CN101768558B - 抗害虫的新颖苏云金芽孢杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗害虫的新颖苏云金杆菌菌株，其具有crylAa、crylAb、crylC、crylD及crylF的基因片段。并且，本发明还提供一种应用该菌株控制害虫的方法与一种包含该菌株培养物与可接受载体的组合物。

Description

抗害虫的新颖苏云金芽孢杆菌菌株

技术领域

本发明是关于一种新颖的苏云金芽孢杆菌菌株，特别是关于一种具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D以及cry1F的基因片段的苏云金芽孢杆菌菌株。

背景技术

随着人们对于生活品质的重视以及环保意识的兴起，目前以生物性杀虫剂取代传统农药来避免食物链的最终累积的趋势已成为主流。其中，苏云金芽孢杆菌是生物性杀虫剂中最广为应用的，且使用简便又安全。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种昆虫病原细菌，为革兰氏阳性杆菌，在营养缺乏或环境不良的时候，苏云金芽孢杆菌会进入不分裂的半静止期，或是分化形成孢子和杀虫结晶蛋白。苏云金芽孢杆菌的杀虫结晶蛋白对于部分害虫有抑制其生长的作用，但对哺乳类动物及鸟类均无害。因此，过去20年来科学家已分离出许多苏云金芽孢杆菌内的杀虫基因，并研制成重组基因产品。

苏云金芽孢杆菌的内毒素基因位于质体上，因此很容易进行转化基因工程。早期的内毒素重组基因大多限制于单一基因片段的转化。最近则利用多重内毒素基因或是差异性很大的基因，甚至是嵌合基因(chimeric)，以增强杀虫效果、扩大杀虫范围或是改良苏云金芽孢杆菌本身对于不良环境的抵抗力。

各类苏云金芽孢杆菌毒蛋白间的类源关系，因其内含质体核酸序列的变异所产生的杀虫结晶蛋白不同，杀虫对象也不同，主要分成六大类(Hofte和Whiteley，1989.Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis.Microbiol.Rev.53：242-255；Gill等，1992.The mode of action of Bacillusthuringiensis endotoxins.Annu.Rev.Entomol.37：615-636；Gleave等，1993.Screening by polymerase chain reaction of Bacillus thuringiensis serotypes forthe presence of cry V-like insecticidal protein genes and characterization of acry V gene cloned from B.thuringiensis subsp.kurstaki.Appl.Environ.Microbiol.59：1683-1687；Lereclus等，1993.Diversity of Bacillusthuringiensis toxins and genes.pp.37-69 In″Bacillus thuringiensis，AnEnviromental Biopesticide：Theory and Prctice″P.F.Entwistle，J.S.Cory，M.J.Bailey and S.Higgs.Eds.John Wiley and Sons Ltd.Press，England；Shin等，1995.Distribution of cry V-type insecticidal protein genes in Bacillusthuringiensis and cloning of cry V-type genes from Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp.entomocidus.Appl.Environ.Microbiol.61：2402-2407；Kostichka等，1996.Cloning of a cry V-typeinsecticidal protein gene from Bacillus thuringiensis：the cry V-encoded proteinis expressed early in stationary phase.J.Bacteriol.178：2141-2144)，其中Cry1类对鳞翅目有毒杀虫效果，Cry2类对鳞翅目及双翅目或只对双翅目有效，Cry3类只对鞘翅目有效，Cry4只对双翅目有效，Cry5不产生结晶，部分可杀鳞翅目和鞘翅目，部分不可，CytA则是无特定杀虫作用范围，但会产生细胞溶解和溶血的效果(cytolytic and hemolytic efficiency)，其中所编码(encode)的氨基酸以cry1最多，而cytA最少。

美国专利号5,827,514与5,965,428分别批露具有杀虫作用的Cry1Ac与Cry1F不同片段的嵌合蛋白；美国专利号7,070,982更批露了Cry1Ab、Cry1Ac与Cry1F的杂合蛋白。台湾专利号224139更批露一种包含有cry1Aa、cry1Ab、cry1C与cry1D基因片段的单一菌株。由上述文献可知具有多重内毒素基因的产物的杀虫效果，远大于单一基因产物的抗害虫作用。

因此，不论是以遗传工程的方式或是天然筛选所分离的具有多重内毒素基因的菌株，仍为目前科学家所积极寻求的。

发明内容

承上所述，本发明首先提供一种抗害虫的苏云金芽孢杆菌菌株，其具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D及cry1F基因片段。

根据上述构想，其中该苏云金芽孢杆菌菌株还含有cry1Ad1基因片段。

本发明另提供一种用于控制害虫的组合物，该组合物为可接受的载体及杀虫有效量的内毒素，该内毒素得自具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D及cry1F基因片段的苏云金芽孢杆菌菌株。

根据上述构想，其中该苏云金芽孢杆菌菌株进一步含有cry1Ad1基因片段。

本发明再提供一种控制害虫的方法，其包括：对受害虫侵袭的区域或预防害虫寄生的区域施加有效量的苏云金芽孢杆菌菌株及/或具其内毒素的组合物，其特征在该苏云金芽孢杆菌菌株具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D及cry1F基因片段。

根据上述构想，其中该苏云金芽孢杆菌菌株进一步含cry1Ad1基因片段。

本发明更提供一种分离的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株A603的代谢物，苏云金芽孢杆菌A603依据布达佩斯条约，于公元2008年8月21日保藏于德国微生物菌种保藏中心，生物材料样品保藏编号为DSM 21764。

根据上述构想，其中该苏云金芽孢杆菌菌株可用于控制害虫。

根据上述构想，其中该害虫选自鳞翅目的夜蛾科、螟蛾科、卷叶蛾科以及菜蛾科所组成组的其中之一。

根据上述构想，其中该害虫为夜蛾科的甜菜夜蛾。

根据上述构想，其中该害虫为夜蛾科的斜纹夜蛾。

根据上述构想，其中该害虫为夜蛾科的粉纹夜蛾。

根据上述构想，其中该害虫为螟蛾科的豆野螟。

根据上述构想，其中该害虫为螟蛾科的粉斑螟。

根据上述构想，其中该害虫为卷叶蛾科的茶小卷叶蛾。

根据上述构想，其中该害虫为菜蛾科的小菜蛾。

为了易于说明，本发明得通过下述的较佳实施例及图示而得到充分了解，并使得熟习本技艺的人士可以据以完成，然而本发明的实施方式并不限制于下列实施例中。

附图说明

图1为本发明的苏云金芽孢杆菌菌株A603的内毒素基因型的电泳分析图；

图2为本发明的苏云金芽孢杆菌菌株A603的内毒素表达的蛋白质电泳图；

图3为本发明以PCR扩增的cry1Ad1基因产物的电泳分析图；以及

图4为以不同IPTG浓度诱导Cry1Ad1表达的蛋白质电泳分析图。

具体实施方式

本发明提供一种新颖的苏云金芽孢杆菌菌株，该苏云金芽孢杆菌菌株能够抑制害虫的生长。以下为该苏云金芽孢杆菌菌株的来源、纯化与分离方式、鉴定方式以及抗目标害虫的效果的详细说明。

菌种采集

由台湾云林县褒忠乡农会谷仓采集到的粉尘样品，每份样品约采集10克，以塑料袋封装后，保存于4℃。

菌种分离与鉴定

将每份样品取0.5克重并剧烈振荡悬浮于10毫升的无菌水中，依据Akiba与Katoh(1986.Microbial ecology of Bacillus thuringiensis V.Selectivemedium for Bacillus thuringiensis vegetative cells.Appl.Entomol.Zool.21：210-215)、Travers等(1987.Selective process for efficient isolation of soilBacillus spp.Appl.Environ.Microbiol.53：1263-1266)、Chak与Yang(1990.Characterization of the Bacillus thuringiensis strains isolated from Taiwan.Proc.Natl.Sci.Counc.B.ROC 14：175-182)以及Chilcott与Wigley(1993.Isolation and toxicity of Bacillus thuringiensis from soil and insect habitats inNew Zealand.J.Invertebr.Pathol.61：244-247)等四种方法进行分离。经热处理过的悬浮土样品，涂布于NA(nutrient agar)平板培养基上，在28℃下连续培养五天后，进行单菌落的筛选，在相差光学显微镜下，以1,500倍油镜进行观察，筛选条件为含有结晶蛋白以及孢子的菌株，分别编号后保存于4℃下(Kao等，1996.Isolation，characterization and cry gene typing ofBacillus thuringiensis isolates from stored product material samples collectedaround Taiwan，pp132-151.Proceedings，The Second Pacific Rim Conferenceon Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Impact to the Environment.November 4-8，1996.Chiang Mai，Thailand)。

菌种培养

将各个经编号的菌株，分别以无菌水悬浮稀释，在NA平板培养基以划线法，再纯化3次并确认无污染后，挑单菌落，各别移到5毫升的LB液体培养基(Luria-Bertani培养基：bacto-胰化蛋白胨1％、bacto-酵母提取物0.5％以及NaCl 1％，pH 7.0)，于恒温振荡培养箱(28℃，250rpm)过夜培养，再取0.5毫升以同条件进行继代培养(5毫升)3小时。

菌种鉴定

对继代培养后的菌株进行分析，挑选一菌株命名为A603，进行菌种型态分析与后续实验。

DNA聚合酶链式反应(PCR)与载体克隆

本发明参照Kalman等(1993.Cloning of a novel cryIC-type gene froma strain of Bacillus thuringiensis subsp.galleriae.Appl.Environ.Microbiol.59：1131-1137)所发表的各个内毒素特异性的核苷酸引物(如下所示)的组合来确认本发明的苏云金芽孢杆菌A603中的内毒素基因型。

(1)cry1Aa基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1Aa特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.2)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1Aa基因片段的存在。

(2)cry1Ac基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1Ac特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.3)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1Ac基因片段的存在。

(3)cry1B基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1B特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.4)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1B基因片段的存在。

(4)cry1C基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1C特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.5)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1C基因片段的存在。

(5)cry1D基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1D特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.6)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1D基因片段的存在。

(6)cry1E基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1E特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.7)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1E基因片段的存在。

(7)cry1F基因片段的扩增

以cry1特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.1)以及以cry1F特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.8)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1F基因片段的存在。

(8)cry1Ab基因片段的扩增

以cry1Ab正向特异性序列作为正向引物(SEQ ID NO.9)以及以cry1Ab反向特异性序列作为反向引物(SEQ ID NO.10)进行复性与PCR放大反应来确认是否有cry1Ab基因片段的存在。

(9)cry1Ad1基因全长扩增与载体克隆

发明人为进一步取得cry1Ab基因片段以进行基因重组实验，设计全长正向引物(1A29A)：ttaacaccctggatccaaaattgatattt(SEQ ID NO.11，下划线处为BamHI切割位点)与全长反向引物(1Ab37B1)：tttgcatgcatatattattcctccataagaagtaatt(SEQ ID NO.12，下划线处为SphI切割位点)(陈等人，2006.台湾苏力菌cry1Ac5杀虫基因克隆及表达.植保会刊.48：17-30)，进行复性与PCR放大反应时，意外发现电泳图上出现有别于cry1Ab基因片段的泳带。

因此，以苏云金芽孢杆菌A603质体为模板，利用SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12为引物扩增该泳带的全长基因，利用StrataClone PCRCloning Kit(Stratagene)将该泳带的基因片段构建至中间载体pSC-A后，委托波仕特生物科技股份有限公司以大片段核酸测序(primer walking)进行全长测序。测序后的结果以电脑分析比对，发现该泳带为cry1Ad1基因(全长为3704bp)(SEQ ID NO.13)，因此，将该表达载体命名为pSC-A-cry1Ad1。

(10)Cry1Ad1蛋白质的表达

以BamHI以及SphI内切酶将cry1Ad1从pSC-A-cry1Ad1载体切下来，构建至表达载体pQE82。再将表达载体pQE82-cry1Ad1转化到大肠杆菌(BL21)以进行后续蛋白质表达。

苏云金芽孢杆菌A603的内毒素基因组合

请参阅图1，其为利用上述引物对进行PCR的筛选结果。根据Kalman等(1993.Cloning of a novel cryIC-type gene from a strain of Bacillusthuringiensis subsp.galleriae.Appl.Environ.Microbiol.59：1131-1137)，已知cry1Aa、cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1D、cry1E、cry1F以及cry1Ab基因的预期的特有片段长度分别为724bp、487bp、830bp、288bp、414bp、883bp、368bp以及238bp。因此，根据图1所示的片段长度可以得知本发明苏云金芽孢杆菌A603具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D以及cry1F的内毒素多重基因片段。图1的M为DNA梯形带(DNA ladder)，单位为碱基对(base pair，bp)，作为DNA分子量标准品。

再请参阅图2，其为苏云金芽孢杆菌菌株A603全蛋白的电泳分析图。由图2所示的结果可以得知苏云金芽孢杆菌菌株A603确实能够表达内毒素蛋白，且其分子量约为130kDa。并且，经由内毒素活性的试管试验(未显示)可以得知苏云金芽孢杆菌菌株A603所表达的内毒素确实具有抗害虫的活性。图2的M为蛋白质标记，单位为千道尔顿(kilodalton，kDa)，作为蛋白质分子量标准品。

请参阅图3，其为PCR扩增的cry1Ad1基因产物的电泳分析图，可以得知该基因全长为3704bp。测序后的结果请参阅序列表的SEQ ID NO.13。图4则为将表达载体转化到大肠杆菌后，以不同浓度的IPTG诱导后的Cry1Ad1表达情况。图3的M为另一种DNA梯形带(DNA ladder)，单位为千碱基对(kilo base pair，kb)，同样作为DNA分子量标准品。由图4的结果可以得知，Cry1Ad1确实能够大量表达。并且，经由内毒素活性的试管试验(未显示)可以得知苏云金芽孢杆菌菌株A603所表达的Cry1Ad1内毒素具有抗害虫的活性。图4的M为蛋白质标记，单位为千道尔顿(kilodalton，kDa)，作为蛋白质分子量标准品。

苏云金芽孢杆菌A603抗目标害虫的活性

本发明更进一步提供一种具有杀虫作用的组合物，其中该组合物包含有效量的苏云金芽孢杆菌菌株A603的培养物以及可接受的载体。并且，该培养物中包含有内毒素。采用工业上的标准培养方法及发酵方式放大本发明的苏云金芽孢杆菌菌株A603或其变异株。再将发酵后的培养物进行试验以确认其抗目标害虫的效果。

实施例一：甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)

大量发酵苏云金芽孢杆菌A603后，取5公升的发酵培养物进行连续稀释后，将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法测试处理甜菜夜蛾第三龄初幼虫连续120小时后的生物活性(每组实验的供试虫数为20只，有更换饲料连续观察)，记录以苏云金芽孢杆菌处理前后的死亡虫数后，计算幼虫死亡率。

请参阅表一，其为苏云金芽孢杆菌A603对于甜菜夜蛾的死亡率测试数据。由此结果可以得知苏云金芽孢杆菌A603确实具有害虫致死效果。

表一、苏云金芽孢杆菌A603发酵培养物抗甜菜夜蛾的活性数据

注：样品效价(IU/mg)＝[(Bta标准品LC₅₀)/(样品LC₅₀)]×Bta标准品效价(IU/mg)，测试昆虫为粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。

实施例二：斜纹夜蛾(Spodoptera litura)

试验处理方式同实施例一。将稀释浓度后的发酵培养物以饲料混拌法测试处理斜纹夜蛾第三龄初幼虫连续120小时(每组实验的供试虫数为20只，有更换饲料连续观察)，记录以苏云金芽孢杆菌处理前后的虫重以及死亡虫数等生长情况。

请参阅表二，其为苏云金芽孢杆菌A603对于斜纹夜蛾的活性抑制数据。处理前斜纹夜蛾的平均虫重为0.0025克。成长倍数为处理后平均虫重除以处理前平均虫重。抑制率(％)为对照组的平均虫重减处理组的处理后平均虫重的差值除以对照组的平均虫重。根据表二的结果得知于相同稀释倍数下，经由苏云金芽孢杆菌A603处理后的幼虫成长倍数降低，同时抑制率也高于市售商品殊立菌(Dipel)，因此其确实具有抗斜纹夜蛾幼虫的能力。

表二、苏云金芽孢杆菌A603发酵培养抗斜纹夜蛾的活性数据与市售商品殊立菌(Dipel)的比较

殊立菌(Dipel)

注：样品效价(IU/mg)＝[(Bta标准品LC₅₀)/(样品LC₅₀)]×Bta标准品效价(IU/mg)，测试昆虫为粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。

实施例三：豆野螟(Maruca vitrata)

试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理豆野螟第二龄与第三龄初幼虫连续120小时(每个浓度五只幼虫，不更换饲料连续观察)，记录第24至120小时间死亡虫数的情况。

由表三致死率的分布结果可以得知苏云金芽孢杆菌A603于处理幼虫96小时后，即使在低处理浓度下，也能达到将近50％抗豆野螟幼虫的能力。

表三、苏云金芽孢杆菌A603发酵培养物抗豆野螟的活性数据

实施例四：粉斑螟(Ephestia cautella Walker)

试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理粉斑螟孵化14天的幼虫连续120小时(每个浓度十只幼虫，每个浓度三重复，不更换饲料连续观察)，并且以市面上常用的殊立菌同时进行测试，分别记录其120小时后死亡虫数的情况。

由表四死亡率的结果可以得知苏云金芽孢杆菌A603相对于市售商品殊立菌(Dipel)，具有较佳的抗粉斑螟幼虫能力。

表四、苏云金芽孢杆菌A603发酵培养物对于抗粉斑螟的活性数据

实施例五：茶小卷叶蛾(Adoxophyes sp.)

试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理茶小卷叶蛾第三龄初幼虫连续120小时(每个浓度十只幼虫，每个浓度三重复，不更换饲料连续观察)，记录死亡虫数的情况后，计算幼虫死亡率。

由表五死亡率的结果可以得知苏云金芽孢杆菌A603于144小时后，即使于低处理浓度下，也可达到50％的抗茶小卷叶蛾幼虫的能力。

表五、苏云金芽孢杆菌A603发酵培养物对于抗茶小卷叶蛾的活性数据

实施例六：小菜蛾(Plutella xylostella)

试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理小菜蛾第三龄初幼虫连续72小时(每个浓度十只幼虫，每个浓度五重复，更换饲料连续观察)，分别记录其72小时后死亡虫数的情况后，计算幼虫死亡率。

由表六死亡率的结果得知苏云金芽孢杆菌A603确实具有抗小菜蛾幼虫的能力。

表六、苏云金芽孢杆菌A603发酵培养物对于抗小菜蛾的活性数据

实施例七：粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)

试验处理方式同实施例一。将不同稀释浓度的发酵培养物以饲料混拌法分别测试处理粉纹夜蛾第二龄初幼虫连续72小时(每个浓度十只幼虫，每个浓度五重复，更换饲料连续观察)，分别记录其72小时后死亡虫数的情况。

由表七死亡率的结果得知苏云金芽孢杆菌A603于不同浓度的处理下，其相对于市售商品见达立(Xentari)和殊立菌(Dipel)具有较佳的抗粉纹夜蛾幼虫的能力。

表七、苏云金芽孢杆菌A603发酵干物对于抗粉纹夜蛾的活性数据

综上所述，本发明所分离纯化的苏云金芽孢杆菌A603确实为新颖的苏云金芽孢杆菌菌株，其含有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D、cry1F以及cry1Ad1等内毒素基因片段。并且，本发明的苏云金芽孢杆菌菌株A603能够抗甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、豆野螟、粉斑螟、茶小卷叶蛾、小菜蛾以及粉纹夜蛾等害虫的能力。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。故凡依本发明申请专利范围所述的形状、构造、特征及精神所做的均等变化或修饰，均应包括于本发明的申请专利范围内。

序列表

<110>行政院农业委员会农业药物毒物试验所

<120>抗害虫的新颖苏云金芽孢杆菌菌株

<160>13

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1基因的特异性序列

<400>1

atcactgagt cgcttcgcat gtttgacttt ctc

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1Aa基因的特异性序列

<400>2

gagccaagca gctggagcag tttacacc

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1Ac基因的特异性序列

<400>3

tcacttccca tcgacatcta cc

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1B基因的特异性序列

<400>4

gtcaacctta tgagtcacct gggcttc

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1C基因的特异性序列

<400>5

caacctctat ttggtgcagg ttc

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1D基因的特异性序列

<400>6

ggtacattta gatattcaca gccac

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1E基因的特异性序列

<400>7

cttagggata aatgtagtac ag

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1F基因的特异性序列

<400>8

ccggtgaccc attaacattc caatc

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1Ab基因的正向特异性序列

<400>9

ggtcgtggct atatccttcg tgtcacagc

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1Ab基因的反向特异性序列

<400>10

gaattgcttt cataggctcc gtc

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1Ab基因的全长正向特异性序列

<400>11

ttaacaccct ggatccaaaa ttgatattt

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cry1Ab基因的全长反向特异性序列

<400>12

tttgcatgca tatattattc ctccataaga agtaatt

<210>13

<211>3704

<212>DNA

<213>苏云金芽孢杆菌

<220>

<223>cry1Ad1基因的全长序列

<400>13

ttaacaccct ggatccaaaa ttgatattta gtaaattcgg ttgcactttg   50

tgtatatttt cataagatga gtcatatgta ttaaactgtg gtgaaaaaca  100

gcaacatagt ataagaactt ttgtatttca ataaaaaatg gaggtatttt  150

atggagataa tgaataatca gaatcaatgc gttccttata actgtttgaa  200

tgatccgaca attgaaatat tagaaggaga aagaatagaa actggttaca  250

ccccaataga tatttccttg tcgctaacgc aatttctgtt gagtgaattt  300

gtcccacgtg ctgggtttgt attaggttta attgatttaa tatgggggtt  350

tgtgggtccc tctcaatggg atgcatttct tgtgcaaatt gaacagttaa  400

ttaaccaaag aatagaggaa ttcgctagga accaagcaat ttctagatta  450

gaagggctaa gcaaccttta tcaaatttac gcagaagctt ttagagagtg  500

ggaagcagat cctactaatc cagcattaac agaagagatg cgtattcagt  550

tcaatgacat gaacagtgct cttacaaccg ctattcctct ttttacagtt  600

caaaattatc aagtacctct tctatcagta tatgttcaag ctgcaaattt  650

acatttatcg gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa cgttggggat  700

ttgatgtagc aacaatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt  750

ggcacctata cagattatgc tgtacgctgg tataatacgg gattagaacg  800

tgtatgggga ccggattcta gagattgggt aaggtataat caatttagaa  850

gagagctaac actaactgta ttagatatcg tttctctgtt cccgaactat  900

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ttatacaaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt cgtggaatgg 1000

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aggacatcaa ataacagctt ctcctgtcgg ttttgcgggg ccagaattta 1150

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ttacgtcaca ctaccgggta cctttaatga gtgttatcct acgtatctgt 2350

atcaaaaaat agatgagtcg aaattaaaag cctatacccg ttaccaatta 2400

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caatacaaaa cacgaaacag taaatgtgcc aggtacgggt tccttatggc 2500

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gaaaccatta gtaggcgaat cgttagcacg cgtgaagaga gcggagaaga 2800

agtggagaga caaacgagag aaattgcaag tggaaacaaa tatcgtttat 2850

aaagaggcaa aagaatctgt agatgcttta tttgtgaact ctcaatatga 2900

tagattacaa gcggataccg acatcgcgat gattcatgcg gcagataaac 2950

gcgttcatcg aattcgagaa gcatatcttc cagagttatc tgtaattccg 3000

ggtgtcaatg cgggcatttt tgaagaatta gagggacgta ttttcacagc 3050

ctactcttta tatgatgcga gaaatgtcat taaaaatggc gatttcaata 3100

atggcttatc atgctggaac gtgaaagggc atgtagatgt agaagaacaa 3150

aacaaccacc gttcggttct tgttgtcccg gaatgggaag cagaggtgtc 3200

acaagaggtt cgtgtctgtc caggtcgtgg ctatatccta cgtgttacag 3250

cgtacaaaga gggatatgga gaaggttgcg taacgattca tgagatcgaa 3300

gacaatacag acgaactgaa attcagcaac tgtgtagaag aggaagtata 3350

tccaaacaac acggtaacgt gtaatgatta tactgcaaat caagaagaat 3400

acgggggtgc gtacacttct cgtaatcgtg gatatggtga atcttatgaa 3450

agtaattctt ccataccagc tgagtatgcg ccagtttatg aggaagcata 3500

tatagatgga agaaaagaga atccttgtga atctaacaga ggatatgggg 3550

attacacgcc actaccagct ggttatgtga caaaagaatt agagtacttc 3600

ccagaaaccg ataaggtatg gattgagatc ggggaaacgg aaggaacatt 3650

catcgtggat agcgtggaat tacttcttat ggaggaataa tatatgcatg 3700

caaa 3704

Claims (8)

1.一种拮抗害虫的苏云金芽孢杆菌菌株，其生物材料样品保存编号为DSM21764，其具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D、cry1F及cry1Ad1基因片段，且该害虫选自夜蛾科、螟蛾科、卷叶蛾科以及菜蛾科所组成组的其中之一。

2.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其中该夜蛾科的昆虫包括甜菜夜蛾、斜纹夜蛾及粉纹夜蛾。

3.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其中该螟蛾科的昆虫包括豆野螟及粉斑螟。

4.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其中该卷叶蛾科的昆虫包括茶小卷叶蛾。

5.如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株，其中该菜蛾科的昆虫包括小菜蛾。

6.一种控制害虫的方法，其包括下列步骤：

对受害虫侵袭区域与预防害虫寄生区域的其中之一施加有效量的苏云金芽孢杆菌菌株的培养物，其中该苏云金芽孢杆菌菌株的生物材料样品保存编号为DSM21764，其具有cry1Aa、cry1Ab、cry1C、cry1D、cry1F及cry1Ad1基因片段，且该害虫选自夜蛾科、螟蛾科、卷叶蛾科以及菜蛾科所组成组的其中之一。

7.如权利要求6所述的方法，其中该苏云金芽孢杆菌菌株用于控制害虫、制备抗虫害或控制害虫的代谢物、制备抗虫害的组合物其中之一。

8.如权利要求7所述的方法，其中该代谢物为内毒素。

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