la secuencia es muy similar a las proteínas conocidas de la mitad C-terminal (es decir, la posición de los aminoácidos 659 a 1 154 de SEQ ID NO:2), la homología alcanzando 87.9%, 86.9% y 87.9%, respectivamente. La secuencia de esta parte es el dominio estructural funcional para formar el cristal parasporal, que no es relevante para la actividad insecticida. Del análisis de secuencia anterior puede verse que, entre todas las proteínas descritas, la homología de la única que es más cercana a la proteína cristalina insecticida Cry7Bal de la presente invención, es de 58.2%, menor de 80%. Cuando la homología de la secuencia de aminoácidos de una cierta proteína con respecto a la proteína cristalina insecticida Cry7Bal rebasa el 80%, se considera dentro del alcance de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal de la presente invención. Similarmente, entre todas las proteínas descritas, la homología de la única que es más cercana a la mitad N-terminal (posición de los aminoácidos 1 a 658 de SEQ ID NO:2) de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal de la presente invención, es de 37.1 %, menor de 50%. Cuando la homología de la secuencia de aminoácidos de una proteína con respecto a la mitad N-terminal (posición de aminoácidos 1 a 658 de SEQ ID NO:2) de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal, rebasa el 50%, se considera dentro del alcance de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal de la presente invención.
4. Actividad insecticida de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal de B. thuringiensis El fragmento de Xho\ de 5 kb en el cual se localiza cry7Bal se transfiere al vector promiscuo de E. coli - B. thuringiensis pHT304 (véase la figura 4; para el origen del vector véase Arantes O y Lereclus D. 1991 , "Construction of cloning vectors for B. thuringiensis" Gene 108:1 15-1 19), para dar un plásmido recombinante pBMB0495 (véase la figura 5). Después, el pBMB se transforma a un muíante acristalífero de ß. thuringiensis cepa CryB (para el origen de la cepa véase Wu D, Federici BA, 1993, "A 20-kilodalton protein preserves cell viability and promotes CytA crystal formation during sporulation in Bacillus thuringiensis. J. Bacteriol, 175:5276-5280), usando un método de electroporación bien establecido (Wu Lan, Sun Ming, Yu Ziniu. A New Resolution Vector with crylAdO Gene Based on Bacillus thuringiensis, Transposon Tn4430. Acta Microbiologica Sínica. 2000, 40:264-269), para dar la bacteria recombinante BMB-0502. (1 ) Expresión de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal Se activa BMB0502 incubándola en medio de cultivo LB (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml) durante la noche. Después, se transfiere a medio de cultivo ICPM (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml), se incuba hasta que la gema madure completamente y precipite. Se recoge la bacteria y se enjuaga 3 veces con NaCI al 0.5% y agua desionizada esterilizada separadamente. La bacteria se vuelve a mezclar con agua a una relación de bacteria : agua desionizada esterilizada = 1 :5, después se agrega un volumen igual de amortiguador de carga 2x y se mezcla bien. Se incuba en un baño de agua en ebullición durante 3 a 5 minutos y después se centrifuga a 12000 rpm durante 5 minutos. Se hace una electroforesis SDS-PAGE con los sobrenadantes. Para la formulación del amortiguador de carga 2x y el procedimiento para realizar la electroforesis SDS-PAGE, véase el método citado por Laemmli (Laemmli, UK. 1970, "Digestión of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature (Londres) 227:680-685). Como se muestra en la figura 6, BMB0502 puede formar una proteína cristalina de 130 kDa, cuyo tamaño es idéntico a YBT-978 de la cepa inicial, mientras que el control negativo BMB0503 (que solo contiene el vector promiscuo pHT304) no forma dicha banda correspondiente. (2) Morfología de cristal de la proteína cristalina insecticida
Cry7Bal Se activa BMB0502 incubándola en medio de cultivo LB (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml) durante la noche. Después, se transfiere a medio de cultivo ICPM (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml), se incuba hasta que la gema casi madure y precipite. Se recoge la bacteria y se enjuaga una vez con agua desionizada esterilizada. La bacteria se vuelve a mezclar con agua a una relación de bacteria : agua desionizada esterilizada = 1 :5. Se preparan muestras para microscopía de electrón de transmisión (TEM) y se fijan con Epon812. Se hacen rebanadas ultradelgadas, se observa la transmisión y se toman fotografías a 80 kv. El MBM0502 puede formar cristal parasporal en forma de bipirámide, que se muestra en las figuras 7A-7D. (3) Evaluación del efecto insecticida de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal El efecto insecticida de la proteína cristalina insecticida CryTBal se evalúa usando larvas del tercer instar de Plutella xylostella. Se activa BMB0502 incubándola en medio de cultivo LB (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml) durante la noche. Después, se transfiere a medio de cultivo ICPM (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml), se incuba hasta que la gema casi madure y precipite. Se recoge la bacteria y se enjuaga una vez con agua desionizada esterilizada para dar una mezcla de cristal parasporal. Se hace un bioensayo usando un procedimiento de prueba estándar (véase Shen Ju-qun, Wang Mian-ju, Yu Zi-niu (1990), "Standard Procedure and Method for Bacillus thuringiensis formulations", Chínese Journal of Biológica! Control (Supl.): 12-16). El bioensayo se repite una vez para cada una de las muestras. Se calcula la CL50. Los resultados muestran que la proteína cristalina insecticida Cry7Bal ejerce una toxicidad muy alta contra Plutella xylostella (como se muestra en el cuadro 1 ). Esto significa que la proteína Cry7Bal clonada en la presente invención exhibe una actividad insecticida muy alta contra insectos del orden Lepidoptera.
CUADRO 1 Resultados experimentales del bioensayo de la proteína Cry7Bal clonada en la presente invención contra Plutella xylostella
Tiempo Material Ecuación de Coeficiente de Valor de CL50 (días) regresión regresión (95% de límite de confianza) (ng/ml) 3 BMB0502 y = 0.0028X + 3.0334 0.9946 95.7 (93.9-97.5) 5 BMB0502 y = 1 .0554x + 3.3103 0.9901 39.9 (38.2-41 .6)
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1 es un diagrama de flujo técnico de la presente invención. La figura 2 es un diagrama de construcción del vector de BAC pBleoBAC1 1 del ejemplo de la presente invención. La figura 3 es un diagrama de construcción del vector de clonación pUC18 construido en la presente invención. La figura 4 es un diagrama de construcción del vector promiscuo construido en el ejemplo de la presente invención. La figura 5 muestra el plásmido recombinante pBMB0495 construido en el ejemplo de la presente invención. La figura 6 muestra un análisis de electroforesis SDS-PAGE de la proteína cristalina parasporal Cry7Bal de Bacillus thuringiensis clonada en la presente invención. M: Marcadores de peso molecular. 1 : Proteína cristalina parasporal de la cepa YBT-978. 2: Proteína cristalina parasporal de la cepa BMB0502. 3: Cepa de control BMB0503. Las figuras 7A-7D muestra la morfología del cristal parasporal producido por las cepas YBT-978 y BMB0502 de Bacillus thuringiensis incluidas en la presente invención (la línea normal representa 1 pm). Figuras 7A-7B: Morfología del cristal parasporal de la cepa YBT- 978; Figuras 7C-7D: Morfología del cristal parasporal de la cepa
BMB0502;
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Los siguientes son ejemplos que muestran la presente invención. Es de notar que los ejemplos solo muestran la presente invención pero de ningún modo la limitan. Los diversos procedimientos experimentales implicados son técnicas estándares del campo de la invención. Para ver el contenido no explicado específicamente, los expertos en la materia pueden consultar varios libros de referencia, artículos científicos, manuales relevantes y otros documentos que están disponibles antes de la fecha de solicitud de la presente invención para realizar dicho contenido.
EJEMPLO 1 Clonación del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal de Bacillus thuringiensis YBT-978
De acuerdo con el método descrito por Luo y Wing (2003) (véase Luo y Wing (2003) "An improved method for plant BAC library construction", p. 3-19, en Grotewold, Erich, "Plant functional genomic: methods and protocols", Scientific and Medical Publishers/Humana Press, Totowa, EE. UU.), se usó el vector pBeloBAC1 1 de la colección de BAC para construir la colección de BAC genómico de Bacillus thuringiensis cepa YBT-978 (para la fuente de la cepa bacteriana véase Dai J y otros, 1996, "Bacillus thuringiensis subsp. huazhongensis, serotype H40, isolated from soils in the People's Republic of China", Letters in Applied Microbiology. 22(1 ): 42-45). Los iniciadores numerados como 130S1-2 y 130A1 -2 se usaron como iniciadores y las bacterias de una sola colonia de la colección de BAC se usaron como molde para realizar una amplificación de PCR. Se seleccionó la clona EMB0491 positiva. Se usó Hind\\\ para digerir enzimáticamente por completo el fragmento genómico de YBT-978 en las clonas positivas. El producto de digestión enzimática se ligó con el vector de clonación pUC18, que también se digirió enzimáticamente por completo con Hind\\\ para transformar E. coli DH5a. Los iniciadores numerados como 130S1 -2 y 130A1 -2 se usaron nuevamente como iniciadores y las bacterias de una sola colonia se usaron como molde para realizar una amplificación de PCR para seleccionar EMB0493 transformado positivo. El plásmido recombinante pBMB0492 se extrajo de EMB0493. El resultado de la digestión enzimática reveló que pBMB0492 contiene un fragmento de aproximadamente 16 kb del genoma de YBT-978. Un análisis ulterior mostró que el gen de proteína cristalina insecticida crylBal se localiza en el fragmento Xho\ de 5 kb.
EJEMPLO 2 Análisis de secuencia del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal de Bacillus thurinpiensis YBT-978
Se analizó la secuencia de nucleótidos del fragmento Xho\ de
5kb en el cual se localiza el gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal. Resultó una secuencia que compre 5235 p.b., en donde 3465 p.b. son la secuencia codificadora. La secuencia codificadora se muestra como SEQ ID NO:1 . Dicha secuencia codificadora podría codificar un polipéptido que consiste en 1 154 aminoácidos, cuyo peso molecular deducido es de 30558 Da. Comparando este polipéptido con secuencias de aminoácidos de otras proteínas Cry y Cyt conocidas, se descubrió que era semejante a Cry7Ab2, Cry7Abl y CryAal , siendo la homología de 58.2%, 57.9% y 57.1 %, respectivamente. La homología de la secuencia en la mitad N-terminal (posición de aminoácidos 1 a 658 de la SEQ ID NO:1 ) fue muy baja, siendo la homología de 37.1 %, 37.0% y 36.4%, respectivamente. Como el polipéptido fue similar a la proteína cristalina insecticida Cry7A, fue denominada por el Comité Internacional de Nomenclatura de Genes de Bacillus thuringiensis como cryBal.
EJEMPLO 3 Expresión del gen de proteína cristalina insecticida cry7Bal
El fragmento Xho\ de 5 kb en el cual se localiza cryJBal, se transfirió al vector al vector promiscuo de E. coli - B. thuringiensis pHT304 (para el origen del vector véase Arantes O y Lereclus D. 1991 , "Construction of cloning vectors for Bacillus thuringiensis" Gene 108:1 15-1 19), para dar el plásmido recombinante pBMB0495. Después, el pBMB0495 se transformó en un mutante acristalífero de Bacillus thuringiensis cepa CryB (para el origen de la cepa véase Wu D, Federici BA, 1993, "A 20-kilodalton protein preserves cell viability and promotes CytA crystal formation during sporulation in Bacillus thuringiensis" J. Bacteriol, 175:5276-5280), usando un método de electroporación bien establecido (Wu Lan, Sun Ming, Yu Ziniu. "A New Resolution Vector with crylAdO Gene Based on Bacillus thuringiensis, Transposon Tn4430. Acta Microbiologica Sínica. 2000, 40:264-269), para dar la bacteria recombinante BMB-0502. La bacteria recombinante anterior llamada BMB0502 se activó incubándola en medio de cultivo LB (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml) durante la noche. Después, se transfiere a medio de cultivo ICPM (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml), se incubó hasta que la gema maduró completamente y precipitó. La bacteria se recogió y se enjuagó 3 veces con NaCI al 0.5% y agua desionizada esterilizada separadamente. La bacteria se volvió a mezclar con agua a una relación de bacteria : agua desionizada esterilizada = 1 :5, después se agrega un volumen igual de amortiguador de carga 2x y se mezcló bien. La mezcla se trató en un baño de agua en ebullición durante 3 a 5 minutos y después se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos. Se hizo una electroforesis SDS-PAGE con los sobrenadantes. Para la formulación del amortiguador de carga 2x y el procedimiento para realizar la electroforesis SDS-PAGE, véase el método citado por Laemmli (Laemmli, UK. 1970, "Digestión of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature (Londres) 227:680-685). Como se muestra en la figura 6, BMB0502 forma una proteína cristalina de 130 kDa, cuyo tamaño es idéntico a YBT-978 de la cepa inicial, mientras que el control negativo BMB0503 (que solo contiene el vector promiscuo pHT304) no forma dicha banda correspondiente.
EJEMPLO 4 Efecto insecticida de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal
El efecto insecticida de la proteína cristalina insecticida Cry7Bal se evaluó usando larvas del tercer instar de Plutella xylostella. La BMB0502 se activó incubándola en medio de cultivo LB (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml) durante la noche. Después, se transfirió a medio de cultivo ICPM (se puede añadir eritromicina a una concentración final de 20 pg/ml), se incubó hasta que la gema casi maduró y precipitó. La bacteria se recogió y se enjuagó una vez con agua desionizada esterilizada para dar una mezcla de cristal parasporal. Se hizo un bioensayo usando un procedimiento de prueba estándar (véase Shen Ju-qun, Wang Mian-ju, Yu Zi-niu (1990), "Standard Procedure and Method for Bacillus thuringiensis formulations", Chínese Journal of Biológica! Control (Supl.): 12-16). El bioensayo se repitió una vez para cada una de las muestras. Se calculó la CL50. Los resultados mostraron que la proteína cristalina insecticida CryTBal ejerce una toxicidad muy alta contra Plutella xylostella. Esto significa que la proteína Cry7Bal clonada en la presente invención exhibe una actividad insecticida muy alta contra insectos del orden Lepidoptera. Los efectos obtenidos del ejemplo se muestran en el cuadro 1 .
Claims (7)
1 . - Un gen aislado de proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis, en donde dicho gen codifica una proteína Cry7Bal que tiene una homología de por lo menos 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:
2. 2. - El gen aislado de proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1.
3. - Un gen aislado de proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis, en donde dicho gen codifica una proteína Cry7Bal que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% de homología con respecto a la secuencia parcial numerada del 1 al 658 de la SEQ ID NO:2.
4. - Una construcción de ADN recombinante que comprende el gen de proteina cristalina insecticida que se reclama en la reivindicación 1 o 3.
5. - Un microorganismo que comprende la construcción de ADN recombinante que se reclama en la reivindicación 4.
6. - Una proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. 7.- La proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. 8.- Una proteína cristalina insecticida de Bacillus thuringiensis que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% de homología con respecto a la secuencia parcial numerada del 1 al 659 de la SEQ ID NO:2. 9. - Un fragmento insecticida de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. 10. - Una célula de planta transformada con una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoácidos que se reclama en la reivindicación 9.
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