BRPI0923334A2 - Gene que codifica toxinas de nematoide. - Google Patents

Abstract

gene que codifica toxinas de nematoide. a invenção refere-se a composição e métodos para conferir atividade nematicida e bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes. a invenção refere-se também a composições incluindo uma sequência de codificação para polipeptídeos nematicidas. as sequências de codificação podem ser usadas em construtos de dna ou cassetes de expressão para transformação e expressão em plantas e bactérias. composições também incluem bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes transformadas. em particular, moléculas de ácido nucleico nematicidas isoladas são proporcionadas. adicionalmente, sequências de aminoácido correspondendo aos polinucleotídeos são abrangidas. em particular, a presente invenção proporciona moléculas de ácido nucleico isoladas incluindo sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácido mostrada em seq id no: 5, 4, 8, 9, 13, 14, 47, 48 ou 49, a sequência de nucleotídeo apresentada em seq id no: 3, 1, 2, 6, 7, 10, 11, 12, 15, 45 ou 46, bem como variantes e fragmentos das mesmas.

Description

" 1/97 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENE QUE CODIFICA TOXINAS DE NEMATOIDE".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo de biologia molecular. São proporcionados novos genes que codificam proteínas nematicidas. Essas prote- Ínas e as sequências de ácido nucleico que codificam as mesmas são úteis no preparo de formulações nematicidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a peste.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Nematoides (derivados da palavra Grega para filamento) são orga- nismos ativos, flexíveis, alongados que vivem sobre superfícies úmidas ou em ambientes líquidos, incluindo filmes de água dentro de solos e tecidos úmidos dentro de outros organismos. Embora apenas 20.000 espécies de nematoides . tenham sido identificados, estima-se que 40.000 a 10 milhões existam realmen- te. Algumas espécies de nematoides evoluíram para serem parasitas de muito ' sucesso de plantas e animais e são responsáveis por perdas econômicas signi- ficativas em agricultura e criação de animais e pela morbidade e mortalidade em seres humanos (Whitehead (1998) Plant Nematode Control. CAB Internati- onal, New York).

Estima-se que nematoides parasíticos custem, às indústrias de hor- ticultura e agricultura, acima de $78 bilhões no mundo todo por ano, baseado em uma perda anual média estimada de 12% dispersa por todas as principais safras. Por exemplo, estima-se que nematoides causam perdas na soja de a- proximadamente $3,2 bilhões no mundo todo anualmente (Barker et al. (1994) —Plantand Soil Nematodes: Societal Impact and Focus for the Future. The Committee on National Needs and Priorities in Nematology. Cooperative State Research Service, US Department of Agriculture and Society of Nematologists).

Há um número muito pequeno de produtos químicos disponíveis para controlar nematoides (Becker (1999) Agricultural Research Magazine 47(3):22-24; Pat. US. No. 6.048.714). Todavia, a aplicação de nematicidas químicas continua a principal forma de controle de nematoide. Em geral, nema- ticidas químicos são compostos altamente tóxicos conhecidos por terem um

BR 2/97 | impacto ambiental substancial e são crescentemente restritos nas quantidades e locais nos quais eles podem ser usados. As lactonas macrocíclicas (por exemplo, avermectinas e milbemici- nas) são produtos químicos que, em princípio, conferem excelente especificida- deeeficáciaepermitirão controle ambientalmente seguro de nematoides para- síticos de planta. Infelizmente, na prática, esses dois agentes nematicidas pro- varam ser menos eficazes em aplicações agrícolas contra patógenos da raiz. Embora determinadas avermectinas mostrem atividade restrita contra nematoi- des parasíticos de planta, esses produtos químicos têm a deficiência de pobre biodisponibilidade em virtude de sua sensibilidade à luz, degradação por micro- organismos no solo e ligação hermética a partículas do solo (Lasota & Dybas (1990) Acta Leiden 59(1-2): 217-225; Wright & Perry (1998) Musculature and Neurobiology. Em: The Physiology and Biochemistry of Free-Living and Plant- parasitic Nematodes (eds R. N. Perry & D. J. Wright), CAB International 1998). Consequentemente, a despeito dos anos de pesquisa e uso extensivo contra ú nematoides, ácaros e insetos parasíticos de animais (aplicações em plantas e animais), lactonas macrocíclicas (por exemplo, avermectinas e milbemicinas) nunca foram comercialmente desenvolvidas para controlar nematoides parasíti- cos de planta no solo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Composições e métodos para conferir atividade de tolerância a ne- matoide a plantas, células, tecidos e sementes de planta são proporcionados. Composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam sequências para polipeptídeos nematicidas, vetores compreendendo essas moléculas de —ácidonucleicoe células hospedeiras compreendendo os vetores. Composições também incluem as sequências polipeptídicas nematicidas e anticorpos a esses polipeptídeos. As sequências de nucleotídeo podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo micro-organismos e plantas. As sequências de —nucleotídeo ou aminoácido podem ser sequências sintéticas que foram criadas para expressão em um organismo incluindo, mas não limitado a, um micro- organismo ou uma planta. Composições também compreendem bactérias,

- 3/97 plantas, células de planta, tecidos e sementes transformadas.

Em particular, são proporcionadas moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam proteínas nematicidas. Adicionalmente, sequências de aminoácido correspondendo à proteína nematicida são abrangidas. Em particular, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 4, 5,8, 9, 13, 14,47, 48 ou 49, a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 1, 2, 3,6,7,10, 11, 12, 15, 45 ou 46, bem como variantes e fragmentos das mesmas. Sequên- ciasdenucleotídeo que são complementares a uma sequência de nucleotídeo da invenção ou que hibridizam a uma sequência da invenção são também a- brangidas.

São proporcionados métodos para produção dos polipeptídeos da - invenção e para uso desses polipeptídeos para controlar ou matar uma peste nematoide. Métodos e kits para detecção dos ácidos nucleicos e polipeptídeos ' da invenção em uma amostra também são incluídos.

As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com resistência ou tolerância intensificada a nematoide. Esses organismos e composições compreendendo os organismos são desejáveis para finsagrícolas. As composições da invenção são úteis para identificação e gera- ção de populações de planta tendo resistência aprimorada a nematoide, bem como na identificação de Locide Traços Quantitativos (Quantitative Trait Loci - OQTLs) úteis em melhoramento marcador-assistido de plantas tendo resistência ou tolerância a nematoide.

DESCRIÇÃO DE FIGURAS A figura 1 mostra a ação enzimática de oxidases de polifenol.

A figura 2 mostra a proteína precursora AXN-1 (SEQ ID NO: 13) com os picos de espectroscopia de massa mapeada.

As figuras 3A e 3B mostram um alinhamento de AXN-1 (SEQ ID —NO:4)com oxidases de polifenol de Neurospora crassa (SEQ ID NO: 31), P- yrenophora tritici-repentis (SEQ ID NO: 32), Podospora anserina (SEQ ID NO: 33), Lentinula edodes (SEQ ID NO: 34), Pycnoporus sanguineus (SEQ ID NO:

- 4/97 35), Pholio nameko (SEQ ID NO: 36), Tuber melanosporum (SEQ ID NO: 37) e Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 38). A figura 4 mostra um alinhamento de AXN-8 (SEQ ID NO: 13) com oxidases de polifenol de Agarícus bisporus (SEQ ID NO: 39), Neurospora cras- — sa(SEQIDNO:31)e Streptomyces castaneglobisporus (SEQ ID NO: 40). His- tidinas de ligação ao cobre putativas são encontradas nas posições de aminoá- cido 47, 81, 90, 208, 212 e 235 de SEQ ID NO: 13. O local de ativação de pro- tease está localizado na posição 377 de SEQ ID NO: 39 e posição 403 de SEQ 1D NO: 31. Histidinas de ligação ao cobre estão localizadas na posição de ami- —noácido 58 de SEQ ID NO: 39, posição 67 de SEQ ID NO: 31 e posições 38, 54, 63, 190, 194 e 216 de SEQ ID NO: 40. A figura 5 mostra um alinhamento de AXN-9 (SEQ ID NO: 48) com AXN-8 (SEQ ID NO: 13). - A figura 6 mostra uma Western blot de tecido de raiz pilosa de soja incubada com anticorpo anti-AXN-1. A Fileira A é tecido de raiz de tecido de ' raiz transgênica contendo o gene AXN-1 e a Fileira B é de uma linhagem de controle carecendo do gene AXN-1. DESCRIÇÃO DETALHADA | Visão Geral Nematoides causam uma perda substancial em produtos agrícolas, incluindo safras alimentícias e industriais e têm sido combatidos, primariamente com compostos químicos tendo atividade nematicida.

Nematoides são animais semelhantes a vermes microscópicos que se alimentam sobre raízes, folhas e caules de mais de 2.000 vegetais, frutas e plantas omamentais.

Um tipo comum — denematoideéonematoide do nó da raiz, cuja alimentação causa protuberân- cias características sobre raízes.

Outros nematoides que se alimentam de raiz são do tipo cisto e lesão, os quais são mais específicos ao hospedeiro.

O ne- matoide do cisto de soja (Soybean Cyst Nematode - SCN) pode diminuir o nú- mero de nódulos de fixação de nitrogênio sobre as raízes e pode tornar as raí- zesmais suscetíveis a ataques por outros patógenos de planta abrigados no solo.

Em virtude da toxicidade (e, em muitos casos, pobre eficácia) dos méto- dos de controle de nematoide existentes, seria desejável desenvolver alternati-

- 5/97 vas seguras e eficazes para o controle de nematoide.

A presente invenção é dirigida a composições e métodos para regu- lação de resistência ou tolerância a nematoide em organismos, particularmente plantas ou células de planta. Por "resistência" entenda-se que o nematoide é —mortoquando de ingestão ou outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por "tolerância" entenda-se uma deficiência ou redução no movimento, alimen- tação, reprodução ou outras funções do nematoide. Os métodos envolvem transformação de organismos com uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína nematícida da invenção. Em particular, as sequências de nucleo- tideodainvenção são úteis para o preparo de plantas e micro-organismos que possuem atividade nematicida. Assim, bactérias, plantas, células de planta, te- cidos de planta e sementes transformados são proporcionados.

Composições incluem proteínas e ácidos nucleicos nematicidas ori- - ginários de bactéria, fungo ou planta. As sequências de ácido nucleico nemati- cidas descritas aqui codificam enzimas oxidase de polifenol. Acredita-se que ' oxidases de polifenol exerçam papéis fisiológicos-chave ao impedir que insetos e micro-organismos ataquem plantas e como parte da resposta a feridas, em plantas e produtos de planta, por insetos, micro-organismos e abrasões (revisto em Marshall et a/. (2000) "Enzymatic Browning in Fruits, Vegetables and Sea- foods" Food and Agricultural Organization of the United Nations em www.fao.org). À medida que frutas e vegetais amadurecem, sua suscetibilidade à doença e infestação é aumentada em virtude de um declínio em seu teor fe- nólico. Enzimas oxidase de fenol endógenas a frutas e vegetais catalisam a produção de quinonas de seus constituintes fenólicos. Uma vez formadas, es- sasquinonas sofrem reações de polimerização, levando à produção de melani- nas, as quais exibem atividade antibacteriana e antifúngica e auxiliam ao man- ter a fruta e/ou vegeta! fisiologicamente saudável. Contudo, o uso de atividade de oxidase de polifenol para controle de nematoide não foi anteriormente des- coberto. As enzimas oxidase de polifenol abrangidas aqui incluem novas se- quências, bem como sequências de oxidase de polifenol conhecidas na técnica. As sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para e 6/97 subsequente transformação em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de proteínas nematicidas alteradas por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como troca de domínio ou embaralhamento de DNA. As proteí- nasencontram uso no controle ou morte de populações de peste nematoide e para a produção de composições com atividade nematicida.

Por "toxina nematicida" ou "proteína nematicida" entenda-se uma toxina que tem atividade tóxica contra uma ou mais pestes de nematoide inclu- indo, mas não limitado a, as toxinas nematicidas apresentadas em SEQ ID NO: 4,5,8,9,13,14,18,20,22,47,48ou49 ou uma proteína que tem homologia a tal proteína. Proteínas nematícidas incluem sequências de aminoácido deduzi- das das sequências de nucleotídeo de comprimento total divulgadas aqui e se- quências de aminoácido que são mais curtas do que as sequências de - comprimento total, quer em virtude do uso de um sítio de início a jusante alter- nativo ou em virtude de processamento (por exemplo, clivagem proteolítica, . junção alternativa e semelhantes) que produz uma proteína mais curta tendo atividade nematicida. Processamento pode ocorrer no organismo em que a pro- teina é expressa ou na peste após ingestão da proteína. Pestes Nematoides As composições e métodos da presente invenção são úteis para o desenvolvimento de plantas transgênicas que são tolerantes a pestes nematoi- des, particularmente nematoides parasíticos de planta. Parasitas nematoides de plantas podem habitar todas as partes de planta, incluindo raízes, desenvolvi- mento de brotos de flor, folhas e caules. Parasitas de planta são classificados —combaseem;seus hábitos de alimentação nas amplas categorias: ectoparasi- tas migratórios, endoparasitas migratórios e endoparasitas sedentários. Endo- parasitas sedentários, os quais incluem os nematoides do nó da raiz (Meloi- dogyne) e nematoides de cisto (Globodera e Heterodera) induzem a locais de alimentação e estabelecem infecções de longo prazo dentro das raízes que, muito frequentemente, danificam safras (Whitehead (1998) Plant Nematode Control. CAB International, New York).

Nematoides parasíticos de planta exemplificativos incluem, mas

' 7197 não estão limitados a, Aphelenchoides spp. (nematoides foliares), Belonolaimus Spp. (o nematoide com ferrão ), Bursaphelenchus xylophilus (nematoide do pi- nho silvestre), Criconemoides species (nematoide de anel), Ditylenchus des- tructor (nematoide da raiz de batata), Ditylenchus dipsaci (nematoide do caule e bulbo), Globodera pallida (nematoide do cisto de batata clara), Globodera ros- tochiensis (nematoide dourado), Helicotylenchus (nematoides espirais), Hetero- dera glycines (nematoide do cisto de soja), Heterodera schachtii (nematoide do cisto de beterraba sacarínica), Heterodera zeae (o nematoide do cisto de mi- lho), Heterodera avenae (nematoide do cisto de cereal), Hoplolaimus (o nema- toide Lance), Meloidogyne spp. (nematoides do nó da raiz), Mesocriconema xenoplax (nematoide de anel), Nacobbus aberrans (falso nematoide do nó da raiz), Paratrichodorus (nematoides de atrofia da raiz), Pratylenchus spp (nema- toide de lesão), Radopholus simíilis (nematoide com ferrão ), Rotylenchulus spp. E (nematoide reniforme), Tylenchorhynchus spp. (nematoide com ferrão), Tylen- chulus semipenetrans (o nematoide de cítricos) e Xiphinema (o nematoide- É punhal). Oxidases de Polifenol As composições nematíicidas divulgadas aqui compreendem se- quências de ácido nucleico e aminoácido de oxidase de polifenol, bem como variantese fragmentos das mesmas. Em várias modalidades, as composições compreendem plantas transgênicas ou formulações pesticidas expressando ou compreendendo uma oxidase de polifenol. As composições são úteis para con- trolar ou matar nematoides parasíticos de planta em uma área suscetível à in- festação por nematoide, particularmente infestação por nematoide parasítico de planta.

Para fins da presente invenção, uma "oxidase de polifenol" refere- se a uma classe de enzimas oxidase contendo cobre que incluem, por exemplo, mono-oxidases de monofenol, tal como tirosinase, oxidases de difenol, tais co- mo oxidase e lacase de catecol, hemocianinas e semelhantes. Em várias moda- lidades,asenzimas oxidase de polifeno!l abrangidas aqui são membros da famí- lia de proteína de cobre do tipo 3. Oxidases de polifenol são enzimas com um centro de cobre dinu-

: 8/97 À clear, com os íons de cobre servindo para ligar um átomo de oxigênio molecular dentro do sítio ativo da enzima para permitir catálise. O estado de oxidação de cada átomo de cobre influencia a ligação ao oxigênio e, assim, atividade de o- xidase em cada etapa. No caso de uma mono-oxidase de monofenol, íons de cobreno estado de oxidação +2 orientam a adição de um grupo hidroxila na orto-posição sobre um anel de feno! existente. Subsequentemente, uma oxida- se de difenol pode se ligar a esses produtos de difenol e oxidar ambas as por- ções hidroxila para gerar a quinona correspondente. A atividade de oxidase de difenol ocorre por redução dos íons de cobre ao estado +1 e ligação a um áto- mode oxigênio molecular. Embora alguns organismos possuam apenas uma única atividade de oxidase de polifenol (notavelmente plantas, ao mesmo tempo em que realiza a etapa de oxidase de difenol), outras enzimas realizam reações de oxidase e mono-oxidase de difenol.

: Várias estruturas de raio x foram resolvidas para enzimas de cobre dotipo3e motivos estruturais distintos são conservados dentre as enzimas.

: Notável é o sítio ativo dessas enzimas, nas quais o cobre é ligado por seis ou sete resíduos de histidina e um único resíduo de cisteína é altamente conser- vado. Os dados estruturais também sugerem que enzimas oxidase de polifenol têm uma especificidade um pouco relaxada por seus substratos e que o sítio ativodas enzimas é flexível durante catálise.

A enzima parece ser de distribuição mais universal em animais, plantas, fungos e bactérias. Sequências primárias de proteína de oxidases de polifenol de Streptomyces glaucescens (Huber et al. 1985), Streptomyces anti- bioticus (Bernan et al. 1985) e Neurospora crassa (Lerch, 1982), tomate (Sha- haretal. 1992; Newman ef a/. 1993), feijão largo (Cary et al. 1992), batata (Hunt et a/. 1993), camundongos (Shibahara et a/. 1986) e seres humanos (Kwon et al. 1987; Giebel et al. 1991) foram determinadas usando técnicas de sequenciamento de DNA. Oxidases de polifenol de plantas intimamente rela- cionadas, tais como tomate e batata, mostram aproximadamente 91 porcento — dehomologiade sequência, enquanto que aquelas de tomate e feijão fava mos- tram apenas 40 porcento de homologia exata (Wong, 1995).

A despeito da baixa identidade de sequência entre enzimas oxidase

: 9/97 de polifenol derivadas de diferentes espécies, todas elas têm, em seu sítio ati- vo, um centro de cobre dinuclear no qual cobre do tipo 3 é ligado a resíduos de histidina e essa estrutura é altamente conservada. Marusek et al. mostram que uma série de características estruturais importantes são conservadas nos do- —mínios N-terminais de oxidases de polifeno! de várias plantas e fungos, incluin- do um motivo de tirosina o qual pode ser considerado uma característica que indica o início da região de ligação que conecta os domínios C- e N-terminais. Alinhamentos de sequência e previsões de estrutura secundária indicam que os domínios C-terminais de oxidases de polifenol provavelmente têm estrutura ter- ciária similar àquela da hemocianina (Marusek et al. (2006) J Inorg Biochem. 100(1): 108-23, aqui incorporado por referência na íntegra, particularmente com relação à descrição de características estruturais conservadas de oxidases de polifenol). - A sequência de aminoácido de um número considerável de PPOs, sobre plantas, fungos e outros organismos derivados de clonagem da enzima, i foi agora publicada e muitos dos relatos e revisões fornecem tal informação comparativa, por exemplo, van Gelder et al. (1997) Phytochemistry 45: 1309— 1323; Wichers et al. (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 61: 336-341; Cho et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100: 10641-10646; Marusek et al. (2006) J Inorg Biochem. 100(1): 108-23; Halaouili et al. (2006) J. Appl. Microbiol. 100: 219—232; Hernandez-Romero et al. (2006) FEBS J. 273: 257270; Nakamura et al. (2000) Biochem. J. 350: 537—545; e Matoba et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 8981-8990, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra. Enzimas oxidases de polifenol foram isoladas de mamíferos, pássaros, peixe, insetos, répteis, anfíbios, fungos e bactérias.

A oxidase de polifenol existe em determinadas espécies como uma forma de pró-oxidase de polifenol ou zimógeno e também acredita-se que pro- teases estejam envolvidas na ativação da forma de pró-oxidase de polifenol. Acredita-se que essas proteases sejam induzidas por atividade microbiana e também sugere que essas enzimas podem ser ativadas por uma protease do hospedeiro após um evento de infecção ou invasão. Metabólitos secundários, tais como glucanas, glicoproteínas, laminarinas, lipopolissacarídeos, etc., pro-

. 10/97 duzidos pelos organismos também podem induzir à ativação de pró-oxidase de polifenol por proteases. Esses metabólitos também são capazes de ativação da pró-oxidase de polifenol mesmo na ausência de atividade proteolítica.

Em várias espécies de planta, genes de oxidase de polifenol são codificados dentro do núcleo e sofrem tradução dentro do citoplasma. Uma vez formada, a pró-oxidase de polifenol é transportada para o cloroplasto, onde ela sofre clivagem proteolítica para produzir a forma de oxidase de polifenol ativa (Vaughn et a/l., 1988, Physiol. Plant., 72: 659-665).

Mono-oxigenases de monofenol Mono-oxigenase de monofenol (EC 1.14.18.1; número CAS: 9002- 10-2) catalisa a hidroxilação de monofenóis em o-difenóis. A enzima é referida como tirosinase em animais, uma vez que a L-tirosina é o principal substrato monofenólico. A tirosina, por outro lado, a qual é um mono-hidróxi fenol, é um - aminoácido importante. Hidroxilação de tirosina leva à formação de di- hidroxifenilalanina (DOPA).

Í Em plantas, a enzima é algumas vezes referida como cresolase em virtude da capacidade da enzima de utilizar o substrato monofenólico, cresol. À mono-oxigenase de monofenol é também conhecida como mono-oxigenase de monofenol, dopa oxidase, oxidase de fenol|, fenoloxidase, fenoloxidase A, feno- loxidase Be tirosinase.

A estrutura cristalográfica de uma tirosinase derivada de Strep- tomyces em complexo com uma assim denominada "proteína caddie" é descrita em Matoba et al (2006) J. Biol. Chem. 281(13): 8981-8990, o qual é incorpora- do por referência na íntegra.

Oxidases de Difenol A oxidase de difenol (EC 1.10.3.1; número CAS: 9002-10-2) é uma enzima que catalisa a oxidação de fenóis, tal como catecol. Oxidases de difeno! também são conhecidas como oxidase de catecol, oxidase de polifeno! e polife- noloxidase. A oxidase de difenol realiza a oxidação de fenóis, tal como catecol|, usando dioxigênio (O>). Na presença de catecol, a benzoquinona é formada. Hidrogênios removidos do catecol se combinam com o oxigênio para formar água.

- 11/97 | A oxidase de catecol é uma enzima contendo cobre cuja atividade é similar àquela da tirosinase, uma classe relacionada de oxidases de cobre.

A lacase (oxidase de p-difenol, E.C. 1.10.3.2) (DPO) é um tipo de oxidase de polifenol contendo cobre.

Ela tem a capacidade única de oxidar p- difenóis, assim, permitindo que ela seja distinta das oxidases de o-difenol, tal como oxidase de catecol.

Vários substratos fenólicos, incluindo metóxi- polifenóis, ocorrem em muitos fungos fitopatogênicos e em determinadas plan- tas superiores (Mayer e Harel, 1991, Phenoloxidase and their significance in fruit and vegetables.

Em P.F.

Fx, ed.

Food Enzymology, página 373. Londres, Elsevier). Moléculas de ácido nucleico e variantes e fragmentos das mesmas Um aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico isoladas ou recombinantes compreendendo sequências de nucleotídeo que co- - dificam proteínas e polipeptídeos nematicidas ou porções biologicamente ativas dosmesmos, bem como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como 7 sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codifi- cam proteínas com regiões de homologia de sequência.

Conforme usado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico" se destina a incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (porexemplo, mMRNA)&e análogos do DNA ou RNA gerado usando análogos de nucleotídeo.

A molécula de ácido nucleico pode ser fita simples ou fita dupla mas, de preferência, é DNA fita dupla.

Uma molécula de ácido nucleico ou proteína "isolada" ou "purifica- da" ou porção biologicamente ativa do mesma, é substancialmente isenta de —outromaterial celular ou meio de cultura quando produzida por meio de técni- cas recombinantes ou substancialmente isenta de precursores químicos ou ou- tros produtos químicos quando quimicamente sintetizada.

De preferência, um ácido nucleico "isolado" é livre de sequências (de preferência sequências de codificação de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA ge- nômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado.

Para fins da inven- ção, "isolado", quando usado para referir-se a moléculas de ácido nucleico, ex-

e 12/97 Clui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína nematicida pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeo que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado. Uma proteína nematicida que é substancialmente isenta de material celular inclui preparados de proteína tendo menos de cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteína não nematicida (também referida aqui como uma "proteína de con- taminação").

Sequências de nucleotídeo que codificam as proteínas da presente invenção incluem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1,2,3,6,7,10,11, 12,15, 16, 17, 19, 21, 45 ou 46 e variantes, fragmentos e complementos das mesmas. Por "complemento" entenda-se uma sequência de nucleotídeo que é - significativamente complementar a uma determinada sequência de nucleotídeo, demodo que ela pode se hibridizar à determinada sequência de nucleotídeo i para, desse modo, formar uma dupla estável. A sequência de aminoácido cor- respondente para a proteína nematicida codificada por essa sequência de nu- cleotídeo é apresentada em SEQ ID NO: 4, 5, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou

49.

Moléculas de ácido nucleico que são fragmentos dessas sequên- cias de nucleotídeo que codificam proteínas nematicidas também são abrangi- das pela presente invenção. Por "fragmento" entenda-se uma porção da se- quência de nucleotídeo que codifica uma proteína nematicida. Um fragmento de uma sequência de nucleotídeo pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína nematicida ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR usando métodos divulga- dos abaixo. Moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína nematicida compreendem pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, — 1300,1350,1400 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos pre- sentes em uma sequência de nucleotídeo de comprimento total que codifica uma proteína nematicida divulgada aqui, dependendo do uso pretendido. Por

. 13/97 nucleotídeos "contíguos" entenda-se resíduos de nucleotídeo que são imedia- tamente adjacentes uns aos outros. Fragmentos das sequências de nucleotídeo da presente invenção codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nematícida e, consequentemente, retêm atividade nemati- cidae de oxidase de polifenol. Por "retém a atividade" entenda-se que o fragmento terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade de oxidase de polife- nol e/ou nematicida da proteína de referência.

Métodos para medição de resistência a nematoide ou atividade nematicida são descritos, por exemplo, nas Publicações de Patente Nos. 20050191714 e 20080153102, bem como nos Exemplos Experimentais forneci- dos aqui. Métodos para medição de atividade de oxidase de polifenol incluem, por exemplo, detecção da presença de o-quinona produzida em uma reação V enzimática da oxidase de polifenol sobre a tirosina. A oxidase de polifenol oxida atirosina a qual, por sua vez, é oxidada em o-quinona. A última é acompanha- ' da por um aumento na absorbância a 280 nm. A taxa de aumento é proporcio- nal à concentração de enzima e é linear durante um período de 5-10 minutos após um retardo inicial. Uma unidade causa uma alteração na absorbância a 280 nm de 0,001 por minuto a 25 ºC, pH de 6,5 sob as condições especifica- das.

Um fragmento de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína nematicida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção codificará pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína nematicida de comprimento total da invenção.

Proteínas nematicidas preferidas da presente invenção são codifi- cadas por uma sequência de nucleotídeo suficientemente idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 2,3,6,7,10,11,12,15, 16,17, 19,21,45 ou 46 0uuma sequência de nucleotídeo que codifica um aminoácido suficiente- mente idêntico à SEQ ID NO: 4, 5, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49. Por "suficientemente idêntica" entenda-se uma sequência de aminoácido ou nucleo-

p 14/97 tídeo que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência comparado com uma se- quênciadereferência usando um dos programas de alinhamento descritos aqui usando parâmetros padrões. Aqueles versados no campo reconhecerão que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identi- dade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleo- tídeo levando-se em conta a degenerescência do código genético, similaridade de aminoácido, posicionamento do quadro de leitura e semelhantes.

Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácido ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ótima. A identidade percentual entre as duas sequências é uma á função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posi- Ê ções (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as du- as sequências são do mesmo comprimento. Em outra modalidade, a identidade percentual é calculada através da totalidade da sequência de referência (isto é, a sequência divulgada aqui como SEQ ID NOS: 1-22 e 45-49). A identidade percentualentre duas sequências pode ser determinada usando técnicas simi- lares àquelas descritas abaixo, com ou sem a permissão de gaps. No cálculo da identidade percentual, tipicamente, combinações exatas são contadas.

A determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser feita usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo de umalgoritmomatemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschu! (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, modi- ficado conforme em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. Buscas de nucleotídeo no BLAST — podem ser realizadas com o programa BLASTN, escore = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. Buscas de proteína pelo BLAST podem ser realiza-

- 15/97 das com o programa BLASTX, escore = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da inven- ção.

Para obter alinhamentos com gaps para fins de comparação, o Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et a/. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser u- sado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre mo- léculas.

Vide Altschul ef al. (1997) supra.

Quando de utilização dos programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros de default dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados.

Alinhamento também pode ser realizado manualmente através de inspeção.

Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Higgins et a/. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). O ClustalW compara sequências e alinha a - totalidade da sequência de aminoácido ou DNA e, assim, pode fornecer dados arespeitoda conservação de sequência de toda a sequência de aminoácido.

O ' algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácido comercialmente disponíveis, tal como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após alinha- t mento das sequências de aminoácido com o ClustalW, a identidade percentual de aminoácido pode ser avaliada.

Um exemplo não limitativo de um programa de software útil para análise de alinhamentos pelo ClustalW é o GENEDOC'Y, O GENEDOCY (Karl Nicholas) permite avaliar a similaridade e identidade de aminoácido (ou DNA) entre múltiplas proteínas.

Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algo- ritmode Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), o qual é parte do GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível da Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EUA). Quando de utilização do programa ALIGN para compa- ração de sequências de aminoácido, uma tabela de resíduos ponderada —PAMI120, uma penalidade por extensão de gap de 12 e uma penalidade por gap de 4 pode ser usada.

A menos que de outro modo estabelecido, o GAP Versão 10, o qual

- 16/97 usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J.

Mol.

Biol. 48(3): 443-453, será usado para determinar a identidade ou similaridade de sequência usando os parâmetros a seguir: identidade % e similaridade % para uma sequência de nucleotídeo usando um peso de GAP de 50 e Peso por Comprimento de 3 e a matriz de escore nwsgapdna.cmp; identidade % ou similaridade % para uma sequência de aminoácido usando um Peso de GAP de 8 e peso por compri- mento de 2 e o programa de escore BLOSUMG62. Programas equivalentes po- dem também ser usados.

Por "programa equivalente" entenda-se qualquer pro- grama de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo correspondências de resíduo de nucleotí- deo idênticas e uma identidade de sequência percentual idêntica quando com-

parado com o alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10. Ainvenção também abrange moléculas de ácido nucleico variantes. - Sequências de nucleotídeo que codificam "variantes" da proteína nematicida incluem aquelas sequências que codificam as proteínas nematicidas divulgadas Ú aqui, mas diferem conservativamente em virtude da degenerância do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas, conforme dis- cutido acima.

Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identifi- cadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem-conhecidas, tais como reaçãoem cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme esboçado acima.

Sequências de nucleotídeo variantes também incluem se- quências de nucleotídeo sinteticamente derivadas que tenham sido geradas, por exemplo, usando mutagênese de sítio-dirigida, mas as quais ainda codifi- cam as proteínas nematicidas divulgadas na presente invenção, conforme dis- —cutidoabaixo.

Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são bio- logicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade desejada da proteína nativa, isto é, atividade de oxidase de polifenol e/ou nematicida.

Por "reter atividade" entenda-se que as variantes terão pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de — 80%da atividade nematicida e/ou atividade de oxidase de polifeno! da proteina de referência.

Aqueles versados no campo reconhecerão que variantes podem ter um aumento ou diminuição em uma atividade (por exemplo, nematicida ou

. 17/97 oxidase de polifenol) sem afetar ou afetando apenas minimamente a outra ativi- dade. Por exemplo, proteínas variantes podem mostrar atividade nematicida aprimorada com relação à proteína nativa sem aprimoramentos concomitantes na atividade de oxidase de polifenol e vice-versa. A menos que de outro modo especificado, proteínas variantes terão pelo menos 30% de cada atividade com relação à proteína nativa. Métodos para medição dessas atividades são descri- S tas em alguma parte aqui.

Aqueles versados no campo ainda apreciarão que alterações po- dem ser introduzidas por meio de mutação das sequências de nucleotídeo da invenção, desse modo, levando a alterações na sequência de aminoácido das proteínas nematicidas conservadas, sem alterar a atividade biológica das prote- íÍnas. Assim, moléculas de ácido nucleico variantes isoladas podem ser criadas introduzindo uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeo na - sequência de nucleotídeo correspondente divulgada aqui, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido sejam introduzidas na Ô proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por meio de técnicas pa- drões, tais como mutagênese de sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeo variantes também são abrangidas pela presen- te invenção.

Por exemplo, substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais previstos. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado com relação à sequência do tipo silvestre de uma proteína nematicida sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é re- — queridopara atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservati- va" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia similar. Famílias de resíduos de aminoácido ten- do cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidi- na), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glu- tamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por

- 18/97 exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptofano, histidina). Substituições de aminoácido podem ser feitas em regiões não con- servadas que retêm a função. Em geral, tais substituições não serão feitas para resíduos de aminoácido conservados ou para resíduos de aminoácido que resi- demdentrode um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que po- dem ser essenciais para atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de to- xinas similares ou relacionadas a sequências da invenção (por exemplo, resí- duos que são idênticos entre todas as proteínas contidas no alinhamento nas figuras 3 e 4). Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácido conservativas e ainda reter atividade in- cluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre - todas as proteínas contidas no alinhamento de toxinas similares ou relaciona- dasàssequências da invenção (por exemplo, resíduos que têm apenas substi- Ô tuições conservativas entre todas as proteínas contidas nas figuras 3, 4 e 5). Contudo, aqueles versados no campo entenderão que variantes funcionais po- dem ter alterações conservadas ou não conservadas mínimas nos resíduos conservados.

Alternativamente, sequências de nucleotídeo variantes podem ser feitas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte da se- quência de codificação, tal como através de mutagênese por saturação e os mutantes resultantes podem sofrer triagem quanto à capacidade de conferir atividade nematicida para identificar mutantes que retêm atividade. Após muta- gênese,a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente e a ativi- dade da proteína pode ser determinada usando técnicas padrões de ensaio.

Usando métodos tais como PCR, hibridização e semelhantes, se- quências nematicidas correspondentes podem ser identificadas, tais sequên- cias tendo identidade substancial às sequências da invenção. Vide, por exem- plo, Sambrooke Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

- 19/97 Alternativamente, sequências de oxidase de polifenol podem ser identificadas usando qualquer número de sequências de oxidase de polifenol conhecidas na técnica. Em um método de hibridização, toda ou parte da sequência de nu- — cleotíideonematicida pode ser usada como triagem de cDNA ou bibliotecas ge- nômicas. Métodos para construção de tais bibliotecas de cCDNA e genômicas são, em geral, conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook e Russell, 2001, supra. As assim denominadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser rotuladas com um grupo detectável, tal como *?P ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. Sondas para hibridização podem ser feitas rotulando oligonucleotídeos sintéticos baseados - na sequência de nucleotídeo que codifica proteína nematicida conhecida divul- gadaaqui Iniciadores degenerados criados com base em resíduos de nucleotí- deo ou aminoácido conservados na sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido codificada podem ser adicionalmente usados. A sonda compreen- . de, tipicamente, uma região de sequência de nucleotídeo que se hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pe- lomenos cerca de 50, 75,100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína nematicida da invenção ou um fragmento ou variante da mesma. Métodos para o preparo de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na técnica e são divulgados em Sambrook e Russell, 2001, supra, aqui incorporado por referência.

Por exemplo, uma sequência de proteína nematicida inteira divul- gada aqui ou uma ou mais porções da mesma podem ser usadas como uma sonda capaz de se hibridizar especificamente a sequências semelhantes à pro- teina nematicida correspondentes e RNAs mensageiros. Para obter hibridiza- ção específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequên- cias que são únicas e têm, de preferência, pelo menos cerca de 10 nucleotí- deos de comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimen- to. Tais sondas podem ser usadas para amplificar sequências nematicidas cor-

- 20/97 respondentes de um organismo escolhido através de PCR.

Essa técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de se- quências de codificação em um organismo.

Técnicas de hibridização incluem triagem por hibridização de bibliotecas de DNA em lâminas (quer placas ou co- lônias; vide, por exemplo, Sambrook et a/. (1989) Molecular Cloning: A Labora- tory Manual (2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). A hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condições estringentes.

Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estrin- gentes" entenda-se condições sob as quais uma sonda se hibridizará à sua se- quência-alvo em um grau detectavelmente maior do que a outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes com relação à base). Condições estringen- ” tes são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstân- cias.

Controlando a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, Ú sequências-alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identifica- das (hibridização homóloga). Alternativamente, as condições de estringência : podem ser ajustadas para permitir alguma correspondência errônea nas se- quências, de modo que menores graus de similaridade sejam detectados (hibri- dização heteróloga). Em geral, uma sonda tem menos de cerca de 1000 nu- cleotídeos de comprimento, de preferência menos do que 500 nucleotídeos de comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é íons de Na a menos de cerca de 1,5 M, tipicamente uma concentração de íons de Na de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) em um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30ºC para sondas cur- tas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60ºC para son- das longas (por exemplo, mais de cerca de 50 nucleotídeos). Condições estrin- gentes podem também ser obtidas com a adição de agentes de desestabiliza- —ção,talcomoformamida.

Condições de baixa estringência exemplificativas in- cluem hibridização com uma solução tampão de formamida a 30 a 50%, NaCl a 1 M, SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% a 37º C e uma lavagem em 1X a 2X

- 21/97 SSC (20X SSC = NaCl a 3,0 M/citrato trissódico a 0,3 M) a 50 a 55ºC. Condi- ções de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em for- mamida a 40 a 45%, NaCl a 1,0 M, SDS a 1% a 37ºC e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 a 60ºC. Condições de alta estringência exemplificativas incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37ºC e uma lava- gem em 0,1X SSC a 60 a 65ºC. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender SDS a cerca de 0,1% a cerca de 1%. A duração de hibridização é, em geral, menos de cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

A especificidade é, tipicamente, a função de lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a resistência iônica e temperatura da so- lução final de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, a Tn pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: - Tm = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde Mé a — molaridade de cátions monovalentes, % GC é o percentual de nucleotídeos de : guanosina e citosina no DNA, % form é o percentual de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de base. ATr é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% de uma se- quência-alvo complementar se hibridizam a uma sonda perfeitamente corres- — pondente.ATh é reduzida em cerca de 1ºC para cada 1% de correspondência errônea; assim, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajusta- . das para se hibridizar a sequências de identidade desejada. Por exemplo, se sequências com >90% de identidade são consideradas, a Tr pode ser diminuí- da 10ºC. Em geral, condições estringentes são selecionadas para serem cerca deS5ºCmenoresdo que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência especí- fica e seu complemento em uma resistência iônica e pH definidos. Contudo, condições rigorosamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou la- vagem a 1, 2,3 ou 4ºC menor do que o ponto de fusão térmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7,8,90u10ºC menor do que o ponto de fusão térmica (Tm); condições de bai- xa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13,14, 15 ou 20ºC menor do que o ponto de fusão térmica (Tm). Usando a equação,

. 22/97 composições de hibridização e lavagem e a Tr, desejada, aqueles versados no campo entenderão que variações na estringência das soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de combinação errônea resulta em uma Tr, de menos de 45ºC (solução aquosa) ou 32ºC (solu- çãodeformamida), é preferido aumentar a concentração de SSC, de modo que uma maior temperatura possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte |, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et a/., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York). Vide Sambrook et a/. (1989) Molecular Cloning: A La- boratory Manual (2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). - Proteínas isoladas e variantes e fragmentos das mesmas Proteínas nematicidas são também abrangidas dentro da presente Í invenção. Por "proteína nematicida" entenda-se uma proteína tendo a sequên- cia de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, 8, 14, 18, 20, 22 ou 48. E Fragmentos, porções biologicamente ativas e variantes dos mesmos são tam- bém proporcionados e podem ser usados na prática dos métodos da presente invenção.

"Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos polipeptídicos compreendendo sequências de aminoácido suficientemente idênticas à sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, 5, 8, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49 e que exibem atividade de oxidase —depolifenol e/ou nematicida. Em algumas modalidades, os fragmentos biologi- camente ativos exibem atividade de oxidase de polifenol e nematicida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína nematicida pode ser um polipeptídeo, isto é, por exemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais ami- noácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser pre- —paradaspormeio de técnicas recombinantes e avaliadas com relação à ativida- de nematicida e/ou de oxidase de polifenol. Métodos para medição de atividade nematicida e atividade de oxidase de polifenol são descritos em alguma parte

- 23/97 aqui. Conforme usado aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoá- cidos contíguos de SEQ ID NO: 4, 5, 8, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49. A in- venção abrange outros fragmentos, contudo, tal como qualquer fragmento de proteína de mais de cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 ou 300 amino- ácidos contíguos.

Por "variantes" entenda-se proteínas ou polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 5,8, 13,14,18,20,22,47,48 ou49. Variantes também incluem polipeptídeos codi- ficados por uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza à molécula de áci- do nucleico de SEQ ID NO: 1, 2,3,6,7,10, 12, 15, 16, 17, 19, 21, 45 ou 46 ou um complemento da mesma, sob condições estringentes. Variantes incluem - polipeptídeos que diferem quanto à sequência de aminoácido em virtude de —mutagênese. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biolo- À gicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica deseja- da da proteína nativa, isto é, retendo a atividade nematicida e/ou atividade de D oxidase de polifenol. Em algumas modalidades, as variantes exibem atividade de oxidase de polifenol e nematicida.

Genes bacterianos, tais como alguns dos novos genes divulgados aqui, muito frequentemente possuem múltiplos códons iniciais de metionina em proximidade com o início do quadro de leitura aberta. Frequentemente, o início de tradução em um ou mais desses códons iniciais levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons iniciais podem incluir códons ATG. Contudo, algumas bactérias também reconhecem o códon GTG como um códon inicial e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, muitas vezes não é determinado, a priori, quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Assim, pretende-se que o uso de um dos códons de metionina alternativos também possa levar à geração de proteínas nematicidas. Essas proteínas nematicidas são abrangidas na presente invenção e podem ser usadas nos métodos da presente invenção.

Anticorpos aos polipeptídeos da presente invenção ou a variantes

- 24/97 ou fragmentos dos mesmos também são abrangidos. Métodos para produção de anticorpos são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Harlow e La- ne (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente U.S. No. 4.196.265).

Variantes alteradas ou aprimoradas É reconhecido que sequências de DNA de uma proteína nematicida podem ser alteradas através de vários métodos e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácido diferentes daquelas codificadas por uma proteína nematicida da presente invenção. Essa proteína pode ser alterada de várias formas, incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácido de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca - de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25,cercade 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de Í 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca l de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido. Métodos para tais manipulações são, em geral, conhecidos na téc- nica. Por exemplo, variantes de sequência de aminoácido de uma proteína ne- maticida podem ser preparadas através de mutações no DNA. Isso pode tam- bém ser realizado através de uma de várias formas de mutagênese e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na sequência deaminoácido não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais vari- antes possuem a atividade nematicida desejada. Contudo, deve ser entendido que a capacidade de uma proteína nematicida de conferir atividade nematicida pode ser aprimorada mediante o uso de tais técnicas sobre as composições da presente invenção. Por exemplo, pode-se expressar uma proteína nematicida emcélulashospedeiras que exibem altas taxas de incorporação errônea duran- te replicação de DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após pro- pagação em tais cepas, pode-se isolar o DNA (por exemplo, preparando DNA

. 25/97 de plasmídeo ou amplificando através de PCR e clonando o fragmento de PCR resultante em um vetor), cultura das mutações de proteína nematicida em uma cepa não mutagênica e identificação de genes com mutação com atividade ne- maticida, por exemplo, realizando um ensaio para testar a atividade nematicida.

Emgeral,aproteina é misturada e usada em ensaios de alimentação. Vide, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293. Tais ensaios podem incluir contato de plantas com uma ou mais pestes e determina- ção da capacidade da planta de sobreviver e/ou causar a morte das pestes.

Alternativamente, alterações podem ser feitas na sequência de pro- teínade muitas proteínas no amino ou carbóxi término sem afetar substancial- mente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introdu- zidas através de métodos moleculares modernos, tal como PCR, incluindo am- plificações por PCR que alteram ou prolongam a sequência de codificação de - proteína em virtude de inclusão de sequências de codificação de aminoácido —nosoligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as Ô sequências de proteína adicionadas podem incluir sequências de codificação de proteína inteiras, tais como aquelas comumente usadas na técnica para ge- : rar fusões de proteína. Tais proteínas de fusão são, frequentemente, usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domíniode ligação, atividade enzimática ou epitopo para facilitar a purificação de proteína, detecção de proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica, (3) objetivar a secreção ou tradução de uma proteína a uma organela subcelular, tal como o espaço periplásmico de bactérias Gram-negativas ou o retículo endoplásmico de células eucariotas, o último dos quais resulta em gli- cosilaçãoda proteína.

Sequências de aminoácido e nucleotídeo variantes da presente in- venção também abrangem sequências derivadas de procedimentos mutagêni- cos e recombinogênicos, tal como embaralhamento de DNA. Com tal procedi- mento, uma ou mais diferentes regiões de codificação de proteína nematicida podem ser usadas para criar uma nova proteína nematicida tendo as proprie- dades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinan- tes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequência

'" 26/97 relacionada compreendendo regiões de sequência que têm identidade de se- quência substancial e podem ser homologamente recombinados in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem, motivos de sequência que codifi- cam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre um gene nemati- cidadainvenção e outros genes nematicidas conhecidos para obter um novo gene que codifica uma proteína com uma propriedade de interesse aprimorada, tal como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para tal embaralha- mento de DNA são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389- 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; e Patentes U.S. Nos.

5.605.793 e 5.837.458. - Troca ou embaralhamento de domínio é outro mecanismo para a geraçãode proteínas nematicidas alteradas. Os domínios podem ser trocados Í entre proteínas nematíicidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade nematicida ou espectro-alvo aprimorado. Métodos para a geração de BR proteínas recombinantes e testagem das mesmas quanto à atividade nematici- da são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Naimov et al. (2001) —Appl. Environ. Microbiol. 67: 5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958; Schnepf ef al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20923-20930; Rang et a/. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 2918-2925). Manipulação de sítio de clivagem de protease Em várias modalidades da presente invenção, uma sequência de nucleotídeo que codifica um fragmento de clivagem da oxidase de polifenol de comprimento total é expressa na célula hospedeira de interesse. Em outras modalidades, as sequências de nucleotídeo que codificam as sequências de oxidase de polifenol são modificadas para adicionar ou remover sequências que codificam sítios de clivagem proteolítica. Por exemplo, algumas oxidases de polifeno! de comprimento total, tais como AXN-1 e AXN-8, são precursores ina- tivos, os quais requerem truncamento proteolítico para proporcionar uma toxina

. 27/97 que é ativa contra SCN.

Por exemplo, AXN-8 de comprimento total expressa em E. coli não é ativa contra SCN mas, quando ela é tratada com tripsina, uma porção C-terminal da proteína é removida, proporcionando uma proteína trun- cada ativa.

Quando a AXN-8 foi expressa em E. coli na forma truncada, ativida- desobreSCN nãofoiobservada, sugerindo que toda a sequência pode ser ne- cessária de forma que a proteína enovele apropriadamente quando ela é sinte- tizada.

Além disso, embora não estando preso à qualquer teoria ou mecanismo particular, também é possível que uma oxidase de polifenol ativa possa catali- sar a produção de compostos que poderiam ser tóxicos para a planta ou ani- mais (outros que não a peste de interesse, por exemplo, nematoides) que se alimentam sobre a planta.

Expressão de uma proteína inativa de comprimento total impede que isso ocorra até que a enzima seja ativada por truncamento proteolítico.

Essa ativação ocorreria apenas quando um nematoide infesta a - planta e apenas na área onde o nematoide está localizado.

Uma vez que o ne- matoideé morto pela toxina, nenhuma outra oxidase de polifenol ativa será

É produzida porque nenhuma outra protease é produzida pelo nematoide.

Se uma proteína de comprimento total inativa é expressa em uma . planta por qualquer uma das razões descritas acima, então, ela deve ser prote- oliticamente truncada de forma a mostrar toxicidade contra SCN ou outros ne- —matoides parasíticos de planta.

É possível que proteases de planta realizem a ativação pelo menos até certo ponto, mas ativação mais completa poderia ser obtida se as proteases produzidas pelos nematoides forem capazes de trunca- mento da proteína.

Se é desejável que a oxidase de polifenol permaneça inativa até que um nematoide infecte a planta (por exemplo, como uma forma de pre- veniracatálisede reações químicas que poderiam produzir compostos tóxicos para a planta ou organismos não-alvo), então, qualquer sítio de truncamento que ocorre naturalmente na proteína que é capaz de ser clivada por proteases de planta pode sofrer mutação de modo a não ser mais clivado.

Em qualquer caso, a sequência da oxidase de polifenol pode ser modificada (ou adicional- mentemodificada), de modo que ela contenha um sítio de reconhecimento para proteases de nematoide no local de truncamento apropriado.

Esse local pode ser determinado através de análise de sequência da toxina ativa isolada de sua

' 28/97 fonte natural ou através de análise de sequência de toxina ativa produzida por meio de tratamento da proteína de comprimento total com proteases capazes de realizar o truncamento, tal como tripsina no caso de AXN-8. A escolha do sítio de reconhecimento de protease dependerá das proteases que são secre- tadaspelonematoide na planta ou que estão presentes dentro do sistema di- gestivo do nematoide.

Esse sítio pode ser determinado por meio de isolamento de proteases e determinando-se sua especificidade de substrato ou sequenci- amento de genes do nematoide ou de uma biblioteca de cCDNA preparada a par- tir de MRNA extraído do nematoide e determinando-se a quais famílias de pro- teaseogene pertence.

Uma protease secretada ativará a toxina na planta, en- quanto que uma protease no sistema digestivo de protease ativará a toxina a- pós ela ser ingerida.

Foi mostrado que células de glândula esofageal do nematoide do - cisto de soja expressam uma proteinase de cisteína putativa (acesso ao Gen- bankAF345792). Essa proteinase cai na família de Peptidase C13, a qual con- : siste em endopeptidases de asparaginil cisteína (proteases que clivam especifi- camente após resíduos de asparagina). Em um exemplo da presente invenção, ' uma oxidase de polifenol expressa em uma planta transgênica poderia ser tor- nada ativada por SCN alterando a sequência da oxidase de polifenol, de modo queelacontenha um resíduo de asparagina no sítio de truncamento que resulta em uma enzima ativa.

Embora não limitado a qualquer teoria ou mecanismo particular, essa versão da oxidase de polifenol poderia proporcionar maior ativi- dade do que a enzima do tipo silvestre porque ela seria totalmente ativada na presença de SCN.

Além disso, ela poderia permanecer inativa na ausência de —SCN,dessemodo, evitando o acúmulo de produtos químicos de reações catali- sadas pela enzima.

Se um sítio de reconhecimento para proteases de planta está presente na proteína, ele pode sofrer mutação, de modo que apenas as proteases de nematoide são capazes de realizar o truncamento.

Uma abordagem similar pode ser realizada para qualquer peste- alvo.

O sítio de truncamento da oxidase de polifenol pode ser modificado, de modo que ele seja suscetível a truncamento por proteases produzidas pela pes- te-alvo.

- 29/97 Vetores Uma sequência de oxidase de polifenol da invenção (ou quaisquer outras sequências de oxidase de polifenol conhecidas na técnica) pode ser pro- porcionada em um cassete de expressão para expressão em uma planta de interesse. Em várias modalidades, a sequência da oxidase de polifenol é sele- cionada de qualquer oxidase de polifenol conhecida na técnica. Em outra moda- lidade, a oxidase de polifenol é selecionada da oxidase de polifeno! derivada de espécies Trichoderma reesei, Bacillus thuringiensis, Glycine Max, Zea maize, Streptomyces castaneoglobisporus, Neurospora crassa.

Por "cassete de expressão de planta" entenda-se um construto de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína a partir de um quadro de leitura aberta em uma célula de planta. Tipicamente, esse contém um promotor e uma sequência de codificação. Frequentemente, tais construtos - também conterão uma região não traduzida 3'. Tais construtos podem conter uma"sequência sinalizadora" ou "sequência líder" para facilitar o transporte co- traducional ou pós-traducional do peptídeo a determinadas estruturas intracelu- lares, tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplásmico ou : aparelho de Golgi. Por"sequência sinalizadora" entenda-se uma sequência que é co- —nhecidaou que se suspeita resultar em transporte de peptídeo cotraducional ou pós-traducional através da membrana celular. Em eucariotas, isso envolve, tipi- camente, secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Toxinas pesticidas de bactérias são frequentemente sintetizadas como pró- toxinas, as quais são proteoliticamente ativadas no intestino da peste-alvo (Chang(1987) Methods Enzymol. 153: 507-516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência sinalizadora está localizada na sequência nati- va ou pode ser derivada de uma sequência da invenção. Por "sequência líder" entenda-se qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma se- quência de aminoácido suficiente para disparar o transporte cotraducional da — cadeiapeptídicaa uma organela subcelular. Assim, isso inclui sequências líde- res que objetivam o transporte e/ou glicosilação por meio de passagem a vacú- olos, plastídeos, incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes.

- 30/97

Por "vetor de transformação de planta" entenda-se uma molécula de DNA que é necessária para transformação eficiente de uma célula de planta.

Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressão de planta e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA "vetor". Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de planta que utilizam dois veto- res de DNA não contíguos codificam todas as funções de cis- e trans-atuação requeridas para transformação eficiente de uma célula de planta (Hellens e Mul- lineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). "Vetor" refere-se a um construto de ácido nucleico projetado para transferência entre diferentes células hospedeiras. "Vetor de expressão" refere-se a um vetor que tem a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências ou fragmentos de DNA heterólo- go em uma célula estranha.

O cassete incluirá sequências regulatórias 5' e 3' operavelmente ligadas a uma sequência da invenção.

Por "operavelmente liga- - das" entenda-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda se- quência, em que a sequência promotora inicia e media a transcrição da se- À quência de DNA correspondendo à segunda sequência.

Em geral, operavel- . mente ligada significa que as sequências de ácido nucleico que estão sendo , ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

O cassete pode, adicio- —nalmente, conter pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no orga- nismo.

Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser proporciona- do(s) sobre múltiplos cassetes de expressão.

Em várias modalidades, a inven- ção abrange células hospedeiras compreendendo o inserto dos vetores.

Por "inserto dos vetores" entenda-se a sequência de DNA compreendendo o(s) ge-

—ne(s)dainvenção que é integrado no genoma da célula hospedeira. "Promotor" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que fun- ciona para dirigir a transcrição de uma sequência de codificação a jusante.

O promotor junto com outras sequências de ácido nucleico regulatórias transcri- cionais e traducionais (também denominadas "sequências de controle") são — necessários para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

Os promotores podem ser constitutivos ou induzíveis ou podem ser funcionais a- penas em determinadas partes de planta.

Em várias modalidades, o promotor é

- 31/97 um promotor raiz-específico (por exemplo, FaRB7, Vaughan (2006) J. Exp. Bot. 57: 3901-3910). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específi- co ao local de alimentação (por exemplo, TobRB7, Opperman (1994) Science 263(5144): 221-223).

Talcassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da sequência nematicida que está sob a regulação transcricional das regiões regulatórias.

O cassete de expressão incluirá a direção 5'-3', uma região de iní- cio de transcrição e tradução (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção e uma região de término de tradução e transcrição (isto é, região de término) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo ou estra- nho ou heterólogo ao hospedeiro vegetal e/ou uma sequência de DNA da in- venção. Adicionalmente, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternati- . vamente, uma sequência sintética. Onde o promotor é "nativo" ou "homólogo" aohospedeiro vegetal, pretende-se que o promotor seja encontrado na planta ' nativa na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é "estranho" ou "hete- d rólogo" à sequência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja o promotor nativo ou que ocorre naturalmente para a sequência de DNA opera- velmente ligada da invenção.

A região de término pode ser nativa à região de início de transcri- ção, pode ser nativa à sequência de DNA operavelmente ligada de interesse, pode se nativa à planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de DNA de interesse, ao hos- pedeiro vegetal ou qualquer combinação dos mesmos). Regiões de término convenientes estão disponíveis do plasmídeo-Tide A. tumefaciens, tal como as regiões de término de sintase de octopina e sintase de nopalina. Vide também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et a/. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et a/. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al.

(1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Onde apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para ex-

Ê 32/97 pressão aumentada na célula hospedeira transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados usando códons de célula hospedeira preferidos para expressão aprimorada ou podem ser sintetizados usando códons em uma frequência de uso de códon preferida. Em geral, o teor de GC do gene será aumentado. Veja, porexemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para uma discus- são de uso de códon hospedeiro preferido. Métodos estão disponíveis na técni- ca para síntese de genes preferidos de planta. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.380.831 e 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, aqui incorporadas por referência.

Em uma modalidade, a proteína é objetivada ao cloroplasto para expressão. Dessa maneira, onde a proteína não é diretamente inserida no clo- roplasto, o cassete de expressão conterá, adicionalmente, um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar a expressão da proteína - aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Vide, porexemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et Í al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer ef al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.

U 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. O gene a ser objetivado ao cloroplasto pode ser otimizado para ex- pressão no cloroplasto levando-se em conta diferenças no uso de códon entre o núcleo da planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de inte- resse podem ser sintetizados usando códons de cloroplasto preferidos. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.380.831, aqui incorporada por referência. Transformação de planta Métodos da invenção envolvem a introdução de um construto de nucleotídeo em uma planta. Os métodos compreendem introdução de pelo me- nos uma sequência de nucleotídeo que codifica uma enzima oxidase de polife- nol heteróloga em pelo menos uma célula de planta. Em várias modalidades, a oxidase de polifenol é derivada de uma planta. Em outras modalidades, a oxi- — dasede polifenol é derivada de um organismo não vegeta! (por exemplo, fungo, alga, bactéria ou outro micro-organismo não vegetal). A oxidase de polifeno! pode ser uma oxidase de monofenol ou uma oxidase de difenol. Em várias mo-

' 33/97 dalidades, a oxidase de polifenol é selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-22 ou 45-49 ou quaisquer oxidases de polifenol mencionadas na Tabela

18.

Por "introdução" entenda-se apresentar à planta o construto de nu- cleotídeode uma maneira que o construto obtenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que um método parti- cular para introdução de um construto de nucleotídeo em uma planta seja usa- do, apenas que o construto de nucleotídeo obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introdução dos construtos de nucle- otídeoem plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, mé- todos de transformação estável, métodos de transformação transitória e méto- dos mediados por vírus.

Por "planta" entenda-se plantas inteiras, órgãos de planta (por e- - xemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de planta, propágulos, embriões e prole da mesma. Células de planta podem ser diferenciadas e não i diferenciadas (por exemplo, caule, células de cultura em suspensão, protoplas- tos, células de folha, células de raiz, células de floema, pólen).

W "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ou plantas ou células ou tecidos "estavelmente transformados" referem-se a plantas que in- corporaram ou integraram sequências de ácido nucleico exógenas ou fragmentos de DNA na célula de planta. Essas sequências de ácido nucleico incluem aquelas que são exógenas ou não estão presentes na célula de planta não transformada. "Heterólogo" refere-se a sequências de ácido nucleico que não são endógenas à célula ou parte do genoma nativo no qual elas estão pre- senteseforam adicionadas à célula por meio de infecção, transfecção, microin- jeção, eletroporação, microprojeção ou semelhante.

Atransformação de células de planta pode ser realizada através de uma de várias técnicas conhecidas no campo. Os genes de oxidase de polifeno! descritos aqui podem ser modificados para obter ou intensificar a expressão em — célulasde planta. Tipicamente, um construto que expressa tal proteína poderia conter um promotor para acionar a transcrição do gene, bem como uma região não traduzida 3' para permitir término de transcrição e poliadenilação. A organi-

zação de tais construtos é bem-conhecida na técnica.

Em alguns casos, pode ser útil manipular o gene, de modo que o peptídeo resultante seja secretado ou de outro modo objetivado dentro da célula de planta.

Por exemplo, o gene pode ser manipulado para conter um peptídeo sinalizador para facilitar a transferên- ciado peptídeo para o retículo endoplásmico.

Pode também ser preferível ma- nipular o cassete de expressão de planta para conter um íntron, de modo que processamento de mRNA do íntron seja requerido para expressão.

Tipicamente, esse "cassete de expressão de planta" será inserido em um "vetor de transformação de planta". Esse vetor de transformação de — planta pode ser compreendido de um ou mais vetores de DNA necessários para obtenção de transformação de planta.

Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de planta que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo.

Esses vetores são, frequentemente, - referidos na técnica como "vetores binários". Vetores binários, bem como veto- rescom plasmídeos auxiliares são mais frequentemente usados para transfor- mação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e complexidade dos seg- - mentos de DNA necessários para obter transformação eficiente são muito ' grandes e é vantajoso separar funções sobre moléculas de DNA distintas.

Veto- res binários contêm, tipicamente, um vetor de plasmídeo que contém as se- quências de cis-atuação requeridas para transferência de T-DNA (tais como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é manipulado para ser capaz de expressão em uma célula de planta e um "gene de interesse" (um gene manipulado para ser capaz de expressão em uma célula de planta para a qual geração de plantas transgênicas é desejada). Também presentes —sobreesse vetor de plasmídeo são sequências requeridas para replicação bac- teriana.

As sequências de cis-atuação são dispostas de modo a permitir transfe- rência eficiente para células de planta e expressão nas mesmas.

Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene nematicida estão localizados entre as bordas esquerda e direita.

Frequentemente, um segundo vetor de plasmídeo — contém os fatores de trans-atuação que mediam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para as células de planta.

Esse plasmídeo, frequentemente, contém as funções de virulência (genes Vir) que permitem infecção de células de planta por Agrobacterium e transferência de DNA por meio de clivagem nas sequências de borda e transferência de DNA vir-mediada, conforme é entendi- do na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHAT1O1, EHA1OS, etc.) podem ser usados para transformação de planta.

O segundo vetor de plasmídeo não é necessário para transformação das plantas através de outros métodos, tais como microprojeção, microinjeção, eletropora-

ção, polietileno glicol, etc.

Em geral, métodos de transformação de planta envolvem atransfe- rênciade DNA heterólogo para células da planta-alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, caule não diferenciado, proto- plastos, etc.), seguido por aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as - células de planta transformadas a partir de um grupo de massa celular não transformada.

Explantes são, tipicamente, transferidos para um suprimento i fresco do mesmo meio e rotineiramente cultivados.

Substancialmente, as célu- - las transformadas são diferenciadas em brotos após colocação sobre meio de l regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de sele- ção.

Os brotos são, então, transferidos para um meio de enraizamento seletivo pararecuperação do broto enraizado ou plântula.

A plântula transgênica, então, cresce em uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei ef al. (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida et a/. (1996) Nature Biotechno- logy 14: 745-750). Explantes são, tipicamente, transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente.

Uma descrição geral das técnicase métodos para geração de plantas transgênicas é encontrada em A- yres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células, células transformadas e não transformadas estão pre- sentes em qualquer parte do caule ou tecido ou grupo de células-alvo em ques- tão.

A capacidade de matar células não transformadas e permitir que células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas.

Fre- quentemente, a capacidade de remover células não transformadas é uma limi-

tação à recuperação rápida de células de planta transformadas e geração com sucesso de plantas transgênicas.

Protocolos de transformação, bem como protocolos para a introdu- ção de sequências de nucleotídeo em plantas podem variar, dependendo do tipode planta ou célula de planta, isto é, monocot ou dicot, objetivada para transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada através de um de vários métodos incluindo, mas não limitado a, microinjeção, eletropo- ração, transferência gênica direta, introdução de DNA heterólogo através de Agrobacterium em células de planta (transformação mediada por Agrobacteri- um), bombardeamento de células de planta com DNA estranho heterólogo ade- rido a partículas, aceleração de partícula balística, transformação por feixe de aerossol (Pedido Publicado U.S. No. 20010026941; Patente U.S. No.

4.945.050; Publicação International No. WO 91/00915; Pedido Publicado U.S.

- No. 2002015068), transformação com Lec1 e vários outros métodos não medi- adosdiretamente por partícula para transferência de DNA.

Ô Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na - técnica. Vide, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: ' 8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. O método conta com a distribuição de DNA por pistola de partícula contendo um marcador selecionável e objetivação do DNA ao genoma do plastídeo através de recombinação homóloga. Adicio- nalmente, a transformação de plastídeo pode ser realizada por meio de transa- tivação de um transgene abrigado em plastídeo silenciosa através de expres- são de tecido preferida de uma RNA polimerase nuclear codificada e plastídeo- dirigida. Tal sistema foi reportado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.

A integração a seguir de DNA estranho heterólogo em células de planta pode se aplicar a um nível de limiar máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células — putativamente transformadas que sobrevivem a esse tratamento de seleção por meio de transferência regular para um meio fresco. Através de passagem con- tínua e estímulo com seleção apropriada, pode-se identificar e proliferar as células que são transformadas com o vetor de plasmídeo.

Uma série de marcadores foram desenvolvidos para uso com célu- las de planta, tal como resistência ao cloranfenicol, o aminoglicosídeo G418, higromicina ou semelhante. Outros genes que codificam um produto envolvido emmetabolismo de cloroplasto também podem ser usados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, genes que conferem resistência a herbicidas de planta, tais como glifosato, bromoxinil ou imidazolinona podem encontrar uso particular. Tais genes foram reportados (Stalker et a/. (1985) J. Biol. Chem. 263: 6310-6314 (gene de nitrilase de resistência ao bromoxinil); e Sathasivan et a/.

(1990) Nucl. Acids Res. 18: 2188 (gene de resistência a AHAS imidazolinona). Adicionalmente, os genes divulgados aqui são úteis como marcadores para a- valiar a transformação de células bacterianas ou de planta. Métodos molecula- res e bioquímicos podem, então, ser usados para confirmar a presença do gene - heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica. Métodos paradetecção da presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), semente, célula de planta, propágulo, embrião ou prole da mesma são bem-conhecidos na técnica. Em uma modali- . dade, a presença do transgene é detectada por meio de testagem de atividade nematicida. Em outra modalidade, a presença do transgene é detectada testan- do-sea atividade de oxidase de polifenol.

As células que foram transformadas podem ser crescidas em plan- tas de acordo com formas convencionais. Vide, por exemplo, McCormick et a/. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Essas plantas podem, então, ser crescidas e polinizadas com a mesma cepa ou cepas diferentes e o híbrido resultante tendoexpressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, en- tão, sementes colhidas para assegurar que expressão da característica fenotí- pica desejada tenha sido obtida. Dessa maneira, a presente invenção propor- cionasementes transformadas (também referidas como "sementes transgêni- cas") tendo um construto de nucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em seu genoma.

A presente invenção pode ser usada para transformação de quais- quer espécies de planta incluindo, mas não limitado a, monocots e dicots. E- xemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a, milho (mi- lho verde), sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarínica, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, açafrão, amendoins, batata-doce, cassava, café, coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, chá, banana, avocado, figo, guava, manga, oliva, papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, vegetais, ornamentais e coníferas.

Vegetais incluem, mas não estão limitados a, tomates, alface, fei- jões verdes, feijões lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis, tais como abóbora, cantalupo e melão almiscarado. Ornamentais incluem, mas não estão limitados a, azaléia, Hortência, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravo, - bico-de-papagaio e crisântemo. De preferência, plantas da presente invenção sãoplantasde safra (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucífe- Í ras, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba sacarínica, cana-de- - açúcar, tabaco, cevada, colza, etc.). B Avaliação de transformação de planta Após introdução de DNA estranho heterólogo em células de planta, atransformação ou integração de gene heterólogo no genoma de planta ser confirmada através de vários métodos, tal como análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados ao gene integrado.

Análise por PCR é um método rápido de triagem de células, tecidos ou brotos transformados quanto à presença do gene incorporado no estágio precoce antes de plantio no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). PCR é realizada usando iniciadores de oligonucleotídeo específi- cos ao gene de interesse ou uma base de vetor de Agrobacterium, etc.

Atransformação de planta pode ser confirmada por meio de análise Southern blot de DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apro- priadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou "blot" é, então, hibridizada com, por exemplo, DNA-alvo radiorrotulado com *?P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrões (Sambrook e Russell, 2001, supra).

Em análise Northern blot, RNA é isolado de tecidos específicos de transformantes, fracionado em um ge! de agarose/formaldeído e seco sobre um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrões que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). Expressão de RNA codi- ficado pelo gene nematicida é, então, testada por meio de hibridização do filtro auma sonda radioativa derivada de um gene nematicida, através de métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra).

Western blot, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser reali- zados sobre as plantas transgênica para confirmar a presença de proteína codi- - ficada pelo gene nematicida por meio de procedimentos padrões (Sambrook e Russell 2001, supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epitopos presentes na proteína nematicida. , Métodos para triagem e desenvolvimento de plantas com atividade de o- xidase de polifenol Várias espécies de planta são conhecidas por expressar oxidase de polifenol. Em alguns casos, foi mostrado que a expressão de oxidase de polife- nol está associada a desempenho agronômico aprimorado. Por exemplo, foi mostrado que plantas as quais exibem resistência comparativamente alta a es- tresse climático possuem níveis de oxidase de polifeno! relativamente maiores do que variedades suscetíveis (Thipyapong et al. (2007) Molecules 12(8): 1569- 95). Contudo, antes da presente invenção, a resistência à infestação por nema- toide não tinha sido demonstrada em plantas tendo atividade de oxidase de po- lifenol. A identificação de plantas tendo níveis ótimos de oxidase de polifenol fornece uma oportunidade até agora não reconhecida para o desenvolvimento de plantas adequadas para cultivo em uma área suscetível à infestação por nematoide. Por "atividade ótima de oxidase de polifenol" entenda-se um nível de atividade suficiente para levar à morte pelo menos uma peste ou reduzir perceptivelmente o crescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal de uma peste quando a planta expressando a oxidase de polifenol é exposta a uma peste nematoide.

Assim, são proporcionados aqui métodos para triagem de uma planta ou variedade de planta quanto à atividade de oxidase de polifenol. Por exemplo, extratos de raiz de diferentes plantas (por exemplo, diferentes linha- ] gens endógamas ou diferentes proles de um cruzamento) podem ser testados quanto à atividade de oxidase de polifenol usando ensaios conhecidos na técni- ca e descritos em alguma parte aqui. Plantas expressando oxidase de polifenol podem ser testadas quanto à atividade nematicida e plantas mostrando ativida- deótima selecionadas para uso em um campo suscetível à infestação por ne- matoide ou usadas para melhoramento adicional para introgressão do traço de resistência a nematoide em uma população de planta. A identificação de uma oxidase de polifenol tendo atividade ótima pode estar associada à presença de - uma oxidase de polifenol, o nível relativo de expressão ou atividade de uma oxidase de polifenol ou a presença de um polimorfismo particular associado à presença de uma oxidase de polifenol e/ou resistência a nematoide. O polimor- ki fismo pode estar dentro do gene de oxidase de polifenol em si ou pode estar ' dentro de um marcador genético identificado como estando associado a ou re- lacionado à expressão de oxidase de polifeno!l (isto é, dentro de um Loci de Traço Quantitativo (QTL) associado à expressão de oxidase de polifenol).

Os métodos da invenção ainda consideram triagem de QTLs exis- tentes para resistência a nematoide quanto à presença de um gene ou polimor- fismo de oxidase de polifenol. Estudos anteriores identificaram grandes regiões genéticas ligadas como QTLs envolvidos em resistência a nematoide e essas regiões podem conter determinadas oxidases de polifenol ou tirosinases. QTLs contêm, tipicamente, muitas centenas, se não milhares de genes, ainda que identificação do gene causal para o traço associado continue, muitas vezes, desconhecida. Assim, a invenção prevê a triagem de genes de oxidase de poli- fenol (ou polimorfismos particulares dos mesmos) a partir de tais regiões. Esses elementos genéticos ou marcadores genéticos intimamente relacionados a es- ses elementos genéticos de oxidase de polifenol podem ser usados em proto- colos de melhoramento marcador-assistido para desenvolver plantas mais re-

sistentes à infestação por nematoide.

Métodos para triagem de uma região ge- nética quanto a um gene de interesse são rotina na técnica, assim como méto- dos para melhoramento marcador-assistido.

Mutagênese de germplasma Ainda proporcionados são métodos para o desenvolvimento de plantas com resistência a nematoide usando mutagênese de germplasma.

Mu- tagênese é um meio para criação de diversidade genética que não existe ou não foi encontrado no germplasma existente.

Tratamento de embriões somáti- cos, embriões derivados de porções de cultura de sementes imaturas, com a- gentesmutagênicos pode ser um método eficiente de criação de mutações por- que elas são mais fáceis de regenerar em plantas inteiras do que culturas de células da planta derivada das mesmas (por exemplo, extratos de raiz) para atividade de oxidase de polifenol.

Isolados tendo ótima atividade de oxidase de - polifenol podem ser usados para desenvolver uma população de planta ade- — quada para cultivo em uma área suscetível à infestação por nematoide.

Métodos para mutagênese de germplasma são, em geral, conheci- - dos na técnica.

Raios gama são o mutágeno mais frequentemente usado, mas . novos agentes, incluindo feixes de íons e condição espacial, também têm sido usados em indução de mutação e melhoramento (Chen et a/. (2006) Plant Mu- tation Reports, Volume 1, Número 1 em www-naweb.iaea.org/nafa/pbg/public/pmr-01-01.pdf). Uso de culturas in vitro para indução de mutação ou uso de outra cultura para produzir rapidamente linhagens homozigóticas a partir de proles irradiadas foi provado ser útil em vá- rios laboratórios.

Métodos para o controle de nematoides em um campo São proporcionados aqui métodos para controle de nematoides em um campo suscetível à infestação por uma ou mais pestes nematoides parasíti- cas de planta.

Os métodos compreendem cultivo de uma planta em uma área suscetível à infestação por nematoide parasítico de planta, em que a planta ex- —pressauma oxidase de polifenol heteróloga.

Uma "área" ou um "campo" susce- tível à infestação inclui uma região geográfica ou área de plantio que tem um nível detectável de uma ou mais espécies de nematoides parasíticos de planta.

Um "nível detectável" inclui qualquer nível de nematoides parasíticos de planta suficientemente altos o bastante para causar dano em uma planta suscetível. Sinais de dano por nematoide inclui atrofia e amarelamento de folhas e mur- chamento das plantas durante períodos quentes. Contudo, alguns nematoides, incluindo nematoide do cisto de soja (SCN) podem causar perdas de rendimen- to significativas sem sintomas acima do solo óbvios. Nesse caso, raízes infec- tadas com nematoides parasíticos de planta serão atrofiadas ou pequenas comparados com as raízes de uma planta não infectada com nematoides. Vá- rios outros métodos de detecção macroscópicos e microscópicos de diferentes tiposde nematoides são conhecidos na técnica e estão, tipicamente, disponí- veis vias serviços de extensão agrícola locais. Uma área suscetível à infestação por nematoide pode também incluir uma área que tem um nível detectável de nematoides parasíticos de planta no solo.

- Uso em controle pesticida Métodos gerais para emprego de cepas compreendendo uma se- Á quência de nucleotídeo da presente invenção ou uma variante da mesma no - controle de peste ou em manipulação de outros organismos como agentes pes- 1 ticidas são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. No.

5.039.523 e EP 0480762A2.

As cepas bacterianas ou fúngicas contendo a(s) sequência(s) de nucleotídeo da presente invenção ou uma variante da(s) mesma(s) ou os micro- organismos que foram geneticamente alterados para conter um gene e proteína nematicidas podem ser usadas para proteção de safras ou produtos agrícolas contra pestes. Em um aspecto da invenção, células inteiras, isto é, não subme- tidas àlise, de um organismo que produz toxina são tratadas com reagentes que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é apli- cada ao ambiente da(s) peste(s)-alvo.

Alternativamente, o pesticida é produzido mediante introdução de um gene nematícida em um hospedeiro celular. Expressão do gene nematicida resulta, direta ou indiretamente, na produção e manutenção intracelular da toxi- na nematoide. Em um aspecto da presente invenção, essas células são, então, tratadas sob condições que prolongam a atividade da toxina produzida na célula quando a célula é aplicada ao ambiente da(s) peste(s)-alvo. O produto resultante retém a toxicidade da toxina. Esses pesticidas naturalmente encap- sulados podem, então, ser formulados de acordo com técnicas convencionais para aplicação ao ambiente que hospeda a peste-alvo, por exemplo, solo, água, raiz, semente e/ou folhagem das plantas. Vide, por exemplo, EPA 0192319 e as referências citadas no mesmo. Em várias modalidades, a oxidase de polifenol pode ser expressa em uma célula bacteriana e usada como um probiótico para tratar a semente da planta. Alternativamente, pode-se formular as células que expressam um gene da presente invenção, de modo a permitir aplicação do material resultante como um pesticida. Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente apli- cados na forma de composições e podem ser aplicados à área da safra ou à planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. - Esses compostos podem ser fertilizantes, venenos para ervas daninhas, crio- protetores, tensoativos, detergentes, sabões pesticidas, óleos dormentes, polí- meros e/ou formulações veículo de liberação com o tempo ou biodegradáveis : que permitem dosagem a longo prazo de uma área-alvo após uma única apli- ] cação da formulação. Os compostos podem ser cofatores ou outras moléculas que intensificam a atividade da enzima oxidase de polifenol. Por exemplo, o composto pode ser jasmonato de metila, o qual foi mostrado aumentar a ex- pressão de genes de oxidase de polifenol (vide, por exemplo, Constable e Ryan (1998) Plant Mol Biol. 36(1): 55-62), um fenol tal como L-DOPA ou tirosina ou um substrato capaz de participar na ligação cruzada mediada por oxidase de polifeno! (por exemplo, tirosina). Esses compostos podem ser fornecidos às plantas antes, durante ou após (ou qualquer combinação dos mesmos) aplica- ção da composição pesticida. Onde o composto é um polipeptídeo capaz de expressão em uma planta, a planta suscetível pode ser transgênica para esse polipeptídeo.

Esses compostos também podem ser herbicidas seletivos, insetici- dasquímicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bacte- riocidas, nematicidas, moluscocidas ou misturas de vários desses preparados, se desejado, junto com outros veículos, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação agricolamente aceitáveis comumente empregados na técnica de formulação. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem a substâncias comumente empregadas em tecnologia de formu- lação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes de umedecimento, aderentes, aglutinantes ou fertilizan- tes. Da mesma maneira, as formulações podem ser preparadas em "iscas" co- mestíveis ou configuradas como "armadilhas" para a peste a fim de permitir a- limentação ou ingestão da formulação nematicida por uma peste-alvo. Métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ouumacomposição agroquímica da presente invenção que contém pelo menos uma das proteínas nematicidas da presente invenção inclui aplicação foliar, re- vestimento de semente e aplicação ao solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade de infestação pela peste corresponden- - te. A composição pode ser formulada como um pó, polvilhado, pelota, i grânulo, spray, emulsão, coloide, solução ou semelhante e pode ser preparada e através de meios convencionais, tais como secagem, liofilização, homogenei- E zação, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células compreendendo o polipeptídeo. Em todas de tais com- posições que contêm pelo menos um de tais polipeptídeos nematicidas, o polipeptídeo pode estar presente em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 99% em peso.

Pestes nematoides podem ser mortas ou seu número reduzido em uma determinada área por meio dos métodos da invenção ou o mesmo pode serprofilaticamente aplicado a uma área ambiental para prevenir infestação por uma peste suscetível (isto é, nematoide). De preferência, a peste ingere ou é contatada com uma quantidade nematicidamente eficaz do polipeptídeo. Por "quantidade nematicidamente eficaz", entenda-se uma quantidade do pesticida que é capaz de levar à morte pelo menos uma peste ou reduzir perceptivelmen- teocrescimento, alimentação ou desenvolvimento fisiológico normal da peste. Essa quantidade variará dependendo de fatores tais como, por exemplo, a es- pécie nematoide específica a ser controlada, o ambiente específico, localiza-

ção, planta, safra ou local agrícola a ser tratado, as condições ambientais e o método, taxa, concentração, estabilidade e quantidade de aplicação da compo- sição de polipeptídeo nematicidamente eficaz. As formulações podem também variar com relação às condições climáticas, considerações ambientais e/ou fre- quênciade aplicação e/ou gravidade de infestação pela peste.

As composições nematicidas descritas podem ser feitas por meio de formulação da célula microbiana (ou extrato da mesma) que expressa o ge- ne nematicida da invenção ou componente de proteína isolada com o veículo agricolamente aceitável desejado. As composições podem ser formuladas an- tesde administração em um meio apropriado, tal como liofilizadas, secas por congelamento, secas ou em um veículo, meio ou diluente aquoso adequado, tal como solução salina ou outro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de um material em pó ou granular ou uma suspensão em óleo (vege- - tal ou mineral) ou água ou emulsões óleo/água ou como um pó umedecível ou emcombinação com qualquer outro material veículo adequado para aplicação agrícola. Veículos agrícolas adequados podem ser sólidos ou líquidos e são - bem-conhecidos na técnica. O termo "veículo agricolamente aceitável" abrange : todos os adjuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aderen- tes, aglutinantes, etc. que são comumente usados em tecnologia de formulação pesticida; esses são bem-conhecidos por aqueles versados no campo de for- mulação pesticida. As formulações podem ser misturadas com um ou mais ad- juvantes líquidos ou sólidos e preparadas através de vários meios, por exemplo, através de mistura homogênea, composição e/ou trituração da composição ne- maticida com adjuvantes adequados usando técnicas de formulação conven- cionais. Formulações adequadas e métodos de aplicação são descritos na Pa- tente U.S. No. 6.468.523, aqui incorporada por referência.

Em várias modalidades, a oxidase de polifenol pode ser usada para tratar ou prevenir infestação de plantas com insetos, fungos, bactérias, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pestes de inseto incluem insetos selecionados das — ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homopte- ra, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Si- phonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera e Dipte-

ra.

A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. As subordens Adephaga incluem as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, en- quanto que a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Sta- phylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoide- a, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea e Curculionoidea. A Super- família Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae e Dytiscidae. À Superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A Superfamília Hydrophiloi- deaincluiafamília Hydrophilidae. A Superfamília Staphylinoidea inclui as famí- lias Silphidae e Staphylinidae. A Superfamília Cantharoidea inclui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A Superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A Superfamília Elateroidea inclui as famílias Elateridae e Bu- - prestidae. A Superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae. A Superfa- mília Meloideaincluia família Meloidae. A Superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. À Superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passali- - dae e Scarabaeidae. A Superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambyci- ' dae. À Superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A Super- família Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e Scolytidae.

A ordem Diptera inclui as subordens Nematocera, Brachycera e Cyclorrhapha. À Subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodi- dae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae e Ceci- domvyiidae. A Subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae e Dolichopodidae. A Subordem Cy- clorrhaphainclui as Divisões Aschiza e Aschiza. A Divisão Aschiza inclui as fa- mílias Phoridae, Syrphidae e Conopidae. A Divisão Aschiza inclui as seções Acalyptratae e Calyptratae. A Seção Acalyptratae inclui as famílias Ofitidae, Tephritidae, Agromyzidae e Drosophilidae. A Seção Calyptratae inclui as famí- lias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphori- daee Sarcophagidae.

A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lyca- enidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Satumii-

dae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae e Tineidae.

Pestes de inseto da invenção para as principais safras incluem: Mi- lho: Ostrinia nubilalis, broca do milho Europeu; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Helicoverpa zea, lagarta do milho; Spodoptera frugiperda, lagarta-de-cartucho; Diatraea grandiosella, broca do milho do sudeste; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule do milho; Diatraea saccharalis, broca da cana-de-açúcar; Dia- brotica virgifera, verme da raiz do milho do ocidente; Diabrotica longicomis bar- beri, verme da raiz do milho do norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do milho do sul; Melanotus spp., vermes; Cyclocephala borealis, —besourodo norte (gafanhoto branco); Cyclocephala immaculata, gafanhoto lis- trado do sul (gafanhoto branco); Popillia japonica, besouro Japonês; Chaetoc- nema pulicaria, besouro da pulga do milho; Sphenophorus maidis, percevejo do milho; Rhopalosiphum maidis, pulgão da folha de milho; Anuraphis maidiradicis, - pulgão da raiz do milho; Blissus leucopterus leucopterus, besouro chinch; Mela- noplus femurrubrum, gafanhoto da perna vermelha; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, berne da semente de milho; Agromyza bi parvicomis, broca da mancha do milho; Anaphothrips obscrurus, tripe do capim; g Solenopsis milesta, formiga; Tetranychus urticae, ácaro aranha com duas man- chas; Sorgo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta-do- cartucho; Helicoverpazea, lagarta do milho; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule do milho; Feltia subterranea, lagarta granulada; Phyllophaga crinita, cigar- ra branca; Eleodes, Conoderus e Aeolus spp., vermes; Oulema melanopus, be- souro da folha de cereal; Chaetocnema pulicaria, besouro da pulga do milho; Sphenophorus maidis, besouro do milho; Rhopalosiphum maidis; pulgão da fo- lhademilho; Sipha flava, pulgão da cana-de-açúcar amarelo; Blissus leucopte- rus leucopterus, besouro chinch; Contarinia sorghicola, ácaro do sorgo; Te- tranychus cinnabarinus, ácaro aranha carmim; Tetranychus urticae, ácaro ara- nha com duas manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta-do-cartucho; Spodoptera frugiperda, lagarta-do-cartucho; Elasmopalpus lignosellus, broca do —cauledemilho; Agrotis orthogonia, lagarta ocidental; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule de milho; Oulema melanopus, besouro da folha de cereal; Hype- ra punctata, broca da folha de trevo; Diabrotica undecimpunctata howardfi, la-

garta do milho do sul; pulgão Russo do trigo; Schizaphis graminum, percevejo verde; Macrosiphum avenae, pulgão do grão Inglês; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto da perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Sitodiplosismoseilana, mofo do trigo; Meromyza americana, berne do caule de trigo; Hylemya coarctata, mosca do bulbo de trigo; Frankliniella fusca, tripe do tabaco; Cephus cinctus, mosca do caule de trigo; Aceria tulipae, ácaro do trigo; Girassol: Suleima helianthana, traça do broto de girassol; Homoeoso- ma electellum, traça do girassol; zygogramma exclamationis, besouro do giras- sol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mofo da semente de girassol; Algodão: Heliothis virescens, lagarta do algodão; Heli- coverpa zea, broca do algodão; Spodoptera exigua, lagarta-do-cartucho de be- terraba; Pectinophora gossypiella, lagarta rosa; Anthonomus grandis, broca; - Aphis gossypii, pulgão do algodão; Pseudatomoscelis seriatus, gafanhoto do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca; Lygus lineolaris, besouro do À escurecimento da planta; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto da perna verme- r Ilha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripe da cebo- U la; Franklinkiella fusca, tripe do tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro aranha carmim; Tetranychus urticae, ácaro aranha com duas manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana-de-açúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta-do- cartucho; Helicoverpa zea, lagarta do milho; Colaspis brunnea, besouro desfo- lhador da uva; Lissorhoptrus oryzophilus, broca da água do arroz; Sitophilus oryzae, broca do arroz; Nephotettix nigropictus, cigarra do arroz; Blissus leucop- terus leucopterus, besouro chinch; Acrosternum hilare, besouro verde; Soja: — Pseudoplusia includens, gafanhoto de soja; Anticarsia gemmatalis, lagarta do feijão; Plathypena scabra, traça verde; Ostrinia nubilalis, broca do milho Euro- peu; Agrotis ipsilon, larva preta; Spodoptera exigua, lagarta da beterraba; Helio- this virescens, lagarta do algodão; Helicoverpa zea, verme do algodão; Epilach- na varivestis, besouro do feijão Mexicano; Myzus persicae, pulgão do pêssego verde; Empoasca fabae, cigarra da batata; Acrosternum hilare, besouro verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto da perna vermelha; Melanoplus differentia- lis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, berne da semente do milho; Sericot-

hrips variabilis, tripe da soja; Thrips tabaci, tripe da cebola; Tetranychus turkes- tani, ácaro aranha do morango; Tetranychus urticae, ácaro aranha com duas manchas; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca do milho Europeu; Agrotis ipsilon, lagarta negra; Schizaphis graminum, besouro verde; Blissus leucopterus leu- copterus, besouro chinch; Acrostemum hilare, percevejo verde; Euschistus ser- vus, percevejo marrom; Delia platura, berne da semente de milho; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Petrobia latens, ácaro do trigo marrom; Colza: Bre- vicoryne brassicae, pulgão da couve; Phyllotreta cruciferae, besouro pulga; Marmestra configurata, lagarta Bertha; Plutella xylostella, traça diamante-negro; Deliassp., bernes da raiz.

Métodos para aumento de rendimento da planta Métodos para aumentar o rendimento de uma planta são proporcio- nados. Os métodos compreendem introdução, em uma planta ou célula de - planta, de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência nematicida di- —vulgada aqui. Expressão da sequência nematicida resulta em resistência apri- i morada à infestação por nematoide a qual, por sua vez, aumenta o rendimento de uma planta transgênica comparado com o rendimento de uma planta não y expressando uma oxidase de polifeno! (quando exposta a nematoides parasíti- cos de planta). Conforme definido aqui, o "rendimento" da planta refere-se à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por "biomassa" entenda-se qualquer produto de planta medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer aprimoramento no rendimento do produto vegetal medido. Aumento de rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exem- plo, aumento da biomassa de folha de planta pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para consumo humano ou por um animal. Adicionalmente, aumento da biomassa de folha pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento no ren- dimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo in- cluindo, mas não limitado a, um aumento de pelo menos 1%, um aumento de — pelomenos 3%, um aumento de pelo menos 5%, um aumento de pelo menos 10%, um aumento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pe- lo menos 70%, pelo menos 100% ou um aumento maior no rendimento compa-

rado com uma planta não expressando a sequência nematicida. Métodos para identificação de foci de traços quantitativos associados à resistência a nematoide Também proporcionados aqui são métodos para identificação ou validaçãode marcadores associados a /oci de traços quantitativos (QTL) para resistência ou tolerância a nematoide. Os métodos compreendem avaliação de genes marcadores dentro da região genômica que circunda um ou mais genes de oxidase de polifenol em uma população de plantas que mostram resistência ou tolerância à infestação por nematoide e detecção de uma associação entre umoumaismarcadores genéticos e o traço de resistência a nematoide. Mapas genéticos de alta densidade foram desenvolvidos para muitas espécies de plan- tas suscetíveis à infestação por nematoide, incluindo plantas de milho e soja. Marcadores desses mapas podem ser avaliados quanto à associação e marca- - dores positivamente associados podem ser usados em aplicações a jusante, tal À 15 como melhoramento marcador-assistido. Métodos para avaliar associações marcador:traço são conhecidos na técnica e podem ser aplicados a regiões ge- nômicas que codificam genes tendo homologia a genes de oxidase de polifenol. Em outra modalidade, QTLs que são conhecidos ou suspeitos de estarem associados à resistência a nematoide podem ser avaliados para de- terminarse um gene de oxidase de polifenol está dentro ou próximo do QTL. Nessa modalidade, regiões dentro ou que circundam o QTL podem ser sequen- ciadas e buscas de homólogos de oxidase de polifeno! realizadas. Os exemplos a seguir são oferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação.

EXPERIMENTAL Exemplo 1. Ensaio de atividade nematicida Uso de aminas biogênicas para induzir à alimentação e/ou movi- mento de nematoides parasíticos foi demonstrado anteriormente para experi- mentos de captação de RNAi (por exemplo, vide P. E. Unwin, Catherine J. Lilley eHowardly. Atkinson, "Ingestion of Double-Stranded RNA by Preparasitic Juve- nile Cyst Nematodes Leads to RNA Interference", Molecular Plant Microbe Inte- raction Vol. 15, No. 8, 2002, páginas 747-752. Vide também MJ Kimber, S

MckKinney, S. McMaster TA Day, CC Flemming e AG Maule (2007) "Flp gene disruption in a parasiític nematode reveals motor dysfunction and unusual neu- ronal sensitivity to RNA interference", The FASEB Journal vol 21, páginas 1233- 1242).

Ensaios de atividade de SCN fornecidos aqui são baseados no uso de um bioensaio de SCN que contém, tipicamente, -200 nematoides J2 (eclo- didos dentro de 2 dias de ensaio) por poço em uma lâmina com metade da área com 96 poços. Os nematoides são incubados em tampão de Tris a 20 mM (pH de 8,0) contendo octopamina a 50 MM e os componentes antibióticos e antifún- gicosa seguir: gentamicina (1,5 ug/ul), nistatina (0,05 ug/ul), antibiótico- antimicótico da Sigma (cat % AS955) a 1X, antimicótico Infuse (diluição a 1/1500 a partir do estoque), todos em um volume final de 30 ul, incluindo a cepa ou proteína de teste. A lâmina de ensaio foi incubada a 28 ºC em uma câmara u- - midificada. Classificação do ensaio é facilitada pela adição de carbonato de só- dio, oquefazcom que os nematoides vivos se enrolem, enquanto que nema- | toides mortos permanecem retos e rígidos. A classificação deve ser feita dentro E de -10 minutos da adição de carbonato. A atividade sobre nematoides é classi- V ficada e comparada com amostras de controle negativo e controle positivo. Tabela 1. Convenção de classificação para ensaios com SCN EE e Exemplo?2. intensificação de níveis em estado uniforme de toxinas de pro- teina nematoide em cepas microbianas Uma cepa microbiana de interesse (por exemplo, uma cepa bacte- riana ou fúngica) é crescida sob condições de meio que podem limitar parcial- mente a disponibilidade de nutrientes ao micróbio. Por exemplo, a disponibili- —dadede carbono ou nitrogênio pode ser reduzida no meio de crescimento mí-

nimo.

O meio é suplementado com componentes que são úteis para esti- mular a produção microbiana de toxinas nematoides. Como um exemplo, a adi- ção de gelatina a um meio de crescimento pode imitar a cutícula gelatinosa en- contrada sobre alguns nematoides e, assim, estimula a produção microbiana de toxinas de proteína nematoide. Como outro exemplo, a adição de nematoides ao meio de crescimento (tal como C. elegans ou nematoide do cisto de soja) pode estimular a produção microbiana de toxinas de proteína. Como outro e- xemplo, um extrato de nematoide pode ser preparado e adicionado a um meio de crescimento microbiano para estimular a produção de toxinas de proteína microbiana. Os vários componentes também foram combinados.

O meio de crescimento (suplementado com um componente para estimular a produção de toxina) é inoculado com uma cepa ou cepas microbia- - nas e, então, crescido sob condições apropriadas para crescimento da cepa. Cultura inteira ou alguma fração da cultura (por exemplo, sobrenadantes de cultura, extratos de proteína, extratos de proteína solubilizada, extratos de pelo- - ta, etc.) é, então, testada para determinar se uma toxina de nematoide foi pro- : duzida pela cepa microbiana sob o meio de crescimento e condições de cres- cimento testadas. Exemplo3.!ldentificação de toxina de proteína nematoide de Arthrobotrys oligospora Sabe-se na técnica que fungos nematicidas podem ser isolados do solo, em particular de solos supressivos. Vários de tais fungos foram obtidos e testados quanto à atividade sobre o SCN, sob uma variedade de condições de crescimento. Arthrobotrys oligospora é um fungo nematófago e foi anteriormente observado que tem atividade nematicida no solo. Essa atividade foi associada à contenção nematófaga na literatura (por exemplo, vide Nansen et al., 1988. Vet Parasitol., 26: 329-37). Não há descrição de produção de toxinas de proteína —nematoide por Arthrobotrys oligospora ou cepas relacionadas. Para testar a capacidade de uma cepa de Arthrobotrys oligospora de produzir toxinas de proteína, uma cepa de Arthrobotrys oligospora

(ATX21995) foi inoculada em meio Arthrobotrys suplementado conforme mos- trado abaixo e incubada a 30ºC com ligeira agitação durante 7 dias.

Os extratos resultantes foram testados com relação à capacidade de matar o SCN.

Meio Arthrobotrys (por litro): + 1 gde glicose + 0,5 g de (NH4)2SO,s + 0,5g de MgSO, + 2 gde KH2PO, + 0,005 g de FeSO, e Ajustar para pH de 6,0 com KOH Opcional: + 0,5 g de gelatina e Adicionar C. elegans coletado de 1 lâmina MYOB (lâmina de 100 - mm, primeiro inoculada com E. coli para gerar uma ração como dieta para C. : 15 elegans) por 50 mL de meio.

Tabela 2. Atividade de ATX 21995 crescida em vários meios es e AE PP | ATX 21995 toides de De cada meio de cultura, um extrato de proteína solúvel foi prepa- rado após sete dias de crescimento.

Nesse momento, a biomassa fúngica foi separada do meio de crescimento usando uma unidade de filtro de 0,4 mícron descartável e essa biomassa foi, então, triturada em um almofariz e pilão na presença de nitrogênio líquido para submeter as células à lise.

Esse material foi, então, ressuspenso em tampão A (Tris a 50 mM (pH de 8,0), DTTa 1 mM) e submetido a bioensaios do nematoide do cisto de soja (SCN). : Extratos de proteína foram preparados a partir de culturas de Art- hrobotrysoligospora (ATX21995) crescidas em meio Arthrobotrys (+ gelatina, + C. elegans) durante sete dias.

Extratos foram preparados triturando a biomassa fúngica na presença de nitrogênio líquido (conforme descrito acima) e ressus- pensão do material celular submetido à lise em tampão em um pH de 6,0 (MES a 50 MM, DTT a 1 mM), pH de 8,0 (Tris a 50 MM, DTT a 1 mM) ou pH de 10,4 (CAPS a 50 mM, DTT a 1 mM). Extratos preparados dessa maneira ensaiados comrelação à atividade sobre SCN mostraram todos forte atividade sobre o SCN.

Exemplo 4. Purificação de AXN-1 a partir de ATX21995 Purificações foram realizadas usando extratos preparados a partir de ATX 21995 crescida em meio Arthrobotrys contendo gelatina e nematoides.

Tipicamente, as purificações foram realizadas em larga escala mediante cres- cimento de vários frascos de 250 mL (aproximadamente 30-60 frascos) com 50 mL de meio em cada frasco para permitir que quantidades suficientes de prote- Ína entrem nas purificações.

Duas diferentes purificações de proteína foram realizadas a partir de culturas da cepa ATX21995. A biomassa fúngica total dessas culturas foi submetida à lise (almofariz e pilão com nitrogênio líquido) e a proteína foi fra- - cionada através de FPLC usando métodos de purificação.

Essas purificações resultaram na identificação de uma proteína de -50kDa que se correlacionava com a eluição de atividade de SCN. . Exemplo 5. Caracterização de proteína de 50 kDa de ATX21995 Para clonar o gene que codifica a proteína de -50 kDa, aproxima- damente 10-15 microgramas dessa proteína foram isolados e uma pequena quantidade da amostra foi submetida à eletroblotting em uma membrana de PVDF através de métodos padrões, a membrana corada com corante Coomas- sieeabanda correspondendo à proteína de 50 kDa excisada e submetida a sequenciamento N-terminal, conforme conhecido na técnica.

Descobriu-se que essa proteína proporciona quantidades muito pequenas de aminoácidos livres durante as reações de sequenciamento, o que sugeriu que o N-término da pro- teina poderia ser quimicamente modificado.

Um pedaço de gel contendo a proteína de 50 kDa foi digerido em gel com tripsina e os fragmentos foram, então, separados através de HPLC.

Picos individuais foram, então, analisados por meio de MALDI para identificar fragmentos adequados para sequenciamento de proteína.

Um total de 5 fragmentos trípticos foram selecionados e submetidos à degradação de Edman para sequenciamento de proteína (Tabela 3). Reações de sequenciamento por degradação de Edman proporcionaram as sequências a seguir para cada um —dessespicos: Tabela 3. Sequência N-terminal de fragmentos trípticos gradação de Edman Exemplo 6. Clonagem de um cDNA que codifica a proteína de 50 kDa de - ATX21995 RNA total foi isolado de culturas de ATX21995 crescidas durante 2 dias ,4diase6 dias.

Esse RNA foi inversamente transcrito para gerar cDNA; : esse cDNA foi subsequentemente normalizado para diminuir a abundância de : transcritos fortemente expressos.

Usando esse cDNA como padrão de inicia- ção, vários produtos de PCR foram gerados e sequenciados.

PCR degenerada baseada no uso de sequência ligante de cD- NA Uma série de oligonucleotídeos degenerados baseados na sequência de aminoácido de 24 (vide Tabela 3) foram criados e testados em combinação com os oligonucleotídeos que representam o final da reserva de cDNA.

Um conjunto de condições foi identificado, o qual resultou em amplificação de um produto de PCR de 1840 nucleotídeos.

Esse produto de PCR, bem como vários outros —produtosdePCR candidatos, foram clonados em um vetor TOPO e as sequên- cias de DNA adjacentes ao vetor foram determinadas.

PCR Degenerada baseada unicamente na sequência de aminoácido.

Inicia- dores de PCR degenerada foram criados baseado nas sequências de aminoá- cido de fragmentos 20, 24 e 29, 36 e 42 da Tabela 3. Esse conjunto de oligonu- — cleotídeosdegenerados utiliza inosina em várias posições para reduzir a dege- nerância dos oligonucleotídeos resultantes.

Também, quando possível, um con-

junto de iniciadores de PCR degenerada agrupados foi criado para cada se- quência de aminoácido na Tabela 3. Essa estratégia permite usar os iniciadores "externos" (aqueles baseados sobre os aminoácidos mais N-terminais de uma sequência na Tabela 3) no primeiro ciclo de PCR e um segundo conjunto "a- grupado" de iniciadores (baseado em aminoácidos ligeiramente C-terminais, mas que se sobrepõem aos aminoácidos utilizados para os iniciadores "exter- nos"). Uma matriz de reações de PCR usando esses oligonucleotídeos degenerados levou à clonagem e sequenciamento de vários produtos da ampli- ficação,os quais mostraram homologia de DNA e se sobrepunham aos 1840 clones de nucleotídeo isolados anteriormente e juntos compreendiam um qua- dro de leitura aberta de CDNA completo; sugerindo que todos esses cDNAs parciais se originavam de um único gene. - Clonagem de cDNA de axn-1 e determinação da sequência ge- nômica Baseado nas sequências de DNA de várias sequências de cDNA par- À ciais, iniciadores de PCR foram criados para amplificar e sequenciar repetida- - mente a região de codificação de cDNA.

Vários cDNAs independentes foram clonados e completamente sequenciados.

Em alguns casos, clones de cDNA Í individuais continham pequenos íntrons sem junção, consistente com junção alternativa do hRNA produzido a partir desse gene.

Por exemplo, duas varian- tes da região não traduzida 5' (UTR) foram recuperadas.

Essas variantes são idênticas para 42 nt a montante do sítio inicial (e incluindo a região que codifica o N-término da proteína codificada); contudo, eles divergem quanto a outros 60- 80 nt a montante; isso é provavelmente em virtude da presença de um íntron —comjunção alternativa ou sem junção na 5' UTR de um dos cDNAs.

Iniciadores de PCR do cDNA foram usados para amplificar e se- quenciar oito clones genômicos independentes a partir da região que codifica o CDNA.

A sequência dessa região genômica corresponde à sequência de CDNA exatamente sobre o comprimento do cDNA.

Assim, a sequência de cDNA dos —múltiplosclonesgenômicos e de cCDNA completo confirmam a estrutura do cD- NA e sua organização genômica.

Esse gene que codifica o cDNA é designado aqui como axn-fea proteína de comprimento total codificada é designada como AXN-1. A sequên- cia do cDNA de axn-1 é apresentada em SEQ ID NO: 2 e o quadro de leitura aberta é fornecido como SEQ ID NO: 3; a sequência da proteína AXN-1 de comprimento total é fornecida como SEQ ID NO: 4. A sequência cromossômica decomprimento totalpara axn-1 é apresentada em SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácido truncada é apresentada em SEQ ID NO: 5. Uma sequência de DNA sintético que codifica a sequência de aminoácido de AXN-1 de comprimento total é apresentada em SEQ ID NO: 6. i Além das variantes S'UTR, é interessante notar que muitos CDNAs isolados através desses experimentos têm modificações internas com relação às sequências descritas aqui.

Por exemplo, muitos clones parecem ser inter- namente deletados com relação à sequência de comprimento total e outros contêm claramente íntrons sem junção.

Assim, é provável que esse gene, de- - signado aqui como axn-1, esteja sujeito a processamento de mRNA alternativo, incluindo junção de mRNA alternativo.

Provavelmente, esses mRNAs alternati- Ú vos são componentes mínimos do MRNA de axn-1 em estado uniforme e o pro- - cesso de normalização de cDNA utilizado na clonagem desse cDNA provavel- mente aumentou a proporção relativa dessas variantes para o transcrito de comprimento total com junção.

Exemplo?7.AXN-1é homóloga a oxidases de monofenol Um alinhamento de AXN-1 com outras sequências de oxidase de polifenol é fornecido na figura 3 e a identidade de sequência percentual da AXN-1 a essas sequências é fornecida na Tabela 4. Outra observação interessante foi que uma seção da proteína codi- ficadaporesse cDNA continha muitos aminoácidos repetidos, especialmente glutamina (Q) e não mostra homologia a oxidases de polifenol ou tirosinases quando de buscas em bancos de dados.

Tabela 4. Identidade de aminoácido de AXN-1 a outras proteínas fúngicas

Exemplo 8. Toxina de nematoide da cepa ATX20514 A cepa bacteriana ATX20514 foi identificada a partir de triagem empírica de cepas, baseada em forte toxicidade de culturas pelo nematoide do cisto da soja (SCN) no formato de bioensaio padrão.

ATX 20514 foi crescida em meio C2 em blocos com 96 poços du- rante 3 dias a 30ºC. Em seguida, as células em cada poço foram submetidas à lise com um Bead Beater e o extrato celular submetido à lise foi alimentado a nematoides do cisto de soja (estágio J2) na presença de um estimulante de a- limentação (octopamina). Cinco dias após incubação, a toxicidade para o SCN ' 10 foiclassificada em uma escala de O a 5, conforme mostrado na Tabela 1. : A fração solúvel preparada a partir de ATX20514 dessa maneira re- cebeu um escore de "5" quando 5 ul desse extrato foram incorporados no bio- ' ensaio de SCN. Um extrato de proteína foi preparado a partir da cepa ATX20514 crescendo a cepa em 50 mL de meio C2 a 30ºC durante 3 dias. Nesse momen- to, as células na cultura foram submetidas à lise através de tratamento em um Bead Beater e o lisato bruto foi centrifugado a 18.000 x g durante 15 minutos para pelotizar os resíduos celulares e proteínas insolúveis. O extrato de proteí- na solúvel foi recuperado como a fração de sobrenadante e, então, filtrado e essematerialfoi, então, submetido a múltiplos tratamentos, seguido por testa- gem em um bioensaio de SCN.

Calor. Uma alíquota do extrato de proteína (100 uL) foi aquecida a 100ºC durante 30 minutos e testada em um bioensaio de SCN. Uma amostra de controle negativo foi simuladamente tratada lado a lado e, da mesma forma, testada em um bioensaio de SCN.

Protease. Uma alíquota do extrato de proteína (95 uL) foi proteoliti- camente digerida com 5 ul de Pronase (1 mg/mL final) (Roche) durante 3 horas a37C. Diálise. Uma alíquota do extrato de proteína (100 uL) foi submetida à diálise contra Tris a 20 mM, pH de 8,0 ("Tampão A") ou fosfato de sódio a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH de 7,0.

Filtração. Uma alíquota do extrato de proteína (500 yuL) foi colocada acima de uma membrana de filtro para centrifugação com um corte de peso molecular de 3000 (Millipore) e centrifugada a 12.000 x g até aproximadamente 400 yuL do volume total terem passados através da unidade de filtro. Extrato de proteína adicional foi, então, adicionado acima da membrana do filtro de centri- fugaçãoea etapa de centrifugação foi repetida até aproximadamente 400 ul.

do volume total terem passados novamente através da unidade de filtro. Os resultados dos bioensaios com SCN são mostrados na Tabela

5. Esses resultados sustentam a conclusão de que a atividade sobre o SCN na - cepa ATX20514 é em virtude de uma proteína ativa contra o SCN. Tabela5. Caracterização de atividade de ATX20514 | Exato de ATX2OBTA IB - [BeeodeATX20STAfemicamente atado — O [Tratamento com proftease MU Do [Tratado com protease O | Controle; protease apenas, sem extrato o is | Tns a 20 mM, prHdeão o sódio a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH de 7,0 [Fosfato de sódio a 5SOmM,NaCia 150mM.pHde7zo [O | gação [ATX205TA, fado de diálise porcentrugação — [O Exemplo 9. Purificação de uma toxina de proteina nematoide de ATX20514 Uma purificação em quatro colunas foi realizada, levando à identifi-

cação de uma banda de proteína de 52 kDa que se correlacionava com a toxi- cidade para o SCN.

ATX20514 foi crescida em 2 litros de meio C2 a 30ºC durante 3 di- as.

A cultura foi centrifugada e a pelota foi ressuspensa em 100 mL de Tris a 50 mM (pHde8,0).A pelota de célula foi, então, submetida à lise usando uma prensa Francesa, centrifugada a 18.000 x g durante 15 minutos e a fração de sobrenadante (isto é, o extrato de proteína solúvel) foi submetido à precipitação com sulfato de amônio, diálise e purificação por cromatografia em coluna.

Após 3 etapas de cromatografia em coluna, as frações ativas foram submetidas à diálise contra Tris a 50 MM (pH de 8,0), DTT a 1 mM; ("'Tampão A"), carregadas sobre uma coluna de troca de ânions Mono Q (1 mL; GE Heal- thcare) e lavadas com o mesmo tampão.

Eluição foi realizada com um gradien- . te de 40 volumes de coluna, com NaCl de O M a 0,2 Mem Tampão A.

Frações - individuais foram submetidas a bioensaios de SCN e descobriu-se que as fra- ções21a24 possuíam a toxicidade mais forte para o SCN.

Uma proteína de K aproximadamente 52 kDa se correlacionava bem com a toxicidade para o SCN Tt nessas frações. y Exemplo 10. Sequência N-terminal da proteína de 52 kDa de ATX20514 Frações de purificação individuais enriquecidas pela proteína de 52 — KkDaforam separadas por meio de eletroforese em gel, transferidas para PVDF e coradas com Coomassie Blue.

A seção da membrana contendo a proteína de 52 kDa foi excisada e submetida a sequenciamento N-terminal.

A sequência N- terminal resultante foi compilada usando o aminoácido correspondendo ao mai- or pico em cada posição sobre os cromatogramas. ' Exemplo11. Purificação e sequência N-terminal de proteína de 31 kDa de ATX20514 Além da atividade que se correlacionava com a proteína de 52 kDa, um segundo pico ativo tendo atividade no SCN foi eluído de uma coluna de tro- ca de cátions.

Essas frações ativas foram subsequentemente carregadas sobre —umacolunade troca de àânions para purificar adicionalmente a atividade.

Assim, uma proteína de 31 kDa que se correlacionava com essa atividade sobre o SCN foi identificada.

Para caracterizar adicionalmente a proteína de 31 kDa, sequencia- mento N-terminal foi realizado.

Essa análise permitiu comparar a sequência de proteína N-terminal da proteína de 52 kDa com aquela da proteína de 31 kDa.

Foi descoberto que as duas sequências de aminoácido são muito similares, sugerindo que a proteína de 31 kDa é um truncamento da proteína de 52 kDa: Tabela 6. Sequências N-terminais de toxinas de ATX 20514 Tamanho de | Sequência primária identificada por meio de de- | SEQ ID NO: proteina, | gradação de idem co | Exemplo 12. Clonagem de axn-8 de ATX20514 Usando os dados de sequência N-terminal das toxinas de 52 kDa e 31 kDa, o gene que codifica essas proteínas foi clonado em várias etapas atra- vésdeestratégias de PCR degenerada e Tail, conforme conhecido na técnica, : levando à amplificação de um fragmento de aproximadamente 5 kb a partir de : múltiplos ciclos de TAIL PCR.

Essa região contém um quadro de leitura aberta que codifica uma proteína de aminoácido.

Aqui, foi designado esse gene como i axn-8e a proteína correspondente como AXN-8. O N-término da proteína AXN- * 15 8prevista corresponde bem às sequências de aminoácido das proteínas de 52 kDa e 31 kDa.

Além disso, a sequência de DNA a jusante de axn-8 contém um segundo quadro de leitura aberta que provavelmente é coexpresso com axn-8 em um óperon.

A sequência de DNA contendo elementos regulatórios é apre- sentada em SEQ ID NO: 11. O quadro de leitura aberta para axn-8 é apresen- tadoemSEQIDNO: 12 e codifica SEQ ID NO: 13. A proteína truncada prevista é apresentada em SEQ ID NO: 14. A proteína integral à membrana de ligação a metal codificada pelo ORF a jusante é apresentada em SEQ ID NO: 41. É reco- nhecido que o sítio de truncamento pode estar a pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos em qualquer direção da arginina na posição 295 de SEQ ID NO: 13. Uma se- quência de DNA sintética que codifica SEQ ID NO: 13 é apresentada em SEQ ID NO: 15. Exemplo 13. Homologia de AXN-8 com oxidases de monofenol Uma análise pelo BLAST de AXN-8 mostra que ela compartilha homologia com oxidases de monofenol bacterianas conhecidas.

Essa classe de enzimas também inclui tirosinases.

Tabela 7. Homólogos mais próximos de AXN-8 GENBANK ft % rans royi thailandensis monofenol | vitis fermentans : Um alinhamento de AXN-8 com enzimas tirosinase (figura 4) revela queelapossuimotivos de sequência que são consistentes com essas tirosina- ses, incluindo a presença de resíduos de histidina que provavelmente são ne- a cessários para ligação de íons de cobre pela enzima. . Exemplo 14. Resposta à dose de atividade de AXN-8 Uma amostra de proteína AXN-8 foi usada para avaliar o efeito de diferentes quantidades de proteína sobre o SCN.

Essa amostra foi diluída em tampão de ensaio de nematoide e os ensaios foram configurados para estabe- lecer concentrações finais de proteína AXN-8 de até 25 ug/ml.

Nematoides fo- ram incubados e os resultados classificados após cinco dias.

Os escores são a média de duas a quatro réplicas.

Tabela8. Resposta à dose de AXN-8 [EEE Bs EEE Ia o BA |

| Exemplo 15. Clonagem de AXN-2 da cepa ATX25028 de Bacillus thuringi- ensis Independentemente da purificação de AXN-1 e AXN-8, atividade sobre o SCN foi observada por várias cepas de Bacillus.

A descoberta de que —AXN-1eAXN-8 codificam proteínas com homologia à oxidase/tirosinase suge- riu que, talvez, a atividade nessas cepas de Bacillus também era em virtude de atividade semelhante à oxidase/tirosinase.

DNA de ATX25028 foi preparado comercialmente disponível descri- to previamente e a sequência de DNA dos preparados de plasmídeo foi obtida.

Análise das sequências de DNA parciais obtidas de ATX25028 DNA demonstrou a existência de um gene que codifica uma enzima semelhante à oxidase/tirosinase nessa cepa.

A sequência de DNA foi utilizada para criar iniciadores de PCR e o quadro de leitura aberta do gene de comprimento total ' foi amplificado por meio de PCR a partir de DNA genômico ou ATX 25028. Esse — 15 geneéreferido aqui como axn-2 (SEQ ID NO: 7) e sua proteína codificada co- mo AXN-2 (SEQ ID NO: 8). O clone pAX5530 contém axn-2 inserido em um " vetor pRSF-1b modificado (Novagen) como um fragmento BamHlI-Ascl para gerar uma proteína contendo his-tag (SEQ ID NO: 9). pAX5531 contém axn-2 inserido em um vetor pRSF-1b modificado como um fragmento Pstl-Ascl, de modo que a proteína expressa carece de uma His-tag.

Lisatos derivados de células de E. coli expressando a proteína AXN-2 foram gerados e testados quanto à atividade sobre SCN.

Clones contendo e carecendo de uma His tag N- terminal exibiram forte atividade sobre o SCN.

Um gene sintético que codifica AXN-2 é apresentado em SEQ ID NO:10. Tabela 9. Atividade de clones de AXN-2 sobre SCN [Controle Neg [ConroleNeg —JOumuransosuemendaátse fo — | [Controle Neg [ControleNeg — [Cutrasuemendaáise — [o — | [Controle Neg [ContoleNeg — JExratode Isconcentado 4X [0 |

Fo E — Jeontoaedemeotsran — fo EEE conto de umpao de Ts To Exemplo 16. Clonagem de uma oxidase de polifeno!l da cepa nematoide ativa ATX26455 ATX26455 foi identificada como uma cepa que exibe forte atividade no ensaio do nematoide do cisto de soja (SCN). ATX 26455 foi crescida em um meioC2emblocoscom 96 poços durante 3 dias a 30ºC. As células foram, en- ' tão, submetidas à lise e o extrato celular submetido à lise foi alimentado a ne- ' matoides do cisto de soja (estágio J2), conforme descrito aqui. Cinco dias após ' incubação, a toxicidade para o SCN foi classificada conforme descrito aqui. A tal ensaio usando 5 yuL de preparado de extrato de ATX26455 submetido à lise “ 10 foiatribuídoum escore de "5", denotando mortalidade de 96-100% desse extra- to sobre o SCN.

Triagem bioquímica preliminar de ATX26455 Um extrato de proteína foi preparado a partir da cepa ATX26455 crescendo a cepa em meio C2 a 30ºC durante 3 dias. Um extrato de proteína — solúvelfoi preparado a partir da cultura e submetido às caracterizações bioqui- micas a seguir, seguido por ensaio de atividade sobre o SCN: + Tratamento térmico. Uma alíquota do extrato de proteína foi ter- micamente tratada para destruir a atividade de proteína e, então, testada em um bioensaio de SCN. Uma amostra de controle negativa foi simuladamente tratadalado a lado com a amostra termicamente tratada e, da mesma forma, testada em um bioensaio de SCN.

+ Tratamento com protease. Uma alíquota do extrato de proteína foi proteoliticamente digerida com uma protease (tal como Pronase) e, então, tes- tada em um bioensaio de SCN. Controles negativos sem protease também fo-

ram testados em um bioensaio de SCN.

+ Tratamento de diálise. Uma alíquota do extrato de proteína foi submetida à diálise para permitir que pequenas moléculas fossem removidas do extrato e, então, testada em um bioensaio de SCN.

+ Testagem de filtração. Uma alíquota do extrato de proteína foi co- locada acima de uma membrana de filtro para centrifugação com um corte de peso molecular de 3000 e, então, centrifugada para passar o extrato através da unidade de filtro. O retentado e o filtrado foram, então, testados em um bioen- saio de SCN.

Os resultados dos bioensaios em SCN realizados sobre cada uma das amostras bioquímicas preliminares são mostrados na Tabela 10. Esses resultados sugerem que a toxina de nematoide produzida por ATX26455 é con- ferida por uma proteína.

- Tabela 10. Testes de atividade de frações de ATX 26455 | | Tratamento térmico : extrato termicamente tratado — fo | | Tratamento com Protease | | | Enxtrato, tratado com protease — | o | | Protease apenas (controle negativo) — Jo = & | Tratamento de diáise UP | controle de ciáie | Testagem de fração Leito, ftvxo passante Purificação de toxina de proteína nematoide de ATX26455 As células foram submetidas à lise usando uma prensa Francesa e o lisato foi centrifugado e o sobrenadante coletado, resultando em um lisato clarificado. O lisato clarificado era altamente ativo em um bioensaio do SCN. À atividade desse lisato clarificado foi confirmada como sendo sensível à digestão por protease.

O lisato clarificado foi ainda enriquecido através das etapas de precipitação com sulfato de amônio a seguir. ! Primeiro, o lisato clarificado foi levado à saturação de 13% com sul- fato de amônio, centrifugado e a pelota descartada.

Esse procedimento foi re- petidoemuma saturação de 25% com sulfato de amônio.

Finalmente, o sobre- nadante foi levado para uma saturação de 50% com sulfato de amônio e, após centrifugação, a pelota foi recuperada e ressuspensa em tampão e submetida à diálise para remover o sulfato de amônio residual.

A pelota ressuspensa foi, então, fracionada sobre uma coluna de troca de ânions e as frações que mos- traram atividade no bioensaio do SCN foram coletadas e agrupadas.

As frações ativas agrupadas foram adicionalmente fracionadas sobre uma coluna de inte- ração hidrofóbica.

Isso resultou na identificação de uma banda de proteína que migra de local, correspondendo a uma proteína de aproximadamente 35 kDa. - Essa proteína (referida aqui como a "proteína de 35 kDa") se correlacionava ' 15 bemcom atoxicidade no SCN observada durante cada etapa da purificação e que era altamente enriquecida durante o processo de purificação. ' Caracterização da proteína de 35 kDa de ATX26455 ' A sequência dos aminoácidos N-terminais de uma proteína de inte- resse de ATX 26455 foi determinada por meio de degradação de Edman, con- forme conhecido no campo.

Uma fração de proteína contendo a proteína de interesse foi separada através de eletroforese em gel e as proteínas no gel re- sultante foram transferidas para uma membrana de PVDF.

A membrana foi, então, corada com Coomassie Blue e a seção da membrana contendo a proteí- na de 35 kDa foi excisada e submetida a sequenciamento N-terminal.

A se- — quênciaN-terminal dessa proteína foi determinada, através desse método, co- mo sendo a seguinte: Sequência N-terminal de proteína de frações ativas de ATX26455 M-N-T-I-R-Q-D-V-A-T-L-G-S-G-W-D-N-K-V-L-L-N-Y-A-L-A-M-R-E-L- D-K-L-P-I-T-N (SEQ ID NO: 42). De modo interessante, essa sequência de proteína revelou similari- dades de sequência com a proteína AXN-8 descrita aqui, sugerindo que a ativi- dade de ATX 26455 é, na verdade, também em virtude de atividade de uma oxidase de polifenol homóloga, mas nova. Clonagem de gene de toxina ativa sobre nematoide de ATX26455 A sequência de proteína N-terminal da toxina putativa foi utilizada comounm iniciador de oligonucleotídeo degenerado correspondendo a essa se- quência. A sequência desse iniciador é mostrada aqui (usando a nomenclatura estabelecida pela International Union of Pure and Applied Chemistry): 85' CAR GAY GTI GCI ACI YTI GGI CCI GGI TGG 3' (SEQ ID NO: 43) Para gerar um oligonucleotídeo degenerado para amplificar a fita invertida do gene de toxina, a sequência de DNA do gene axn-8 foi utilizada como um padrão, resultando na geração de uma série de iniciadores de oligo- nucleotídeo degenerados para testagem sobre ATX26455. Um iniciador de - PCR projetado por meio dessa abordagem é mostrado aqui: | 15 5' RTG RTG IAG CCA RAA IAT IGG RTC 3' (SEQ ID NO: 44) As reações de PCR usando os iniciadores degenerados (SEQ ID 1 NO: 43 e 44) resultaram em amplificação e sequenciamento de um produto de E PCR de 711 nucleotídeos. Esse fragmento de PCR de 711 nt foi confirmado como sendo originário da região de DNA que codifica a proteína de 35 kDa.

A sequência de DNA do produto de PCR de 711 nucleotídeos foi u- tilizada para isolar toda a região de codificação para a proteína de 35 kDa por meio de métodos de PCR por intelace térmico (TAIL) conhecidos no campo. Essa abordagem permitiu montagem da sequência do quadro de leitura aberta completo que codifica a proteína de 35 kDa. O quadro de leitura aberta de axn- 9foiamplificado por PCR a partir de ATX 26455 e clonado em um vetor de clo- nagem prsf1b modificado. O inserto do clone resultante (pAX5597) foi sequen- ciado e descobriu-se que era idêntico à sequência obtida por meio de TAIL.

A sequência do fragmento de DNA é fornecida como SEQ ID NO:

45. O quadro de leitura aberta contido dentro dessa região de DNA é designado comoaxn-9(SEQIDNO:46)e sua proteína correspondente como AXN-9 (SEQ ID NO: 47). A proteína truncada prevista corresponde ao resíduo 314 de SEQ ID NO: 47. É reconhecido que o sítio de truncamento pode estar a pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, 4, 5,6,7,8, 9 ou 10 aminoácidos na direção da lisina na posição 314 de SEQ ID NO: 47. Verificação da sequência de DNA do quadro de leitura aberta de axn-9 mostra que há um códon GTG presente nos nucleotídeos 22-24 de axn-9. Dadaa proximidade desse códon ao sítio inicial ATG e a tendência de alguns quadros de leitura aberta bacterianos de tolerar múltiplos sítios de início de tra- dução, é possível que tradução desse códon GTG ocorra na natureza e que a proteína resultante tenha propriedades similares à proteina AXN-9 de comprimento total.

Assim, essa proteína também é fornecida aqui como SEQ ID NO:48e designada AXN-9 (GTG). Exemplo 17. Homologia de AXN-9 com a AXN-8 e outras proteínas oxidase . de polifenol A AXN-9 é homóloga à proteína AXN-8 divulgada aqui.

A AXN-9 é - 68% idêntica à AXN-8. Um alinhamento de AXN-9 com AXN-8 é fornecido como ' 15 figura5.Dado que se sabe que a AXN-8 é truncada e também dado que a maio- ria das oxidases de polifenol são proteoliticamente processadas e dada a ho- f mologia entre a AXN-8 e AXN-9, pode-se prever que a AXN-9 provavelmente é y similarmente truncada através de proteólise.

Exemplo 18. Proteína AXN-9 protease-ativada é ativa em bioensaio do SCN O vetor de expressão de AXN-9 bacteriana descrito acima (pAX5597) foi transformado em células BL21*DE3 (Invitrogen). Após indução com IPTG, toda a cultura de célula foi centrifugada.

A pelota resultante foi res- suspensa em 1/10º do volume de tampão (Tris a 50 MM (pH de 8,0), CuSO4 a 10 uM) e, então, submetida à lise por meio de ultrassom.

O lisato foi dividido em 2 alíquotase 1 alíquota foi tratada com tripsina recentemente preparada (0,1 mg/mL de lisato) durante 2 horas a 37ºC.

A proteína AXN-9 tratada com tripsina mostrou forte atividade sobre o SCN, enquanto que a proteína AXN-9 não tra- tada não mostra atividade sobre o SCN (Tabela 11). Tabela 11. Atividade de clones de AXN-9 sobre o SCN ss EA

[Controle Neg [Tampaotmpsia o [paxsso7 — proteina AXN-O,naotratada — fo Exemplo 19. Atividade de tirosinase de cogumelo sobre o SCN Dada a descoberta de atividade de AXN-1, AXN-8, AXN-9 e AXN-2 sobre o SCN e a homologia de AXN-1, AXN-8, AXN-9 e AXN-2 a enzimas oxi- dase de polifenol/tirosinase, enzimas tirosinase previamente identificadas foram testadas para essa propriedade.

Tirosinase de cogumelo (Sigma T3824) foi ressuspensa em tampão para proporcionar uma solução concentrada. Diluições dessa solução foram testadas sobre o SCN conforme descrito acima e os resultados de ensaio a se- : " guir foram obtidos. Embora não diretamente afirmado pelo fornecedor dessa - 10 enzima, a enzima contida nessa "Tirosinase de cogumelo" provavelmente foi derivada do cogumelo branco.

: Tabela 12. Titulação de atividade de tirosinase de cogumelo

E a A | O A AA EA AAA: Foi demonstrado que o preparado de tirosinase de cogumelo obtido tem atividade sobre o SCN aproximadamente na mesma concentração relativa deenzima com relação às quantidades testadas de AXN-1 e AXN-8. Exemplo 20. Possibilidades de outras oxidases de polifenol tendo ativida- de no SCN Dada a descoberta de atividade anti-SCN de proteínas bacterianas e fúngicas que têm homologia a oxidases de fenol e a observação de atividade de tirosinase de cogumelo, deve ser entendido que é provável que muitas oxi- dases de polifenol/tirosinases tenham tal atividade quando testadas conforme descrito aqui; Por exemplo, em um bioensaio do SCN contendo jovens J2, Tris a 20 mM e octopamina a 50 mM durante 3-7 dias em torno de 20ºC, com agita- çãoemumaincubadora giratória, contido em uma lâmina, tal como uma lâmina com 96 poços.

Por exemplo, Selinheimo et a/ descrevem a caracterização de tiro- sinases fúngicas e de planta e demonstram diferenças de substrato e atividade entre essas amplas classes enzimáticas, incluindo a tirosinase de cogumelo (Fluka)aqual provavelmente é a mesma enzima descrita no Exemplo 19 aci- ma. A Tabela 2 de Selinheimo ef a/ mostra que tais enzimas podem ter diferen- tes especificidades de substrato por compostos mono- e polifenólicos. Em ge- ral, deve ser entendido que a enzima de planta, tal como as enzimas de maçã e - batata do estudo de Selinheimo et al., têm menos atividade sobre substratos : 15 fenólicos, tal como tirosina, do que enzimas bacterianas ou fúngicas. Além dis- so, a figura 3 e o texto de Selinheimo et al descrevem que determinadas enzi- " mas têm a capacidade de ligação cruzada a uma proteína representativa (case- BR ína). No estudo citado, cada uma das enzimas é capaz de ligação cruzada com a caseína, mas as enzimas diferem quanto à quantidade de enzima requerida —paraligação cruzada. Ainda, todas, menos uma dessas enzimas parecem ter uma forte preferência e/ou requisito por um monofenol ou difenol na reação de forma a obter ligação cruzada. A exceção notável a esse requisito é a enzima de T. reesei.

A enzima de T. reesei (apresentada em SEQ ID NOS: 21 e 22 aqui) exibeparâmetros de substrato e atividade que distinguem a mesma das outras enzimas testadas. Notavelmente, a enzima de T. reesei mostrou a ligação cru- zada mais eficiente de caseína na menor das duas concentrações enzimáticas testadas. Além disso e em contraste com as outras enzimas testadas, T. reesei tinha forte atividade na ausência de um monofenol ou difenol na reação; embo- raaadiçãodetais compostos parecesse aumentar a quantidade de tal ligação cruzada. As outras enzimas testadas pareciam requerer um monofenol ou dife- nol para tal atividade de ligação cruzada. Selinheimo et a/ fornecem ainda evi-

dência para essa propriedade da enzima de 7. reesei em referências adicionais (Selinheimo et al. (2008) J Agric Food Chem. 56(9): 3118-28 e Selinheimo et al. (2007) J Agric Food Chem. 55(15): 6357-65), cada um dos quais é incorporado por referência na íntegra.

Por exemplo, o cDNA com número de acesso ao GENBANK AK246031 de Glycine max (SEQ ID NOS: 16 e 17, que codifica SEQ ID NO: 18; Umezawa et al (2008) DNA Res. 15(6): 333-46) exibe homologias característi- cas de oxidases de fenol de planta.

À guisa de exemplo adicional, o cDNA com número de acesso ao GENBANK AM418385 (SEQ ID NO: 19) que codifica uma enzima de T. Reesei (SEQ ID NO: 20) com homologia à oxidases de polifenol (Selinheimo et al. (2006) FEBS Lett. 273, 4322-4335) é fornecido como um exemplo de uma oxi- dase de polifenol que fornecida na invenção aqui que é provável de exibir ativi- - dade sobre o SCN. Outras sequências (de acordo com os números de acesso ao À GENBANK) tendo homologia às sequências divulgadas aqui são abrangidas pela presente invenção. Uma lista exemplificativa (mas não limitativa) é apre- sentada na Tabela 13. i Tabela 13. Números de acesso ao GENBANK de homólogos de oxidase de polifenol i ! :

| !

' 75/97 : :

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TTI97 | ' :

! |

| |

| :

: 81/97

: | :

| 82/97 :

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84/97 i [Evora 1 — fEU2I52T — [EUTABSAST — [MeStast |

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: 87/97

: Passas Po Passo o o Desse o passar Do

O ps Do Passat o passat Do aerea o o pari DO paemsst o passas Do paras o paras Do pasto Do TE passa DO paras Do TO passar Do passo o Paso passat O E Daesasara o

[ax esaaso Tg amet oo Passar [AEE meses o | XM aBaa aaa RB Doo rea ta | pasa o E EE sa men Do assa a Br DO EEE asas a rs assa | Br Do E TE ara a 166 |

NS ESSES RR RR O [ssa O ' Exemplo 21. Oxidases de monofenol adicionais Dada a demonstração de forte atividade no SCN pela enzima de bactérias e fungos com homologia à oxidase de monofenol/tirosinases, é agora evidente que muitas enzimas previamente identificadas dessa classe exibirão atividade sobre o SCN. Exemplo 22. Ensaios de Atividade Nematicida As sequências de nucleotídeo da invenção podem ser testadas com relação à sua capacidade de produzir proteínas nematicidas. A capacidade de uma proteína de atuar como um pesticida sobre uma peste nematoide é, fre- quentemente, avaliada através de uma série de formas. Uma forma bem- conhecida no campo é realizar um ensaio de alimentação. Em tal ensaio de alimentação, se expõe a peste a uma amostra contendo compostos a serem testados ou amostras de controle. Frequentemente, isso é realizado colocando o material a ser testado ou uma diluição adequada de ta! material sobre um ma- terialquea peste irá ingerir, tal como uma dieta artificial. O material a ser testa-

do pode ser composto de um líquido, sólido ou pasta.

O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e, então, deixado secar.

Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta de proteína fundida, então, distribuída na câmara de ensaio.

A câmara de ensaio pode ser, por e- xemplo, um copo, um disco ou um poço de uma lâmina de microtitulação.

Outros tipos de ensaios podem incluir microinjeção do material de teste na boca ou intestino da peste, bem como desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido por teste da capacidade da peste de se alimentar sobre a planta transgênica.

Testagem da planta pode envolver isolamento das partes de planta normalmente consumidas, por exemplo, pequenas gaiolas presas a cada folha ou isolamento de plantas inteiras em gaiolas contendo insetos.

Outros métodos e abordagens para avaliar pestes são conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson e Preisler, - eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL.

Alterna- tivamente, ensaios são comumente descritos nos jornais Arthropod Manage- ment Tests e Journal of Economic Entomology ou por meio de uma discussão í com membros da Entomological Society of America (ESA). : Exemplo 23. Sequências Gênicas Sintéticas Os genes a seguir foram criados, os quais codificam as sequências de aminoácido de AXN-1, AXN-2, AXN-8 ou AXN-9, mas utilizando uma se- quência de nucleotídeo diferente.

A SEQ ID NO: 6 descreve uma nova sequência de nucleotídeo que codifica AXN-1. A SEQ ID NO: 10 descreve uma nova sequência de nucleotídeo que codifica AXN-2. A SEQ ID NO: 15 descreve uma nova sequência de nucleotídeo que codifica AXN-8. A SEQ ID NO: 17 descreve uma sequência de nucleotídeo que co- difica a proteína prevista a partir do número de acesso ao GENBANK AK246031 de Glycine max.

A SEQ ID NO: 21 descreve uma nova sequência de nucleotídeo que codifica a proteína prevista do cCDNA a partir no número de acesso ao

GENBANK AM418385 que codifica uma enzima de T. reesei. Exemplo 24. Vetorização de Genes para Expressão de Planta As regiões de codificação da invenção são conectadas com se- quências promotoras e terminadoras apropriadas para expressão em plantas. Taissequênciassãobem-conhecidas na técnica e podem incluir o promotor de actina de arroz ou o promotor de ubiquitina de milho em monocots, o promotor UBOQ3 de Arabidopsis ou o promotor CaMV 358 para expressão em dicots e os terminadores nos ou Pinll. Técnicas para produção e confirmação de construtos de promotor - gene - terminador também são bem-conhecidas no campo.

Em um aspecto da invenção, sequências de DNA sintéticas são projetadas e geradas. Essas sequências sintéticas têm sequência de nucleotí- deo alterada com relação à sequência parental, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à sequência de aminoácido parental.

Em outro aspecto da invenção, versões modificadas dos genes sin- téticos são projetadas, de modo que o peptídeo resultante seja objetivado a uma organela de planta, tal como o retículo endoplásmico ou o apoplasto. Se- É quências peptídicas conhecidas por resultar em objetivação de proteínas de U fusão a organelas de planta são conhecidas na técnica. Por exemplo, a região N-terminal do gene de fosfatase ácida do Lúpulo branco Lupinus albus (GENBANKGO ID Gl:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594- 606) é conhecida na técnica por resultar em objetivação de proteínas heterólo- gas ao retículo endoplásmico. Se a proteína de fusão resultante também con- tém uma sequência de retenção no retículo endoplásmico compreendendo o peptídeo N-término-lisina-ácido aspártico-ácido glutâmico-leucina (isto é, o mo- tivo"KDEL", SEQID NO: 30) no C-término, a proteína de fusão será objetivada ao retículo endoplásmico. Se a proteína de fusão carece de uma sequência de objetivação ao retículo endoplásmico no C-término, a proteína será objetivada ao retículo endoplásmico mas, por fim, será capturada no apoplasto.

Assim, esse gene codifica uma proteína de fusão que contém os trintae um aminoácidos N-terminais do gene de fosfatase ácida do Lúpulo Branco Lupinus albus (GENBANKO ID GI: 14276838 , Miller et a/., 2001, supra) fundida ao N-término da sequência da invenção, bem como a sequência KDEL no C-término.

Assim, a proteína resultante é prevista como sendo objetivada ao retículo endoplásmico de planta quando de expressão em uma célula de planta.

Os cassetes de expressão de planta descritos acima são combina- dos com um marcador selecionável de planta apropriado para auxiliar na sele- —çãodecélulase tecidos transformados e ligados em vetores de transformação de planta.

Esses podem incluir vetores binários de transformação mediada por Agrobacterium ou vetores de plasmídeo simples para transformação por aeros- sol ou biolística.

D Exemplo 25. Vetorização de Genes para Expressão em Planta O DNA da região de codificação dos genes abrangidos aqui são operavelmente conectados com sequências promotoras e terminadoras para expressão em plantas.

Tais sequências são bem-conhecidas na técnica e po- dem incluir o promotor de actina de arroz ou promotor de ubiquitina de milho para expressão em monocots, o promotor UBQ3 de Arabidopsis ou o promotor CaMV35S para expressão em dicots e os terminadores nos ou Pinll.

Técnicas para produção e confirmação dos construtos promotor - gene - terminador tam- É bém são bem-conhecidas no campo. ! Os cassetes de expressão de planta descritos acima são combina- dos com um marcador selecionável de planta apropriado para auxiliar nas sele- çõesdecélulasetecidos transformados e ligados em vetores de transformação de planta.

Esses podem incluir vetores binários de transformação mediada por Agrobacterium ou vetores de plasmídeo simples para transformação por aeros- sol ou biolística.

Exemplo 26. Expressão de proteína AXN-1 em tecido de raiz de soja Construção de Vetor O vetor pAG6004 foi preparado para orientar a superexpressão da proteína AXN-1 em tecidos de raiz pilosa de soja.

O pPAG6004 contém o gene de AXN-1 de comprimento total, organizado 3' ao promotor UBQ10 (Arabidopsis thaliana) e 5' ao terminador 358 (vírus mosaico de couve-flor), de uma maneira — que provavelmente levará à transcrição de um gene axn-1 do promotor UBQ10 e término de tal transcrição pelo terminador 35s.

Também presente no vetor está um marcador visual (proteína fluorescente amarela (YFP), sob controle do promotor UBQ3), uma origem de replicação funcional em espécies Agrobacteri- um e um gene de resistência à gentamicina.

A organização do vetor foi confir- mada por meio de sequenciamento de DNA do vetor inteiro e, então, introduzi- do na cepa K599 de Agrobacterium rhizogenes e propagado através de cresci- mento sobre gentamicina.

Transformação de Soja Culturas de raiz pilosa de soja foram preparadas como segue.

Se- mentes de soja (cultivar Williams 82) foram germinadas em uma câmara de crescimento (25ºC) durante 1 semana, tempo no qual os cotilédones foram ex- cisados(apósremoção dos envoltórios de semente). Os cotilédones foram ma- chucados com um bisturi que ficou imerso durante a noite em uma cultura de A. rhizogenes transformada com pAG6004. Os cotilédones infectados foram colo- cados com o lado abaxial para cima sobre um papel filtro Whatman, submersos em água estéril em uma placa de Petri e incubados em uma câmara de cresci- mento escura a 25ºC durante 3 a 5 dias.

Em seguida, cotilédones individuais foram transferidos para e cultivados com o lado abaxial para cima sobre meio MB carb (sais MS, vitaminas B5, sacarose a 3%, 500 mg/L de carbenicilina e By solidificado com 3 g/L de Gelrite). Os cotilédones foram subcultivados a cada duas semanas sobre o mesmo meio MB carb para regenerar as raízes pilosas.

Raízesexpressando o gene de proteína fluorescente amarela (YFP) associado ao gene de AXN-1 derivado de pAG6004 foram detectadas sob um microscópio de estereodissecção ZEISS (KL 1500 LCD) com um conjunto de filtro (filtro de excitação a 508 nm; filtro de emissão a 524 nm). Raízes YFP foram subcultiva- das sobre o mesmo meio MB carb a cada duas semanas, conforme necessário.

Detecção de proteína AXN-1 em tecido de raiz Análise Western blot foi utilizada para identificar a expressão de proteína AXN-1 em tecidos de raiz pilosa.

Um grama de tecidos de controle e transgênico que tinham sido crescidos durante aproximadamente 6 semanas foram suspensos em 2x corante de carregamento LDS (Invitrogen) com B- —mercaptoetanol a 2,5 mM e, então, homogeneizados usando glóbulos de aço inoxidável em um instrumento Bead Beater.

Os extratos homogeneizados foram separados sobre um gel de Bis-Tris a 4-20%, transferidos para nitrocelulose e,

então, incubados com soro de coelho de coelhos imunizados com proteína AXN-1 purificada.

Após uma série de etapas de lavagem e incubação com um anticorpo secundário (anticoelho de burro, conjugado com peroxidase de rába- no, Pierce), a presença de AXN-1 foi visualizada por ECL (Pierce). De modo interessante, essa análise revelou que as raízes de soja geraram uma forma truncada da proteína (aproximadamente 50 kDa) ao invés da proteína de comprimento total (103 kDa). Essa observação é consistente com processa- mento pós-traducional da proteína AXN-1 e corresponde ao tamanho da proteí- na AXN-1 que foi purificada da cepa bacteriana hospedeira, ATX21995. Detecção de proteína AXN-8 em tecido de raiz Análise Western blot foi utilizada para identificar expressão de pro- teina AXN-8 em tecidos de raiz pilosa.

Um grama de tecidos de controle e transgênicos que tinham sido crescidos durante aproximadamente 6 semanas foram suspensos em 2x tampão de carregamento LDS (Invitrogen) com B- mercaptoetanola2,5mM e, então, homogeneizados usando glóbulos de ácido inoxidável em um instrumento Bead Beater.

Os extratos homogeneizados foram separados sobre um gel de Bis-Tris a 4-20%, transferidos para nitrocelulose e, - então, incubados com soro de coelho de coelhos imunizados com proteína AXN-8 purificada.

Após uma série de etapas de lavagem e incubação com um anticorpo secundário (anticoelho de burro, conjugado com peroxidase de rába- no, Pierce), a presença de AXN-8 foi visualizada por ECL (Pierce). Essa análise revelou que as raízes de soja geraram uma proteína AXN-8 de comprimento total (tamanho de aproximadamente 50 kDa) que corresponde ao tamanho da proteína AXN-8 que foi purificada da cepa bacteriana hospedeira, ATX20514, bem como formas truncadas adicionais da proteína.

Detecção de atividade enzimática de oxidase de fenol em tecido de raiz Várias oxidases de fenol, incluindo AXN-1, podem utilizar tirosina como um substrato para produzir melanina.

Para determinar se a proteína AXN- 1 expressa em raízes pilosas de soja era enzimaticamente ativa, foram realiza- dos ensaios enzimáticos com extratos de proteína de tecidos de raiz AXN-1 (PpAG6004) e controle (pAG5385). Cada tecido (aproximadamente 1 grama) foi homogeneizado em nitrogênio líquido e 10 mg de cada foram suspensos em

B 94/97 0,4 mL de tampão (Tris a 20 MM, pH de 8,0). Cada suspensão de tecido foi, então, adicionada em um volume final de 1/10º aos ensaios enzimáticos con- tendo o mesmo tampão e tirosina a 1 MM.

As reações de ensaio foram incuba- das durante a noite e um preparado comercial de tirosinase (Sigma-Aldrich) foi usado como um controle posítivo para atividade enzimática.

Tecido de raiz AXN-1 e enzima tirosinase comercial geraram uma cor marrom no ensaio que é consistente com a melanina, enquanto que o tecido da raiz de controle foi nega- tivo.

A formação de cor era dependente da presença do substrato tirosina.

As- sim, axn-1 é eficazmente expresso em tecido de soja, resultando em atividade de oxidase de polifenol ativa.

Exemplo 27. Transformação de células de milho com os genes nematici- das descritos aqui Espigas de milho são melhor colhidas 8-12 dias após polinização.

Os embriões são isolados das espigas e aqueles embriões com tamanho de 0,8-1,5mm;são preferidos para uso em transformação.

O embriões são coloca- dos, com o lado do escutelo para cima, sobre um meio de incubação adequado, tal como meio DN62A5S (3,98 g/L de sais N6; 1 mL/L (de 1000x Estoque) de . Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarose; 1 mL/L (de Esto- quea1mg/mL)2,4-D). Contudo, meios e outros sais que não DN62A5S são adequados e são conhecidos na técnica.

Embriões são incubados durante a noite a 25ºC no escuro.

Contudo, não é necessário, per se, incubar os embriões durante a noite.

Os explantes resultantes são transferidos para quadrados de malha (3040 porlâmina), transferidos para meios osmóticos durante cerca de 30-45 minutos, então, transferidos para uma placa de pulverização (vide, por exemplo, Publicação PCT No.

WO/0138514 e Patente U.S.

No. 5.240.842). Construtos de DNA criados para os genes da invenção em células de planta são acelerados em tecido de planta usando um acelerador por feixes de aerossol, usando condições essencialmente conforme descrito na Publica- ção PCT No.

WO/0138514. Após pulverização, os embriões foram incubados durante cerca de 30 min sobre meios osmóticos e colocados sobre meios de incubação durante a noite a 25ºC no escuro.

Para evitar dano indevido aos ex- plantes pulverizados, eles são incubados durante pelo menos 24 horas antes de transferência para os meios de recuperação.

Os embriões foram, então, dis- persos sobre meios de recuperação, durante cerca de 5 dias, 25ºC no escuro, então,transferidos para um meio de seleção.

Explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e característi- cas da seleção utilizada em particular.

Após o período de seleção, o caule re- sultante é transferido para meios de maturação de embrião, até que formação de embriões somáticos maduros seja observada.

Os embriões somáticos ma- durosresultantes são, então, colocados sob baixa luz e o processo de regene- ração é iniciado através de métodos conhecidos na técnica.

Os brotos resultan- tes são deixados enraizar sobre meio de enraizamento e as plantas resultantes são transferidas para vasos de germinação e propagados como plantas trans- gênicas.

Materiais Meio DN62A5S O pH da solução é ajustado para um pH de 5,8 com KOH a 1N/KCI a 1N, Gelrite (Sigma) é adicionado em uma concentração de até 3 g/L e o meio é submetido à autoclave.

Após esfriar para 50ºC, 2 ml/L de uma solução de es- toquea5S5 mg/ml de nitrato de prata (Phytotechnology Labs) são adicionados.

Exemplo 28. Transformação dos genes da invenção em células de planta através de transformação Mediada por Agrobacterium Espigas são melhor colhidas 8-12 dias após polinização.

Os embri- ões são isolados das espigas e aqueles embriões com tamanho de 0,8-1,5 mm são preferidos para uso em transformação.

O embriões são colocados, com o lado do escutelo para cima, sobre um meio de incubação adequado e incuba- dos durante a noite a 25ºC no escuro.

Contudo, não é necessário, per se, incu- bar os embriões durante a noite.

Os embriões são contatados com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para transferência mediada peloplasmídeo Tidurante cerca de 5-10 min e, então, colocados sobre meio de cocultura durante cerca de 3 dias (25ºC no escuro). Após cocultura, os explan- tes são transferidos para meio de recuperação durante cerca de cinco dias (a 25ºC no escuro). Os explantes são incubados em meio de seleção durante até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção utilizada emparticular.

Após o período de seleção, o caule resultante é transferido para meio de maturação de embrião, até formação de embriões somáticos maduros " ser observada.

Os embriões somáticos maduros resultantes são, então, colo- 8 cados sob baixa luz e o processo de regeneração é iniciado, conforme conheci- do na técnica.

Exemplo 29. Expressão de proteína AXN-8 em tecido de folha de milho Construção de Vetor O vetor pAG4146 foi preparado para orientar a superexpressão da proteína AXN-8 em tecidos de milho.

O pAG4146 contém o gene de AXN-8 de comprimento total, organizado 3' ao promotor de ubiquitina Ubi4 de cana-de- açúcar (Saccharum sp.) e 5' ao terminador 358 (vírus mosaico de couve-flor), de uma maneira que provavelmente leva à transcrição do gene axn-8 do pro- motor Ubi e término de tal transcrição pelo terminador 35s.

Também presente no vetor está um marcador selecionável que confere resistência ao glifosato (GRG23ace5, sob o controle do promotor Ubi4 de cana-de-açúcar), uma origem dereplicação funcional em espécies Agrobacterium e um gene de resistência à espectinomicina.

A organização do vetor foi confirmada por meio de sequenci- amento de DNA do vetor inteiro.

Detecção de proteína AXN-8 em tecidos de folha de milho Análise Western blot foi utilizada para identificar expressão de pro- teíina AXN-8 em tecidos de folha e raiz. Um grama de tecidos transgênico e de controle foi suspenso em 2x tampão de carregamento LDS (Invitrogen) com B- mercaptoetanol a 2,5 MM e, então, homogeneizado usando glóbulos de aço inoxidável em um instrumento Bead Beater. Os extratos homogeneizados foram separados sobre um gel de Bis-Tris a 4-20%, transferidos para nitrocelulose e, então, incubados com soro de coelho de coelhos imunizados com proteína AXN-8 purificada. Após uma série de etapas de lavagem e incubação com um anticorpo secundário (anticoelho de burro, conjugado com peroxidase de rába- no, Pierce), a presença de AXN-8 foi visualizada por ECL (Pierce). O tamanho da proteína detectada através de Western blot era muito similar para o tecido de folha e raiz e é similar àquele esperado para a proteina AXN-8 de comprimento total (aproximadamente 50 kDa) e corresponde ao tamanho da proteína AXN-8 que foi purificada da cepa bacteriana hospedeira, ATX20514.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relató- f rio descrito são indicativos do nível de perícia daqueles versados no campo ao " qual a presente invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência, até o ponto como se cada publicação ou pedidode patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns deta- lhes à guisa de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será óbvio que determinadas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido tendo atividade nematicida, em que a referida sequência de nucleo- tídeoé selecionada do grupo consistindo em: a) uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13,14, 47, 48 ou 49; b) uma sequência de nucleotídeo que codifica um fragmento de cli- vagem proteolítica de SEQ ID NO: 5, 4, 8, 9, 13, 14, 47, 48 ou 49, em que o referido fragmento tem atividade nematicida; c) uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de iden- tidade de sequência à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9,13, 14,47,480u49;e d) a sequência de nucleotídeo apresentada em SEQ ID NO: 3, 1,2, - 7, 12, 45 ou 46.

2. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindica- ' ção 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeo é uma sequência sintética que foi criada para expressão em uma planta.

3. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindica- ção 2, caracterizada pelo fato de que a referida sequência sintética compreende SEQ ID NO: 6, 10 ou 15.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de —ácidonucleico como definida na reivindicação 1.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.

6. Célula hospedeira bacteriana, caracterizada pelo fato de que contémo inserto do vetor como definido na reivindicação 4.

7. Célula de planta transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma oxidase de poli-

fenol heteróloga, em que uma semente ou planta regenerada a partir da referi- da célula transgênica tem atividade nematicida.

8. Célula de planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida oxidase de polifenol é uma oxidase de polifenolnão vegetal.

9. Célula de planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida oxidase de polifenol é uma oxidase de monofenol.

10. Célula de planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida oxidase de polifenol é uma oxidase de difenol.

11. Célula de planta transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a referida oxidase de polifenol é selecionada do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49; - b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácido ' de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, em que o referido polipeptídeo tem atividade nematicida; c) um polipeptídeo que é um fragmento de clivagem proteolítica de SEQ ID NO: 5, 4, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, em que o referido fragmento tem atividade nematicida; e d) um polipeptídeo que é codificado por SEQ ID NO: 3, 1,2,6,7, 10,12,15,16,17,19,21,45 ou 46.

12. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que é regenerada a partir da célula de planta como definida na reivindicação 11.

13. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zada pelo fato de que a referida planta é selecionada do grupo consistindo em milho, sorgo, trigo, couve, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algo- dão, arroz, soja, beterraba sacarínica, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza.

14. Polipeptídeo isolado com atividade nematicida, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13, 14, 47, 48 ou 49; b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendopelomenos 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5,4,8, 9, 13, 14, 47, 48 ou 49, em que o referido polipeptídeo tem atividade nematicida; c) um polipeptídeo que é um fragmento de clivagem proteolítica de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13, 14, 47, 48 ou 49, em que o referido fragmento tem atividade nematicida; e d) um polipeptídeo que é codificado por SEQ ID NO: 3, 1, 2,6, 7, 10, 12, 15, 45 ou 46.

15. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma sequência de aminoácido heteróloga.

16. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 14.

" 17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada - pelo fato de que a referida composição é selecionada do grupo consistindo em um pó, polvilhado, pelota, grânulo, spray, emulsão, coloide e solução.

18. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a referida composição é preparada através de secagem, liofili- zação, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas.

19. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada —pelofatodeque compreende de cerca de 1% a cerca de 99% em peso do refe- rido polipeptídeo.

20. Método para matar ou controlar uma peste nematoide caracteri- zado pelo fato de que compreende contato da referida peste com ou alimenta- ção à referida peste de uma quantidade nematicidamente eficaz de uma com- —posiçãocompreendendo uma enzima oxidase de polifenol.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a referida oxidase de polifenol é uma oxidase de polifenol não vege-

tal.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a referida oxidase de polifenol é uma oxidase de monofenol.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fatodequea referida oxidase de polifenol é uma oxidase de difenol.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a referida enzima oxidase de polifenol é selecionada do grupo con- sistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQIDNO:5,4,8,9,13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49; b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, em que o referido polipeptídeo tem atividade nematicida; c) um polipeptídeo que é um fragmento de clivagem proteolítica de SEQ ID NO: 5, 4, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, em que o referido 7 fragmento tem atividade nematicida; e . d) um polipeptídeo que é codificado por SEQ ID NO: 3, 1,2,6,7, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 21, 45 ou 46.

25. Método para proteção de uma planta contra uma peste caracte- rizado pelo fato de que compreende introdução, na referida planta ou célula da mesma, de pelo menos um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de oxidase de polifenol nematicida, em que a referida planta é plantada em uma área suscetível à infestação por nematoide.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida enzima oxidase de polifenol é selecionada do grupo con- sistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQIDNO:5,4,8,9,13,14,18,20, 22, 47, 48 ou 49; b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade de sequência à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, 4,8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, em que o referido polipeptídeo tem atividade nematicida; c) um polipeptídeo que é um fragmento de clivagem proteolítica de SEQ ID NO: 5, 4, 8, 9, 13, 14, 18, 20, 22, 47, 48 ou 49, em que o referido fragmento tem atividade nematicida; e d) um polipeptídeo que é codificado por SEQ ID NO: 3, 1,2,6,7, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 21, 45 ou 46. ”