JPH05509235A

JPH05509235A - 新規なバチルス・トリンジェンシス単離物

Info

Publication number: JPH05509235A
Application number: JP4506298A
Authority: JP
Inventors: ウイルコツクス，デイビツド・アール; スミス，ロバート・エイ; ベンソン，テリー・エイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1991-02-05
Filing date: 1992-02-05
Publication date: 1993-12-22
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: WO1992013941A1; AU1372792A; EP0570506A1; ES2197901T3; DE69233007D1; AU668859B2; US6264942B1; DE69233007T2; US5801046A; TW224139B; ATE237679T1; MX9200507A; JP2620478B2; EP0570506A4; EP0570506B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｔバ　ルス　トリンジェンシスの本発明は、生物学的殺虫剤を産生ずる生物に係わる０本発明は特に、幾つかの昆虫種に対して有効である細菌バチルス・トリンジェンシス（［１ａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉＢｉｅｎｓｉｓ）の新規な株と、この菌株の製造及び使用方法とに係わる。

光１しと！遣− 殺虫剤は商業的農業で広範に利用され、作物の収量及び品質の著しい向上を可能にしてきた。殺虫剤はまた、害虫個体群がヒトや家畜にとってうるさかったり、その「康を害したりする場合に、例えば蝿や蚊などの様々な昆虫を防除するべく日常的に用いられる。しかし、成る種の合成殺虫剤の使用に関連して、殺虫剤の食物連鎖内での生体蓄積、もしくは標的でない生物に及ぼす悪影響への懸念を含めた環境上の危険性が次第に明らかになってきている。従って、生物学的殺虫剤、特に天然の生物殺虫剤は、環境的に許容可能な害虫防除手段を模索する者にとって非常に重要となった。

微生物Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが有害昆虫の防除に有用であることは以前から知られている。胞子を形成するＢ、　ｔｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎｓｉｓ細胞は一群の化合物を産生じ、これらの化合物は以前単一のδ内毒素と看做されていたが、今では数種の異なる毒素タンパク質から成ると理解されており、前記タンパク質は内生胞子中に見いだされる結晶性タンパク質含有体中に濃縮される。

上記含有体が感受性を有する昆虫の幼虫によって摂取され、昆虫の消化管内でタンパク質の分解が生起するとＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの内毒素タンパク質は、消化管の上皮を破壊し、最終的には害虫そのものを死亡させる活性化合物に変換される。

従って、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｒＢＩｉｅｎｓｉｓのδ内毒素類は該微生物の培養物の溶解物または他の発酵抽出物の形態で適用されれば殺虫剤として有用であることが明らかになった。上記毒素顕は様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａＮその他の昆虫に対して著しい活性を示す。しかし、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ製剤は、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ属及びＰｌｕｔｅｌｌａ属昆虫並びに他の様々な鱗翅類害虫などの昆虫の撲滅において限られた価値しか有しないことが判明した。Ｂ、　ｔｈｕｒｉＢｉｅｎｓｉｓ製剤の、このように成る一定の害虫種に対してしか発揮されない毒性、即ち差別的毒性は、所与のＢ、　ｔｈｕｒｉｎ４ｉｅｎｓｉｓ変異体で発現する内毒素遺伝子の種類が限られており、個々の毒素は全体的な毒性プロフィールに対して予測不能な仕方でしか寄与しないことに起因すると考えられる。

多くの研究者が、より広範囲の、または異なる範囲の殺虫活性を有するＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株を同定することや、Ｂ。

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓゲノムを操作して特定のδ内毒素の発現を促進することを試みている０Ｍ々の単離物を毒性に関してスクリーニングする努力が払われた結果、Ｋｒｉｅｇ等の１９８８年８月２３日付米国特許第４，７６６．２０３号に開示された、報告によればＣｏ１ｅｏｐｔｅｒａの撲滅に有効であるＢ、　ｔｈｕｒｉＢｉｅｎｓｉｓｖａｒ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓのような従来未知であった株が幾つか単離された。しかし、新規な殺虫活性を有する株の同定に通常のスクリーニング操作を用いると、天然に生じるＢ。

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ変異体がきわめて多種であるため多大の時間及び労力が掛かる。

Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素をコードする遺伝子をクローニングしてＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓゲノムを好ましく再構成し、またはクローニングした遺伝子を発現のため新規な微生物宿主に導入する別のアプローチも存在した。Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔ等の１９８８年９月１３日付米Ｔ５特許第４，７７１，１３１号には、Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓなど他の微生物での発現に適するとされるＨ−７毒素遺伝子をクローニングすること、及びそれによってＣｏ１ｅｏ−ｐＬｅｒａ目の甲虫票を防除する能力を付与することが開示されている。この方法はしかし、得られた生物に、天然に生じた生物に施すより多くの調整的精査を施すという欠点を有する。

従って、より広範囲の、または異なる範囲の殺虫活性を示すＢ、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ株を同定する必要性は依然として存在する。理想的には、そのような株は天然に生じる変異体の中からランダムスクリーニング法を用いずに同定される。

ｌ１二１１従って本発明は、従来耐性であったかまたは十分感受性でなかった昆虫種に対して向上した毒性を有する、Ｂ。

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの新規な細菌単離物を包含する。この単離物は、Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕＦ！１−ｐｅｒｄａ［フォールアーミーウオーム（ｆａｌｌ　ａｒｍｙｗｏｒｎ）コ及び５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ［ビードアーミーウオーム（ｂｅｅｔ　ａｒＩＩＩｙ−ｗｏｒｍ）］、並びにｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（イラクサキンウワバ）など規程かの二次的害虫を非限定的に含む、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓでの処理に耐性である幾つかの昆虫種に対して用いられ得る。本発明の細菌単離物は、様々なり、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素タンパク質をコードする遺伝子の特定のサブセットを有することと、当該サブセットに関連することが知られている特徴的なプラスミドプロフィールもしくはアレイ（ａｒｒａｙ）とによって特徴付けられ得る。

本発明は、上記のような細菌単離物を効率的に同定する方法も包含し、この方法では普遍的な又クレオチドプローブを用いて、特定の有害昆虫に対して何等かの毒性を有することが既に知られている株において当該法の内毒素遺伝子の存在を確認することができる０次に、上記内毒素遺伝子を検出する遺伝子特異的なりＮＡプローブを製造し、このプローブを用いてＢ、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ株に予備スクリーニングを施して、対応する内毒素を合成し得る一連の変異体を同定する。最後に、上述のように選別した変異体に比較的通常のように行なわれる別のスクリーニングを施すことによって、更に高いレベルの殺虫活性を示す特定の変異体を得ることができる。

本発明は更に、本発明の遺伝子特異的なりＮＡプローブの製造に有用な、クローニングされたかまたは合成されたヌクレオチド配列も包含する。この配列は所期の目的遺伝子の配列分析によって、かつ所望の特異度に従って決定される。普遍的なく即ち多種の内毒素遺伝子を認諏し得る）プローブが必要である場合は、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ１ｇ素遺伝子の保存領域に基づくヌクレオチド配列が構築され得る。あるいは他の場合には、様々な毒素遺伝子に独特の配列を用いて高度に特異的なプローブが製造され得る。

本発明の細菌単離物の、有害昆虫の防除または撲滅への使用、及び殺虫有効量の本発明の細菌単離物を許容可能なキャリヤと共に含有する組成物も、本発明の範囲内である。

図面の簡単な説明本発明を、添付図面を参照しつつ説明する。添付図面の第１図は、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株＾ＢＴＳ　１８５７及び幾つかの基準株に関する一連のプラスミドプロフィールを示している。

汀の；　６日本発明はまず、入手可能なり、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ変異体の中から、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓのδ内毒素タンパク質をコードする遺伝子の選択されたサブセットに関する予備スクリーニングを含む操作によって選別されるＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの細菌単離物を開示する。本発明の単離物は特定の昆虫種に対する差別的毒性を有し、従来Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫剤に対して耐性であるかまたは十分感受性でないと考えられた害虫種に対して毒性を有するＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ変異体の単離物を含む。

本発明ノ単離物ハ例えば、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、　Ｓｅｘｉｇｕａ＋Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉミノから選択された害虫に対して有効な株である。今や、上記害虫種はｃｒｙ　ｌ＾（ａ）、ｃｒｙ　ｌ＾（ｂ）、ｃｒｙ　ｌ　Ｃ及びｃｒｙ　Ｉ　Ｄ遺伝子を発現し、かつ場合によってはｃｒｙＩ＾（ｃ）遺伝子を欠失したＢ。

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの単離物で防除され得ることが判明した。

理論に拘泥するつもりは無いが、このような遺伝子相補性（ｇｅｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）によって上記株の優れた殺虫活性が少なくとも部分的に説明されると考えられる。そのうえ、上記遺伝子の活性はこれらの遺伝子の細菌ゲノム内での組織化に関連すると考えられる０例えば細菌プラスミドの電気泳動分離によって容易に得られるプラスミドアレイもしくはプロフィールは株の遺伝子構造の特徴を明らかにするうえで有用であり得、即ち本発明の細菌、単離物を同定するもう一つの手段として有用であり得る。Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ＾ＢＴＳ　１８５７から得られる代表的プラスミドプロフィールを第１図に示す。

本発明の細菌単離物の好ましい一例は、本明細書中に開示した新規な細１単離物Ｂ、仁ｈｕｒＩｎｇＩｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７であり、この単離物は上述の遺伝子相補性を有し、市販のＢ。

ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ株に比較してＰｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａに対する改善された毒性を示す、亜種Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ａｉｚａｗａｉに属するＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７は＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕｂＬｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）に、受託番号５Ｏ−１３７２の下に寄託しである。第１図のプラスミドプロフィールに加えて、株＾Ｂ丁Ｓ　１８５７は本明紹書中の実施例４に記した生化学的特性、及びく米国農務省Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ型株ＨＤ−１１に同等の〉鞭毛血清型Ｈ−７の提示、並びに［熱−キユアリング（ｈｅａｔ−ｃｕｒｉｎｇ）によって明らかとなる］少なくとも三つの内毒素遺伝子保有プラスミドの存在によっても同定され得る。

次に本発明は、上述の単離物の生物学的に純粋な培養物を開示する１本明細書中に用いな゛生物学的に純粋な培養物”という語は、生物学的汚染を実質的に免れている培養物で、該培養物から得られた異なる継代培養物が実質的に同し遺伝子型及び表現型を示すような遺伝学的均一性を有する培養物を意味する。このような培養物は大規模発酵において、あるいはまた周知の株操作技術のための出発物質として有用である。従って、本発明の単Ｎｍに由来する突然変異体、組み換え体及び遺伝子操作された変異体とその培養物とは本発明の範囲内に有ると看做される。

本発明はまた、特定の標的害虫種に対して有効であるＢ。

ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓの株を単離する方法も開示する。この方法は、その存在または不在が特定の標的害虫に対する毒性の決定要因である内毒素タンパク質をコードする遺伝子の組み合わせを同定する最初の段階と、入手可能なり、　ｔｈｕ−ｒｉ１ｇｉｅｎｓｉｓ株の中から前記内毒素遺伝子の組み合わせを有する一連の変異体を予備スクリーニングするかもしくは単離する次の段階と、前記一連の変異体をスクリーニングして好ましい単離物な得る更に次の段階とを含む、内毒素遺伝子の特定の組み合わせ、及び対応する毒素複合体の、異なる標的害虫に対して差別的に毒性を発揮する能力の同定は、成る毒素を合成する株の毒性を合成しない株の毒性と比較することによって達成し得る。必要であれば、所期の毒素の産生を実現し得る遺伝子を熱−キユアリングなどによって選択的に除去し、得られた株を毒性が向上したか低下したか試験することができる。

あるいは他の場合には、ｆ３．　ｊ）Ｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素遺伝子の望ましい組み合わせは３．組み会わせを構成する全遺伝子とハイブリダイズ可能である普遍的なヌクレオチドプローブを用いて同定し得る。ｃｒｙＩ＾（ａ）、ｃｒｙＩ＾（ｂ）、ｃｒｙＩ＾（ｃ）、ｃｒｙＩＢ、ｃｒｙｌｃ、ｃｒｙｌＤ、　ｃｒｙｌＥ、　Ｃｒａｍ＾、ｅｒｙｌｌｊＢ、ｃｒｙｒＶΔ、ｃｒｙｒｖＢ及びｃｒｙＮＣを含めた幾つかの毒素遺伝子が同定されており、その配列の一部または全部が、例えば５ｃｈｎｅｐｆ等によりＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０．　ｐｐ、　６２６４−［３２７２（１９８５）に公表されている。これらの遺伝子の成る一定の領域が良好に保存されて、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの内毒素遺伝子全般を認識するＤＮＡプローブの製造を可能にすることが判明した。上記のような普遍的プローブは、所期の害虫種に対して成る程度の毒性を有することが常套的なスクリーニングによって明らかとなった株のゲノムとハイブリダイズする場合、そのような株に存在する内毒素遺伝子を同定し、かつその特徴を明らかにするのに用いることができる。このような操作は、本発明の実施に有用であるその他の操作同様、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）などの参考文献中に見いだせる周知の技術を用いて実行し得る。

Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに優れたた毒性をｆ１与すると考えられる遺伝子ｃｒｙＡ　ｌ　（ａ）、ｃｒｙ　ｌ＾（ｂ）、ｃｒｙ　ｌ　Ｃ及びｃｒｙ　ｌ　Ｄの同定に用いる普遍的プローブの一例に、配列＾ＴＣ（：ＣＡＧＡＧＡ［；ＡＴＧＡＣ丁ＣＴ＾＾ＣＴにＴＣＴＴＡにＡＴＡＴＣＧＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣ＾＾＾ＴＴＡＴＧＡＣＣＣ（起死番号：１）を含む新規なプローブが有る。上記のような配列は、文献中に報告されている場合、標準的なポリヌクレオチド合成操作を用いて製造し得る。あるいは他の場合には、既知である所期の遺伝子から直接配列をクローニングし得る。関連プローブを用いることも可能であり、例えば上記配列の、δ内毒素と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さを有する断片も、本発明の普遍的ＤＮＡプローブとして用いるのに適している０本明細書中、ヌクレオチド配列は常に通常のように、即ち５′末端から３′末端の方向に表記してあり、その際記号屓まアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンであることが留意されるべきである。

内毒素遺伝子の特定の組み合わせを同定したら、本発明の方法によれば、同定した遺伝子の組み合わせを確実に有する、即ち対応する内毒素タンパク質の組み合わせ企産生じ得る一連のＢ、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ変異体を単離する。

変異体の単離は、まず所望の各内毒素をコードする各遺伝子の一部の非反復ヌクレオチド配列を決定し、次いで前記配列とハイブリダイズし得る一連の遺伝子特異的なヌクレオナトプローブを製造することによって達成し得る。上記非反復配列はＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素遺伝子の、きわめて変化しゃすい（即ち保存されない）とされている領域がら得られる。先に述べた普遍的プローブの場合同様、遺伝子特異的な１０−ブの構築は場合によっては、公表されているヌクレオチド配列を参照して行ない得る。しかし、配列データが入手できない場合、または新規な内毒素遺伝子を同定した場合は所期の遺伝子をクローニングするか、または対応するプローブ配列のクローニングもしくは合成に有用な非反復配列の同定が可能となるまで配列決定しなければならない。

本発明の方法の好ましい例で用いるような、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎｓｉｓのδ内毒素遺伝子の同定に用い得る遺伝子特異的なプローブは、ｃｒｙ　Ｉ　Ａ（ａ）遺伝子を同定する配列ＡＣＡＡ丁（：ＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧ（：ＡＧＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＴＴ［；／、ＧへＧＣＴ（配列番号２）と−ｃｒｙｌ＾（ｂ）遺伝子を同定する配列にＡＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧ＾＾＾ＣＣ＾＾ＴＴＣＴＴＣＴＧ　（配列番号３）と、ｃｒｙｌ＾（ｃ）遺伝子を同定する配列にＣＴＡＣＧＴＣＡＴＴＡＧＡＴ＾＾ＴＣＴＡＣ＾＾ＴＣ＾＾ＧＴにＡＴＴ７ＴＧＧＴＴＡＴＴ７７Ｇ＾＾＾ＧＴＧＣＣ＾＾ＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＡＧＧＴ＾＾ＴＡＴＡＧＴＡＧＧＴＣＴＴＡＧ＾＾＾ＴＴＴＴＡＧＴＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ［；ＴＧ　（配列番号４）と、ｃｒｙ　ｌ　Ｃ遺伝子を同定する配列ＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧｆｌ：にＧＧＧｆ；ＣＡＣＣ（配列番号５）と、ＣｒｙＩＤ遺伝子を同定する配列ＣＣＧＣＡＴＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＧｆ；ＴＧＣＣ（配列番号６）とを含むヌクレオチド配列から成り得る。これらの配列を完全状態で用いるかまたは短縮し、延長し、もしくはその内部に修飾を施すことによって、同定しようとする内毒素遺伝子に対して所望程度のホモロジーと、対応するハイブリダイゼーション特異性とを有するプローブを得ることができる。そのうえ、付加的な内毒素遺伝子及び該遺伝子各個の非反復配列が既知となるにつれて、または既知遺伝子の成る種の遺伝変異体が該変異体を有するＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓ株に望ましい特性を付与することが判明した場合には、本発明の方法の実施から逸脱せずに用い得る新たなプローブが派生的に得られることが予期される。

上述のＪ　（Ｅ子持異的）゛ローブは該プローブの結合の７ｇｉを可能にする幾つかの通常方法のうちのいずれかにおいてａ識することができ、このように１ｓ識した遺伝子特異的プローブは、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの入手可能な株総てを迅速かつ経済的に予備スクリーニングするのに用い得る。前記予備スクリーニングは、レプリカプレート培養法＜ｒｅｐ　Ｉ　ｉｃａｐｌａｔｉｎｇ）、ハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィー等のような公知技術を用いて行ない得る。このようにして請求める遺伝子相補性を表わすハイブリダイゼーションパターンを示す一連の変異体を試験様の中から容易に選別することができる。この点に関して、本発明の方法は特定の内毒素遺伝子の存在に関する予備スクリーニングのみでなく、所望の毒性を抑制すること、または該毒性に対して顕著な影響を有しないことが判明した他の内毒素遺伝子の不在に関する予備スクリーニングも含み得ることが留意されるべきである。

本発明の単離方法は、上段ではＢ、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓのδ内毒素遺伝子の同定及び予備スクリーニングと関連付けて説明したが、毒素のＤＮＡ配列でないにもかかわらず差別的毒性の決定に関与すると判明し得る他のＤＮＡ配列を有する変異株の組の選別にも十分適していることが予期される。　ｒ！ＩＩえば、産生される内毒素の１、または該毒素の漂的害虫に対する特異性に影響する調節遺伝子もしくは不発現配列を同定するべきである場合、配列特異的なヌクレオチドプローブを製造かつ使用して、天然に生じたＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ変異体をそのような配列の存在または不在に関して予備スクリーニングし得る。従って、本明細書中に用いた“遺伝子”または“内毒素タンパク質をコードする遺伝子”という語は内毒素として発現するＤＮＡ配列のみでなく、そのような発現を調節する配列や、自ら発現する場合に当該配列を有するＢ、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ株の毒性プロフィールを変化させる配列をも意味する。

予備スクリーニングによって選別した変異体の中から好ましいＢ、　ｔｈｕｒｉｎＦｉｉｅｎｓｉｓ株を、毒性に関する通常の、ただし小規模のスクリーニングによって同定し得る。最終的に選別した単離物はその後、収率改善の公知技術を用いて、または株の突然変異体、組み換え体もしくは遺伝子操作された誘導体の製造などにより株自体を操作することによって、毒素産生に関しＩＦｆ化することができる０株自体の操作には、例えば毒素結晶は生じるが胞子は形成しないｓｐｏ−（無胞子性）突然変異体などである２別単離物の好ましい六環型を実現させることも含まれ得る。しかし、本発明の方法は繰り返し用いることも可能であると理解され、また最終的な単離物は、特定の毒性プロフィールの遺伝学的決定因子を同定し、適当な遺伝子特異的またｊよ配列特異的プローブを構築し、かつこの決定因子の存在に関してＢ、　ｔｈｕ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株全般を予備スクリーニングする新しいサイクルの開始点として用いることができると理解される。

本発明は、本発明の細菌単離物または該単離物から得られる内毒素を殺虫有効量で、許容可能なキャリヤと共に含有する組成物も開示する。上述の方法により適当なり。

ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ変異体を同定及び安定化した後、当業界で原車的である培地及び発酵技術を用いて大規模発酵を実現し得る。次に、内毒素結晶を（該結晶と容易に分離できない胞子と共に〉発酵ブイヨンから分離して凍結乾燥し得、または幾つか有る公知方法のいずれかにおいて、濃縮液、葉の上や下に吹き付けるための乾燥粉末もしくは水和性粉末または懸濁液、及び土壌に適用するための粒状調製物などを含めた任意形態に調製し得る。本明細書中に用いた゛″許容可能なキャリヤ”という語は、組成物に望ましい貯長　蔵性、取り扱い特性及び施用特性を付与する、その池の点ケ　では不活性な賦形剤や結合剤を意味し、通常用いるキャリ受　ヤには、賦形剤、結合剤、界面活性剤、分散剤、付着剤等ヒ　が含まれ得る０本発明の組成物の好ましい一例は、単離物７Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７またはその突然変異体、組み換え体もしくは遺伝子操作された誘導体を含有する組成物′　である。

本発明は有害昆虫を防除する方法も開示し、この方法は前記先生によって食害されている区域に本発明の細菌単離°物または該単離物から得られる内毒素を殺虫有効量で適用う語は細菌単離物または内毒素の、例えば害虫死亡率や作ｌ　物被害の終止によって測定される、標的害虫を実質的に撲滅し得る量を意味する。必要な細菌単離物または内ｓＴ：の量には、施用方法、主な気象条件、即ち温度、湿度、降雨量及び風など、害虫による食害の程度、標的種の成長段階等を含めた多くの要素が影響する。防除するべき昆虫が５ｐｏｃｌｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ＋Ｓ、　ｅｘｉｇｕａ＋Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｉｌａ及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉなどの害虫である場合、本発明の有害昆虫防除方法の好ましい一例は、適用する活性物質がり、　ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ八ＢＴＳ　１８５７の４［へｉＷ物または鎖車ａｉｍの突然変異体、組み換え体もしくは遺伝子操乍された誘導体である方法である。

本発明は、本発明を説明するだけで限定しないと看做されるべきである以下の実施例との関連で更に良く理解されよう。

え施」ニー　゛の；日・・。びＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株の土壌からの単離を、６〜１０種の胞子形成バチルス、及び胞子を形成しない細菌、酵母及び黴を含めた他の微生物よりもＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ型バチルスの出芽に適するように設計された操作を用いて実施しな。短い加熱処理＜８０℃で１０分間）を用いて胞子を活性化し、その後急いで試料をＭｙｅｒｓ　ａｎｄ　Ｙｏｕｓｅｔｅｎ　１９８０によるＮＳＹＭ寒天培地上て継代培養した。

Ｂ、仁ｈｕｒｉＢｉｅｒ＋ｓｉｓ型バチルスのコロニーを、当該様に典型的なコロニー形態及び増殖特性に基づいて選別した。また、順微鏡検査を用いて、形五学的にも生化学的にも区別不能な通常の土ｔｉＩ、ｌ１ｌｌ菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓからＢ、　ｔｈｕ−ｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓを区別する内毒素タンパク質結晶の同定ら行なった。

バイオアッセイで用いるＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単ＭＴｔｊＪと、５゜鴎１のＭｅｃｌｉａ　１６８（１１の脱イオン水中に１８ｇの大豆粉と、０．３ｇ（７）ＭｇＳＯ，・７ＬＯト、　０．７ｇ（’）Ｋｚｌ’１ＰＯ−と、０．５ｇノＣａＣ０Ｉ　Ｊ−１１，０ｍ１の１％ＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏと、１．０ｍｌの１％ＺｎＳＯ４とが存在；加圧滅菌済み；使用前に１００ｍ１当たり約２．５ｍｌの滅菌２０％グルコース溶液を添加）を入れた２５０ｖｌ容の培養フラスコ内で増殖させた。培養物を２８℃で７２時間、２５０ｒｐ＋＊で振盪しつつインキュベートし、そのｆ＆３ｍｌ試料を滅菌済みの１５１１＋ｌ容ポリプロピレン管に分は入れ、がっ−２０℃で凍結させて後の分析に備えた。

の　に　バ　・・セイ細菌単離物の毒性を実験室内で、様々な量の細菌で処理した昆虫用餌に害虫種の幼虫を暴露することによって評価した。試験株及び基準細菌それぞれについて並行稀釈液系列を調製し、その際（必要であれば最初に予備試験を行なった後）濃度範囲を選択することにより、該系列の中央点をそれぞれのＬＤ、。に一致または近似させた。温度６０’Ｃ″′ｃＷＬ状に維持した通常の昆虫用餌（主に寒天、大豆粉、固形栄養素及び補給ビタミン）の３６−１アリコートに、脱イオン水漂準液を含有する各稀釈液４ｍｌを添加した。混合後、処理済みの餌の各４０ｍ　ｌ試料を高温のまま６個の１オンスプラスチツクカツプに分配し、餌が固化し、かつその温度が室温となるまで少なくとも１時間冷ました。

次に、所期の害虫種の、例えばＳ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａであれば卿化２日後の二齢幼虫２匹を上記各カップに注意深く入れ、それによって前記幼虫に試料を食害させた。カップを個々に覆い、環境室（終日暗闇、２８℃、相対湿度２０〜５０％）内で６４〜６８時間インキュベートした。インキュベーション後、生存幼虫及び死亡幼虫を計数し、結果を後のＬＣ，。分析に用いた。

ＤＮＡプローブｆ゛告　コロニーハ　ブ１　イゼーシ　ン本発明の方法で用いる普遍的及び遺伝子特異的ＤＮＡプローブを、三カラムＤＮへ自動合成機＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ｂ（登録商標）において該装置に付属する標準的なβ−シアンエタノールホスホアミダイト化学薬剤を用いて所盟のオリゴヌクレオチドを合成することにより製造した。得られたオリゴヌクレオチドを、γ−八へ″”Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用い、かつＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端を標識するＭａｙａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔの操作（１９８０）を用いて末端Ｗ識した。

上記プローブとのハイブリダイゼーション用の細菌単離物を、連続稀釈及びプレート培養の後に単独コロニーを滅菌した爪楊枝で、液体ＬＢ培地（１１当たり５ｇのＮａＣｌと、Ｌｏｇのバクトドリプトンと、５ｇの酵母抽出物とを含有）を入れた９６ウエルのマイクロタイター皿内に配置し、かつ２８℃で少なくとも４時開インキュベートすることによって製造した。

９６個の尖端を有する金属スタンプを用０て培養物アレイを、固体ＬＢ寒寒天プレートロ配置した１、２μｍナイロンハイブリダイゼーション膜、及びマスターパイオア・ンセイプレートに移すことにより多数のレプリカを製造し、これを２８℃で約１６時間インキュベートした。

次に、得られたコロニーを、ＴＥＳＭ衝液（３０ｆｉＭトリスーＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴ＾、５０ｍＭ　ＮａＣ１）を溶媒とした１０＋Ｂ／ｍｌリゾチーム溶液上でフィルターをコロニー側を上にして１時間浮動させることによりプロトプラスト化した。プロトプラスト化後、フィルターを、まず過剰量の変性Ｍ衝液（０，５Ｍ　ＮａＯＨ１２，５Ｍ　ＮａＣＩ）中、次いで過剰量の中和緩衝液（ｐ）１７．０の０．５１リス、３．０Ｍ　ＮａＣＩ）中で、いずれの場合も途中１回Ｍ衝液を交換しながら３０分間ずつ穏やかに振盪することにより洗浄した。フィルター３少しの間自然乾燥させ、かつ少なくとも１時間８０℃のオーブンに入れた後、サイン法（１９７５）による予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを実施した。

ハイブリダイズしたフィルターを５８℃のクエン酸塩緩衝液（０，１％ＳＤＳ　ｗＩｌ／ｖ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ　ＮａＣ１；ＨＣＩでｐＨ７，０に調節）で１時閉ずつ２回洗浄し、吸取紙上で自然乾燥させた。次に、− ７０℃のフリーザー内で上記フィルターにＫｏｄａｋ　Ｘ−０ＩＩＩａｔ（登録商標）＾Ｒフィルムを、増感スクリーンを用いながら一晩露出し、その後フィルムを現像及び分析することによってハイブリダイゼーションを評価した。

実」１倉Ｒ工い　の　みΔわ　のロビードアーミーウオーム、フォールアーミーウオーム及びコナガに対する毒性に関連するＢ、　ｔｈｕｒｉｒ＋Ｆｉｉｅｎｓｉｓのδ内毒素遺伝子分、次のように同定した。Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＨＤ−１変種に関して５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉに対する可変の毒性を数回観察したところ、サザンブロ・ンティング法で決定される成る毒素遺伝子が欠失すると５ｐｏ−ｄｏρＬｅｒａの死亡率が甚だしく低下することが開明した。陵にｃｒｙ　ｌ＾（ｂ）として同定した対応遺伝子の欠失はサザンブロッテイング分析によって確コΣした。これとは別に、クローニングしたｅｒｙ　ｌ＾（ｂ）及びｃｒｙＩ＾（ｅ）遺伝子をＥｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおいて発現させ、この菌から顆粒を単離して、上記害虫種に対してやはりま著な差別的毒性を示す抽出物を得た。同時に、ｃｒｙｌ＾（ｂ）遺伝子は毒性にとって重要であるが、。ｒｙｌ＾（ｃ）は全く不要かもしれないことも研究によって示唆された。

次に、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＨＤ−１の誘導木様を熱−キユアリングによって製造し、この株から精製した結晶をＳ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ及びＴ、　ｎｉの幼虫に対する毒性に関して評価した。ｃｒｙＩ＾（ａ）及びｃｒｙ　Ｉ＾（ｂ）遺伝子を有するがｃｒｙ　ｌ＾（ｃ）が欠失している上記誘導木様は、Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに対して実質的に改善された活性を示した。従って、同等の遺伝子相補性を有する変異体を得るべ（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｒ＋ｇｉｅｎｓｉｓ土壌単離物をスクリーニングするのに、ｃｒｙ　Ｔ＾（ａ）、ｃｒｙ　ｌ＾（ｂ）及びｃｒｙ　ｌ＾（ｃ）に関して遺伝子特異的なりＮ＾プローブを製造して用いた。

上記のような変異体は約２０種を同定し、それらの変異体に、Ｓ、　ｒｒｕｇｉｐｅｒｄａに対する活性に関してパイオア、セイを施した。記号＾ＢＴＳ　５８０３を付した一つの株が特に高活性であると判明し、この株は上記種に対して基準株ＨＤ−１の２倍の毒性を示した。そこで株＾ＢＴＳ　５８０３を、この時点で既知であるＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素遺伝子の保存領域に基づいて形成した普遍的ＤＮ＾プローブでの処理によって分析したところ、サザン法分析の採用により、該株がｃｒｙ　ｌ＾（ａ）及びｃｒｙ　ｌ＾（ｂ）に加えて新たに２種の遺伝子を有することが判明した。クローニング及び配列決定の際、これらの遺伝子をｃｒｙ　ｌ　Ｃ及びｃｒｙ　Ｉ　Ｄとして同定した。プラスミド熱−キユアリングを用いて更に行なった研究から、上記遺伝子が少なくとも３個の分離したプラスミド上に配置され、その際ｃｒｙ　Ｉ　Ｃとｃｒｙ　Ｔ　Ｄとは隣接プラスミド上に配置されるのでなければ同一プラスミド上に配置されることが明らかとなった。これらの遺伝子が１種以上欠失した八ＢＴＳの誘導体はその毒性が低下することが判明したので、次に行なう予備スクリーニング用として遺伝子ｃｒｙ　Ｉ＾（ａ）と、ｃｒｙＴ＾（ｂ）と、ｃｒｙ　ｌ　Ｃと、ｃｒｙＩＤとの組み合わせ［ｃｒｙ　Ｉ＾（ｃ）は含ます］を選択した。

え止■ｌＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　の口　び　ＡＢＴＳ　１８５７の　゛本発明の代表的ＭＢ直単離物を次のようにして得た。上記４種の内毒素遺伝子の組み合わせに関して遺伝子特異的であるプローブを用いてＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単独コロニー土壌単離物を、前記遺伝子を有する変異体を約１００同定するまで予備スクリーニングした。同定した変異体を、Ｓ、　ｆｒｕ−１ｉｌｉｐｅｒｄａに対する活性に関して試験した。　ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＥｐｈ−した一つの変異体が他のいずれの変異体にも優る活性を有し、Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに対して基準株Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＨＤ−１の３倍の毒性を有する毒素／胞子複合体を形成することが判明した。

再び遺伝子特異的プローブを用いて株＾ＢＴＳ　５６８６の単独コロニー単離物を、所望の四つの内毒素遺伝子の総て、即ち遺伝子保持プラスミドの総てを保有するか調べることにより、前記様の遺伝子型の純粋性を［認した。完全な、従って明らかに安定な遺伝子相補性を有する３３のコロニーをプールし、これに“株＾ＢＴＳ　１８５７”と命名し直した。更に、（通常の培養温度である２８℃に替えて）３４℃でのプラスミド安定性を調べてゲノムの安定性を確認し、その際ｃｒｙ　ｌ＾（ｂ）遺伝子の損失は二のような鳥温下に７２時間経過してら２？６でしかなかった。得られたＢ、　ｔｈｕｒｉＢｉｅｎｓｉｓ株＾ＢＴＳ　１８５７を後述のように、殺虫活性に関してより詳細に調べ、かつ試験した。

失１ｊ１− Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７の−　、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７の特異な増殖及び代謝特性を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏ１２、　ｐｐ、　１１０４−１１２９．１９８６の記載に後段に記したような変更を加えた操作によって評価した。以下の諸特性に着目した（次表中×＝肯定、０＝否定、■＝可変、Ｔ−痕跡応答）。

パラ胞子結晶　× カタラーゼ　× 嫌気的増殖　× フオゲスーブロスカウエル試験　× ｖ−ｐブイヨンのｐＨ＜６．ＯｘＤ−グルコース由来の酸　× Ｌ−アラビノース由来の酸　ＶＤ−キシロース由来の酸　ＶＤ−マンニトール由来の酸　■ グルコース由来のガス　０カゼインの加水分解　Ｘゼラチンの加水分解　× 澱粉の加水分解　× クエン酸塩の利用　× プロピオン酸塩の利用　× チロシンの分解　Ｏフェニルアラニンの脱アミノ化　０卵黄レシチナーゼ　× ＮａＣｌ　０％において増殖　× レシチナーゼの検出では、レシチナーゼ産生の評価がより正確となるように、上記Ｂｅｒｇｅｙの操作で推奨されてし）る液体培地に替えて固体寒天培地を用いた。栄養要求性増殖の分析では、Ｃａ５ｐａｋ（登録商標）ジャー及びガス発生器（ＢＢＬ）を用いて適当なガス環境を用窓し、２０〜３０°Ｃで３日及び６日インキュベートした浸に増殖を評価した。

対照生物５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓの応答に関するＮａｔｉｏ−ｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄｓのＳ、Ｏ。

Ｐ、　０４７Ｔ−１２−０３４＾の規準によって評価した抗生物質感受性は次のとおりであった（Ｒ＝耐性、Ｓ＝惑受性）。

トリメトプリム／スルファメトキサゾール　Ｓ火］１外１ブース≧ドブロフ　−ルのＢ、　ｔｈｕｒｉｎＦｉｉｅｎｓｉｓ　八ＢＴＳ　１８５７のプラスミドプロフィ−１しを、Ｇｒｙｃｚａｎ等（１９７８）から採用し、がつＳｈ　１ｖａｋｕｉａｒ等（１９８６）が行なったように改良した操作を用いてめ、これをＣｏｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｋｕｒｓｔａｋｉ　ｔ？Ｄ−１、及び亜種Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓ　ａｉｚａｗａｉの２種の株）１０−１１及びＨＤ −１３３のプロフィールと次のように比較した０株の培養物を、２０ｍ　ｌのＬＢを入れた５０ｍ１容のボυグロピレン製遠心分離管内で２８℃で約１６時間、（２５０ｒｐ＋＊での）振盪下に増殖させた。４８００Ｘ　ｇでの遠心分屋を４ ℃で１０分間行なって細胞と回収し、これを１ｍｌのＴＥＳｌｆ衝液（３新液１Ｈトリス、ｐＨ７，５，５ＩＩＭＥＤＴ＾、４０ｍＭ　ＮａＣ１）で２回洗浄したが、その際各洗浄後にマイクロ遠心分離機でペレット形成した。上清を吸引し、ペレットを１８０μｍのスクロース培地（２５％スクロース、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス、ｐ［１７，５）中に再懸濁させた。試料を完全に混合して２０μｍのりゾチーム（５０＋ｇ／ｍｌのりゾチームを含有するスクロース培地）を、もはや混合せずに添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、各試料に５８　ＮａＣｌを４８μ＋、０．５Ｍ　ＥＤＴ＾を１２μ＋、及びＳＤＳ　２％含有の０．７８　ＮａＣｌを２６０μ＋添加し、かつ管を２回転倒することにより緩慢な混合を行なって細胞を溶解させてから更に６８℃で１０分間インキュベートした。その後、試料を水浴中で１時間冷却し、４℃の温度を維持しながら１５分間マイクロ遠心分離を行なうことによって染色体ＤＮＡ及び細胞破片を除去した。先端を平滑にしたエツペンドルフビベットチップで各試料から約３００μｍの上滑を、ＤＮＡを切断しないように試料界面への接触に用心しながら穏やかに取り出し、清浄なエッペンドルフチューブに移した。

次に、試料を温度４℃において３３μｍの３Ｍ酢酸ナトリウム及び６７０μｍのエタノールで処理してプラスミドＤＮＡ　ｐ沈澱させ、１８時閏−２０℃に維持した後４℃で１５分間マイクロ遠心分離に掛けた。エタノールをデカンテーションによって除去し、管縁部を拭って乾かし、ペレットを、室温で３０分間真空下に遠心分離を行なうことにより乾燥した。乾燥した各ペレットを２００μｍのＴＥＳ［新液で覆い、そのまま１５分間放置してから平滑にしたエッペンドルフピペットチップを用いて穏やかにピペッティングし、かつ指先で弾くことによって再懸濁させた。各２μｍのＲＮアーゼ＾（１０＋＊ｇ／ｍｌ）及びＴ、　ＲＮアーゼ（１００ＩＪ／＋＋＋Ｉ）を各試料に添加し、この試料を３７℃の水浴中で１時間インキュベートした。２０μｍのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌン添力ａｔ、ｔｔ、各試料を更に２時間インキュベートした。

２００μｍの緩衝化フェノール（８−ヒドロキシキノロンを０．１％まで添加；　ｐＨ８の１Ｍトリスて１回洗浄し、かつｐｌ（８の０．１Ｍ１〜リスで２回洗浄して抽出を行ない、ｐＨを７．６とした）を用いるフェノール抽出と１０秒間の短い混合とを行なって、試料からプロテアーゼを除去した。次に、各試料を３分間マイクロ遠心分離に掛け、水性相を新しいエツベンドルフチューブに移した８等量（２００μｍ）のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：　１　ｖ／ｖ）を添加して試料を混合し、府と同様に遠心分離に掛けた。水性相と除去し、温度４℃において１／１ｏ量＜２０μＩ　）ノ３８酢酸ナトリウム及び２．５ｆｆｌ　Ｉ（０，５１１）のエタノールを添加して再び沈澱を生起させ、この試料を１時間−２０℃に維持した。そ°の後、先に述べたのと同様に試料をペレット状とし、乾燥し、かつＴＥＳＷ衝液中に再懸濁させた。

Ｐｕｌｓｅｗａｖｅ（登録商１７６０スイッチャ−（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と、ＴＢＥ［新液（８ＩＩＭトリス塩基、８９−Ｍホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴ＾、ｐｌ＋８．３）中で調製した、各端部に１．５％のアガロースを詰めた１０１０Ｘ１５のブリッジ型ゲル支持体とを用いてゲル分にを行なった。ＴＢＥｆ　ｌｉ液液中調製したアガロースゲル（０，８％）を約４ｍｍの深さまで注ぎ、これに１，５Ｘ７＋ｎｍのゲルコームを配置した。４℃に維持したゲルを８０ｖで１時間泳動させてからプラスチックフィルムで被覆し、電圧を２６時間５０Ｖに低下させた。波形パラメーターは“電場反転、正常泳動（ＦｉｅｌｄＩｎｖｅｒｓｉｏｎ、　Ｎｏｒｍａｌ　Ｒｕｎ）″であり、その際最初のへ時間は９秒、最後のへ時間は６０秒であった。開始比は３であり、また泳動時間は２６時間に設定した。

泳動を終えたゲルを約０．６％のエチジウムプロミドで３゜分間染色し、がっ思波長ＵＶ光を背険がら照射して写真撮影する前に水中で１５分間脱色した。２種のＴｉ［ｅｎ（登録商標）フィルター（２５−レッド及び１６−オレンジ）の組み合わせ分用い、またＰｏ１ａｒｏｉｄ　６６７フイルムをｆ２２で２０秒間露光した。

得られた株＾ＢＴＳ　１８５７のプラスミドプロフィールを第１図にレーン３として示す、レーン１は、記載した相対分子量（単位ｍＤａ）を有する分子量マーカーを示している６株１！Ｄ−１、ＨＤ−１３３及びＨＤ−１１のプラスミドプロフィールはレーン２．４及び５としてそれぞれ示しである０株＾ＢＴＳ　１８５７の場合、五つのプラスミドバンドが染色体バンドの後方に移動し、また十が後方に移動して、そのうちの一つは染色体の染みによって部分的に不明瞭となっていることが注目された。残りの九つのうち、二つはダブレットとして互いに接近した。

ＡＢＴＳ　１８５７のプラスミドプロフィールはユニークであり、３種の基準法のプロフィールから明確に区別できることが観察された。

Ｘ差１亙・　に・　るＢ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　７８５７のパ温室試験及び野外試験を行なって、本発明の細菌単Ｎ物が野菜作物の重大な鱗翅目害虫、特にＰｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（ｆｆＦ外で試験）及び５ｐｏｄｏｐｔｓｒａ　ｅｘｉｇｕａ（実験室で飼育したで試験）の防除に関して有する効力を測定した。植物種は様々なものを用いた。単離物Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７を工業レベル粉末として製造し、６〜８回の反復を伴う完全乱塊実験計画を用いて試験した。比較基準は、同様に製造したＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｋｕｒｓｔａｋｉ　）ＩＤ−１工業粉末と、市販のＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫剤であるＤｉＰｅｌ（登録商標）２χＨＰ（＾ｂｂｏｔｔ）とした、殺虫剤調製物の適用は、温室内ではエアブラシ噴霧器を用いて０．５〜４．８ｍ１ｇ／ｍｌの量で行ないく各植物に２＋ａｌずつ噴霧）、野外ではＣＯ２加圧式のバックパック噴霧調製物の活性を、処理後の昆虫幼生の死亡率または個体数減少と、適当であれば作物被害の推定とに基づいて評価した。データの記録は処理後３日以上経過してから、かつ季節実験において何回も適用した場合は普通５〜７日置きに行なった。これらの試験の代表的な結果を次の表Ｉに示す。

この表で落葉を０〜４のスケールで評価し、その際完全な落潰含４とした。

艮−上Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｅｘｉ　ｕａ　（Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘ　１ｏｓｔｅｌｌａの　の　、Ｓ、　ｅｘｉｇｕａ　ビート　１８５７　０．５　８９　０．６８１．０　９９　０．３６２．０　１００　０．０）１０−１　０．５　８４　０．８１１．０　９５　０．６Ｓ２．０　９６　０．１３ＤｉＰｅｌ　２．４　４５　２．１６（登録商標＞　４．８　６７　１．１５Ｓ、　ｅｘｉｇｕａ　ニアラード　１８５７　１．２　９７　ｏ、１５２．４　１００　０．０４）ＩＤ−１１，２７８０，７５２，４９１０，４４ＤｉＰｅｌ　２．４　６１　０．７８（登録商標）　４．８　７３　０．７４ＨＤ−１０，１２５４０− ０，５４８− ＤｉＰｅｌ　１．０　５３　− （登録商標）Ｐ、　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ　菜種　１８５７　０．１２５　６２　−０．５　７８　− ＨＤ−１０，１２５２３− 主１１及びＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに耐性であるコナガ幼虫及びビードアーミーウオームに対して基準法）１０４よりはるかに高い活性を有することを示している。そのうえ、試験株は非耐性のコナガ、イラクサキンウワバ、及びモンシロチョウ幼虫から作物を商業的に許容可能に医護することが判明し、前記害虫に対して試験株は、少なくとも基準Ｂ、　ｔｈｕ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ産物のものに等しい活性を示した。

本明細書では、本発明の単離物その他の特徴をＢ、　Ｌｈｕ−ｒｉＢｉｅｎｓｉｓ株の、主として亜種ｋｕｒｓｔａｋｉ及びａｉｚａｗａｉに関連付けて説明した。しかし、ここに開示した技術は任意のタイプまたは血清型の新規なり、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ単離物の同定及び使用に適用可能であることが留意されるべきである。

！」ＴＢ、　ｊｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの新規な細菌単離物は、Ｐｌｕｔｅｌｌａ　ｘｙ−１ｏｓｔｅｌｌａ、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ及び５ｐｏｄｏｐｔｅｒｉ　ｅｘｉｇｕａ。

並びにＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉなど規程かの二次的害虫を非限定的に含む、従来耐性であったかまたは十分感受性でなかった昆虫種に対して向上した毒性を有する。このような単離物は、様々なり、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδ 内毒素タンパク質をコードする遺伝子の特定のサブセットを有することと、当該サブセットに関連することが知られている特徴的なプラスミドプロフィールもしくはアレイとによって特徴付けられ得る。上記のような細菌単離物を普遍的な、あるいはまた遺伝子特異的なりＮＡプローブを用いて効率的に同定する方法、前記プローブの製造に有用な、クローニングされたかまたは合成されたヌクレオチド配列、殺虫有効量の本発明の細菌単離物を許容可能なキャリヤと共に含有する組成物、及び前記組成物を有害昆虫の防除または撲滅に用いる方法も開示されている。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株全般から、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓのδ内毒素タンパク質をコードする遺伝子の選択されたサブセットの存在に関する予備スクリーニングを含む手段によって選別されるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの細菌単離物。
２．ＳＰｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｓ、Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中から選択された有害昆虫に対して有効であることを特徴とする請求項１に記載の単離物。
３．亜種Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ａｉｚａｗａｉに属することを特徴とする請求項１に記載の単離物。
４．Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７の同定特性を有することを特徴とする請求項３に記載の単離物。
５．第１図に示したのと実質的に同じプラスミドプロフィールを有することを特徴とする請求項１に記載の単離物。
６．遺伝子のサブセットがｃｒｙＩＡ（ａ）、ｃｒｙＩＡ（ｂ）、ｃｒｙＩＣ及びｃｒｙＩＤを含み、ｃｒｙＩＡ（ｃ）は含まないことを特徴とする請求項１に記載の単離物。
７．請求項１に記載の単離物の生物学的に純粋な培養物。
８．単離物がＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７の同定特性を有することを特徴とする請求項７に記載の培養物。
９．Ｂ．ｔｈｒｕｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＡＢＴＳ　１８５７またはその突然変異体、和み換え体もしくは遺伝子操作された誘導体の生物学的に純粋な培養物。
１０．標的害虫種に対して有効であるＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変異体を単離する方法であって、（ａ）その存在または不在が標的害虫に対する毒性の決定要因である内毒素タンパク質をコードする遺伝子の組み合わせを同定し、（ｂ）Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株の中から前記遺伝子の組み合わせを有する一連の変異体を単離し、かつ（ｃ）前記一連の変異体をスクリーニングして好ましい単離物を得ることを含む方法。
１１．請求項１に記載の細菌単離物または該単離物から得られる内毒素を殺虫有効量で、許容可能なキャリヤと共に含有する組成物。
１２．被害区域に請求項１に記載の細菌単離物または該単離物から得られる内毒素を殺虫有効量で適用することを含む有害昆虫防除方法。
１３．ヌクレオチド配列【配列があります】（配列各号：１）及び該配列の、少なくとも１個の対応するＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ−ｓｉｓ遺伝子配列との特異的ハイブリダイゼーションに十分な長さを有する断片の中から選択されたヌクレオチド配列。