CN1160458C - 苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株 - Google Patents
苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1160458C CN1160458C CNB981222307A CN98122230A CN1160458C CN 1160458 C CN1160458 C CN 1160458C CN B981222307 A CNB981222307 A CN B981222307A CN 98122230 A CN98122230 A CN 98122230A CN 1160458 C CN1160458 C CN 1160458C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- bacterial strain
- bacillus thuringiensis
- p21zb
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 95
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 33
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 23
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 30
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 abstract 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 15
- 101100497222 Bacillus thuringiensis cry1Af gene Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 9
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 9
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 101100497223 Bacillus thuringiensis cry1Ag gene Proteins 0.000 description 1
- 101100275685 Bacillus thuringiensis cry2Ad gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193365 Bacillus thuringiensis serovar israelensis Species 0.000 description 1
- 101100219198 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis cry11Aa gene Proteins 0.000 description 1
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 1
- 101000578940 Homo sapiens PDZ domain-containing protein MAGIX Proteins 0.000 description 1
- 102100028326 PDZ domain-containing protein MAGIX Human genes 0.000 description 1
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 101150015309 p20 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及克隆自苏云金杆菌(Bt)的一个分子伴侣(Chaperone)基因p21zb以及含有该基因的载体和菌株。该基因转入Bt菌株不仅能显著提高野生型苏云金杆菌杀虫晶体蛋白(ICPs)的产量，且能激发苏云金杆菌杀虫晶体蛋白“沉默”基因的高水平表达。本发明构建了含有p21zb基因的重组载体和工程菌，该工程菌的ICPs表达量比出发菌提高一倍以上，室内外试验证实了该工程菌株对鳞翅目害虫的幼虫有高毒力和良好的遗传稳定性，且有高产高毒的新性状。
Description
技术领域
本发明属于苏云金杆菌的基因工程技术领域，具体涉及一种苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)杀虫剂是目前国内外生产量最大、应用面积最广的一种微生物杀虫剂，具有无污染、无残毒、对靶害虫专一和对人畜、植物等非目标生物安全等优点。苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要靠杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystalproteins，ICPs)起作用，提高ICPs的产量即可提高产晶的总毒力，降低生产成本。过去只从常规筛选和选育菌株着手，但其产量随着菌种的退化而不稳定或降低。
Ellis和Hemmingsen把分子伴侣定义为一类互不相关的细胞蛋白质，它们能介导其他蛋白质的正确装配，但它们本身却不是有功能的最终装配产物的组成成分。目前对其作用的详细机制还不清楚，分子伴侣概念已被广泛用于几乎所有动植物和细菌的蛋白质装配过程之中。现已证明，许多细胞内蛋白的装配都需要一类称做“分子伴侣”(molecularchaperone)的蛋白质帮助才能完成。分子伴侣概念的提出并没有否定“氨基酸的顺序决定蛋白质的空间结构”这一原则，只是补充和修正“自装配”学说，它认为在活细胞中蛋白质分子内部或分子间以及与其它非蛋白质分子间的相互作用都必须受到控制才能有效地形成有生物活性的正确装配产物。分子伴侣就是这种有控制功能的蛋白质，它能阻止不正确的相互作用以防止错误装配。这里的装配不仅指蛋白质的折叠，也包括蛋白质的多聚化和蛋白质与其它非蛋白质分子形成复杂的结构。任何装配过程都存在着因错误的相互作用而产生无功能活性的结构的可能性。只有当这种可能性极小时“自装配”才能自发完成。反之，正确的装配就必须有分子伴侣的帮助。分子伴侣概念的提出是近十几年来蛋白质研究的一次飞跃。
在苏云金杆菌中，国外实验室已发现来源于苏云金杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis subsp.israelensis)，定位于cry11Aa下游的一个开放读码框ORF编码20 kDa蛋白，这个基因后来命名为P20基因。20kDa蛋白实际上具有“Chaperone”蛋白的作用。至目前为止，已经证实20kDa蛋白可促进CytlAa(Wu and Federici，1993；Visisck and Whiteley1991)、Cry4Aa(Yoshisue，1992)、Cry11Aa(Wu and Federici，1995)蛋白的从头合成，有趣的是Cyt和Cry蛋白在氨基酸序列差异很大且生化特性也不一样(Hofte and whiteley，1989)，这些暗示着20kDa蛋白可能对其他蛋白同样有类似的功能，所以它在重组细胞中稳定那些特别容易降解的蛋白可能是有益的(Visick and Whiteley，1991)。1997年Thiery等在medellin亚种中也克隆到相似的基因，命名为p21med，其功能未知。上述20kDa蛋白虽然能提高ICP“表达”基因的表达水平，但没有关于它能激发ICP“沉默”基因的报道。ICP“表达”基因是指一个Bt菌株在正常培养条件下能够表达的杀虫晶体蛋白，这些蛋白的编码基因处于表达状态中，此类基因命名为ICP“表达”基因；ICP“沉默”基因是指一个Bt菌株在正常培养条件下由于未知的原因不能够表达的杀虫晶体蛋白，这些蛋白的编码基因其实存在于该菌株的染色体或质粒上，此类基因命名为ICP“沉默”基因。
发明内容
本发明的目的之一是提供一个新的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的分子伴侣基因，该基因不仅能显著提高野生型苏云金杆菌ICP“表达”基因的表达水平和促进晶体的形成，且能激发苏云金杆菌ICP“沉默”基因的高水平表达。
本发明的目的之二是提供含有上述基因的重组载体。
本发明的目的之三是提供一种含有上述基因的苏云金杆菌及其构建方法。
本发明的分子伴侣基因是从新分离的苏云金杆菌Bt.ZB522菌株中克隆得到的，该基因与p20和p21med基因相比其同源性分别为97.8％和85.1％(如图2和图3所示)，该基因编码21kDa蛋白，具有分子伴侣作用，命名为p21zb基因。p21zb基因的DNA和氨基酸序列已输入国际数据库EMBL，且已得到认可，其Accession NO为AJ011857，其全序列公开日为1999年12月30日。
该基因的基本特征如下：
a.序列特征：长度549bp，类型为核酸，双链，线性
b.分子类型：DNA
c.来源：克隆自苏云金杆菌
d.DNA序列如图1所示。
本发明还构建了含有上述p21zb基因的重组载体。该重组载体是将含有完整p21zb基因及其调控区的PstI片段插入出发载体的多克隆位点而构成的。出发载体可以是各种细菌如Bt、E.coli等的载体和病毒的载体。
上述所用的出发载体优选Bt-E.coli穿梭载体pHT3101(D.Lereclus等，1989)，所构建成的含p21zb基因的重组载体为pHZB1。pHZB1的结构及构建过程如图6所示。
将含有完整p21zb基因及其调控区的PstI片段插入pHT3101的多克隆位点，酶切分析筛选获得重组质粒pHZB1。外源片段的导入对pHT3101复制特性、稳定性和安全性均无影响。
所采用的Bt-E.coli穿梭载体pHT3101(如图6所示)，为法国巴斯德研究所D.Lereclus等人构建。pHT3101由三部分构成：一个2.9kb的BalI片段来源于Bt，为Bt中的复制子；一个1kb的红霉素(Em)抗性基因，来源于链球菌；一个pUC18的全组件，由青霉素(Ap)抗性基因、多克隆位点、大肠杆菌的复制子和LacZ基因的5’-端α-lac片段组成。pHT3101是目前已知的苏云金杆菌稳定性较好的质粒，能在Bt-E.coli中稳定遗传。基因片段插入到多克隆位点后导致LacZ基因失活，得到的重组克隆在含有IPTG和X-gal的LB-红霉素/青霉素平板上是白色菌落。相反，非重组质粒则可大肠杆菌宿主互补为蓝色菌落。pHT3101及其衍生质粒已在苏云金杆菌的基因克隆和基因表达中得到广泛应用，质粒遗传性稳定，不带有任何危险的标记基因，对人类和生态环境没有或危害的可能性极小。
本发明还提供了一种含有上述p21zb基因的苏云金杆菌杀虫工程菌。该工程菌是用本发明的上述含p21zb基因的重组载体pHZB1转化苏云金杆菌出发菌而获得的。其具体构建成方法为：
a.根据需要，选择具有较高杀虫活性的苏云金杆菌为出发菌株；
b.参照Schurter(1989)及Brain & Luke(1988)的方法制备出发菌的感受态细胞；
c.采用高压电激法将含p21zb基因的穿梭载体导入出发菌的感受态细胞；
d.在抗生素板上筛选阳性菌落。抽提阳性菌落的质粒，转化大肠杆菌JM101或TG1，再提取质粒，酶切分析确认阳性菌落，即为目标工程菌。
本发明的含有p21zb基因的苏云金杆菌杀虫工程菌还可通过将含p21zb基因的Bt重组载体经转座子载体(transposon vector)整合进Bt出发菌染色体中而获得。
本发明的含有p21zb基因的苏云金杆菌杀虫工程菌的代表菌株为Bt-YPF22菌株。该菌株是由本发明的含有p21zb基因的重组载体pHZB1转化野生菌株Bt-F2而获得的。
上述工程菌Bt-YPF22已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏编号：CCTCC M98018，保藏日：1998年11月26日。
由该Bt-YPF22菌株即可直接提取得到本发明的重组载体质粒pHZB1。质粒pHZB1的复制方法：参照Sambrook(1989)方法，转化大肠杆菌如TG1或JM10，加入氨苄青霉素(100ug/ml)和红霉素(50ug/ml)的培养基培养，碱法提取质粒。
由质粒pHZB1经NsiI/ClaI酶切，可得约1.2kb的DNA片段；也可经PstI酶切，可得约1.5kb的DNA片段，即可获得本发明的p21zb基因。
试验表明，本发明的p21zb基因的表达产物有助于ICPs表达和形成晶体，具分子伴侣的功能，而且能激发苏云金杆菌ICP“沉默”基因的高水平表达，是一个“增产”基因。含有此基因的重组质粒pHZB1经电激转化至野生菌株Bt-F2，获得工程菌株。在相同培养条件下，取等量培养物经SDS-PAGE蛋白电泳证实，工程菌产生的晶体量提高一倍多。生物测定也表明，工程菌株的毒力明显提高。这表明，p21zb基因具有增产增效的功能，用其构建的工程菌的可获得高产高毒的新性状。
作为本发明工程菌Bt-YPF22的出发菌的苏云金杆菌Bt-F2菌株从我国土壤中分离获得。这株野生菌株产生的伴孢晶体为菱形，主要含分子量为130～140kDa和60～70kDa两种蛋白，基因型属于cry1和cry2。
在基因工程菌Bt-YPF22(CCTCC M98018)中，目的基因p21zb及其调控区片段位于高拷贝的重组质粒pHZB1上，在受体菌中能稳定遗传和表达，在电子显微镜下能观察到晶体数量明显增多，晶体形状也发生明显变化，不仅有菱形，还有方形晶体，两种形状的晶体数量上均等。连续培养150代质粒丢失频率小于10-4/代。
以下通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明的p21zb基因的DNA序列。
图2是p21zb基因与p20基因的DNA序列同源性比较，显示其同源性为97.8％，其中第一行为p21zb基因，第二行为p21基因。
图3是p21zb基因与p21med基因的DNA序列同源性比较，显示其同源性为85.1％。
图4是p21zb蛋白与p20蛋白的氨基酸序列同源性比较，显示其同源性为97.3％，其中第一行为p21zb蛋白，第二行为p20蛋白。
图5是p21zb蛋白与p21med蛋白的氨基酸序列同源性比较，显示其同源性为70.2％。
图6是穿梭质粒pHT3101的结构及重组质粒pHZB1的结构和构建过程示意图。
图7是工程菌Bt-YPF22和Bt-QS与相应出发菌株的晶体蛋白SDS-PAGE对比分析图；M1和M2代表标准蛋白，Q代表Bt-QS，S代表Bt-S181，Y代表Bt-YPF22，F代表Bt-F2。
图8是电激转化晶体缺陷型菌株的晶体蛋白SDS-PAGE对比分析图；M代表标准蛋白，B代表晶体缺陷型菌株BtK-BE20，Q代表晶体缺陷型菌株Bti-4Q7，T代表晶体缺陷型菌株Btt-P12；(+)表示经pHZB1(p21zb基因)转化。
具体实施方式
实施例1.p21zb基因的制备过程：
从我室新分离菌株Bt-ZB522中提取质粒，质粒DNA经PstI酶切消化，随机克隆于穿梭质粒pHT3101上，并直接电激转化晶体缺陷型菌株BtK-BE20，将转化处理的受体菌涂布于含50ug/ml Em和100ug/ml Ap的LB平板培养基上培养，在光学显微镜下观察有无伴孢晶体产生，进而确定有效重组子。用此法筛选到的重组菌株之一JB001，能够产生大卵圆型晶体。提取JB001的全部质粒，转化大肠杆菌JM101，获得重组穿梭质粒pHZB001，外源片段大小为1.6kbp的片段。
基因p21zb也可如前面所述，直接从Bt-YPF22(CCTCC M98018)菌株提取质粒pHZB1，经NsiI/ClaI酶切，可得约1.2kb的DNA片段；也可经PstI酶切，可得约1.5kb的DNA片段，p21zb基因(549bp)定位于这两个片段上，即获得本发明的p21zb基因。
实施例2.含p21zb基因的重组质粒pHZB1的构建：
a.设计2个引物：Primer I：C[CTGCAG]GTCAACACCCTGGGTCAA，括号中为PstI位点；PrimerII：G[ATGCAT]TCATTGATGTTCGG，括号中为NsiI位点；模板为质粒pWF45，含有基因cryIA(c)的启动子。通过PCR反应获得195bp的DNA片段，序列测定表明PCR产物是预期的；
b.上述片段与pALTER-EX1/PstI、NsiI连接转化，获得重组质粒pAL-P。；
c.质粒pAL-P经PstI/HindIII双酶切获295bp含启动子的DNA片段，插入BluscriptM13-，得到质粒pBL-P；
d.p21zb基因的ORF、启动子调控区域及转录终止区等定位于NsiI/ClaI双酶切的1.2kb片段内，把这个片段插入质粒pBL-P，获得重组质粒pBL-P-CH；
e.质粒pBL-P-CH经KpnI/BamHI双酶切，回收约1.5kb片段，插入pUC18，获得配套质粒pHZY1。
f.质粒pBL-P-CH经PstI酶切，回收约1.5kb片段，插入pHT3101，获得Bt表达载体质粒pHZB1。
重组质粒pHZB1也可如前面所述，直接从Bt-YPF22(CCTCC M98018)菌株提取得到。
实施例3.含p21zb基因的工程菌Bt-YPF22的构建：
a.选择具有较高杀虫毒性的Bt-F2菌株作为出发菌株；
b.参照Schurter(1989)及Brain & Luke(1988)的方法制备苏云金杆菌感受态细胞；
c.吸取0.01～0.05ug/ul的质粒pHZB1加入到准备好的感受态细胞中，充分混匀，置冰浴10分钟，移入预冷的电激杯中(0.2mm)，电压1500v，电阻400～800进行电激，电激后迅速移入冰浴经10分钟，加入800ml SOC，30～35℃静止培养1～2小时，然后取样，涂布于青霉素和红霉素双抗板上筛选阳性菌落。由于pHZB1是Bt-E.coli的穿梭质粒，可抽提阳性菌落的质粒，转化大肠杆菌JM101或TG1，再提取质粒，酶切分析而排除假阳性菌落。确认的阳性菌落即为Bt-YPF22。
实施例4.
重组质粒pHZB1转化野生Bt菌株Bt-S181和Bt-F2，分别获得工程菌Bt-QS和Bt-YPF22。在相同培养条件下，取等量培养物经SDS-PAGE蛋白电泳证实，工程菌Bt-QS和Bt-YPF22的晶体蛋白表达量分别为各出发菌株的2.4和4.3倍(如图7)，晶体形状发生明显的变化(如表1)。生物测定结果表明，Bt-QS和Bt-YPF22菌株对斜纹夜蛾的毒力显著提高，LC50分别为出发菌株的2.14倍和1.94倍(如表2)。按总毒力计算，Bt-QS和Bt-YPF22菌株分别是相应出发菌株的5.14和8.43倍。
表1.野生型菌株Bt-S181利Bt-F2经pHZB1(p21zb基因)电激转化后产生的晶体类型和主要蛋白：
| 菌株 | 晶体形状 | 主要蛋白分子量(kDa) |
| Bt-S181 | 菱形 | 130～140，60～70 |
| Bt-QS | 菱形，方形 | 130～140，60～70 |
| Bt-F2 | 菱形 | 130～140，60～70 |
| Bt-YPF22 | 菱形，方形 | 130～140，60～70 |
表2.工程菌Bt-QS和Bt-YPF22对斜纹夜蛾的生物测定
(每一浓度的试虫数为20头，重复3次供试昆虫：2～3龄斜纹夜蛾幼虫，以目前生产上对斜纹夜蛾和甜菜夜蛾等防治效果较好的菌株Bta作为对比)
| 菌株 | 线性方程 | LC50(ug/ml) | 标准毒力倍数 | 相对毒力倍数 | 总毒力倍数 |
| Bta | Y＝2.30X+1.61 | LC50＝29.65 | 1 | ||
| Bt-F2 | Y＝1.21X+3.83 | LC50＝9.298 | 3.19 | 1∶1.94 | 1∶8.43 |
| Bt-YPF22 | Y＝1.86X+4.02 | LC50＝4.791 | 6.19 | 1.94∶1 | 8.43∶1 |
| Bt-S181 | Y＝2.17x+2.92 | LC50＝9.74 | 3.04 | 1∶2.14 | 1∶5.14 |
| Bt-QS | Y＝1.67x+3.90 | LC50＝4.55 | 6.51 | 2.14∶1 | 5.14∶1 |
实施例5.
重组质粒pHZB1(p21zb基因)电激转化晶体缺陷型菌株BtK-BE20、Bti-4Q7和Btt-P12时，能激发ICP“沉默”基因的高水平表达，分子量分别为130～140、60～70、38、33、27kDa等(如图8)，形成的晶体形状有多样(如表3)，经生物测定证实这些蛋白有较高的毒力。生物测定表明：BtK-BE20(+)对库蚊有较强毒力，Bti-4Q7(+)和Btt-P12(+)对银纹、斜纹夜蛾有毒杀作用。(+)表示经pHZB1(p21zb基因)转化。
表3.晶体缺陷型菌株经pHZB1(p21zb基因)电激转化后产生的晶体类型和主要蛋白：
| 菌株 | 晶体形状 | 主要蛋白分子量(kDa) |
| BtK-BE20 | 卵圆形，双梯形 | 60～70，38，33，27 |
| Bti-4Q7 | 菱形，方形 | 130～140，60～70(少) |
| Btt-P12 | 菱形，大扁方形 | 130～140，60～70(少) |
Claims (5)
1.苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的分子伴侣基因，其特征在于该基因为p21zb，其DNA序列如下：
ATGACAGAAA ATGGAGTGTT TTATAAAATA TTCACAACAG AAAATAATAA TTTCTGTATA 60
AATCCTACTT TGTTAGAAAG GGTTTTTAAA AATAATTTAG ATGAATTTGA TTTTTCGCTA 120
GTAAAAAAAA ACTTAGAACA TGAGAAGAAT TGTGTGATTA CTTCTACAAT GAATCAAACA 180
ATTTCTTTCG AGAATATGAA TAGTACAGAA ATGGGGCATA AGACATATTC CTTTTTAAAT 240
CAAACAGTTT TAAATAATAA GGGGAAATCC TCTTTAGAGG AACAAGTCTC TAATATTTTT 300
TATAGATGTG TATATATGGA AGTTTGGAAA TCAAGTTCAT ATATTAACCC TCTTGAGCAG 360
GATTCTAATA AATTAAGGTA TGTGTGTAGT TTGCTCTTTA TAGTGCCCTA TAAGGATAAC 420
ATAACATCAA TTATTCCAGT AAATTTACAA CTAACATTAT TATCGAAAAA TGTAAAACAA 480
TCGTCTTCTA CAAATATATT TTCAGGAGAT ATACATTTTA ATATGGTAAC AATGACTTAT 540
TTAACTTAA 549。
2.一种重组载体，其特征是该载体含有权利要求1所述的基因。
3.按照权利要求2所述的载体，其特征是该载体为苏云金杆菌表达载体pHZB1。
4.一种苏云金杆菌杀虫工程菌，其特征是该菌株含有权利要求1所述的基因。
5.按照权利要求4所述的苏云金杆菌杀虫工程菌，其特征在于该菌株为Bt-YPF22CCTCC M98018。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB981222307A CN1160458C (zh) | 1998-12-03 | 1998-12-03 | 苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB981222307A CN1160458C (zh) | 1998-12-03 | 1998-12-03 | 苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1234446A CN1234446A (zh) | 1999-11-10 |
| CN1160458C true CN1160458C (zh) | 2004-08-04 |
Family
ID=5227685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB981222307A Expired - Fee Related CN1160458C (zh) | 1998-12-03 | 1998-12-03 | 苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1160458C (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1324816A (zh) * | 2000-05-24 | 2001-12-05 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——分子伴侣cpn60蛋白15和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CN100510081C (zh) * | 2005-10-17 | 2009-07-08 | 华中农业大学 | 苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry7Bal |
-
1998
- 1998-12-03 CN CNB981222307A patent/CN1160458C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1234446A (zh) | 1999-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Springer et al. | The phylogenetic status of Sarcobium lyticum, an obligate intracellular bacterial parasite of small amoebae | |
| Park et al. | Construction and characterization of a recombinant Bacillus thuringiensis subsp. israelensis strain that produces Cry11B | |
| CN105367634B (zh) | 一种Bt蛋白Cry1Ie5、其编码基因及应用 | |
| CN107058124B (zh) | 一种莱氏野村菌菌株及在防治淡剑灰翅夜蛾上的应用 | |
| CN1160458C (zh) | 苏云金杆菌分子伴侣基因、含有该基因的载体及菌株 | |
| CN109810907B (zh) | 一株对柳杉毛虫末龄幼虫有强致病力的球孢白僵菌BbJL-01 | |
| CN109136101B (zh) | 一种真菌菌株及应用 | |
| CN101050449A (zh) | 一种苏云金芽孢杆菌工程菌uv173a及其制备方法和应用 | |
| CN114480436B (zh) | 一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用 | |
| CN105367636B (zh) | 一种Bt蛋白Cry1Dd1、其编码基因及应用 | |
| CN103525836B (zh) | 一种Bt Cry71Aa1操纵子基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN103525835B (zh) | 一种Bt cry71Aa1基因及其编码蛋白和应用 | |
| KR100280380B1 (ko) | 바실러스투린지엔시스 엔티0423 균주의 내독소단백질 및 이를 이용한 미생물 살충제 | |
| Bałazy et al. | Laboratory trials to infect insects and nematodes by some acaropathogenic Hirsutella strains (Mycota: Clavicipitaceous anamorphs) | |
| CN103525837B (zh) | Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因及其应用 | |
| CN103396977B (zh) | 一种杀鞘翅目害虫的苏云金芽孢杆菌工程菌及制备方法和应用 | |
| CN112574901A (zh) | 苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种Btk-KN-R8及其应用 | |
| CN1164733C (zh) | 具优良基因组合的高效Bt15A3菌株、分离及应用 | |
| JPH05509235A (ja) | 新規なバチルス・トリンジェンシス単離物 | |
| CN102363631B (zh) | 一种杀虫Bt蛋白Cry8Qa1、其编码基因及应用 | |
| CN103103204A (zh) | 一种Bt cry54Ab1操纵子基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN1160452C (zh) | 一株重组广谱苏云金芽孢杆菌 | |
| CN103103203A (zh) | 一种Bt cry54Ab1基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN105367635B (zh) | 一种Bt蛋白Cry1Hc1、其编码基因及应用 | |
| CN102408475A (zh) | 一种Bt蛋白Cyt1Da1、其编码基因及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |