JPS61172806A - 生物学的殺虫剤の細胞カプセル化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 従来の技術と問題点 農業生産性の驚異的な向上は、農業関連の諸方結果であ
る。最後に挙げた殺虫剤については、環境へのマイナス
効果のため有害な面がないわけではなかった。従って、
環境上受は入れられる効果的な殺虫剤の開発は、現実的
な関心事である。

生態学的に受は入れられる殺虫剤の中に、ムシラス・ス
リンギエンシスのような種々の微生物によってつくられ
る蛋白質毒素・がある。しかし、Ｂスリンギエンシスの
溶菌液や胞子を殺虫剤として使うのは、著しい欠点があ
った。殺虫剤の寿命が環境中で比較的短く、適当に保護
するには複合的な施用を必要とする。そのため、これら
の殺虫剤は長期の残留活性をもつ従来の化学製品に比べ
て経湾的ではない。田畑での長期効力を改良することは
、生物学的又は蛋白質性の毒素に基づく殺虫剤の応用を
拡大するのに大きな助けになるであろう。

上に示したように、殺虫剤には特定の施用に関連して多
くの必要条件がある。例えば、多くの場合、環境に蓄積
せずに田畑で長い残留活性をもつ殺虫剤が望ましい。更
に経湾的配慮からは、適度に広い範囲の生物活性をもつ
殺虫剤が好ましい。

また殺虫剤は、環境上受は入れられる分解生成物まで分
解していくものでなければならない。他の考慮すべき点
としては、処方の容易さ、Ｑ虫剤活性、光・水・生物等
の環境的影響に対する安定性及び環境中の有益生物や無
害な生物への影響がある。

ウェスト（Ｗｅｓｔ）、　５ｏｉｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｓ、　　（１９８４年）１６巻３５７−３６０
頁は土壌中におけるＢ、Ｌ毒素の持続性に関する研究結
果について報告している。

またウェストら、　Ｊ、ｏｒ　ＩｎＶｅｒｔｅｂｒａｔ
ｅ　ｐａｔｈｏ＋ｏｏｙ（１９８４年）４３巻１５０−
１５５頁も参照のこと。合衆国特許第４，２６５，８８
０号は、］アセルベートのマイクロビーズ中に生きた殺
虫剤病原体を埋め込むことを記述している。日本特許第
５１−５０４７号は毒性を保持しながら８．スリンギエ
ンシス胞子を殺す物理化学的方法を記述している。

問題解決手段 農作物と農業製品を害虫から保護する方法及び組成物が
明らかにされている。本発明のある面で毒素（殺虫剤）
生産生物の細胞全体、すなわち溶菌していないものを、
目標害虫環境への細胞施用時に細胞内につくられる毒素
の活性が持続するような試薬で処理している。本発明の
もう一つの面で、細胞宿主へ非相同遺伝子を導入するこ
とによって殺虫剤がつくられる。非相同遺伝子の発現の
結果、直接的又は間接的に殺虫剤が細胞内で生産され保
持される。上記のように目標害虫環境への細胞施用時に
つくられる毒素の活性を持続させるような条件下に、こ
れらの細胞を処理する。生ずる生成物は毒素の毒性を保
持している。次に目標害虫のいる環境、例えば土壌、水
及び植物の葉に施用するための慣用技術に従って、天然
にカプセル化されたこれらの殺虫剤を処方できる。

本発明に従って、天然に生ずる殺虫剤生産微生物、又は
宿主中に発現できる非相同遺伝子を担った殺虫剤生産微
生物で、発現の結果、直接周接に殺虫剤を生産するもの
を変更することによって、池の利点の中でも特に長期の
残留寿命をもつ改良された殺虫剤が提供されている。本
発明は目標害虫環境への細胞施用時に、細胞内につくら
れる毒素の活性を持続させるような試薬で生物を処理す
ることを含む。生ずる生成物は毒素の毒性を保持してい
る。

細胞内で、特に細菌等の原核生物や、カビ、例えばアカ
パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ、ｒａ）とコウジカヒ（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のような酵母と糸状菌を例とす
る真核生物、又はアメーバ、臘生動物、藻類のような原
生生物などの単細胞微生物中で生産できることを特徴と
する広範囲の殺虫剤が生産できる。

これらの殺虫剤は微生物でつくられる任意の毒素であり
うる。例えば殺虫剤は鞘翅目、鱗翅目、双翅目、半翅目
、革翅目、及び直翅目等の昆虫、又はクモ形綱、腹足頚
、又は線虫やへん平動物等の嬬虫のような真核性の多細
胞害虫に対して毒性をもつポリペプチドでありうる。感
受性のある種々の昆虫はカプトムシ、ガ、ハエ、バッタ
、シラミ及びハサミムシを包含する。

宿主細胞中でつくられる殺虫剤は、活性型でつくられる
ポリペプチドか、又は８スリンギエンシス・バラエティ
・クルスタキの結晶毒素の場合と同様、害虫などによる
毒素活性の処理をなおも必要とする前駆型である。この
ため、遺伝子は殺虫剤組成物をつくるために代謝物を変
更するような酵素を暗号化できる。

天然に生ずる毒素には、鱗翅目に対して活性のあるＢス
リンギエンシス・バラエティ・クルスタキ、蚊に対して
活性のあるＢ［バラエティ・イスラエレンシス、鞘翅目
に対して活性のある８［Ｈ−７、スボドブテラ（Ｓｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ　）に対して活性のあるａスリンギエン
シス・バラエティ・アイザワイ及び蚊の幼虫に活性のあ
る８スフ？エリクスがある。池の毒素はボーバリアφバ
ッジアナ（Ｂｅａｕｖｅ−ｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ）
のボーバリンやメタリジウム（Ｈｅ−ｔａｒｈｉＺｉｌ
Ｊｌ）　Ｓｐｐのデストラキシンのような昆虫病原性の
カビのもの、又はストレプトミセス・アバーミチルス（
ＳｔｒｅｐｔＯｌｙＣｅＳ　ａＶｅｒ’１ｉｔｉｌｕｓ
）のアパーメクチン類のような広範囲の殺虫化合物を包
含している。上の例となる培養基は次の通りである。

バシラス・スルンギエンシス拳バラエティ串りルスタキ
ＨＤ−１（ＮＲＲＬ　Ｂ−３７９２、合衆国特許第４、
４４８、Ｂ．８５号）。

ａスリンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシス（
ＡＴＣＣ３５６４６）　。

ＢスリンギエンシスＨ−７（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９３９
＞　。

Ｂスリンギエンシス・バラエティ・デネブリオニス（Ｄ
ＳＨ２８０３）。

以下のＢ、スリンギエンシス培養基は、テキサス州ブラ
ウンスピルの合衆国農務省（ＵＳＤＡ　）から入手でき
る。請求は、７８５２０合衆国テキサス州ブラウンスピ
ル、私書箱１０３３号、農務省農業研究局。

綿昆虫研究部、ショー・ガルシア宛で。

８スリンギエンシス・バラエテ、イＨＤ２８スリンギエ
ンシス番バラエティ・フイニテイムスＨＤ３ ８スリンギエンシス・バラエティ・アレステイＤ４ ａ、スリンギエンシス・バラエティ・クルスタキ）ＩＩ
）７３ ａスリンギエンシス・バラエティ・ソットーＨＤ８スリ
ンギエンシス・バラエティ・デンドロリムスＨＤ７ Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・ケニレエ）１０ａ
スリンギエンシス・バラエティ・ガレリアエＤ２９ ａスリンギエンシス・バラエティ・カナデンシスＨＤ２
２４ ａ、スリンギエンシス・バラエティ・エントモシダスＨ
Ｄ９ ８スリンギエンシス・バラエティ・スブトキシクスＨＤ
１０９ ８スリンギエンシス・バラエティ・アイザワイＤ１１ Ｂスリンギエンシス争バラエティφモリソニＨＤａスリ
ンギエンシス・バラエティ・オストリニアエＨＤ５０１ ８スリンギエンシス・バラエティ・トルウォルシ１Ｉ９
５３７ ａ、スリンギエンシス・バラエティ・ダルムシュタディ
エンシスＨＤ１４６ Ｂ、スリンギエンシス・バラエティ・トマノフィＤ２０
１ ８スリンギエンシス・バラエティ・キュウシュウエンシ
スＨＤ５４１ Ｂ、スリンギエンシス・バラエティ・トンプソニＤ５４
２ ａスリンギエンシス・バラエティ・パキスタニ８スリン
ギエンシス争バラエテイ・イスラエレンシスＨＤ５６７ Ｂスリンギエンシスφバラエティ・インディアナＨＤ５
２１ ８スリンギエンシス・バラエティ・ダコタａ、スリンギ
エンシス・バラエティ・トーホクエンシスＨＤ８６６ ８スリンギエンシス・バラエティ・クマモトエンシスＨ
Ｄ８６７ Ｂ、スリンギエンシスφバラエティ・トチギエンシスＨ
Ｄ８６８ ａスリンギエンシス・バラエティ・コルメリＨ［）Ｂス
リンギエンシス・バラエティ・ウハネンシスＨＤ５２５ バシラス・セレウス、　ＡＴＣＣ２１２８１バシラス・
モリタイ、　ＡＴＣＣ２１２８２バシラス・ボピリアエ
、　ＡＴＣＣ１４７０６バシラス・レンチモルブス、　
ＡＴＣＣ１４７０７バシラス・スファエリクス、ＡＴＣ
Ｃ３３２０３ボーベリア・バッジアナ、　ＡＴＣＣ９８
３５メタリジウム・アニソプリアエ（ｔ４．ａｎｉｓｏ
ｐｌ　１ａｅ）ＡＴＣＣ２４３９８ メタリジウム・フラボビリデ（Ｈ，ｒｌａｖｏｖｉｒｉ
ｄｅ）ＡＴＣＣ３２９６９ ストレプトミセス・アバーミチルス、　ＡＴＣＣ３１２
６７毒素は天然に生ずる毒素と同じである必要はない。

ポリペプチド毒素は天然に生ずる毒素の断片でもよく、
又アミノ酸の２％以下を変更した欠失。

塩基転換又は塩基転位などの突然変異の発現生成物、又
は意図された害虫宿主による加工処理の可能な繰り返し
配列のものでありうる。更に例えば毒素の蛋白質分解を
減少させるためにＮ−末端に１個、５個又はそれ以上の
アミノ酸が提供されている融合生成物をつくることがで
きる。ある場合には、複数の同じ又は異なる毒素を暗号
化し発現させ、その場合にポリトキシンの各毒素部分の
間に処理位置を導入できる。

宿主細胞の例は、＠乳類のような高等生物に有毒な物質
をつくらない細胞に通常限定された原核生物又は真核生
物を包含している。しかし、高等生物に有毒な物質をつ
くる生物でも、毒素が不安定であるか、又は使用水準が
哺乳類宿主に有毒となる可能性を避けるほど十分低い場
合は使用できる。宿主として特に興味あるものは、原核
生物とカビのような下等な真核生物である。グラム陰性
及びグラム陽性の原核生物の例、シま、エシェリヒア（
ＥＳＣｈｅｒｉＣｈｉａ）属、エルビニア菌（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ザルモネ
ラ（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　Ｉ　−Ｉａ　ｌ属、及びプロテ
ウス（ＰｒＯｔｅｕｓ）属のような腸内細菌科；バシラ
ス科；リゾビウムなどのりゾビウＬ＼科；発光細菌、ザ
イモモナス（Ｚｙｓｏｎ＋ｏｎａｓＪ属、セラチア（Ｓ
ｅｒｒａｔｉａｌ属、アエロモナス（Ａｅｒｏｓｏｎａ
ｓ）属、ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ）属、デスルホごブリ
オ（Ｄｅ−ｓｕｌｒ６ｖｉｂｒｉｏ）ｊ！、スピリルム
（Ｓｌ）ｉｒｉｌｌＵＩｌ）属のようならせん科；乳酸
杆菌科；シュードモナス属とアセトバクター（Ａｃｅｔ
ｏｂａｃ　ｔｅｒ）属のようなシュードモナス科；アセ
トバクター科及びニトロバクタ−科を包含する。真核生
物には藻菌類と子のう菌類のようなカビ類があり、これ
らはサツカロミセス（ＳａＣＣｈａｒＯｌｌｙＣｅＳｌ
属とスキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属のような酵母、及びロドトルラ（Ｒ
ｈｏｄｏｔｏｒｕ　ｌａ）属、アウレオバシジウム（Ａ
ＵｒｅＯｂａＳｉｄｉＵｌｌ）属、スポロボロミセス（
ＳｐＯｒＯ−ｔ）ｏｒｏｉｙｃｅｓ）属等のような担子
菌類酵母を包含している。

生産の目的で宿主細胞を選択する上で特に興味ある特性
は、非相同遺伝子を宿主へ導入するのが簡便なこと、発
現系が入手しやすいこと、発現の能率、宿主中での殺虫
剤の安定性、及び補助的な遺伝的可能性の存在を包含す
る。殺虫剤のマイクロカプセルとして使うための興味あ
る特性としては、厚い細胞壁や色素、細胞内包み込み又
は封入体の形成のような殺虫剤保護性１葉の親和性、＠
乳類毒性の欠如、毒素に被害を与えずに細胞殺菌・固定
しやすいこと等がある。他の考慮する点は処方と取扱い
の容易さ、経湾性、貯蔵安定性等を包含している。

特に興味ある宿主生物は、ロドトルラ種、アウレオバシ
ジウム種、サツカロミセス種及びスポロボロミセス種等
の酵母；シュードモナス種、エルビニア種及びフラボバ
クテリウム種のようなフィロプレーン（ｐｈｙｌ　Ｉｏ
ｐｌａｎｅ）生物：又はエシェリヒア、乳酸杆菌種、バ
シラス種等の他の生物を包含する。特定的な生物は緑膿
菌（Ｐｓｅｕｄｏａｏｎａｓ　ａｅｒｕ−ｇｉｎｏｓａ
）　、シュードモナス・フルオレッセンス、サツカロミ
セス・セＬ／　ｔ：’　シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃ
ｅｓ　ｃｅ−ｒｅｖｉｓｉａｅ）　、バシラス・スリン
ギエンシス、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　、枯草菌（Ｂ
、　５ｕｂ）等を包含する。

細胞は通常無傷のものであり、殺菌時には胞子型よりは
実質的に増殖型にあるが、場合によっては胞子も使用で
きる。

細胞は種々の方法で増殖を抑制できるが、但しその手法
が殺虫剤性状に悪影響せず、殺虫剤を保護する細胞能力
を打ち消すものであってはならない。手法としては物理
的処理、化学的処理、細胞の物理的性質を変えるもの、
又は細胞の物理的性質を実質的に無傷に保つものなどが
ある。

宿主細胞を不活性化する種々の技術は加熱（通常５０℃
ないし７０℃）、冷凍、紫外線照射、凍結乾燥、毒素、
例えば抗生物質、フェノール、アニリド類、例えばカー
バニリドとサリチルアニリド。

ヒドロキシコリア、第四級塩類、アルコール、抗菌染料
、　Ｅ［）ＴＡ及びアミジン類、ハロゲン化剤例えば塩
素化剤、臭素化剤又は沃素化剤のような非特巽的な有機
・無機化学薬品、アルデヒド類、例えばグルタルアルデ
ヒド又はホルムアルデヒド、オゾン及びエチレンＡキシ
ドのような有毒ガス、過酸化物、プソラレン類、乾燥剤
等を包含し、これらを個々に、又は組み合わせて使用す
る。薬剤の選択は特定殺虫剤、宿主細胞の性質、架橋剤
で細胞壁を固定し保存するなど細胞構造の変更の性質に
依存するであろう。

細胞は一般に強化された構造安定性をもち、畑での環境
分解に対して抵抗力が高くなっている。

殺虫剤が前駆型の場合は、目標病原体によって前駆型が
成熟型の殺虫剤に加工処理されるのを抑制しないように
不活性化方法を選択すべきである。

例えば、ホルムアルデヒドは蛋白質を架橋し、ポリペプ
チド殺虫剤の前駆型の処理を抑制することがある。不活
性化又は殺菌の方法は、毒素の生物学的利用率又は生物
活性の少なくとも実質的な部分を保持する。

非相同遺伝子は染色体外で維持されるか、又は宿主ゲノ
ムに組み込まれるが、いずれにしても任意慣用の方法で
宿主に導入される。（非相同とは遺伝子が導入先の宿主
にないものか、又はその遺伝子がそのような宿主中に通
常見い出されないものであることを意図している。すな
わら、宿主生物と非相同遺伝子源が情報交換するとして
も、非相同遺伝子は自然界の野生型宿主細胞中に通常見
当らない。普通、非相同という用語は宿主及び遭伝子源
として異なる属の種について使われる。）プラスミド、
ウィルス又は動原体からの複製系を安定維持用の自律複
製分節（ａｌＪｔｏｎｏＩＩＯＵｓ　ｒｅｐｌｉ−ｃａ
ｔｉｎｇ　５ｅＨｅｎｔ、　ａｒｓ）と組み合わせた種
々の構造体を使用できる。組込みのみを望んでいる場合
には、構造体は複製を提供するもので、トランスボゾン
であるか、又はトランスポゾン様の挿入活性をもつもの
か、又は宿主ゲノムとの相同を提供するものを使用でき
る。宿主染色体又はプラスミドのゲノム中の配列と相同
な配列間に非相同遺伝子をもつＩ）ＮＡ配列が、しばし
ば使用される。非相同遺伝子が複数コピーで存在するの
が望ましい。例として合衆国特許第４，３９９，２１６
号を参照。こうして、非相同遺伝子の導入には形質導入
、トランスフエクンヨン及び形質転換を使用できる。

ベクター類は、Ｃｏｌ［ｌ：１　、　Ｐ−１非相合性プ
ラスミド類１例えばｐＲに２９０、酵母２ｍμプラスミ
ド、ラムダ等のような真核生物及び原核生物の複製系に
依存する多数のものが、現在入手できる。

染色体外の要素を使用する場合は、　ＤＮＡ　＃ｌｉ造
体が標識遺伝子を含み、ｍ造林を含有する宿主細胞の選
定ができるようにするのが望ましい。標識は生物を殺す
物質に対する耐性１例えば抗生物質耐性や重金属耐性、
また栄養要求宿主に基本栄養性を与える相補性などを提
供するものが一般的である。複製系は、ランナウェイ複
製のような特別な性状を与えるもの、　ＣＯＳ　細胞に
関係するもの、又は他の特徴をもつものでありうる。

非相同遺伝子は、宿主細胞によって認識される転写及び
闘訳の開始終了についての調節信号をもっているが、非
相同遺伝子と連携してこれらの調節特徴を使うとうまく
いくことが多い。しかし。

例えばリーダー配列を除くか、殺虫剤の成熟型を暗号化
した配列を提供するなどのように、非相同遺伝子を変更
する場合や、遺伝子全体を前駆物質に対して暗号化する
場合には、天然のものとは異なる転写開始の調節配列が
提供されるようにＤＮＡ配列を操作する必要がしばしば
起る。

広範囲の宿主に対して広範囲の転写開始配列が存在する
。配列は殺虫剤の構成表現又は調節表現を提供でき、そ
の場合調節は代謝物質など化学物質や、温度、調節可能
なリプレッサーによって誘導できる。例として合衆国特
許第４，３７４，９２７号を参照のこと。プロモーター
の特定的な選択は、プロモーターの強さ、細胞生存度に
対するプロモーターの干渉、細胞に内在する調節機構の
プロモーターに対する影響など、多くの因子に左右され
よう。多数のプロモーターが商業的なものを含めた種々
の給源から入手できる。

非相同殺虫剤遺伝子を、含有する細胞宿主は、任意慣用
の栄養培地で生育できる。培地中でＤＮＡ　ＭＩｆ造体
は選択的な利点を提供し、全部又は実質的に全部の細胞
が非相１２ｉ］遺伝子を保持するように選択培地を生じ
させる。次に、これらの細胞は慣用の方法で収穫され、
上記のように種々の方法で変更できる。その代わりに、
細胞を取り入れる前に固定できる。

毒素を含んだ宿主生物を処理する方法は、多くの役割を
果たすことができる。第一に１ＭＩＪ造の一体性を強め
ることができる。第二に、蛋白質分解に対する感受性を
低下させるように毒素を変更することによって、また細
胞内に天然に存在するプロテアーゼの蛋白質分解活性を
減少させることによって、毒素の蛋白質分解安定性が強
化される。

無傷の段階で、毒素蛋白質の実質的な蓄積があった時に
細胞を変更するのが好ましい。これらの変更は広いスペ
クトラムの化学的安定性をもつ化学試薬を使用するなど
１種々の方法で達成できる。

無傷の細胞をかきまぜながら、又はかきまぜないで、約
−１０ないし６０℃の範囲の温度で、化学試薬を含有す
る液体試薬培地と一緒にすることができる。反応時間は
経験的に決定でき、試薬と反応条件により広範囲にわた
る。細胞濃度は１当り約１０［２ないしｌ０ＥＩＯの範
囲にある。

ｊヒ学試薬として特に興味あるものはハロゲン他側、特
に原子番号１７−８０のハロゲン類である。更に詳しく
は、望んでいる結果を達成するのに十分な時間の間、温
和な条件下に沃素を使用できる。

池の適当な手法はホルムアルデヒドとグルタルアルデヒ
ドのようなアルデヒド類、ゼフィランクロライトとセチ
ルピリジニウムクロライドのような抗感染薬、イソプロ
ピルとエタノールのようなアルコール類、７７ン（Ｂｏ
ｕｉｎ）固定剤とへＩＪ　−（Ｈｅ−１１ｙ）固定剤の
ような種々の病理学固定剤［フマソン、グレッチェン・
し、「動物組織技法ｊ　（Ａｎｉ−−ａｌ　Ｔｉ５ｓｕ
ｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　（Ｗ、Ｈ，フリーマン社
、１９６７年）を参照コでの処理や、目標害虫環境への
細胞施用時に細胞中につくられる毒素の活性を持続させ
るような物理的処理（熱）と化学剤との組合せを包含す
る。

沃素でのハロゲン化では、温度は概して約０ないし５０
℃の範囲にあるが１反応を室温で行なうのが好都合であ
る。沃素化は、酸性の水性媒体、特に約０．５−５８の
範囲のカルボン酸水溶液中における０５ないし５ｘの三
沃化物又は沃素を使用して、都合よ〈実施できる。酢酸
を使うのが好都合であるが、概して約１−４個の炭素原
子の他のカルボン酸類も使用できる。反応時間は一般に
１分未満から約２４時間、＠通には約１ないし６時間の
範囲にある。任意の残留沃素は、ジチオナイト、チオ硫
酸ナトリウムのような還元剤、又は畑での最終的使用で
両立できる他の還元剤、との反応によって除去できる。

更に、変更された細胞は、反応媒体の全部を除くための
洗浄や、乾燥型での中離、及び当業者に周知のように農
業用に一般に利用される典型的な粘着剤、展着剤、助剤
との処方などの処理にかけることができる。

特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬である。

この目的には幾つかの試薬が知られている。この処理で
殺虫剤の安定性が強まるものでなければならない。すな
わち、畑の条件下に殺虫剤の持続性又は残留活性が強化
されるべきである。

従って、未処理細胞の殺虫剤活性が消滅する条件下で、
処理細胞の活性は１−３倍長い期間の間、持続する。細
胞は種々の方法で処方できる。ｐ！Ａ機鉱物（フィロ珪
酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は植物材料（トウ
モロコシ穂軸の粉末、米のもみ殻、クルミの殻等）のよ
うな種々の不活性材料と混合することによって、水和剤
、粒剤又は粉剤としてこれらを使用できる。処方剤は展
着・粘着助剤、安定剤、他の殺虫添加物、又は表面活性
剤を包含できる。液体処方剤は水性基盤が非水性のもの
で、フオーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として施用できる
。成分には流動剤、表面活性剤、乳化剤１分散剤又は重
合体を包含できる。

殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特にそれが濃縮液か直
接使用されるかにより、大幅に変わる。

殺虫剤は少なくとも１重量％の量で存在し、１００季量
χも可能である。乾燥処方剤は約１−９５重Ｎ％の殺虫
剤をもつが、液体処方剤は概して液体相に約１−６０重
量％の固体がある。処方剤は一般にｒａｇ当り約１０Ｅ
２ないし約１０Ｅ４の細胞をもつ。これらの処方剤は、
ヘクタール当り約２オンス（液体又は乾燥）ないし２ボ
ンド以上で施用されよう。

処方剤は害虫環境に、例えば植物、土壌又は水に、噴霧
、散布、散水等によって施用される。

以下の実施例は例示のために提供されており。

限定のためではない。

実施例１ （自家溶菌の前に）Ｂ、スリンギエンシスの胞子を含有
する無傷の細胞をルゴール（１υ９０１）沃素で処理し
てから、細胞を殺すが、これらはトリー１プルシアー　
ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）の幼虫に対する
毒性を保持している。

胞子形成細胞の自家溶菌の直前に８スリンギエンシスＣ
ＨＤ−１）の無傷の細胞を遠心分離によって取り入れ、
ｍ胞ペレットを脱イオン水に懸濁して。

６、Ｏｘ１０Ｅ９＠胞／１の濃度とする。細胞懸濁液の
アリコートを１．５　ｘ１０Ｅ８細胞／鴎１に希釈し、
１％ルゴール沃素に室温で４時間当てたく１％ルゴール
液はリットル当り沃化カリウムｉ、ｏｇ、沃素０．５　
（Ｊ及び氷酢酸１０１を含有）。処理細胞を洗い、Ｗ？
。

菌の脱イオン水に再懸濁して６．Ｏｘｉ□Ｅ９の細胞濃
度とした。４時間の沃素処理後、栄養寒天培地上でのプ
レート計数により生存可能な細胞を検出しなかった。次
にルゴールの処理及び未処理対照細胞をＴ二幼虫に対す
る毒性について生物検定にかけた。

本発明の細胞は天然に生ずる細胞であるから。

本発明の利点を実現するために殺菌条件下にこれらを処
理する必要がない。このため、当業者は目標害虫環境下
に毒素（殺虫剤）活性の高水準の持続を達成するために
、水明＠書に記述されたとおりの細胞処理を最適化でき
る。

生物検定手順 ルゴールの殺菌細胞又は未処理の生きたＨＤ−１＠胞の
希釈液を、一定量の幼虫飼料カップに混合した。次に生
＠５日の１二幼虫を１匹ずつ各カップに加えた。希釈当
り１８匹の幼虫を試験した。幼虫を６日後に検査し、死
亡した幼虫の総数を記録した。結果を第１表に示す。こ
れらは幼虫の死亡率で示しである。

第１表 胞子を含有するルゴール処理された ８スリンギエンシス（ＨＤ−１）ＩＩ胞の生物検定細胞
　　　希釈　１０Ｅ９　１０Ｅ８　１０Ｅ７　１０Ｅ６
　　ＬＯＥ５ＨＤ−１未処理　　１００　１００　　６
８、Ｂ．　０　　０ルゴール処理　　９４．４６１．Ｏ
ＯＯＯ実施例２　安定性試験 Ｂ、ｔ、ＨＤ−１の胞子を含有する無傷の細胞を１％ル
ゴール液で、室温で４時開処理し、脱イオン水で洗い、
冷蔵庫に５２日間貯蔵した。この期間後、細胞は完全な
状態にあり、溶菌（胞子と結晶の放出）の証拠はなかっ
た。

胞子を含有するＢ、ｔ、ＨＤ−１の無傷の細胞を遠心分
離によって取り入れ、生ずるペレットを無菌の脱イオン
水に懸濁しく１０Ｅ１０１１胞／ＩＩＩ）、、　７０℃
に３０分加熱し、冷蔵庫に９日間貯蔵した。この期間後
。

実際上全部の細胞が溶菌し、胞子と結晶を放出した。

実施例３　土壌実験手順 Ｂ、ｔ、ＨＤ−１の調製： 胞子を含有するＢ、　ｔ、ＨＤ−１の無傷の培養基を、
遠心分離によって取り入れ、細胞ペレットを１％ルゴー
ル沃素液４００１に懸濁した（４ｘ　１０Ｅ８細胞＃ａ
ｌ）、。

沃素／ＩＩＩ胞懸濁液を室温で３時間かきまぜ、３回洗
い、無菌の０．ｌＨｇ４酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，
９）４００１に再懸濁した。沃素処理後、栄養寒天培地
（ＩＯＣ−１）上で生きたＢ、　ｔ、ＨＤ−１＠胞は検
出されず、顕微鏡検査は、全細胞が無（１（未溶菌）で
あることを明らかにした。

グイベル調製： Ｂ、ｔ、ＨＤ−１細胞を含有するダイベル（０，ｉｏ、
アボット・ラボラトリーズ、効力１６，０００国際中位
／ｍ９リストＮｏ、　５１８８＞を０．１８燐酸ナトリ
ウム無菌緩衝液４００１に計り入れた。

実験設計： １）無菌でない土壌の調製。土壌４０９を無菌の５００
　ｍｌフラスコに入れ、試験液２００１を加えた。

２）無菌土壌の調製：土＠４０９を無菌の５００　ｏｗ
ｌフラスコに入れ、試験液２００１を加える前に１時間
オートクレーブ処理した。土壌懸濁液を入れたフラス］
を回転ＳＦｍ機（２００ｒｐｍ）上で培養した。

各土壌懸濁液の試料（３０−４０ｍｌ）を４×のチーズ
布に通してろ過し、レタス苗木の葉に噴霧し、その後Ｔ
二の幼虫に対する毒性を測定した。

菓抑制検定での摂取抑制によるＢ、を毒素の測定二ロメ
イン・レタス苗の菓に、新しく調製された標準濃度（１
ｘ　Ｏ，１９ｇ／１００　ａｌｌ、　１／１０ｘ、　１
／２０ｘ及び１／１００ｘ）のダイベルと試験液を施用
の２４時間前に噴霧した。

標準液と試験液で処理された葉を植物から除いて葉ごと
に計早し１個々のペトリ皿に入れた。生（多７日の絶食
さゼた■二幼虫１０匹を名菓に添わせて、２５℃で約２
４時間１葉を食べさせた。給餌期間の終わりに葉を再び
計量し、各処理に対して平均重量損失を測定した。

上記の条件下に１葉の重Ｎ損失は、　０．１９１１（］
／１１１１ないし０．０１９１（１／’１１１１のダイ
ペル（ＩＩＩＱ当り１６，０００国際中位の効力）に等
しい毒素濃度にわたり、毒素濃度の対数−次関数である
。このため、新しく調製したダイペルをレタス苗に噴霧
し各検定を行なった時の濃度は、標準としての役目を果
たしており、試験液を噴霧した葉の毒素濃度と等式化で
きる。第２表のデータは、元の毒性（第１日）に対して
、培養接種々の時に土壌中に残留し菓抑制検定でその後
検定された残留毒性比率を示す。レタス苗以外の葉をＢ
［毒素効力の検定に使用できる。

第２表 元の毒性に対する土壌中の残留毒性の比率沃素処理した
溶菌前 土壌培養　　ダイペル（胞　のＢ、ｔ、ＨＤ−１（完全
製５　　　　８１　　０．５　　１３３　　　１００土
壌中のＢ、　ｔ、ＨＤ−１の蛋白質結晶の不活性化は、
土壌微生物の活性によることが示された（ウェスト、、
１９８４年）。第２表の結果は、ダイペル及びルゴール
沃素処理された溶菌前のＢ、　ｔ、ＨＤ−１調製剤を同
様な条件下に培養した時、ダイペル（胞子−結晶）製剤
の毒性は急速に劣化したが、ルゴール沃素処理の細胞の
毒性は木質的に未変化のままであったことを示している
。

上の結果から、！（Ｉの微生物細胞の化学的処理は、細
胞を貯蔵条件に安定にさせながら、ポリペプチド毒素の
活性を保持するような形で実施できるのが明らかである
。これにより、畑の条件下に毒素の残留活性が高くなる
。

実施例４　非相同遺伝子の構築と適当な宿主への形質転
換 構築は北部研究所から入手できる緑膿菌（ＮＲＲＬＢ−
１２１２７）のクローンで始まるが、これは広い宿主範
囲のシャトル・プラスミドｐＲ０１６１４を含んでいる
。（Ｊ、　ＢａＣｔ、　　［１９８２年コ　１５０巻６
０頁１合衆キサ許第４，３７４，２００号）。このプラ
スミドは、特異なＨｉｎｄｎＩ、Ｂａｇ旧、５ａｌｌ及
びＰｖｕ　Ｉ　Ｉの制限位置や、’ＰＳｔｌ挿入部をも
っていて、これはカルベニシリン耐性遺伝子と緑膿菌複
製系を包含しており、ここで旧ｎｄｌ［、Ｂａａｒ旧及
び５ａｌｌ制限位置はテトラサイクリン耐性遺伝子の中
にある。残りのプラスミドはｐ、ＢＲ３２２から誘導さ
れる。第二のプラスミドｐＳ）４１−１７は大腸菌（Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１５９７６）のクローンとして寄託された
。この寄託は６１６０４合衆国イリソイ州ビオリア、合
衆国農務省北部研究所の永久保存施設になされたもので
ある。プラスミドｐＳＨ１−１７はアンピシリン耐性を
大腸菌に与え、ＢスリンギエンシスＨＤ７３の５０　ａ
ｄプラスミドからのδ−エンドトキシン遺伝子を含んだ
６、Ｂ．　Ｋｂｐの旧ｎｄｌｌＩＤＮＡ断片を含有する
。無傷の細胞をキャベツ・シャクトリムシに有毒にさせ
るのに十分な毒素が、大腸菌のこの遺伝子から発現され
る。毒素の発現を評価し１代わりの宿主のシュードモナ
ス・フルオレッセンス中での毒素発現を達成するため、
　ＤＮＡ断片を更に変更する。望んでいないＤＮＡを６
８　Ｋｂｐの断片から除くために、ｐＳＨｌ−１７をＢ
ａｎ＋Ｈで消化させて、毒素遺伝子の５°末端に最も近
い位置で環状プラスミドを開裂させ、またエキソヌクレ
アーゼＢａ１３１で処理して６８にｂｐの旧ｎｄ［挿入
物を約２．９　Ｋｂｐに減らした。ＤＮＡの遊離末端を
クレノフ・ポリメラーゼでふさぎ、Ｂａ１１旧リンカー
スを加えて、線状ＤＮＡを連結し、環状プラスミドを再
形成させた。生ずるベクターのｐ　ＦＧ２７０をＸｈｏ
ｌで消化させると、環状プラスミドが毒素遺伝子の３”
末端に最も近い位置で開裂した。５ａｌｌリンカースを
加え、プラスミドを環状に連結させ、生ずるベクターの
ｐＦＧｌｏ　６を大腸菌で増殖させた。ｐＦＧｌｏ、６
を５ａｌｌとＲａｍ旧で完全に消化させ、生ずる毒素遺
伝子を含有する２、Ｉ　Ｋｂｐ断片をゲル電気泳動によ
って精製し、プラスミドｐＲ０１６１４のＢａｎ＋ＨＩ
と５ａｌｌ位置に連結した。生ずるプラスミドｐＣＨ２
．１を大腸菌で増殖させ、シュードモナス・フルオレッ
センスをカルベニシリン耐性及びδ−エンドトキシン合
成能に形質転換するのに使用した。シュードモナス・フ
ルオレッセンス（ｐｃ８２．１）をＮＲＲＬに寄託し呼
出し番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９７７を与えられた。プラ
スミドｐＳＨ１−１７は、　１９８５年７月２日に同施
設に寄託された。

以下の例示的な実験でＰフルオレッセンス（ｐｃＨ２１
）を形質転換していない細胞の対照群と連携して使用し
た。

大腸菌（ｐＳＨ１−１７）−ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９７６
とＰフルオレッセンス（ｐＣＨ２，１）−ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５９７７の培養基寄託は。

ＮＲＲＬ受託機関の永久保存施設になされたもので。

少なくとも３０年間保存される。これらの寄託物はそれ
らを明らかにした特許の公布により一般に入手できる。

また本出願の対応特許ないしその後継特許の出願された
国における外国特許法の要求に応じても入手できる。し
かし、寄託物の入手が、政府措置によって許可された特
許権を侵害してまで本発明の実施権を構成するものでな
いことは、理解すべきである。　　　　　　　　　　　
　　　　ｊ実施例５　非相同遺伝子を取込んだ微生物の
処理　　１と試験 シュードモナス菌を、１％ルゴール沃素（ｙｌ！Ａ菌蒸
溜水１リットル中のＫｌ　１００　ａ、　１．　５０　
（＋　、氷酢酸　　Ｅｌｏｏ　ＩＩＩ）で、又は２％ホ
ルマリン溶液処理により、　　：いずれも周囲温度で殺
菌した。

ＢＬ、毒素を加えた。又は加えないＰフルオレッセンス
のブロス培養基２リツトルからの細胞ペレットを半分に
分けた。細胞の半分を１ｘルゴール沃素で４時間処理し
、他の半分を氷上に保持した。

洗ったルゴール処理細胞と未処理細胞を無菌の脱イオン
水１０１中で再ペレット化した。この懸濁液（１０Ｅ８
−１０Ｅ１２　ｍ胞／ｍ１）９　ａｌｌを若いレタス苗
３本に噴霧した。噴霧湾みの苗３本を閉じた一室に入れ
、トリコブルシア・二の幼虫５０−７０匹を苗に付けた
。観察期間中に葉に目に見える損失がなければ、苗は保
護されたと考えられる。

第３表　植物検　１−Ｐフルオレッセンス＠￥！！Ｌｆ
ｆｉｌ！　　　　　　　１１ソー≧膣１ば４−　幼虫総
数　保護の有無：、フルオレッセンス　　生ｍ　　　　
　　　　２．５　Ｘ１０Ｅ１１　　　７５　　　　保’
ｆａナシ１、フルオレッセンス　生菌　　　　　　　３
．１ｘ１０Ｅ１１　　　７５　　　　保護ありヒ８．【
、毒素 、フルオレッセンス　１ｚルゴールヨウ素、　　　Ｏ７
５保護なし４時間 、フルオレッセンス　１ｘルゴールヨウ素、　　　Ｏ７
５保護あり−Ｂ、ｔ、毒素　　　　　４時間 設定　第１日−生後２日の幼虫２５匹を苗に付着させた
。

第２日−生後５日の幼虫５０匹を苗に付着させた。

第１０日−観察を記録した。

次の研究では、新しくふ化させたキャベツ・シャクトリ
ムシを、生物検定しようとする材料の水滴の入ったペト
リ皿に入れる。幼虫が液を吸い込んでから、取り出して
幼虫の餌が入っている小さなカップに入れる。１日後に
幼虫を検査して、総死亡数を記録する。次の第４表はそ
の結果を示す。

第４表　生物検　１−Ｐ、フルオレッセンス幼虫死　幼
虫死　生育可能 ！１皇　　　　　　　ｑＭＬ　　　　　　　息嵐改　立
上ｊ　細胞数／ｍｌＰフルオレッセンス　生菌　　　　
　　　０／１５　　　０　　　８　ｘｌＯＥ１１Ｐフル
オレッセンス　生菌　　　　　　　１１／１８　　６２
　　２．５　、ｘ　１０［１２＋　ａ、　ｔ、　＠素 Ｐフルオレッセンス　１％ルゴール、４ｈｒＯ／１５　
　　０　　　　０Ｐ、フルオレッセンス１岬レゴール、
４ｈｒ　　８／１３　　６２　　　　　Ｇ幼虫死　幼虫
死　生育可能 監１監　　　　　　Ｕ！！！　　　　　　　ロ凰孜息！
Ｊ　咀嵐致但ＬＰフルオレッセンス　生菌　　　　　　
　０／１５　　　０　　３．７　ｘ１０Ｅ１１Ｐフルオ
レッセンス　生菌　　　　　　　３／２０　　１５　　
　ａ、５　Ｘ１ｏＥ１１＋Ｂ、ｔ、Ｊｉ素 Ｐ、フルオレッセンス１％ルゴール、４ｈｒＯ／１５　
　　０　　　　０Ｐ、フルオレッセンス１χルゴール、
’４ｈｒ　　８／１５　　５３　　　　０生物検　３−
Ｐ、フルオレッセンス 幼虫死　幼虫死　生育可能 引１　　　　　■　　　　　コｌコμ」■堕１Ｐ、フル
オレッセンス　生菌−凍結１４日　　９／１０　　９０
　　２．５　ｘ１０Ｅ１２＋Ｂ、ｔ、毒素 Ｐフルオレッセンス　１χルゴール、４ｈｒ１／１５　
　　７　　　　０Ｐ、７／Ｌｒｔレツｔンス１％ＪＬｔ
コ−／Ｌ／　　　　　１１／１５　　７３　　　　０十
Ｂ、を毒素 Ｐ、フルオレッセンス　２χホルマリン、４ｈｒＯ／１
５　　　０　　　　　ＧＰフルオレッセンス　２％ホル
マリン、４　ｈｒ　１０／１５　　６７　　　　０−土
しム蚤＊−一−−−−一−−一一−−一−−−−−−−
−−−−−−−生物検　４−Ｐ、フルオレッセンス 幼虫死　幼虫死　生育可能 Ｐ、フルオレッセンス　生菌　　　　　　　２０／２０
　　１００　　　３　Ｘｌ０ＥＩＯ＋Ｂ、ｔ、！素 Ｐ、フルオレッセンス　１％ルゴール、４ｈｒＯ／２０
　　　０　　　　０Ｐ、フルオレッセンス　１％シルゴ
ール。ｈｒ　　１８／２０　　９０　　　　　Ｇ＋Ｂ、
ｔ、素 次の研究では、細胞の鹸化安定性に対する効果を測定す
るため、異なる方法を用いて細胞を殺した。Ｐフルオレ
ッセンス菌株３３は、ａ、［、毒素を含有しない未形質
転換の細胞であるが、菌株ｐｃＨは２．１ｋｂの毒素遺
伝子を含んでいる。第一の研究では、菌株３３と菌株ｐ
ｃＨの静止相培養基を遠心分離によって取り入れ、細胞
ペレットを無菌の脱イオン水に、それぞれｌ０ＥＩＯ及
び１０Ｅ９の濃度で懸濁した。細胞のアリコートを種々
の長さの時間に７０℃の温浴にかけ、キングＢ寒天上で
のプレート計数によって細胞の生育可能性を測定した［
キング・イー・オー（にｉｎｇ、Ｅ、０．）ら（１９５
４年）　、Ｊ、Ｌａｂ、＆Ｃ１１ｎ、　Ｈｅｄ、４４巻
３０４頁を参照のこと。培地は次の成分をもつ。プロテ
オース・ペプトン３号２．０％、バクト寒天１５％、グ
リセロールＣ，Ｐ、１．０χ、Ｋ２ＨＰＯ４（無水＞　
０．１５％　、８ｇ３０．．７８２００．１５％、　ｐ
Ｈ７，２１，：調整］。菌株３３は５分以内に実質的に
完全に死滅したが、菌株ｐＣＨは１０分以内に生育可能
な＠抱を実質的に示さなかった。

菌株３３の細胞（未処理、７０℃加熱処理又はルゴール
処理（１％ルゴール沃素、２時間、室温１）を。

１０醜１の脱イオン水に懸濁して、約１０Ｅ９／ｅｌの
細胞濃度とした。次に細胞懸濁液をブロンラン２００鹸
化機（マイクロプローブ出力１０．デユーティサイクル
５０ｘ１パルス・モード使用）にかけた。細胞懸濁液の
光学濃度（５７５０ｓ）を鹸化処理の前後に測定した。

光学濃度の減少は細胞の破壊を示している。次の第５．
６表はその結果を記載している。

生菌　　　　　　　０．２４　　　　　０．　ＯＳルゴ
ール　　　　　０．２０　　　　０．１９（１％、２　
ｈｒ、室温） 加熱７０℃ １　　　　　　　０．２２　　　　　０．０６３　　　
　　　　０．２ｉ　　　　　　０．０７５　　　　　　
　０．２２　　　　　０．０９１５　　　　　　　０．
２０　　　　　０．１０３Ｑ　　　　　　　　Ｏ，２１
０，１１６００，１９０，１３ 生物検定手頃は新たにふ化させたキャベツ・シャクトリ
ムシを使用し、生物検定しようとする材料の水滴を含ん
だペトリ皿に入れた。幼虫に液を吸わせてから、幼虫の
餌を入れた小さなカップに移し、た。幼虫を６日後に検
査し、動物の死亡総数を記録した。

Ｐフルオレッセンス−Ｒｊ毒素（菌株ｐｃＨ）のルゴー
ル処理＠抱の持続性を次のように温室で分析した。（１
）ロメイン種レタスの葉に殺虫剤細胞を噴霧した。（２
）処理ずみ植物を１９日間まで温室環境に置いＩ：（温
室を紫外線透過屋根で覆った）。

（３）菓抑制検定により、葉に残留するキャベツ・シャ
クトリムシ殺虫剤活性を検定した。給餌抑制によるＢし
毒素の測定は、既述のとおりであり。

植物に噴霧する方法は実施例５に記述されている。

この実験で、１０の毒素活性水準は、噴霧液１００１当
りダイペル０１９ｏを植物・当り約１０１　（づなわ＃
５′ａ出寸前）の率で施用して得られる殺虫剤活性と同
等である。

第７表に示すように、１１日後、シュードモナス調製剤
はまだ十分に活性があったが、ダイペルの例は初期活性
の２７３以上を失った。固定されたシュードモナス細胞
が、何らかの方法で菓表面での不活性化から殺虫剤毒素
を保護しているものと。

我々はこのデータから解釈している。

第７表　温室内持続性データ 活性 日数　　　　　　　ｐｃＨダイペル １　　　　　　　　　０．７５　　　　　１．０５　　
　　　　　　　１．１５　　　　　０、Ｂ．５８　　　
　　　　　　１．１　　　　　　１．２１１１．６０．
３ １９　　　　　　　　０、１３　　　　　　＜０．０１
上の精巣から、毒素を含有する殺菌された細菌は生菌の
殺虫剤活性の全部又は実質的に全部の割合を保持しなが
ら多くの利点を提供することが明らかである。貯蔵、輸
送及び施用のため死菌を保持するほうが、生菌を使用す
るより都合がよく、経済的である。それと同時に、長期
間にわたり毒素の生物活性を維持するように、菌は毒素
のカプセル化による保護を提供する。更に、プロテアー
ゼの変性がポリペプチド殺虫剤の蛋白質分解性の解体を
防ぐ。菌体構造を破壊したり蛋白質殺虫剤を変性したす
せずに殺菌するために種々の手段を使用して、処方と植
物及び植物製品への応用に都合のよい殺虫剤組成物を提
供しながら、望んでいる殺虫剤活性を得ることができる
。

本発明は明快な理解を目的として説明と実施例によって
かなり詳しく記述されたが、添付の特許請求の範囲内で
、ある変化・変更を行なえることは明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、目標害虫の環境に適用される時に持続的な殺虫剤活
   性をもった実質的に無傷の殺虫剤含有細胞で構成され、
   この殺虫剤がポリペプチドで細胞内のものであり、天然
   につくられるか、又はこの細胞内の非相同遺伝子の発現
   の結果としてつくられる場合の殺虫剤組成物。 ２、細胞が殺虫剤活性を保持しながら、プロテアーゼ不
   活性化又は細胞壁強化条件下に殺菌される、特許請求の
   範囲第１項による殺虫剤組成物。 ３、細胞が腸内細菌科、バシラス科、リゾビウム科、ら
   せん菌科、乳酸杆菌科、シュードモナス科、アゾトバク
   ター科、及びニトロバクター科からなる群から選ばれる
   原核生物、又は藻菌類、子のう菌類及び担子菌類からな
   る群から選ばれる下等真核生物である、特許請求の範囲
   第１項による殺虫剤組成物。 ２、原核生物がバシラス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉ
   ｌｌｕｓ　ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｍ−７、Ｂ．ス
   リンギエンシス・バラエティ・クルスタキ（ｖａｒ．ｋ
   ｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ１、Ｂ．スリンギエンシスＨＤ２
   、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・フィニティムス
   （ｖａｒ．ｆｉｎｉ−ｔｉｍｕｓ）ＨＤ３、Ｂ．スリン
   ギエンシス・バラエティ・アレスティ（ｖａｒ．ａｌｅ
   ｓｔｉ）ＨＤ４、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・
   クルスタキＨＤ７３、Ｂ．スリンギエンシス・バラエテ
   ィ・ソット−（ｖａｒ．ｓｏｔｔｏ）ＨＤ７７０、Ｂ．
   スリンギエンシス・バラエティ・デンドロリムス（ｖａ
   ｒ．ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ）ＨＤ７、Ｂ．スリンギエ
   ンシス・バラエティ・ケニヤエ（ｖａｒ．ｋｅｎｙａｅ
   ）ＨＤ５、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・ガレリ
   アエ（ｖａｒ．ｇａｌｌｅｒｉａｅ）ＨＤ２９、Ｂ．ス
   リンギエンシス・バラエティ・カナデンシス（ｖａｒ．
   ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）ＨＤ２２４、Ｂ．スリンギエン
   シス・バラエティ・エントモシダス（ｖａｒ．ｅｎｔｏ
   ｍｏｃｉｄｕｓ）ＨＤ９、Ｂ．スリンギエンシス・バラ
   エティ・スブトキシカス（ｖａｒ．ｓｕｂｔｏｘｉｃｕ
   ｓ）ＨＤ１０９、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・
   アイザワイ（ｖａｒ．ａｉｚａｗａｉ）ＨＤ１１、Ｂ．
   スリンギエンシス・バラエティ・モリソニ（ｖａｒ．ｍ
   ｏｒｒｉｓｏｎｉ）ＨＤ１２、Ｂ．スリンギエンシス・
   バラエティ・オストリニアエ（ｖａｒ．ｏｓｔｒｉｎｉ
   ａｅ）ＨＤ５０１、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ
   ・トルウォルシ（ｖａｒ．ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ）ＨＤ５
   ３７、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・ダルムシュ
   タジエンシス（ｖａｒ．ｄａｒ−−ｓｔａｄｉｅｎｓｉ
   ｓ）ＨＤ１４６、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・
   ツマノフィ（ｖａｒ．ｔｏｕｍａｎｆｆｉ）ＨＤ２０１
   、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・キュウシュエン
   シス（ｖａｒ．ｋｙｕｓｈｕｅｎｓｉｓ）ＨＤ５４１、
   Ｂ．スリンギエンシス、バラエティ・トンプソニ（ｖａ
   ｒ．ｔｈｏｍｐｓｏｎｉ）ＨＤ５４２、Ｂ．スリンギエ
   ンシス・バラエティ・パキスタニ（ｖａｒ．ｐａｋｉｓ
   ｔａｎｉ）ＨＤ３９５、Ｂ．スリンギエンシス・バラエ
   ティ・イスラエレンシス（ｖａｒ．ｉｓｒ−ａｅｌｅｎ
   ｓｉｓ）ＨＤ５６７、Ｂ．スリンギエンシス・バラエテ
   ィ・インディアナ（ｖａｒ．ｉｎｄｉａｎａ）ＨＤ５２
   １、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・ダコタ（ｖａ
   ｒ．ｄａｋ−ｏｔａ）、Ｂ．スリンギエンシス・バラエ
   ティ・トーホクエンシス（ｖａｒ．ｔｏｈｏｋｕｅｎｓ
   ｉｓ）ＨＤ８６６、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ
   ・クマモトエンシス（ｖａｒ．ｋｕｍａｍｏｔｏｅｎｓ
   ｉｓ）ＨＤ８６７、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ
   ・トチギエンシス（ｖａｒ．ｔｏｃｈｉｇｉｅｎｓｉｓ
   ）ＨＤ８６８、Ｂ．スリンギエンシス・バラエティ・コ
   ルメリ（ｖａｒ．ｃｏｌｍｅｒｉ）ＨＤ８４７、Ｂ．ス
   リンギエンシス・バラエティ・ウハネンシス（ｖａｒ．
   ｗｕｈａｎｅｎｓｉｓ）ＨＤ５２５、Ｂ．スリンギエン
   シス・バラエティ・テネブリオニス（ｖａｒ．ｔｅｎｅ
   ｂｒｉｏｎｉｓ）からなるバシラス・スリンギエンシス
   の殺虫剤生産菌株から選ばれるバシラス種、及びＢ．セ
   レウス（ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．モリタイ（ｍｏｒｉｔａ
   ｉ）、Ｂ．ポピリアエ（ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、Ｂ．レ
   ンチモルブス（ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）及びＢ．スフ
   ァエリクス（ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）から選ばれる他の
   バシラス種である、特許請求の範囲第３項による殺虫剤
   組成物５、実質的に無傷の殺虫剤含有単細胞微生物で構
   成される殺虫剤組成物の有効量を植物に施用することか
   らなる植物を害虫から保護する方法であって、ここで殺
   虫剤が細胞内のもので天然につくられるものか、又は微
   生物中の非相同遺伝子の発現の結果としてつくられ、ま
   た目標害虫環境への組成物の施用時に殺虫剤活性を持続
   するような条件下に微生物が処理される場合の方法。 ６、微生物が腸内細菌科、バシラス科、リゾビウム科、
   らせん科、乳酸杆菌科、シュードモナス科、アゾトバク
   ター科、及びニトロバクター科からなる群から選ばれる
   原核生物、又は藻菌類、子のう菌類及び担子菌類からな
   る群から選ばれる下等真核生物である、特許請求の範囲
   第５項による方法。 ７、単細胞微生物が殺虫剤活性を保持しながらプロテア
   ーゼ不活性化又は細胞壁強化条件下に殺菌される、特許
   請求の範囲第５項による方法。 ８、毒素がポリペプチド毒素を暗号化した非相同遺伝子
   の発現結果であって、目標害虫環境に細胞を施用する時
   に殺虫剤活性を保持しながら、プロテアーゼ不活性化又
   は細胞壁強化条件下に細胞が殺菌される、細胞内毒素を
   含有する実質的に無傷の単細胞微生物の細胞。 ９、微生物がシュードモナスであり、毒素がＢ．スリン
   ギエンシスに由来する、特許請求の範囲第８項による細
   胞。 １０、大腸菌（ｐＳＨ１−１７）とシュードモナス・フ
   ルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ｐＣ
   Ｈ２．１）から選ばれる微生物、及び以下から選ばれる
   プラスミド。 （ａ）プラスミドｐＳＨ１−１７。アンピシリン耐性を
   大腸菌に付与し、Ｂ．スリンギエンシスＨＤ７３の５０
   ｍｄプラスミドからのδ−エンドトキシン遺伝子を含め
   た６．８ＫｂｐのＨｉｎｄIIIＤＮＡを含有する。 （ｂ）プラスミドｐＣＨ２．１。プラスミドｐＲ０１６
   １４のＢａｍＨ I とＳａｌ I 位置に連結されたＢ．ス
   リンギエンシスＨＤ７３からの毒素遺伝子を含有する２
   １ＫｂｐのＤＮＡ断片を含有する。