CN102369280B - 编码线虫毒素的基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能够赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子杀线虫活性的组合物和方法。提供了包含杀线虫多肽的编码序列的组合物。所述编码序列能在用于转化植物和细菌并在其中表达的DNA构建体或者表达盒中使用。组合物也包括转化了的细菌、植物、植物细胞、组织以及种子。特别地，本发明提供了分离的杀线虫核酸分子。此外，也涉及和所述多核苷酸对应的氨基酸序列。特别地，本发明提供了分离的核酸分子，包括编码如SEQ ID NO：5、4、8、9、13、14、47、48或者49所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：3、1、2、6、7、10、11、12、15、45或者46所示，以及它们的变体和片段。

Description

编码线虫毒素的基因

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。本发明提供新的编码杀线虫蛋白质的基因。这些蛋白质以及编码它们的核酸序列可用于制备杀线虫制剂以及生产转基因的抗害虫植物。

发明背景

线虫类(衍生自希腊词的线)是活跃的、灵活的、细长形的生物体，它们生活在湿润的表面或者是液体环境中，包括土壤内部的水膜以及其他生物体内部的湿润组织。虽然只有20,000种线虫类被鉴定，实际上却估计有40,000到千万种线虫真实存在。一些种类的线虫已经进化成了非常成功的植物和动物的寄生虫，并且已经造成农业和畜牧业巨大的经济损失和在人类中的发病和死亡。(Whitehead(1998)Plant Nematode Control.CAB International，New York)。

据估计在全世界范围内，每年寄生线虫造成园艺与农业超过780亿美元的损失，依据在整个主要作物预计平均12％年损来计算。例如，预计全世界范围线虫造成大豆大约每年32亿美元的损失(Barker等(1994)Plant and Soil Nematodes：Societal Impact and Focus forthe Future。The Committee on National Needs and Priorities inNematology。Cooperative State Research Service，US Department ofAgriculture and Society of Nematologists)。

只有非常少量的化学物质能够控制线虫(Becker(1999)Agricultural Research Magazine 47(3)：22-24；U.S.Pat.No.6,048,714)。然而，化学杀线虫剂的方式依然是主要的线虫控制方法。通常，杀线虫的化学制品是高毒的化合物，为引发真实的环境影响而为人所知，而且在使用的剂量和位置上越来越被限制。

大环内酯(例如，阿凡曼菌素与密比霉素)是原则上提供优秀的专一性与效力的化学制品，允许环境上安全地管理植物寄生的线虫。遗憾的是，在实践中，这两种杀线虫的试剂在农业应用中被证明对根源病原体效果不明显。虽然某些阿凡曼菌素显示精确的对植物寄生线虫的活性，但是这些化学制品受困于不良生物利用率，因为它们的光敏感性，土壤微生物对其降解，以及与土粒的强结合(Lasota& Dybas(1990)Acta Leiden 59(1-2)：217-225；Wright & Perry(1998)Musculature and Neurobiology.In：The Physiology andBiochemistry of Free-Living and Plant-parasitic Nematodes(R.N.Perry & D.J.Wright编著)，CAB International 1998)。因此尽管对动物寄生线虫，螨与昆虫(植物与动物应用)多年的研究与广泛应用，大环内酯(例如，阿凡曼菌素与密比霉素))从来没有被商业开发用于控制土壤中的植物寄生线虫。

发明概述

本申请提供了给予植物、植物细胞、组织与种子线虫耐受活性的组合物和方法。组合物包括编码杀线虫多肽序列的核酸分子，包含这些核酸分子的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。组合物也包括杀线虫的多肽序列与所述多肽的抗体。核苷酸序列可被用于DNA构建体或者表达盒，所述DNA构建体或者表达盒用来在生物体中转化和表达，生物体包括微生物与植物。核苷酸或者氨基酸序列可以是化学合成的序列，其已经被设计用于在生物体中表达，生物体包括但不限于微生物或者植物。组合物也包含转化了的细菌、植物、植物细胞、组织与种子。

具体地，提供了分离的编码杀线虫蛋白质的核苷酸分子。另外，与杀线虫蛋白质对应的氨基酸序列也被包括在内。具体地，本文提供了一种分离的核酸分子，包括编码SEQ ID NO：4，5，8，9，13，14，47，48或者49所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1，2，3，6，7，10，11，12，15，45或者46所示，以及它们的变体和片段。和本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者和本发明序列杂交的核苷酸序列也被包括在内。

提供了生产本发明多肽的方法，以及用所述多肽控制或者杀死线虫寄生虫的方法。也提供了在样品中检测本发明的核酸和多肽的方法和试剂盒。

本发明的组合物和方法可用于生产具有提高的线虫抗性或者耐受性的生物体。所述生物体和包含组合物的生物体符合农业目的。本发明的组合物用于鉴定和生产具有改善的线虫抗性的植物群体，以及用于鉴定数量性状基因座(Quantitative Trait Loci)(QTLs)，所述数量性状基因座用于具有线虫抗性或耐受性的植物的标识物辅助育种。

附图描述

图1显示多酚氧化酶的酶促作用。

图2显示AXN-I前体蛋白(SEQ ID NO：13)，其质谱峰被标出。

图3A和3B显示了AXN-I(SEQ ID NO：4)和多酚氧化酶的比对，所述多酚氧化酶来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(SEQ IDNO：31)，小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophora tritici-repentis)(SEQ IDNO：32)，Podospora anserina(SEQ ID NO：33)，亚洲香菇(Lentinulaedodes)(SEQ ID NO：34)，血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)(SEQID NO：35)，滑菇(Pholio nameko)(SEQ ID NO：36)，黑孢块菌(Tubermelanosporum)(SEQ ID NO：37)，以及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(SEQ ID NO：38)。

图4显示了AXN-8(SEQ ID NO：13)和多酚氧化酶的比对，所述多酚氧化酶来自双孢菇(Agaricus bisporus)(SEQ ID NO：39)，粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(SEQ ID NO：31)，以及Streptomycescastaneglobisporus(SEQ ID NO：40)。推定结合铜的组氨酸处于氨基酸SEQ ID NO：13的47，81，90，208，212以及235位点。蛋白酶活性位点处于SEQ ID NO：39的377位点，SEQ ID NO：31的403位点。结合铜的组氨酸处于SEQ ID NO：39的58位点，SEQ IDNO：31的67位点，以及SEQ ID NO：40的38，54，63，190，194以及216位点。

图5显示了AXN-9(SEQ ID NO：48)和AXN-8(SEQ ID NO：13)的比对。

图6显示了用抗-AXN-1抗体孵育的大豆发根组织的Western印迹。A泳道是从包含AXN-1基因的转基因根组织获得的根组织，B泳道是来自于缺乏AXN-1基因的对照系。

发明详述

综述

线虫导致包括食物和经济作物的农产品的实质损失，并且基本上和具有杀线虫活性的化合物对抗。线虫类是微小的蠕虫样动物，以超过2,000种蔬菜、果实、与观赏植物的根、叶与茎为食。一种普通的线虫是根结线虫，其进食导致根具有特征性虫瘿。其他的以根部为食的线虫类是胞囊型和损害型，其为更加寄主专一性。大豆胞囊线虫(SCN)可以减少根部固氮根瘤的数量，以及会使根部对其他土壤中带有的植物病原菌的攻击更加敏感。由于现存的线虫防治方法的毒性(与在很多情形里，弱的效力)，人们想要发展出安全与有效的控制线虫的替代方式。

本发明涉及在生物体，特别是植物或者植物细胞中调节线虫抗性或者耐受性的组合物以及方法。所谓“抗性”，意指线虫在摄取本发明的多肽或者与本发明的多肽其他接触时被杀死。所谓“耐受”，意指线虫运动、进食、繁殖或者其他功能损伤或减少。方法包括用编码本发明杀线虫蛋白的核苷酸序列转化生物体。特别地，本发明的核苷酸序列用于制备具有杀线虫活性的植物与微生物。因此，提供了转化了的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。

组合物包括细菌的、真菌的、或者植物来源的杀线虫核酸和蛋白质。此处所述杀线虫核酸序列编码多酚氧化酶。多酚氧化酶据信在预防昆虫与微生物攻击植物中起了关键性的生理学作用，并且作为植物与植物产物对昆虫、微生物、与压伤的伤反应的一部分(Marshall等人综述，(2000)“Enzymatic Browning in Fruits，Vegetables and Seafoods”Food and Agricultural Organization of theUnited Nations at www.fao.org)。随着水果与蔬菜成熟，因为它们的酚含量的降低，使得它们对疾病与害虫侵袭的易感性增加。水果与蔬菜内源的酚氧化酶催化从它们酚的组分生产醌。一旦形成了，这些醌经历了聚合反应，导致了黑色素的产生，所述黑色素显示出抗菌与抗真菌的活性，以及帮助保持水果和/或植物生理学健康。然而，通过利用多酚氧化酶活性控制线虫在以前还没被发现过。

在这里涉及的多酚氧化酶包括新的序列以及本领域已知的多酚氧化酶序列。发现所述序列用于构建随后用来转化到目的生物体的表达载体，作为分离其他同源(或者部分同源)基因的探针，以及用于通过本领域公知的方法(例如结构域交换，或者DNA改组)生产改变的杀线虫蛋白质。发现所述蛋白质用于控制或者杀死线虫害虫群体以及用于生产具有杀线虫活性的组合物。

所谓“杀线虫毒素”或者“杀线虫蛋白质″，意指具有抗一种或多种线虫害虫毒力活性的毒素，包括但不限于，如SEQ ID NO：4，5，8，9，13，14，18，20，22，47，48或者49所示线虫毒素，或者和这样一种蛋白质具有同源性的蛋白质。杀线虫蛋白质包括从此处披露的全长核酸序列推导出来的氨基酸序列，比全长序列短的氨基酸序列，因为使用改变的下游启始位点，或者由于加工(例如，蛋白水解(proteolytic)裂解，可变剪接，等等)，生产出具有杀线虫活性的缩短的蛋白质。所述加工可以在表达所述蛋白质的生物体内发生，或者在吞食所述蛋白质后的害虫体内发生。

线虫害虫

本发明的组合物和方法用于生产对线虫害虫，尤其是植物-寄生线虫耐受的转基因植物。寄生植物的线虫能在植物的所有部分栖居，包括根部、发育的花茎、叶以及茎部。植物寄生虫根据它们的进食习惯分成广义类别：移动的外寄虫、移动的体内寄生虫、与定居内寄生虫。定居内寄生虫，包括根结线虫(根结线虫属(Medoidogyne))与包囊线虫(Globodera和胞囊线虫属(Heterodera))诱导进食部位并且根内部建立长期的感染，对作物非常有害。(Whitehead(1998)Plant Nematode Control。CAB International，New York)。

例举的植物寄生线虫包括但不限于，滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)(滑刃线虫(Foliar nematodes))，刺线虫属物种(belonolaimus spp.)(细刺线虫(The Sting nematode))，松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)(松枯萎线虫(Pine wilt nematode))，轮线虫种(Criconemoides species)(环线虫(Ring Nematode))，马铃薯茎线虫(Ditylenchus destructor)(马铃薯茎线虫(Potato RotNematode))，起绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)(茎线虫(Stem andbulb nematode))，马铃薯癌肿病菌(Globodera pallida)(尖板条马铃薯囊肿线虫(Pale Potato Cyst Nematode))，马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)(金线虫(Golden Nematode))，螺旋线虫属(Helicotylenchus)(螺旋线虫(Spiral Nematodes))，大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode)，甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)(糖用甜菜囊肿线虫(Sugar beetcyst nematode))，玉米异皮线虫(Heterodera zeae)(玉蜀黍囊肿线虫(The Corn Cyst Nematode))，燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)(谷类囊肿线虫(cereal cyst nematode))，纽带线虫属(Hoplolaimus)(柳叶刀线虫(The Lance Nematode))，根结线虫属物种(Meloidogynespp.)(根结线虫)，Mesocriconema xenoplax(环线虫(Ringnematode))，异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)(假根结线虫(Falseroot-knot nematode))，paratrichodorus(粗而短的-根部线虫(Stubby-Root Nematodes))，短体线虫属物种(Pratylenchus spp)(损害线虫(Lesion nematode))，相似穿孔线虫(Radopholus similis)(穿孔线虫(Burrowing nematode))，肾形小盘旋线虫(Rotylenchulusspp.)(肾状线虫(Reniform nematode))，矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)(阻碍线虫(Stunt nematodes))，半穿刺小垫刃线虫(Tylench ulus semipenetrans)((柑桔根线虫(The Citrusnematode))，与剑线虫属(Xiphinema)(短剑线虫(The DaggerNematode))。

多酚氧化酶

这里公开的杀线虫组合物包含多酚氧化酶核酸与氨基酸序列，也包括它们的变体和片段。在各种实施方案中，组合物包含表达或者包含多酚氧化酶的转基因植物或者杀虫配方。所述组合物用于在对线虫侵袭特别是植物寄生线虫侵袭敏感的区域控制或者杀死植物寄生线虫。

为了本发明的目的，“多酚氧化酶”指一类包含铜的氧化酶，包括，例如，单酚单氧化酶，例如酪氨酸酶，联苯酚氧化酶，例如儿茶酚氧化酶与漆酶，血蓝蛋白等等。在各种实施方案中，这里涉及的多酚氧化酶是属于3型铜蛋白质家族。

多酚氧化酶是带有双核铜中心的酶，在酶的活性位点中铜离子结合分子氧原子以使得催化。每个铜原子的氧化态影响氧结合，从而影响每一步骤中的氧化酶活性。单酚单氧化酶的情况下，+2氧化态铜离子指导在现存的酚环邻位上加上羟基。接着联苯酚氧化酶能结合这些联苯酚产物并且氧化两个羟基部分以产生相应的醌。联苯酚氧化酶活性通过将铜离子还原到+1态并且与分子氧原子结合来发挥。虽然有些生物体只拥有单一的多酚氧化酶活性(尤其是植物，其实施联苯酚氧化酶步骤)，其他酶实施单氧化酶与联苯酚氧化酶反应。

对于3型铜酶已经解析出一些X射线结构，并且酶中有保守的、明确的结构基序。值得注意的是这些酶的活性位点，其中铜被六或七个组氨酸残基结合，并且单一的半胱氨酸残基高度保守。结构数据还提示，大多数的多酚氧化酶对它们的底物有某些松弛的专一性，因此酶的活性位点在催化作用中是灵活的。

这种酶似乎是几乎普遍分布在动物、植物、真菌与细菌中。利用cDNA序列技术已经测出来自Streptomyces glaucescens(Huber等人，1985)，抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)(Bernan等人，1985)，与粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(Lerch，1982)，番茄(Shahar等人，1992；Newman等人，1993)，蚕豆(Cary等人，1992)，马铃薯(Hunt等人，1993)，小鼠(Shibahara等人，1986)，以及人类(Kwon等人，1987；Giebel等人，1991)的多酚氧化酶的一级蛋白质序列。密切相关植物例如番茄与马铃薯的多酚氧化酶显示大约91％的序列同源性，而番茄与蚕豆的多酚氧化酶只显示40％精确同源性(Wong，1995)。

尽管由不同物种得来的多酚氧化酶之间序列同一性低，但是它们全部在它们的活性位点有一个两核的铜中心，其中3型铜结合组氨酸残基，并且这个结构是高度保守的。Marusek等人证明来自不同的植物和真菌的多酚氧化酶N-末端域许多重要的结构特点是保守的，包括酪氨酸基序，其被认为是连接N-和C-末端结构域的连接区域的开始标志。序列比对和二级结构预测表明多酚氧化酶的C-末端结构域可能在三级结构上和血蓝蛋白相像(Marusek等人(2006)J Inorg Biochem.100(1)：108-23，这里全文引作参考，特别是关于多酚氧化酶保守结构特征的描述)。

已经公开了相当数量的PPOs的氨基酸序列，从植物、真菌及其他生物体酶的克隆得到的，并且许多报告和综述提供了这样的对比信息，例如van Gelder等人(1997)Phytochemistry 45：1309-1323；Wichers等人(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.61：336-341；Cho等人(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100：10641-10646；Marusek等人(2006)J Inorg Biochem.100(1)：108-23；Halaouili等人(2006)J.Appl.Microbiol.100：219-232；Hernandez-Romero等人(2006)FEBS J.273：257-270；Nakamura等人(2000)Biochem.J.350：537-545；以及，Matoba等人(2006)J.Biol.Chem.281：8981-8990，这里引用的所有文献以其整体引入作为参考。多酚氧化酶已经从哺乳动物、鸟、鱼、昆虫、爬行动物、两栖动物、真菌以及细菌中分离出来。

多酚氧化酶以酶原或者前体多酚氧化酶(propolyphenol oxidase)的形式存在于某些物种中，并且蛋白酶类也被认为在前体多酚氧化酶形式的激活中涉及到。这些蛋白酶类被认为由微生物活性诱导，并且还提示这些酶可以由宿主蛋白酶通过感染或者入侵事件而激活。生物体产生的次级代谢产物，例如葡聚糖，糖蛋白，昆布多糖，脂多糖等等，也可以通过蛋白酶类诱导前体多酚氧化酶的激活。这些代谢物甚至是在缺少蛋白质分解活性时还能激活前体多酚氧化酶。

在各种不同的植物品种中，多酚氧化酶基因在细胞核内编码，并且经历细胞质内翻译。一旦形成，前体多酚氧化酶被运输到叶绿体，在那里经历蛋白裂解剪切，以生产活化的多酚氧化酶形式(Vaughn等人，1988，Physiol.Plant.，72：659-665)。

单酚单加氧酶

单酚单加氧酶(EC 1.14.18.1；CAS number：9002-10-2)催化单酚到o-联苯酚的羟基化作用。所述酶被认为在动物中是酪氨酸酶，因为L-酪氨酸是主要的单酚化酶作用底物。另一方面，酪氨酸是一元羟基的酚，是重要的氨基酸。酪氨酸的羟基化作用导致二羟苯丙氨酸(DOPA)的形成。

在植物中，所述酶有时被认为是甲酚酶，由于其利用单酚底物甲酚的酶的能力。单酚单加氧酶又名单酚单氧化酶、多巴氧化酶、酚氧化酶、酚氧化酶A、酚氧化酶B和酪氨酸酶。

从链霉菌属得到的与称之为“辅助蛋白质(caddie protein)”复合的酪氨酸酶晶体结构描述在Matoba等人(2006)J.Biol.Chem.281(13)：8981-8990，这里引用的所有文献以其整体引入作为参考。

联苯酚氧化酶

联苯酚氧化酶(EC 1.10.3.1；CAS number：9002-10-2)是催化酚例如儿茶酚氧化的酶。联苯酚氧化酶又名儿茶酚氧化酶，多酚氧化酶，以及多酚氧化酶。联苯酚氧化酶利用双氧(02)执行例如儿茶酚的酚的氧化。在有儿茶酚的情况下，苯醌形成了。从儿茶酚脱去的氢与氧结合形成水。

儿茶酚氧化酶是含铜的酶，其活性与酪氨酸酶——一类相关的铜氧化酶的相似。

漆酶(p-联苯酚氧化酶，E.C.1.10.3.2)(DPO)是一种含铜多酚氧化酶。它有独特的氧化p-联苯酚的能力，因而使得它与o-联苯酚氧化酶例如儿茶酚氧化酶不同。几种酚的酶作用底物，包括多酚，甲氧基取代酚，二胺和相当大范围的其他化合物充当漆酶的酶作用底物(Thurston，1994，Microbiology，140：19-26)。漆酶存在于许多致植物病的真菌和某些高等植物中(Mayer和Harel，1991，Phenoloxidase and their significance in fruit and vegetables，In P.F.Fx，ed.Food Enzymology，p.373.London，Elsevier)。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明一方面关于分离或者重组的核酸分子，包括编码杀线虫蛋白质和多肽或者其生物学活性部分的核苷酸序列，也包括核酸分子，其足以用作识别编码具有序列同源性区的蛋白质的核酸分子的杂交探针。如在这里使用的，术语“核酸分子”意指包括DNA分子(例如，重组DNA，cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或者RNA类似物。核酸分子可以是单链或者双链，但优选是双链DNA。

“分离”或者“纯化”的核酸分子或者蛋白质，或者其生物学活性部分，当由重组技术生产出来时，是基本上不含其他的细胞材料或者培养基的；或者当化学合成时，基本上没有无前体化合物或者其他的化学品。优选的是，“分离”核酸不含在该核酸来源的生物体基因组DNA中天然地位于核酸侧翼(即，位于核酸5′和3′端的序列)的序列(优选蛋白质的编码序列)。为了本发明的目的，当用来指核酸分子时，“分离的”则不包括分离的染色体。例如，在各种不同的实施方案中，编码杀线虫蛋白质的分离的核酸分子能包含少于大约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或者0.1kb的在该核酸来源的细胞基因组DNA中天然位于核酸分子侧翼的核苷酸序列。基本上没有细胞材料的杀线虫蛋白质包括有少于大约30％、20％、10％或5％(干重)非-杀线虫蛋白质(此处也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。

编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1，2，3，6，7，10，11，12，15，16，17，19，21，45或46所示的序列，以及它们的变体，片段以及互补序列。所谓“互补序列”意指与给定的核苷酸序列充分互补使得它可以和给定的核苷酸序列杂交形成一种稳固的双螺旋的核苷酸序列。这种核苷酸序列编码的杀线虫蛋白质相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4，5，8，9，13，14，18，20，22，47，48或49所示。

本发明也包括编码杀线虫蛋白质的这些核苷酸序列片段的核酸分子。所谓“片段”，意指编码杀线虫蛋白质的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀线虫蛋白质的生物学活性部分，或者其可以是通过下文披露的方法能用作杂交探针或者PCR引物的片段。编码杀线虫蛋白质的核苷酸序列片段的核酸分子包含大约至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续的核苷酸，或者根据需要高达此处披露的编码杀线虫蛋白质的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目。所谓“连续”的核苷酸，意指彼此直接相连的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段编码仍然保留杀线虫蛋白质生物学活性的蛋白质片段，因此，保留杀线虫以及多酚氧化酶活性。所谓“保留活性”，意指片段具有至少大约30％、至少大约50％、至少大约70％、80％、90％、95％或者更高的参考蛋白质的杀线虫和/或多酚氧化酶活性。

检测线虫抗性或者杀线虫活性的方法描述在，例如，美国专利公开号为Nos.20050191714以及20080153102中，也公开在此处提供的实验实施例中。检测多酚氧化酶活性的方法包括，例如，检测多酚氧化酶对酪氨酸的酶促反应产生的o-醌的存在。多酚氧化酶氧化酪氨酸，其被氧化成o-醌。后者伴随有280nm处增加的吸光率，增长率与酶浓度成正比例，并且在初始滞后之后的5-10分钟阶段是呈线性的。在特定条件下，在25℃，pH 6.5，一个单位导致280纳米处吸光率每分钟0.001的变化。

编码本发明蛋白质的生物学活性部分的编码杀线虫蛋白质的核苷酸序列的片段编码至少大约15，25，30，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350，400，450个连续氨基酸，或者高达本发明全长杀线虫蛋白质中存在的氨基酸总数。

与SEQ ID NO：1，2，3，6，7，10，11，12，15，16，17，19，21，45或者46的核苷酸序列充分同一的核苷酸序列，或者编码与SEQ ID NO：4，5，8，9，13，14，18，20，22，47，48或者49充分同一的氨基酸的核苷酸序列编码本发明优选的杀线虫蛋白质。所谓“充分同一”，意指利用这里描述的比对程序中的一种使用标准参数与参照序列相比具有至少大约60％或者65％序列同一性，大约70％或者75％序列同一性，大约80％或者85％序列同一性，大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者更大的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员可以认识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸类似性、阅读框位置等等适当地调节这些值，以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

为了确定二个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，于最佳对比目的来比对序列。二个序列的同一性百分比是序列共有相同位置数目的函数(即，同一性百分比＝相同位置数目/位置总数(例如，重叠位置)x100)。在一个实施方案中，二个序列是相同的长度。在另一个实施方案中，跨越整个参照序列(即，这里公开的SEQ ID NO：1-22，以及45-49的任一序列)计算同一性百分比。使用类似下文描述的技术，有或没有允许的缺口，能测定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常记入精确配对。

两个序列之间的同一性百分比能利用一个数学运算法则来实现。用于两个序列对比的一个数学运算法则的非限制性例子是Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877改进的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法。这样一个算法被结合到Altschul等(1990)J.MoI.Biol.215：403的BLASTN以及BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序实施，score＝100，wordlength＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用BLASTX程序实施，score＝50，wordlength＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了对比目的获得有空位的比对，可以使用空位化BLAST(在BLAST 2.0)，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389描述。作为选择，PSI-Blast可以用来完成重复搜索，其检测分子间的远缘关系。参见Altschul等人(1997)上文。当使用BLAST，空位化BLAST，以及PSI-Blast程序时，可以使用各程序的默认参数(例如，BLASTX以及BLASTN)。也可以通过人工检阅进行比对。

用于序列对比的数学运算法则的另一个非限制性例子是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列，并且比对所有的氨基酸或者DNA序列，因此能提供关于整个氨基酸序列的保守序列的数据。该ClustalW算法在数个商业供应的DNA/氨基酸分析软件包中被使用，例如Vector NTI Program Suite的ALIGNX模型(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。用ClustalW将氨基酸序列比对后，可以评估出氨基酸的同一性百分比。用于ClustalW比对分析的软件程序的非限制性例子是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(KarlNicholas)允许评估多种蛋白质之间的氨基酸(或者DNA)的相似性和同一性。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法。这样一个算法则被结合到ALIGN程序(2.0版)，ALIGN程序是GCG WisconsinGenetics软件包10版的一部分(获得自Accelrys，Inc.，9685 ScrantonRd.，San Diego，CA，USA)。当利用ALIGN程序对比氨基酸序列时，可以使用一个PAM120权重残基表格，一个空位长度惩罚12，以及一个空位惩罚4。

除非另有说明，使用利用Needleman和Wunsch(1970)J.MoI.Biol.48(3)：443-453的算法的GAP 10版，来测定序列同一性或者相似性，使用如下参数：核苷酸序列％同一性和％相似性，使用GAP权重50以及长度权重3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列％同一性或者％相似性，使用GAP权重8以及长度权重2，以及BLOSUM62评分程序。也可以使用等效程序。所谓“等效程序”，意指对于任何二个考虑中的序列，当和由GAP 10版生成的相应比对相比时，产生具有相同核苷酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对的序列比较程序。

本发明也包括变体核酸分子。杀线虫蛋白质编码核苷酸序列的“变体”包括编码这里所公开的杀线虫蛋白质但是由于遗传密码子简并性而保守性不同的蛋白质的那些序列，以及与上述序列充分同一的那些序列。利用公知的分子生物学技术，例如下文描述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，能鉴定自然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括已经产生的合成得到的核苷酸序列，例如通过使用定位诱变但是还编码本发明披露的如下描述的杀线虫蛋白质。本发明包括的变体蛋白质是有生物学活性的，也就是说它们连续拥有天然蛋白质的期望的生物活性，即，多酚氧化酶和/或杀线虫活性。所谓“保持活性”，意指变体将具有至少有大约30％，至少大约50％，至少大约70％，或者至少大约80％的对照蛋白质的杀线虫活性和/或多酚氧化酶活性。本领域技术人员应该认识到所述变体在没有影响或者很少影响另外一种活性下，在一种活性上(例如，杀线虫活性或多酚氧化酶)增加或者降低。例如，变体蛋白质可以显示相对天然蛋白质提高的杀线虫活性，而无伴随的多酚氧化酶活性提高，反之亦然。除非另作说明，变体蛋白质将有相对于天然蛋白质至少30％的各种活性。测定这些活性的方法在本文的别处描述。

本领域技术人员会进一步理解可以通过本发明的核苷酸序列的突变来引入变化，从而改变编码的杀线虫蛋白质的氨基酸序列，而不改变蛋白质生物学活性。因此，分离的核酸分子变体能通过对这里公开的相应核苷酸序列引入一个或多个核苷酸取代、添加或者缺失来产生，这样一个或几个氨基酸取代、添加或者缺失被导入编码的蛋白质。突变能通过标准技术引入，例如定位诱变和PCR-介导诱变。这样的核苷酸序列变体也被本发明包括在内。

例如，保守的氨基酸取代可以发生在一个或几个预期的非必需氨基酸残基上。“非必需”氨基酸残基是可以从杀线虫蛋白质野生型序列改变而不改变其生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性必需的。“保守的氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被替换为有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在现有技术中已经定义了。这些家族包括有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，无电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。

氨基酸取代可以发生在非保守区域而保持功能。一般情况下，对于这样的对蛋白质的活性是必不可少的保守氨基酸残基，或者保守基序内的氨基酸残基不进行这样的取代作用。保守的和对蛋白质活性是不可缺少的残基例子包括，例如，包括在和本发明序列相似或者相关毒素的比对中包含的所有蛋白质之间相同的残基(例如，在列于附图3和4的比对中所包含的所有蛋白质之间相同的残基)。保守但是可以允许保守的氨基酸取代并且还保持活性的残基例子包括，例如，在和本发明序列相似或者相关毒素的比对中包含的所有蛋白质之间只有保守取代的残基(例如，在列于附图3，4和5中的比对中所包含的所有蛋白质之间只有保守取代的残基)。然而，本领域技术人员会理解，功能性变体可以在保守残基上具有较小的保守或者非保守的改变。

可替代地，核苷酸序列变体可以通过沿着全部或者部分编码序列随机引入突变而获得，例如通过饱和诱变，并且可以对得到的突变体筛选给予杀线虫活性的能力，以鉴别保持活性的突变体。诱变后，编码的蛋白质可以重组表达，并且蛋白质的的活性可以使用标准分析技术测定。

应用例如PCR、杂交等等方法，能鉴定相应的杀线虫序列，这样的序列和本发明的序列具有实质同一性。参见，例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)以及Innis等人(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，NY)。或者，多酚氧化酶序列可以使用许多本领域公知的的多酚氧化酶序列鉴定。

在一种杂交方法中，能使用全部或者部分杀线虫核苷酸序列来筛选cDNA或者基因组文库。构建这样的cDNA以及基因组文库的方法在本领域是公知的，并且披露于Sambrook和Russell，2001，上文。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段，cDNA片段，RNA片段，或者其他的低聚核苷酸，并且可以用可检出基团进行标记，例如³²P，或者可以用任何其他的可检测的标记物进行标记，例如其他的放射性同位素，荧光化合物，酶，或者酶辅因子。杂交用的探针可以以在这里公开的已知的编码杀线虫蛋白质的核苷酸序列为基础，通过标记合成寡核苷酸来产生。另外可以使用根据核苷酸序列或者编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或者氨基酸残基设计的简并引物。探针一般包括，在严谨条件下与本发明的编码杀线虫蛋白质的核苷酸序列或者其片段或变体至少大约12，至少大约25，至少大约50，75，100，125，150，175，或者200个连续的核苷酸杂交的核苷酸序列的区域。制备用于杂交的探针的方法在本领域是公知的，并且披露于Sambrook和Russell，2001，上文，在此处引作参考。

例如，这里公开的完整杀线虫蛋白质序列，或者其一个或者几个部分，可以用作能够和相应的类-杀线虫蛋白质和信使RNA序列特异性杂交的探针。为了在各种不同条件下实现特异性杂交，这样的探针包括特有的序列，并且优选有至少大约10个核苷酸的长度，或者至少大约20个核苷酸的长度。这样的探针可用于通过PCR从一个选定生物体扩增相应的杀线虫序列。该技术可用于从目标生物体中分离另外的编码序列，或者作为测定生物体中编码序列存在与否的判断实验。杂交技术包括杂交筛选平板DNA文库(噬菌斑或者菌落；参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)。

这样的序列杂交可以在严谨条件下进行。所谓“严谨条件”或者“严谨杂交条件”，意指探针和它的目标序列杂交的可检测度大于和其他序列杂交(例如，比背景高至少2-倍)的条件。严谨条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨度，能鉴定和探针100％互补的目标序列(同源性探测)。或者，能调节严谨条件使允许序列中一些不匹配，以便检测较低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于大约1000个核苷酸，优选小于500个核苷酸的长度。

一般地，严谨条件是其中盐浓度小于大约1.5M Na离子，典型地大约为0.01到1.0M Na离子浓度(或者其他的盐)，pH 7.0到8.3的那些条件，对于短探针(例如，10到50个核苷酸)温度至少大约30℃；对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度至少大约60℃。严谨条件也可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。例示的的低严谨条件包括在30-35％甲酰胺缓冲溶液，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)，37℃下杂交，以及在50-55℃下用1X到2X SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸钠)洗涤。例示的中等严谨条件包括在40-45％甲酰胺缓冲溶液，1.0M NaCl，1％SDS，37℃下杂交，以及在55-60℃下用0.5X到1X SSC洗涤。例示的高严谨条件包括在50％甲酰胺缓冲溶液，1M NaCl，1％SDS，37℃下杂交，以及在60-65℃下用0.1X SSC洗涤。视情况而定地，洗涤缓冲液可以含有大约0.1％到大约1％SDS。杂交持续的时间通常少于24小时，通常为大约4到12个小时。

特异性通常是杂交后洗涤，是最后洗涤溶液的离子强度和温度的关键性因素的函数。对于DNA-DNA杂交，T_m可以从如下等式估算出来，Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是一价阳离子摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤核苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交液中甲酰胺的百分比，L是以碱基配对计的杂交物的长度。T_m是互补的目标序列50％和完美配对的探针杂交的温度(在给定离子强度和pH下)。T_m每降低一度会造成1％的误配；因此，能调节T_m、杂交和/或洗涤条件，与期望的同一性的序列杂交。例如，如果寻求≥90％同一性的序列，T_m可以降低10℃。通常，对于给定离子强度和pH的特定序列和它的互补序列，选择严谨条件低于热熔点(Tm)大约5℃。然而，极高的严谨条件可以利用在低于热熔点(Tm)1，2，3或者4℃下的杂交和/或洗涤；中等严谨条件可以利用在低于热熔点(Tm)6，7，8，9或者10℃下的杂交和/或洗涤；低严谨条件可以利用在低于热熔点(Tm)11，12，13，14，15或者20℃下的杂交和/或洗涤。利用该等式，杂交和洗涤组合物和要求的Tm，本领域技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的严谨性的变化是内在地描述的。如果期望的错配程度导致Tm小于45℃(水性溶液)或者32℃(甲酰胺溶液)，那么优选增加SSC的浓度以便应用较高的温度。核酸杂交的全面指南参见Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，I部分，第2章(Elsevier，New York)；以及Ausubel等人编著的(1995)Current Protocols in MolecularBiology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork)。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)。

分离的蛋白质及其变体和片段

本发明还包括杀线虫蛋白质。所谓“杀线虫蛋白质”，意指获得具有如SEQ ID NO：5，8，14，18，20，22或者48所示的氨基酸序列的蛋白质。也提供了其片段，生物活性部分，和变体，并且其可用来实验操作本发明的方法。

“片段”或者“生物活性部分”包括包含与SEQ ID NO：4，5，8，13，14，18，20，22，47，48或49所示的氨基酸序列足够相同，而且显示出多酚氧化酶和/或杀线虫活性的氨基酸序列的多肽片段。在一些实施方案中，生物活性片段显示出多酚氧化酶和杀线虫活性。杀线虫蛋白质的生物学活性部分可以是，例如，10，25，50，100，150，200，250或更多的氨基酸长度的多肽。这样的生物学活性部分可以用重组技术制备，并且评估其杀线虫和/或多酚氧化酶活性。测定杀线虫活性和多酚氧化酶活性的方法在这里的别处描述了。如这里使用的，片段包括SEQ ID NO：4，5，8，13，14，18，20，22，47，48或49的至少8个连续氨基酸。然而本发明还包括其他的片段，例如大于大约10，20，30，50，100，150，200，250或300个连续氨基酸的蛋白质中的任何片段。

所谓“变体”，意指具有和SEQ ID NO：4，5，8，13，14，18，20，22，47，48或者49的氨基酸序列至少大约60％，65％，大约70％，75％，大约80％，85％，大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或者99％的同一性的氨基酸序列的蛋白质或者多肽。变体还包括在严谨条件下与SEQ ID NO：1，2，3，6，7，10，12，15，16，17，19，21，45或者46的核酸分子或者其互补序列杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括因为诱变而氨基酸序列不同的多肽。本发明包括的蛋白质变体是生物学活性的，也就是说它们仍然保持所需的天然蛋白质生物活性，那就是说，保持杀线虫活性和/或多酚氧化酶活性。在一些实施方案中，变体显示出多酚氧化酶和杀线虫活性两者。

细菌基因，例如在这里公开的一些新的基因，相当经常在接近于开放阅读框的起始部分具有多重的甲硫氨酸起始密码子。经常地，起始于这些起始密码子的一个或几个的翻译将导致产生功能蛋白。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，一些细菌还识别GTG密码子为起始密码子，在GTG密码子开始翻译的蛋白质包含甲硫氨酸作为第一个氨基酸。此外，常常不能确定在细菌中这些密码子中的哪些优先自然地使用。因而，可以理解使用这些可选甲硫氨酸密码子的之一也可以产生杀线虫蛋白质。在本发明中包括这些杀线虫蛋白质，并且可以在本发明的方法中使用。

本发明的多肽、或者其变体或其片段的抗体，也被包括在内。生产抗体的方法在本领域是公知的(参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY；U.S.Patent No.4，196，265)。

改变的或者改进的变体

认识到杀线虫蛋白质的DNA序列可以通过不同的方法改变，而且这些改变可以产生编码蛋白质的DNA序列，所述蛋白质的氨基酸序列不同于本发明的杀线虫蛋白质的氨基酸序列。可以以各种不同方式改变这种蛋白质，包括SEQ ID NO：4，5，8，9，13，14，18，20，22，47，48或者49的一个或几个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短、和插入，包括多至大约2，大约3，大约4，大约5，大约6，大约7，大约8，大约9，大约10，大约15，大约20，大约25，大约30，大约35，大约40，大约45，大约50，大约55，大约60，大约65，大约70，大约75，大约80，大约85，大约90，大约100，大约105，大约110，大约115，大约120，大约125，大约130，大约135，大约140，大约145，大约150，大约155，或者更多的氨基酸取代、缺失或者插入。这样的操作方法在本领域是公知的。例如，杀线虫蛋白质的氨基酸序列变体可以通过突变DNA制备。这也可通过多种诱变类型之一和/或在定向进化下完成。在一些方面，该编码氨基酸序列的变化基本上不会影响该蛋白质的功能。这样的变体具有期望的杀线虫活性。然而，要理解杀线虫蛋白质给与杀线虫活性的能力可以通过在本发明的组成物基础上利用这样的技术而得到改善。例如，可以在DNA复制期间表现高比例碱基错配的寄主细胞例如XL-1Red中表达杀线虫蛋白质(Stratagene，La Jolla，CA)。在这样的菌株增殖后，可以分离该DNA(例如通过制备质粒DNA，或者通过PCR扩增以及将得到的PCR片段克隆成一个载体)，在非诱变菌株中培养该杀线虫蛋白质突变体，并且例如通过实施测定杀线虫活性的分析来鉴定带有杀线虫活性的突变基因。通常，在饲料实验中混合蛋白质并且使用，例如Marrone等人(1985)J.ofEconomic Entomology 78：290-293。这样的试验包括使植物接触一种或多种害虫，并且测定该植物存活的能力和/或引起害虫死亡的能力。

另外地，可以在氨基或者羧基末端改变许多蛋白质的蛋白质序列，而基本上不影响活性。这包括通过现代分子学方法引入的插入、缺失、或者改变，诸如PCR，包括改变或者延伸该蛋白质的编码序列的聚合酶链式反应扩增，通过将PCR扩增中使用的寡核苷酸加入氨基酸编码序列。另外地，加入的蛋白质序列可包括完整的蛋白质编码序列，诸如本领域普遍使用的产生蛋白质融合体的那些。这样的融合蛋白质常常用来(1)增加所关心的蛋白质的表达；(2)引进利于蛋白质纯化，蛋白质检测，或者其他本领域已知的实验用途的结合域，酶活性，或者表位；(3)亚细胞器的蛋白质目标分泌或者翻译，诸如革兰氏阴性细菌的周质间隙，或者真核细胞的内质网，后者常常导致该蛋白质的糖基化作用。

本发明的核苷酸和氨基酸序列变体还包括由诱变和重组基因程序例如DNA改组得来的序列。用这样的程序，能使用一个或几个不同的杀线虫蛋白质编码区来产生具有期望的性质的新的杀线虫蛋白质。用这样的方式，从包括具有实质序列同一性并且能在体外或者体内同源重组的序列区的相关的序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库。例如，使用这方法，可以在本发明的杀线虫基因及其他已知的杀线虫基因之间改组编码所关心的域的序列基序，以获得目的性质得到改善例如提高的杀虫活性的蛋白质的新编码基因。这样的DNA改组策略在本领域中是已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及U.S.Patent Nos.5,605,793以及5,837,458。

结构域交换或者改组是另一种产生改变的杀线虫蛋白质的策略。结构域可以在杀线虫蛋白质之间交换，产生有改善的杀线虫活性或者目标光谱的杂交或者嵌合毒素。产生重组体蛋白质和测试其杀线虫活性的方法在本领域是公知的(参见，例如，Naimov等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；de Maagd等人(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge等人(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf等人(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang等人(1999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。

蛋白酶切割位点操作

在本发明的各个实施方案中，在目的宿主细胞中表达编码全长多酚氧化酶的切割片段的核苷酸序列。在其他的实施方案中，修饰编码多酚氧化酶序列的核苷酸序列，添加或除去编码蛋白裂解切割位点的序列。例如，一些全长多酚氧化酶，例如AXN-I和AXN-8，是非活化的前体蛋白，其需要蛋白水解作用的切断以获得对SCN有活性的毒素。例如，在大肠杆菌中表达的全长AXN-8对SCN不是有活性的，但是当它用胰蛋白酶处理，该蛋白质的C-末端部分被移除了，产生了有活性的缩短的蛋白质。当AXN-8在大肠杆菌以缩短形式表达，检测不到SCN活性，提示为了使该蛋白质在合成时被适当地折叠，完整的序列可能是必须的。此外，不受任何特殊的理论或者机制限制，也有可能的是，活性多酚氧化酶可以催化对植物或者以该植物为食的动物(除了所感兴趣的害虫，例如，线虫)有毒的化合物的生产。全长的非活化的蛋白质的表达会阻止其发生，直到该酶被蛋白水解截短激活。所述激活只当线虫浸染该植物时才发生，并且只发生在线虫坐落的区域。一旦线虫被毒素杀死，就不会产生更多的激活的多酚氧化酶，因为没有更多线虫生产的蛋白酶。

不管因为如上所述的任何原因，如果全长的非活性蛋白质在植物中表达，其必定会被水解截短以显示出对SCN或者其他植物寄生线虫的毒力。有可能植物蛋白酶会实现至少在某种程度上的激活，但是如果线虫生产的蛋白酶能够截短蛋白质，则可以实现更完全的激活。如果想要该多酚氧化酶在线虫浸染植物之前保持无活性(例如，作为阻止化学反应的催化作用的一条途径，所述途径可能生产对植物或者非目的生物体有毒的化合物)，则可以对能被植物蛋白酶类切割的蛋白质上天然存在的任何截短位点进行突变使其不再被切割。不论哪种状况，能修饰(或进一步修饰)多酚氧化酶序列，使得它在适当的截断位置包含线虫蛋白酶识别位点。这个位置可以通过对从它的天然源分离的活性毒素进行序列分析而测定，或者通过对用能实施截短的蛋白酶例如在AXN-8情况下的胰蛋白酶处理全长蛋白质得到的活性毒素进行序列分析来测定。蛋白酶识别部位的选择取决于由线虫分泌到植物中或者存在于线虫消化系统中的蛋白酶。能通过分离蛋白酶并测定它们的底物特异性，或者通过对来自线虫或者来自从线虫提取的mRNA制备的cDNA文库测序的基因进行测序并且确定该基因属于那个蛋白酶家族来测定这种位点。分泌的蛋白酶将激活植物中的毒素，而线虫消化系统的蛋白酶则在它被摄取之后激活毒素。

已经证明大豆胞囊线虫的食道腺细胞表达一种推定的半胱氨酸蛋白酶(Genbank accession AF345792)。这种蛋白酶属于肽酶C13家族，其由天冬酰胺酰半胱氨酸内肽酶组成(特定在天冬酰胺残基之后切割的蛋白酶)。在本发明的一个实施例中，转基因植物表达的多酚氧化酶可以由SCN活化，通过改变多酚氧化酶的序列，使得它在截短位点包含一天冬酰胺残基，这样产生了活性酶。不受任何特定理论或者机制限制，这种版本的多酚氧化酶可能会比野生型的酶有更强的活力，因为它在SCN存在下完全活化了。而且，SCN不存在时它可能保持没有活性，从而避免酶催化反应的化学产品的累积。如果蛋白质中存在植物蛋白酶的识别位点，可以对其突变使得只有该线虫蛋白酶能够执行截断。任何目标害虫可以用类似方法。多酚氧化酶的截短位点可以被修饰，使得它容易被目标害虫产生的蛋白酶截短。

载体

本发明的多酚氧化酶序列(或者本领域公知的任何其他多酚氧化酶序列)可以在表达盒中提供用于在感兴趣植物中的表达。在各种实施方案中，多酚氧化酶序列选自任何本领域公知的多酚氧化酶。在另一个实施方案中，多酚氧化酶选自来自里氏木霉(Trichodermareesei)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大豆(GlycineMax)、玉蜀黍(Zea maize)、Streptomyces castaneoglobisporus、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)物种的多酚氧化酶。

所谓“植物表达盒”，意指能够导致在植物细胞中由开放阅读框表达蛋白质的DNA构建体。一般地，这些包含增强子和编码序列。这样的构建体常常还包含3′非翻译区。这样的构建体可包含“信号序列”或者“前导序列”以促进肽的共同翻译或者翻译后运输到确定的胞内细胞结构，例如叶绿体(或者其他的质体)、内质网或者高尔基体。

所谓“信号序列”，意指已知或者预计导致共同翻译或者翻译后多肽跨细胞膜运输的序列。在真核生物中，这一般涉及分泌到高尔基体，伴随着一些产生的糖基化作用。细菌的杀虫毒素常常作为毒素原被合成，其在目标害虫的肠中被蛋白裂解激活(Chang(1987)Methods Enzymol.153：507-516)。在本发明的一些实施方案中，信号序列位于天然序列中，或者来源于本发明的序列。所谓“前导序列”，意指当翻译时，产生足够触发肽链共翻译运输到亚细胞器的氨基酸序列的任何序列。因而，这包括靶向运输和/或进入内质网的糖基化作用、靶向进入液胞、质体包括叶绿体、线粒体等等的前导序列。

所谓“植物转化载体”，意指植物细胞有效转化必须的DNA分子。这样的分子可由一个或几个植物表达盒组成，并且可组织成超过一个“载体”的DNA分子。例如，双载体是利用两个非连续DNA载体以编码植物细胞转化的全部必要的顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science5：446-451)。“载体”指的是为了在不同的宿主细胞之间传递而设计的核酸构建体。“表达载体”指的是在外来细胞中具有插入、整合并且表达异源DNA序列或者片段能力的载体。表达盒包括和本发明的序列有效连接的5′和3′调节序列。所谓“有效连接”，意指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列开始并且调节对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，有效连接的意思是连接的核酸序列是紧邻的，并且需要时连接两个蛋白质的编码区，连续的并且在同一个阅读框内。表达盒可另外包含至少一个要共转化到生物体的附加基因。或者，能在多个表达盒中提供附加基因。在各种实施方案中，本发明包括包含载体插入物的宿主细胞。所谓“载体插入物”，意指包含整合到宿主细胞基因组中的本发明基因的DNA序列。

“启动子”指的是功能是指导下游编码序列转录的核酸序列。启动子和其他转录和翻译调节核酸序列(也称为“控制序列”)一起是所目的DNA序列表达所必须的。启动子可以是组成型的或者可诱导型的，或者只在某些植物部分是有功能的。在各种实施方案中，启动子是根特异性启动子(例如，FaRB7，Vaughan(2006)J.Exp.Bot.57：3901-3910)。在一些实施方案中，启动子是饲食位点特异性启动子(例如，TobRB7，Opperman(1994)Science 263(5144)221-223)。

这样的表达盒提供有许多限制性内切位点，用于插入杀线虫序列到调节区域的转录调节之下。

表达盒以转录5′-3′方向包括：在植物中有功能的转录和翻译启动区域(即启动子)，本发明的DNA序列，翻译和转录终止区域(即终止子)。启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是自然的或者相似的，或者外来的或者外源的。另外，启动子可以是天然序列或者合成序列。当启动子对植物宿主是“天然的”或者“同源的”，意指该启动子在启动子被引入的天然植物中找到。当启动子对本发明的DNA序列是“外来”或者“异源”的，意指该启动子对于本发明有效连接的DNA序列来说不是天然的或者自然存在的启动子。

终止区域可以和转录起始区域一起是天然的，可以和有效连接的目的DNA序列一起是天然的，可以和植物宿主一起是天然的，或者可以来自其他来源(即，对于启动子、目的DNA序列、植物宿主或者其任意组合是外来的或者异源的)。来自A.tumefaciens的Ti-plasmid的是方便的终止区域，例如章鱼肉碱合酶和胭脂碱合酶终止区域。也可参见Guerineau等人(199I)Mol Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等人(1987)NucleicAcid Res.15：9627-9639。

如果适当，为了在转化的宿主细胞中增加表达可以对基因优化。也就是说，基因能使用宿主细胞偏好的密码子合成来改善表达，或者可以使用宿主偏好的密码子使用频率的密码子来合成。通常，基因的GC含量会增加。对于宿主偏好的密码子使用的讨论，参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。合成植物偏好基因的方法是本领域可得的。参见，例如，U.S.Patent Nos.5,380,831，和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，这里引作参考。

在一个实施方案中，蛋白质被定位到叶绿体表达。在这种方式，当蛋白质不是直接插入到叶绿体中时，表达盒另外包含编码转运肽以指导多肽转运到叶绿体中的核酸。这样的转运肽在本领域是已知的。参见，例如Von Heijne等(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等(1986)Science233：478-481。

为了在叶绿体中的表达，可以对定位到叶绿体的基因优化，考虑到植物细胞核和细胞器之间密码子使用的不同。通过这种方式，使用叶绿体偏好密码子可以合成目的核酸。参见，例如，U.S.PatentNo.5,380,831，在这里引作参考。

植物转化

本发明的方法涉及导入核苷酸构建体到植物中。所述方法包括将至少一个编码异源多酚氧化酶的核苷酸序列导入到至少一个植物细胞中。在不同的实施方案中，多酚氧化酶来自植物。在其它实施方案中，多酚氧化酶来自非植物生物体(例如，真菌、藻、细菌或者其他的非植物微生物)。多酚氧化酶可以是单酚氧化酶或者联苯酚氧化酶。在各种实施方案中，多酚氧化酶选自SEQ ID NO：1-22或者45-49，或者表13涉及的多酚氧化酶。

所谓“导入”，意指以这样一种方式将核苷酸构建体呈递给植物，使得构建体进入植物细胞内部。本发明的方法不要求使用特殊的导入核苷酸构建体到植物中的方法，只要核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。将核苷酸构建体导入到植物的方法在本领域是已知的，包括但不限于，稳定转化方法，瞬时转化方法，以及病毒介导的方法。

所谓“植物”，意指整个植株、植物器官(例如，叶、茎、根等等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和它们的后代。植物细胞可以是分化的或者没有分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或者“转化的植物”或者“稳定转化”的植物或者细胞或者组织指的是，将外源核酸序列或者DNA片段插入或整合到植物细胞的植物。这些核酸序列包括那些外源的，或者在非转化植物细胞中不存在的。“异源”指的是对细胞或者它们存在的天然基因的部分而言不是内源的，并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击或者类似的方法加入到细胞中的核酸序列。

植物细胞的转化能通过几种本领域已知的技术中的一种来实现。可以修饰此处描述的多酚氧化酶以获得或者提高在植物细胞中的表达。典型地，表达这样一种蛋白质的构建体会包括驱使基因转录的启动子，还有允许转录终止以及多腺苷酸化的3’非翻译区域。这样的构建体的组织结构在本领域是公知的。在一些情况下，对基因进行工程处理是有用的，使得生产的多肽被分泌或者在植物细胞内定位。例如，对基因进行工程处理以包含一个信号肽以有利于肽运输到内质网中。优选的是，工程处理植物表达盒使其包含内含子，使得表达需要内含子的mRNA处理。

典型地，将这种“植物表达盒”插入到“植物转化载体”中。这种植物转化载体可以由实现植物转化需要的一个或几个DNA载体组成。例如，本领域普通的实践是利用由多于一个连续的DNA片段组成的植物转化载体。这些载体通常在本领域指作“双载体”。双载体以及有辅助质粒的载体最经常用于农杆菌介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的尺寸和复杂度是非常大的，将功能分离到分别的DNA分子是有好处的。双载体通常包括质粒载体，其包含T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)，选择性标记，其工程处理使能够在植物细胞中表达，还有“目的基因”(经工程处理能够在期望转基因植物产生的植物细胞中表达的基因)。这种质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。以这样一种方式安排顺式作用序列使有效地转入植物细胞并在此处表达。例如，选择性标记基因和杀线虫基因位于左和右边界之间。通常第二质粒载体包含反式作用因子，其介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞。这种质粒通常包含使得农杆菌感染植物细胞的毒性功能(VIR基因)、通过在边界序列切割转移DNA和毒力介导的DNA转移，这是本领域理解的(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science5：446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404，GV3101，EHAlOl，EHA105，等等)能用于植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法诸如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等转化方法转化植物不是必须的。

一般来说，植物转化方法涉及将异源DNA转移到目标植物细胞(例如不成熟的或者成熟胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等等)，接着实施最大阈值水平的合适的筛选(取决于选择标记基因)，从一组未转化的细胞群回收转化的植物细胞。外植体通常被转移到相同培养基的新鲜培养基常规培养。接着，放置在补充有最大阈值水平的选择试剂的再生培养基中之后，转化了的细胞分化成为苗。接着将苗转移到选择的生根培养基，得到生根的苗或者小植株。转基因小植株接着长成成熟的植物并且产生能育种子(例如Hiei等(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750)。外植体通常被转移到相同培养基的新鲜培养基常规培养。生产转基因植物的技术和方法的一般性描述可以在此处找到：Ayres和Park(1994)Critical Reviews inPlant Science 13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120。既然转化的材料包含很多细胞；转化的和没有转化的细胞都存在于靶愈伤组织或者组织或者细胞群中。杀死未转化细胞并使转化细胞增殖的能力导致了转化植物培养物。经常地，除去未转化细胞的能力是快速回收转化的植物细胞和转基因植物成功产生的限制条件。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物的方案可以根据目标转化的植物或者植物细胞的类型例如单子叶或者双子叶而不同。转基因植物的产生可以通过几种方法中的一种来实施，包括但不限于，显微注射、电穿孔、定向基因转移、通过农杆菌将异源DNA导入植物细胞中(农杆菌介导的转化)、用附着于粒子的外源DNA轰击植物细胞、弹道粒子加速、气溶胶射线转化(U.S.Published ApplicationNo.20010026941；U.S.Patent No.4,945,050；InternationalPublication No.WO 91/00915；U.S.Published Application No.2002015066)、Lecl转化，以及各种其他的非粒子定向介导转移DNA的方法。

叶绿体的转化方法在本领域是公知的。参见，例如，Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。所述方法依赖于包含可选择标记的DNA的粒子枪传递，并且通过同源重组将DNA定向于质体基因组。此外，通过核编码以及质体定向RNA聚合酶的组织偏好表达对带有沉默质体的转基因的反式激活作用能实现质体转化。这样的系统报导在McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305。

将异源外来DNA整合到植物细胞后，在培养基中实施最大阈值水平的合适的筛选，杀死未转化的细胞并且分离和繁殖推定的转化的细胞，即从通过有序转移到新鲜培养基的选择处理中生存了下来的细胞。通过连续传代并经过合适的筛选挑战，人们鉴别并且繁殖用质粒载体转化了的细胞。

已经开发出很多标记物用于植物细胞，例如对氯霉素，氨基糖苷类G418，潮霉素的抗性，等等。编码叶绿体代谢作用涉及的产品的其它基因也可以用作选择标记物。例如，提供对植物除草剂诸如草甘膦，溴苯腈，或者咪唑啉酮抗性的基因可能发现特别有用。这样的基因已经有报道(Stalker等(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，此处公开的基因作为评定细菌或者植物细胞转化的标记物是有用的。分子和生化的方法则被用来证实所关心的整合到转基因植物基因组的异源基因的存在。转基因在植物、植物器官(例如，叶、茎、根等等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或者它们的后代中存在的检测方法在本领域是公知的。在一个实施方案中，通过检验杀线虫活性来检测转基因的存在。在另一个实施方案中，通过检验多酚氧化酶活性来检测转基因的存在。

已经转化的细胞可以根据常规方式长成植株。参见，例如，McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。接着可以种植这些植物，用相同转化株或者不同株授粉，并且鉴定产生的具有组成型表达期望的表型特征的杂种。可以生长两代或更多世代以保证要求的表型特征的表达是稳定持续并且遗传的，然后收获种子，实现确保要求的表型特征的表达。用这样的方式，本发明提供了转化的种子(也称做“转基因种子”)，其包含稳定插入到它们的基因组中的本发明的核苷酸构建体，例如，本发明的表达盒。

本发明可用于任意植物品种的转化，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括但是不限于，谷物(玉米)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔、紫花苜蓿、黑麦、黍、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶叶、香蕉、鳄梨、无花果、石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳大利亚坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但是不局限于，番茄、莴苣、菜豆、利马豆、豌豆和curcumis属的成员，诸如黄瓜、罗马甜瓜和香瓜。观赏植物包括但是不局限于，杜鹃花、八仙花、木槿、玫瑰、郁金香、水仙花、牵牛花、康乃馨、猩猩木和菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、马铃薯、棉、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等等)。

植物转化的评价

将异源外来DNA导入植物细胞后，通过许多方法证实异源基因转化并整合到植物基因组中，例如核酸、蛋白质，和整合的基因相关的代谢产物的分析。

PCR分析是一种在移栽到土壤之前的早期阶段，对转化细胞，组织或者苗筛选是否存在整合基因的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用对所关心基因或者土壤杆菌载体背景等等特异的低聚核苷酸引物来进行PCR。

植物转化可以用Southern blot对基因组DNA分析来证实(Sambrook和Russell，2001，上文)。通常，从转化体中提取出总DNA，用适当的限制性内切酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离，并转移到硝化纤维或者尼龙膜。按照标准技术，该膜或者“印记”，使用，例如，针对DNA片段的放射性同位素示踪的³²P来探测，证实引入的基因已经整合到植物基因组中(Sambrook和Russell，2001，上文)。

Northern印迹分析中，按照本领域通常使用的标准程序，从转化体特定的组织分离出RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分级，印迹到尼龙过滤膜之上(Sambrook和Russell，2001，上文)。接着通过本领域已知的方法，通过滤膜与衍生自杀线虫基因的放射性探针杂交，来测试杀线虫基因编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，2001，上文)。

对转基因植物进行Western印迹分析，生化分析等，通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，上文)，使用与杀线虫蛋白质上存在的一个或几个表位结合的抗体，以证实杀线虫基因编码的蛋白质的存在。

筛选和培育有多酚氧化酶活性的植物的方法

已知许多不同植物物种都表达多酚氧化酶。在有些情况下，已经证明多酚氧化酶的表达与改善的农学特性有关。例如，已经证明对气候胁迫显示出相对高抗性的植物比易受影响的品种有相对较高的多酚氧化酶水平(Thipyapong等(2007)Molecules 12(8)：1569-95)。然而，在本发明以前，还没有证实具有多酚氧化酶活性的植物对线虫侵染有抗性。对具有最理想的多酚氧化酶水平的植物的鉴别提供了一种至今未被认识的、研发适于在线虫侵袭易感区域耕作的植物的时机。所谓“最佳多酚氧化酶活性”，意指当表达多酚氧化酶的植物暴露于线虫害虫时，足够造成至少一种害虫死亡，或者显著地减少害虫生长、进食、或正常生理发育的酶活性水平。

因而，在这里提供了筛选植物或者植物品种多酚氧化酶活性的方法。例如，通过使用本领域已知的并且在本文别处描述的实验，能对从不同植物(例如，不同的近交系，或者不同的杂交品种后代)获得的根检验多酚氧化酶活性。表达多酚氧化酶的植物可以检测到杀线虫活性，并且选择显示最佳活性的植物用于线虫侵袭易感田间，或者用来进一步育种用于将线虫抗性性状基因渗入到植物群体中。具有最佳活性的多酚氧化酶的鉴定可能与多酚氧化酶的存在、多酚氧化酶的表达或者活性的相对水平、或者与改善的多酚氧化酶活性和/或线虫抗性有关的多态性的存在有关系。多态性可能在多酚氧化酶基因本身内，或者可能在被鉴定为与多酚氧化酶表达有关系或者与之连锁的遗传标志内(即，与多酚氧化酶表达有关的数量特性基因座(QTL)内)。

本发明的方法进一步包括对已存在的QTLs筛选多酚氧化酶基因或者多态性存在的线虫抗性。早先的研究已经鉴定了线虫抗性涉及的连接为QTLs的大遗传区域，并且这些区域可能包含一些多酚氧化酶或者酪氨酸酶。QTLs一般包含要不是数千就是数百的基因，然而构成相关性状原因的基因的鉴定常常是不易捉摸的。因而，本发明期望从这样的区域筛选多酚氧化酶基因(或者其特殊的多态性)。这些遗传因素，或者与这些多酚氧化酶遗传成分紧密连锁的遗传标志，能被用于标记物辅助育种规程，以开发对线虫侵袭更有抗性的植物。对遗传区域筛选出目的基因的方法在本领域是常规的，标记物辅助育种方法也是本领域常规的。

种质诱变

本发明进一步提供使用种质诱变来开发有线虫抗性植物的方法。诱变是产生不存在或者现存种质中还没有发现的遗传多样性的手段。用诱变剂处理体细胞胚、未成熟种子培养部分来源的胚是一种有效的产生突变的方法，因为它们比细胞培养更容易再生成完全植株，并且比种子在大量处理时容易。因此，本发明涉及的方法包括诱变植物种质，以及对来源于其中的成分(例如，根提取物)筛选多酚氧化酶活性。能使用具有最佳多酚氧化酶活性的分离物来开发适于在线虫侵袭易感区域种植的植物种群。

种质诱变的方法在本领域是公知的。γ射线是最常用的诱变剂，但是新的试剂包括离子束和空间条件也已经用于突变诱导和育种(Chen等(2006)Plant Mutation Reports Volume 1Number 1 atwww-naweb.iaea.org/nafa/pbg/public/pmr-01-0l.pdf)。已经证明用于突变诱导的体外培养物的使用、或其它培养物的使用以从接受照射的后代快速产生纯合品系在一些实验室是很有用处的。

在田间控制线虫的方法

本发明提供了在易感一种或几种植物寄生线虫害虫侵袭的田间控制线虫的方法。所述方法包括在易感植物寄生线虫侵袭的区域培植植物，其中植物表达异源的多酚氧化酶。对侵袭易感的“区域”或者“大田”包括有可检测水平的一种或几种种类的植物寄生线虫的地理区或者种植区。“可检测水平”包括充分高足以引发易感植物的损伤的植物寄生线虫的任何水平。线虫伤害的信号包括矮化和叶子发黄、炎热期植物枯萎。然而，一些线虫，包括大豆胞囊线虫(SCN)，其能引起显著的收得率损失，而没有明显的地上症状。在这种情况下，感染植物寄生线虫的根部相比没有侵染线虫的植物的根部会矮化或者矮小。不同线虫类型的各种不同的肉眼可见的和显微的其它检测方法在本领域是已知的。并且一般通过当地的农业推广服务来实施。对线虫侵袭易感的区域还可以包括土壤中具有可检测水平的植物寄生线虫的区域。

在杀虫控制中的应用

在害虫控制或者工程处理其他生物体作为杀虫试剂时应用包含本发明的核苷酸序列或者其变体的菌株的常规方法在本领域是已知的。参见，例如U.S.Patent No.5,039,523和EP 0480762A2。

包含本发明的核苷酸序列或者其变体的细菌或者真菌菌株，或者经遗传改变而包含杀线虫基因和蛋白质的微生物可用于保护农作物和农产品免受害虫侵害。在本发明的一个方面，在细胞被应用于目标害虫环境中时，用延长在细胞中生产的毒素的活性的试剂处理整个的即没有裂解的产生毒素的生物体的细胞。。

或者，将杀线虫基因导入到细胞宿主中来生产杀虫剂。杀线虫基因的表达直接或者间接地导致杀线虫毒素在细胞内生产并保持。本发明的一方面，在细胞被应用于目标害虫环境中时，在延长在细胞中生产的毒素的活性的条件下处理这些细胞。得到的产物保持毒素的毒力。可以根据常规技术配制这些自然微囊农药，应用到，环境，例如土壤、水、根、种子和/或植物的叶宿生的目标害虫。参见，例如EPA 0192319，这里引作参考。在各种实施方案中，多酚氧化酶可以在细菌细胞中表达，并且用作处理植物的种子的微生态调节剂。或者，可以将表达本发明基因的细胞制成制剂，使得将得到的材料作为杀虫剂加以应用。

本发明的活性成分通常以组合物的形式施用，并且能与其他化合物同时或依次应用到作物的种植区或待处理的植物。这些化合物可是化肥、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、农药肥皂、休眠油、聚合物和/或随时间释放或生物降解载体制剂，在一次施用制剂之后使得目标区域长期发生药效。该化合物可以是协同因子或提高多酚氧化酶活性的其他分子。例如，该化合物可以是茉莉酸甲酯，其已被证明能增加多酚氧化酶基因的表达(参见，例如，Constable和Ryan(1998)Plant Mol Biol.36(1)：55-62)，如L-DOPA或酪氨酸的酚，或能够参与多酚氧化酶介导的交联的底物(如酪氨酸的)。可以在施用杀虫剂组合物之前、期间或之后(或任何组合)对植物提供这些化合物。在化合物是能在植物中表达的多肽的情况下，易感植物可以是这种多肽的转基因的。

这些化合物也可以是选择性除草剂，化学杀虫剂，杀病毒剂，杀微生物剂，杀变形虫剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀细菌剂，杀线虫剂，灭螺剂或这些制剂中的几种的混合物，如果需要，与制剂领域常规使用的其它农业可接受的载体、表面活性剂或应用促进佐剂一起使用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并符合制剂技术通常使用的物质，如自然或再生矿物物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样，配方可制备成可食用的“诱饵”或成害虫“陷阱”，使杀线虫制剂的目标害虫进食或摄食。

施用本发明的活性成分或包含至少一种本发明的杀线虫蛋白质之一的农用化学组合物的方法包括叶施用，种子包衣和土壤施用。施用次数和施用比例取决于相应虫害侵扰强度。

组合物可以配制成粉末、粉剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳液、胶体、溶液或类似制剂，并可以通过常规手段制备，如干燥、冷冻干燥、同质化，提取，过滤，离心，沉淀，或浓缩包含所述多肽的细胞培养物等。在包含至少一种这样的杀线虫多肽的所有这样的组合物中，多肽可以约1％至约99％(重量)的浓度存在。

通过本发明的方法在给定地区可以杀死线虫或减少线虫的数量，或可预防性应用到环境区域，以防止易感害虫(即线虫)感染。优选的是害虫摄入或者是接触杀线虫有效量的多肽。所谓“杀线虫有效量”，意指能对至少一个害虫带来死亡、或显著减少害虫生长、摄食、或正常生理发育的杀虫剂的量。这个量会根据这样的因素有所不同，例如，具体要控制的线虫品种、特定的环境、位置、植物、农作物、或待处理的农业区域、环境条件、以及应用有效杀线虫多肽组合物的方法、比率、浓度、稳定性、和数量。该制剂还可以随着气候条件、环境因素和/或应用频率和/或虫害侵袭严重性而不同。

通过将表达本发明杀线虫基因的微生物细胞(或其提取物)或分离的蛋白质成分与期望的农业可接受的载体配制成描述的杀线虫组合物。可以在应用之前以合适的方式配制组合物，如冻干、冷冻干燥、脱水或在含水的载体、基质或合适的稀释剂中，如生理盐水或其他缓冲液。制备成的组合物可以是粉剂或颗粒物质、或在油(植物或矿物油)中的悬浮液、或水或油/水乳状液、或作为可湿性粉剂形式，或与适合农业应用的任何其他载体材料组合使用。合适的农业载体可以是固体或液体并且是本领域已知的。术语“农业可接受载体”涵盖了所有佐剂、惰性成分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等，是通常在农药制剂技术中采用，这些对于杀虫剂制剂领域技术人员是公知的。制剂可通过各种手段与一种或几种固体或液体佐剂混合，如通过均匀混合，用传统的制剂技术将杀线虫组合物与合适佐剂混合和/或研磨。合适的配制和应用方法在美国专利号U.S.Patent No.6468523中进行了描述，此处引作参考。

在各种实施方案中，多酚氧化酶能被用于处理或预防昆虫、真菌、细菌、螨、蜱之类给植物造成的侵扰。害虫包括选自鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目(Hymenoptera)，鳞翅目(Lepidoptera)，食毛目(Mallophaga)，同翅目(Homoptera)，半翅目(Hemiptera)，直翅目(Orthroptera)，缨翅目(Thysanoptera)，革翅目(Dermaptera)，等翅目(Isoptera)，虱目(Anoplura)，蚤目(Siphonaptera)，毛翅目(Trichoptera)等，尤其是鞘翅目，鳞翅目，双翅目。

鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)，而多食亚目包括水龟虫总科(Hydrophiloidea)、隐翅虫总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公虫总科(Cleroidea)、叩头虫总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芜菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步行甲总科(Tenebrionoidea)、长蠢总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象虫总科(Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟虫总科包括水龟虫科(Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(Silphidae)隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芜菁总科包括芫菁科(Meloidae)。拟步行甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象虫总科包括象虫科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。

双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Aschiza Division)和有缝组(Schizophora Division)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidae)。

针对主要农作物的本发明虫害包括：玉米：玉米螟(Ostrinianubilalis)、欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotisipsilon)、黑地老虎(black cutworm)；谷实夜娥(Helicoverpa zea)、棉铃虫(corn earworm)；草地夜娥(Spodoptera frugiperda)、秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)、西南玉米螟(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟(lesser cornstalk borer)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)，小蔗螟(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、西方玉米根虫(western cornrootworm)；长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornis barberi)、北方玉米根虫(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根虫(southerncorn rootworm)；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)、金针虫(wireworms)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)、北方假面金龟子(northern masked chafer)(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方假面金龟子(southern maskedchafer)(蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)，日本金龟子(Japanese beetle)；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)、玉米铜色跳甲；玉米长啄象(Sphenophorus maidis)，玉米长啄象；玉米蚜(Rhopa1osiphum maidis)，玉米蚜；玉米根蚜(Anuraphismaidiradicis)，玉米根蚜(corn root aphid)；美洲谷秆长蝽(Blissusleucopterus leucopterus)，美洲谷秆长蝽(chinch bug)；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；灰种蝇(Hylemyaplatura)、玉米种蝇(seedcorn maggot)；玉米斑潜蝇(Agromyzaparvicornis)、玉米斑潜蝇；黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)、草蓟马(grass thrips)；窃蚁(Solenopsis milesta)、窃蚁(thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、二斑叶螨；高粱：斑禾草螟(Chilopartellus)，高粱螟；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜娥，棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；粒肽脏切夜娥(Feltia subterranea)，颗粒地老虎(granulate cutworm)；长毛食叶然金龟(Phyllophagacrinita)、蛴螬；伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、单叶叩甲属物种(Conoderus spp.)、以及Aeolus spp.，线虫；黑角负泥虫(Oulemamelanopus)，谷类叶甲(cereal leaf beetle)；玉米铜色跳甲，玉米铜色跳甲；玉米长啄象，玉米谷象；玉米蚜，玉米蚜；美甘蔗伪毛蚜(Sipha flava)，黄甘蔗蚜(yellow sugarcane aphid)；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，粱痪蚊(sorghummidge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)；二斑叶蹒(Tetranychus urticae)，二斑叶蹒；小麦：一点黏虫(Pseudaletia unipunctata)，黏虫(armyworm)；草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方地老虎；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；黑角负泥虫，谷类叶甲；三叶草叶象(Hypera punctata)，三叶草叶象；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根虫；俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；特异黑蝗(Melanoplus differentialis)，特异黑蝗；血黑蝗，迁徙蝗虫；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessianfly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，麦蛆(wheat midge)；美洲杆蝇(Meromyza americana)，美洲麦秆黄潜蝇(wheat stemmaggot)；麦瘿种蝇(Hylemya coarctata)，麦种蝇(wheat bulb fly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草褐蓟马(tobacco thrips)；麦茎蜂(Cephus cinctus)，麦茎蜂；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae)，小麦曲叶螨(wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽卷叶娥(Suleimahelianthana)，向日葵芽娥；向日葵同斑螟(Homoeosomaelectellum)，向日葵娥；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜利犀金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽瘿蚊；棉花：烟芽夜娥(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；谷实夜娥，棉铃虫；甜菜夜娥(Spodoptera exigua)，甜菜夜娥；红铃麦娥(Pectinophoragossypiella)，粉色螟蛉(pink bollworm)；墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)，棉子象鼻虫；棉蚜(Aphis gossypii)，棉蚜；棉序盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉花跳盲蝽；茼麻粉虱(Trialeurodesabutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，tarnished plant bug；赤胫黑蝗，红胫蝗虫；特异黑蝗，特异黑蝗；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；烟褐花蓟马，烟草褐蓟马；朱砂叶螨，朱砂叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；稻：小蔗螟，小蔗螟；草地夜娥，秋夜娥；谷实夜娥，棉铃虫；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄鞘叶甲；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus)，稻水象甲；米象(Sitophilus oryzae)，米象；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，米叶蝉；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；大豆：大豆夜娥(Pseudoplusia includens)，大豆尺夜娥(soybean looper)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，梨豆夜蛾(velvetbean caterpillar)；夜蛾科；苜蓿绿夜娥(Plathypena scabra)，苜蓿绿夜娥；玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；甜菜夜娥，甜菜夜娥；烟芽夜娥(Heliothis virescens)，烟芽夜娥；谷实夜娥，棉铃虫；墨西哥大豆瓢虫(Epilachna varivestis)，墨西哥大豆瓢虫；桃蚜(Myzuspersicae)，桃蚜；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉；拟缘蝽，绿蝽；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；特异黑蝗，特异黑蝗；灰种蝇(Hylemya platura)，玉米种蝇；大豆蓟马(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；烟蓟马，洋葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychusturkestani)，草莓叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；大麦：玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；麦二叉蚜，麦二叉蚜(greenbug)；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；拟缘蝽，绿蝽；烟草蝽(Euschistusservus)，褐臭蝽；灰地种蝇(Delia platura)，玉米种蝇(seedcornmaggot)；小麦瘿蚊，小麦瘿蚊；麦岩螨(Petrobia latens)，麦长腿蜘蛛；油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，卷心菜蚜；黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲(Flea beetle)；蓓带夜娥(Mamestraconfigurata)，贝莎夜蛾(Bertha armyworm)；菜蛾(Plutellaxylostella)，小菜蛾(Diamond-back moth)；地种蝇属物种(Deliassp.)，根蛆(Root maggot)。

增加植物产量的方法

本发明提供了增加植物产量方法。这些方法包括对植物或植物细胞导入包括此处披露的杀线虫序列的多核苷酸。杀线虫序列的表达产生对线虫感染的提高的抗性，随之相比不表达多酚氧化酶的植物的产量增加了转基因植物的产量(当暴露在植物寄生线虫下)。如此处定义的，植物的“产量”指的是植物生产的生物质的质和/或量。所谓“生物质”是任何测得的植物产品。生物质生产的增加是测得的植物产品产量的任何提高。提高植物产量有一些商业应用。例如，增加植物的叶生物质可增加人类或动物食用的叶菜类蔬菜的产量。此外，增加叶生物质可以用来增加来自植物的药用产品或工业产品的生产。产量增加包括任何统计学意义的增加，包括但不限于，相比不表达杀线虫序列的植物，至少增加1％，至少增加3％，至少增加5％，至少增加10％，至少增加20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％或更大的产量增加。

确定与线虫抗性相关的数量性状基因座的方法

本发明还提供识别或确认与线虫的抗性或耐受性数量性状基因座(QTL)相关的标记的方法。所述方法包括对显示线虫感染有抗性或者耐受性的植物群的一个或几个多酚氧化酶基因周围的遗传区域内的遗传标记物进行评估，并检测一个或多个遗传标记物和线虫抗性性状之间的关联性。对于许多种易感染线虫的植物品种已经开发出高密度遗传图谱，其中包括玉米和大豆植物。这些图谱的标记物可以评价这种关联性，并且能在诸如标记辅助育种的下游应用中使用正相关标记物。评估标记物：性状关联性的方法是本领域已知的，可以应用到编码和多酚氧化酶基因具有同源性的基因的基因组区域。

在另一个实施方案中，可以对已知或怀疑与线虫抗性相关的QTL评估，以确定多酚氧化酶基因是否在QTL内或附近。在这个实施方案中，QTL内部或周围的区域可以被测序和搜索多酚氧化酶同系物。

提供下面的例子详细说明，而不是限制的方式。

实验

实施例1.杀线虫活性的测定

以前已经证明生物胺用于诱导寄生线虫饲养和/或运动用于RNAi摄取实验(例如，参见P.E.Urwin，Catherine J.Lilley，和Howard J.Atkinson，“Ingestion of Double-Stranded RNA byPreparasitic Juvenile Cyst Nematodes Leads to RNA Interference”Molecular Plant Microbe Interaction Vol.15，No.8，2002，pp.747-752。还可参见MJ Kimber，S McKinney，S.McMaster TA Day，CC Flemming和AG Maule(2007)“Flp gene disruption in aparasitic nematode reveals motor dysfunction and unusual neuronalsensitivity to RNA interference”The FASEB Journal vol 21pp1233-1242)。

此处提供的SCN活性分析是基于SCN生物测定的应用，其通常在96孔半面积板中每孔包含～200J2线虫(实验中2天内孵化的)。该线虫培养在20mMTris缓冲液(pH值8.0)中，所述缓冲液含有50mM的章鱼胺，以及下面的抗生素和抗真菌成分：庆大霉素(1.5微克/μL)，制霉菌素(0.05微克/μL)，1X Sigma抗生素-抗真菌素(CAT#A5955)，注入杀真菌剂(从储备物稀释到1/1500)，都到30μl的终体积，包括测试菌株或蛋白质。该实验板在28℃的湿室孵育。通过添加碳酸钠促进了试验的计分，其导致活着的线虫卷曲，而死的线虫保持平直且僵直。必须在加入碳酸盐～10分钟内完成计分。对线虫活性用下述格式评分，并与阴性对照、阳性对照样品对比。

实施例2.微生物菌株中线虫蛋白质毒素稳态水平的提高

在部分限制对微生物养分供应的培养基条件下培养目的微生物菌株(如细菌或真菌株)。例如，在基本生长培养基中可减少碳或氮的供应。

培养基补充有对刺激微生物生产线虫毒素有用的成分。举一个例子，加入明胶到培养基中能模仿一些线虫中发现的胶状外皮，从而激发了线虫蛋白质毒素的微生物生产。作为另一个例子，把线虫加入到生长培养基中(如线虫或大豆胞囊线虫等)能刺激蛋白毒素的微生物生产。作为另一个例子，一种线虫提取物能被制备并添加到微生物培养基内，以刺激微生物蛋白质毒素的生产。各成分也可以组合使用。

在生长培养基(供应有刺激毒素产生的组分)接种微生物一种菌株或几种菌株，然后在适合菌株生长的条件下生长。然后对整个培养物或培养物的一些部分(例如：培养上清，蛋白提取物，可溶性蛋白提取物，沉淀提取物等)进行测试，以测定在测试的生长培养基和生长条件下微生物菌株是否生产线虫毒素。

实施例3.从少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)鉴定线虫蛋 白质毒素

本领域已知可以从土壤中，特别是从抑制性的土壤中分离出来杀线虫真菌。获得几种这样的真菌并且测试了在各种生长条件下SCN活性。

少孢节丛孢是一种食线虫真菌，并在之前已被观察到在土壤中具有杀线虫活性。在文献中已经将这种活性和食线虫的捕捉相关联(例如，参见Nansen等，1988.Vet Parasitol.，26：329-37)。还没有少孢节丛孢或者相关菌株生产杀线虫蛋白质毒素的描述。

要测试少孢节丛孢菌株产生蛋白质毒素的能力，将少孢节丛孢菌株(ATX21995)接种于节丛孢属培养基中，所述培养基补充有如下所示成分，并在温和振摇下，30℃下培养7天。对由此产生的提取物测定杀死SCN能力。

节丛孢属培养基(每升)：

-1g葡萄糖

-0.5g(NH₄)₂SO4

-0.5gMgSO₄

-2gKH₂PO₄

-0.005g FeSO₄

-用KOH调节pH至6.0

可选：

-0.5g明胶

-每50毫升培养基加入从1MYOB板(100毫米平板，先接种大肠杆菌以产生菌苔作为秀丽线虫(C.elegans)的食物)收获的线虫。

表2.生长在各种培养基中的ATX 21995的活性

生长7天后从每一种培养基制备可溶性蛋白提取物。在那时，用一次性0.4微米的过滤装置将真菌生物质从生长培养基分离出来，接着在液态氮的存下将这个生物质在研钵中用杵研磨以裂解细胞。接着将这种材料悬浮于缓冲液A(50mM Tris(pH 8.0)，1mM DTT)中，并提交做大豆胞囊线虫(SCN)的生物测定。

少孢节丛孢(ATX21995)培养物在节丛孢属培养基(+明胶+秀丽线虫)中生长七天后制备蛋白提取物。通过在液氮存在下研磨真菌生物质(如上所述)，以及将裂解的细胞材料重悬浮于pH 6.0的缓冲液(50mM MES，1mM DTT)，pH 8.0(50mM Tris，1mMDTT)或pH 10.4(50mM CAPS，1mM DTT)的缓冲液中来制备。对用这种方式制备的提取物检测SCN的活力，都显出对SCN的强活力。

实施例4.从ATX21995中纯化AXN-1

使用从在含有明胶和线虫的节丛孢属培养基中生长的ATX21995制备的提取物进行纯化。通常情况下，大规模进行纯化，通过用每瓶含有50毫升培养基的250毫升容量瓶(约30-60瓶)进行培养，以保证充足量的蛋白质进行纯化。

从菌株ATX21995的培养物进行两种不同蛋白质的纯化。裂解从这些培养物得到的总的真菌生物质(有液氮存在的研钵和杵)，并且用标准纯化方法通过FPLC纯化将蛋白质分级分离。这些纯化导致～50kDa的蛋白质的鉴定，其和SCN活性的洗脱物相关。

实施例5.得自ATX21995的50kDa蛋白质的鉴定

为了克隆编码～50kDa蛋白质的基因，分离出约10-15微克这种蛋白质，并且将小量样品通过标准方法电转染到PVDF膜，用考马斯染料染色膜，切除50kDa蛋白质对应的条带，并按照已知的现有技术做N-末端测序。发现这种蛋白质在测序反应期间得到非常少量的游离氨基酸，这表明，蛋白质的N端可能是化学修饰的。

用胰蛋白酶在凝胶中消化含有50kDa蛋白质的凝胶片，然后用HPLC分离所述片段。对不同的峰接着用MALDI分析以确定适合蛋白质测序的片段。选择总共5个胰蛋白酶消化片段，进行用于蛋白质测序的Edman降解(见表3)。Edman降解测序反应得到如下序列，对应这些峰的每一个：

表3.胰蛋白酶消化片段的N-末端序列

峰值名	Edman降解鉴定的一级序列	SEQ ID NO：
			20	G-T-W-S-I-A-A-G-S-R	23
24	D-S-T-G-E-F-N-A-T-L-Y-R	24
			29	S-A-P-Y-A-I-T-G-I	25
36	Y-P-D-A-W-F-N-A-Q-S-A-Q-L-R	26
			42	F-G-S-S-Y-P-E-L-Q-P	27

实施例6.编码来自ATX21995的50kDa蛋白质的cDNA的克 隆

从培养了2天、4天和6天的ATX21995培养物中分离总RNA。这种RNA反转录产生cDNA，随后标准化此cDNA以减少强烈表达的转录本的丰度。使用该cDNA作为起始模板，生成和测序了一些PCR产物。

基于cDNA接头序列使用的简并PCR。联合存在于cDNA池末端的寡核苷酸，设计和检测基于24氨基酸序列(见表3)的一些简并寡核苷酸。确定产生1840个核苷酸PCR产物扩增的一组条件。该PCR产物，以及其他几个候选的PCR产物，克隆到TOPO载体，并且测定与该载体毗邻的DNA序列。

完全基于氨基酸序列的简并PCR。以表3的片段20，24，29，36，42的氨基酸序列为基础设计简并PCR引物。这套简并寡核苷酸利用数个位置的肌苷减少产物寡核苷酸的简并性。另外，如果可能，对表3每个氨基酸序列设计一套嵌套简并PCR引物。这个策略允许“外”引物(那些基于表3序列更多的N-端氨基酸)在PCR第一轮和第二套“嵌套”引物(基于略有偏向氨基酸C端，但与“外”引物使用的氨基酸重叠)的使用。

一个使用这些简并寡核苷酸的PCR反应矩阵导致克隆和测序几种扩增产物，其表明与先前分离出来的1840核苷酸克隆有DNA同源性和重叠，并且一起组成了一个完整的cDNA开放阅读框；这表明所有这些部分cDNA来源于一个单独的基因。

axn-1cDNA的克隆，以及基因组序列测定。基于几个部分cDNA序列的DNA序列，PCR引物设计为反复扩增和测定cDNA编码区的序列。一些独立的cDNA被克隆和完全测序。在某些情况下，个别cDNA克隆包含小的未剪切内含子，与这个基因产生的hRNA可选剪切相一致。例如，回收了5′非翻译区(UTR)的两个变体。这些变体在起始位点上游有相同的42nt(包括编码编码蛋白的N端的区域)，但是，然后它们在上游有另一个60-80nt的分歧，这很可能是存在于cDNA之一的5′非编码区中的替代的剪切的或者未剪切的内含子。

cDNA的PCR引物用于扩增和测定八个来自编码cDNA区域的独立的基因组克隆。来自该基因组区域的序列和cDNA序列在全长cDNA精确匹配。因此，多基因组DNA序列和全长cDNA克隆证实了cDNA的结构，及其基因组的组织。

这个编码cDNA的基因在这里被指定为axn-1，编码的全长蛋白质指定为AXN-I。该axn-1cDNA序列如SEQ ID NO：2所示，其开放阅读框如SEQ ID NO：3所示；AXN-1全长蛋白质的序列如SEQ ID NO：4所示。axn-1的全长染色体序列如SEQ ID NO：1所示。截短的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。一个编码全长AXN-1氨基酸序列的人工合成的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。

除了5′UTR变体，有趣的是，注意到通过这些实验分离的许多cDNA具有和此处描述的序列相关的内部改动。例如，许多克隆显示相对于全长序列被内部删除了，其他的显然包含未剪切的内含子。因此，此处指定为axn-1的这种基因很可能经历了可选的mRNA加工，包括可选mRNA剪接。这些可选mRNA可能是稳态axn-1mRNA的微量成分，并且在克隆这些cDNA中利用的cDNA归一化过程可能增加了这些变体的相对于完全剪接的全长转录本的相对比例。

实施例7.AXN-1和单酚氧化酶同源

AXN-1和其他多酚氧化酶序列的对比示于附图3，AXN-1与这些序列的同一性百分比示于表4中。

另一个有趣的发现是，由所述cDNA编码的蛋白质的片段包含许多重复氨基酸，特别是谷氨酸(Q)，并且在数据库的检索中不显示与多酚氧化酶或者酪氨酸酶的同源性。

表4.AXN-1和其他真菌蛋白质的氨基酸同一性

实施例8.来自菌株ATX20514的线虫毒素

根据标准生物实验模板，基于对大豆胞囊线虫(SCN)有强毒性的培养物，根据经验观察筛选出细菌ATX20514菌株。

ATX 20514菌株在C2培养基，96孔板区30℃下生长3天。接着，每个孔的细胞用珠搅拌器裂解，在喂食刺激物(章鱼胺)的存在下，将裂解的细胞提取物喂给大豆胞囊线虫(J2阶段)。培养5天后，对SCN的毒力评分为如表1所示的0到5的水平。

当5μL的这种提取物被包括进SCN生物测定中时，用这种方式从ATX20514制备得到的可溶部分被评分为“5”。

通过在50mL的C2培养基，30℃下培养3天培养菌株，从ATX20514菌株制备蛋白质提取物。那时，培养物中的细胞用珠搅拌器处理裂解，并且粗裂解液在18,000xg下离心15分钟以去除细胞碎片和不可溶的蛋白质。可溶蛋白质提取物作为上清部分被回收，接着被过滤，所述材料接着接受多次处理之后进行SCN生物实验检测。

加热。蛋白质提取物的一部分(100μL)在100℃加热30分钟，接着用SCN生物实验中检测。同时仿制处理阴性对照组样品，同样地在SCN生物实验中检测。

蛋白酶。蛋白质提取物的一部分(95μL)用5μL链霉蛋白酶(1mg/mL终浓度)(Roche)在37℃下蛋白质水解消化3小时。

透析。蛋白质提取物的一部分(100μL)用20mM Tris，pH 8.0，(“Buffer A”)或者50mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.0来进行透析。

过滤。蛋白质提取物的一部分(500μL)被置于有3000分子量截留(Millipore)的旋转滤膜上，并且在12,000xg下离心直到大约400μL的总体积通过了该过滤装置。在旋转滤膜上加入额外的蛋白质提取物，并且重复所述离心步骤直到大约400μL的总体积再次通过了该过滤装置。

SCN生物实验的结果示于表5。这些结果支持了这样的结论，即ATX 20514菌株的SCN活性是由于一种对SCN有活性的蛋白质。

表5.ATX 20514活性的表征

实施例9.来自ATX 20514的线虫蛋白质毒素的纯化

进行一个四柱纯化，结果52kDa蛋白质条带被鉴定为和SCN毒性相关。

ATX20514在2公升C2培养基中30℃下培养3天。所述培养物进行离心，沉淀再悬浮在100mL的50mM Tris(pH 8.0)中。该细胞沉淀物接着用弗氏压碎器裂解，在18,000xg下离心15分钟，并且该上层清液部份(即，可溶解的蛋白质提取物)进行硫酸铵沉淀，透析，以及柱色谱法提纯。

柱色谱法3个步骤后，有活性的部分用50mM Tris(pH 8.0)，1mM DTT；(“Buffer A”)透析，装到Mono Q阴离子交换柱上(1mL；GE Healthcare)，并用相同的缓冲液清洗。用40柱体积从0M到0.2M NaCl梯度的Buffer A洗脱。对各个级分进行SCN生物测定，发现21到24级分具有最强的SCN毒性。这些级分中大约52kDa的蛋白质与SCN毒性很相关。

实施例10.来自ATX 20514的52kDa蛋白质的N端序列

各个富集52kDa蛋白质的纯化级分通过凝胶电泳进行分离，转移到PVDF，用考马斯蓝染色。包含52kDa蛋白质的膜的部分被剪下，并提交做N端测序。利用对应于在色谱图上每个位置最大峰值的氨基酸来编辑获得的N端序列。

实施例11.来自ATX 20514的31kDa蛋白质的纯化和N端测 序

除了和52kDa蛋白质相关联的活性外，第二个有SCN活性的活性峰被从阳离子树脂交换柱上洗脱下来。这些活性级分被接着装载到阴离子交换柱以进一步纯化该活性。这样，31kDa蛋白质被鉴定为和SCN活性相关。

为了进一步表征31kDa蛋白质，进行了N端测序。该分析让我们比较31kDa蛋白质和52kDa蛋白质的N端序列。我们发现所述两种氨基酸序列非常类似，提示31kDa蛋白质是52kDa蛋白质的截短形式。

表6.ATX 20514毒素的N端序列

实施例12.从ATX20514中克隆axn-8

使用52kDa和31kDa毒素的N-端序列数据，编码这些蛋白质的基因用现有技术已知的简并PCR和Tail策略技术的几个步骤克隆出来，从而从多轮Tail PCR中扩增出来一个大约5kb片段。这个区域包含编码氨基酸蛋白质的开放阅读框。此处我们指定该基因为axn-8，其对应的蛋白质为AXN-8。预期的AXN-8蛋白质的N-端和52kDa及31kDa蛋白质的氨基酸序列匹配得很好。进一步地，axn-8的DNA下游序列包含第二开放阅读框，其可能是在一个操纵子下和axn-8共表达。包含调控元件的DNA序列如SEQ ID NO：11所示。axn-8的开放阅读框如SEQ ID NO：12所示，并且编码SEQ ID NO：13。预测的截短蛋白质如SEQ ID NO：14所示。由下游ORF编码的结合金属的膜内在蛋白如SEQ ID NO：41所示。认识到，截断位点可以是SEQ ID NO：13的位置295上精氨酸的任何方向至少约1，至少约2，至少3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸。编码SEQ IDNO：13的人工合成DNA序列如SEQ ID NO：15所示。

实施例13.AXN-8和单酚氧化酶的同源性

AXN-8的BLAST分析显示其和已知的细菌单酚氧化酶共享同源性。该类酶也包括酪氨酸酶。

表7.AXN-8最接近的同系物

AXN-8和酪氨酸酶的比对(附图4)显示其具有和这些酪氨酸酶一致的序列基序，包括可能对酶结合铜离子是必需的组氨酸残基的存在。

实施例14.AXN-8活性的剂量反应

一个AXN-8蛋白质样品被用来评估不同蛋白质量对SCN的影响。这个样品用线虫分析缓冲液稀释，并设立了检测，以确定最终的AXN-8蛋白质的浓度高达25μg/ml。孵育线虫，五天后给结果评分。评分都是两到四个重复实验的平均值。

表8.AXN-8的剂量反应

试验中的[AXN-8](μg/ml)	SCN分数
		25	4.7
12.5	4
		6.25	2.7
3.125	1.7
		1.6	0.75
0.8	1
		0.4	1
0	1

实施例15.从苏云金芽孢杆菌菌株ATX25028中克隆AXN-2

AXN-1和AXN-8单独纯化，从几个芽孢杆菌菌株观察到SCN活性。这一发现，即这两个AXN-1和AXN-8编码蛋白质和氧化酶/酪氨酸酶具有同源性提示，也许这些芽孢杆菌菌株的这种活性亦是由于氧化酶/酪氨酸酶样活性。

ATX25028 DNA如前所述制备，并且获得了质粒制备的DNA序列。

从ATX25028DNA获得的部分DNA序列的分析证明在该菌株中存在编码氧化酶/酪氨酸酶样酶基因。使用该DNA序列来设计PCR引物，并且通过PCR从基因组DNA或ATX25028扩增全长基因的开放阅读框。这个基因被称为axn-2(SEQ ID NO：7)，其编码的蛋白质为AXN-2(SEQ ID NO：8)。克隆pAX5530包含axn-2，其插入到修改的pRSF-1b载体(Novagen)中，作为BamHI-AscI片段以生成含his标签的蛋白质(SEQ ID NO：9)。pAX5531包含axn-2，其插入到修改的pRSF-1b载体中作为PstI-Asc I片段，这样表达的蛋白质缺少His标签。制备源自表达AXN-2蛋白质的大肠杆菌细胞的细胞裂解液并检测对SCN的活性。包含和缺乏N-端His标签的克隆都对SCN显示出强活性。

编码AXN-2的人工合成基因如SEQ ID NO：10所示。

表9.AXN-2克隆对SCN的活性

实施例16.从杀线虫活性菌株ATX26455中克隆多酚氧化酶

ATX26455被确定为在大豆胞囊线虫(SCN)检测中表现强活性的菌株。ATX26455菌株在96孔板区的C2培养基中30℃下生长3天。接着，细胞被裂解，将裂解的细胞提取物喂给大豆胞囊线虫(J2阶段)，如此处描述。培养5天后，对SCN的毒力如此处所描述的进行评分。使用5μL从ATX26455制备的裂解提取物进行该项测定，评分为“5”，指示这种提取物对SCN有96-100％的致死率。

初步生化筛选ATX26455

通过使菌株在C2培养基，30℃下生长3天而从菌株ATX26455制备蛋白质提取物。对从该培养物制备得到的可溶性蛋白提取物进行以下生化表征，接着检测对SCN的活性：

●热处理。对蛋白质提取物试样量进行热处理以破坏蛋白质的活性，然后进行SCN生物测试。阴性对照样品同时模拟样品的热处理，并且同样进行SCN生物测试。

●蛋白酶处理。蛋白质提取物试样量用蛋白酶(诸如链霉蛋白酶)蛋白水解消化，然后用于SCN生物测试。没有蛋白酶的阴性对照物也在SCN生物测试中检测。

●透析处理。对蛋白质提取物试样量透析以从提取物中除去小分子，并接着进行SCN生物测试。

●过滤处理。将蛋白质提取物试样量置于有3000分子截留量的旋转滤膜上，并接着离心使提取物通过该过滤装置。滞留物和滤液接着在SCN生物测试中进行分析。

对每份初始生化样品进行的SCN生物实验的结果示于表10。这些结果表明ATX 26455产生的线虫毒素是由于蛋白质赋予的。

表10.ATX 26455级分的活性测试

来自ATX 26455的线虫蛋白质毒素的纯化

细胞用弗氏压碎器裂解，裂解物被离心，收集上清液，得到澄清的溶胞产物。该澄清的溶胞产物在SCN生物测定中是高活性的。该澄清的溶胞产物活性被证明对蛋白酶消化敏感。该澄清的溶胞产物进一步通过以下硫酸铵沉淀步骤富集。

首先，该澄清的溶胞产物用硫酸铵处理至13％饱和，离心，并且丢弃沉淀颗粒。用硫酸铵在25％饱和度重复该程序。最终，该上清液用硫酸铵处理到50％饱和，离心后，回收沉淀颗粒并且再悬浮在缓冲液中，并且经透析以除去残余的硫酸铵。再悬浮的颗粒然后用阴离子交换柱分级分馏，并且在SCN生物测定中显示活性的级分被集中和合并。合并的活性级分进一步用疏水性相互作用柱分馏。这导致了一个蛋白质条带的鉴定，其移动在相当于大约35kDa.蛋白质的位置。这种蛋白质(在这里称为“35kDa”蛋白质)和SCN毒性很相关，在每个纯化步骤都能观察到，而且在纯化过程中是高度富集的。

来自ATX 26455的35kDa蛋白质的表征

来自ATX 26455的目的蛋白质的N-端氨基酸序列用本领域已知的Edman降解来测定。包含目蛋白质的蛋白质成分通过凝胶电泳分离，得到的凝胶中的蛋白质被转移到PVDF膜。该膜接着用考马斯蓝染色，包含35kDa蛋白质的膜的部分被剪下，并提交做N-端测序。该蛋白质的N-端序列通过以下方法测定：

ATX 26455活性部分的蛋白质的N-端序列

M-N-T-I-R-Q-D-V-A-T-L-G-S-G-W-D-N-K-V-L-L-N-Y-A-L-A-M-R-E-L-D-K-L-P-I-T-N(SEQ ID NO：42)。

有趣的是，这种蛋白质序列揭示和此处描述的AXN-8蛋白质的序列类似，表明ATX 26455的活性实际上，同样是因为同源的、但是是新的多酚氧化酶的活性。

从ATX 26455克隆线虫活性毒素基因

使用推定的毒素的N-端蛋白质序列来获得相应于该序列的简并寡核苷酸引物。该引物的序列显示在这里(利用国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry)建立的命名法)：

5’CAR GAY GTI GCI ACI YTI GGI CCI GGI TGG 3’(SEQ ID NO：43)

为了生成简并寡核苷酸以扩增毒素基因的反向链，axn-8基因的DNA序列被用作模板，从而产生了一系列简并寡核苷酸引物用于测试ATX26455。一个由这种方法设计的PCR引物如下所示：

5’RTG RTG IAG CCA RAA IAT IGG RTC 3’(SEQ ID NO：44)

使用简并引物(SEQ ID NO：43和44)的PCR反应产生了711个核苷酸的PCR产物的扩增和测序。这711 nt PCR片段被证实来自编码35kDa蛋白质的DNA区域。

使用711个核苷酸的PCR产物的DNA序列通过本领域公知的热交错(thermal interlaced，TAIL)PCR方法来分离编码35kDa蛋白质的整个区域。这种方法使编码35kDa蛋白质的完整的开放阅读框的序列装配起来。axn-9开放阅读框，通过PCR从ATX26455扩增，克隆到经修改的prsflb克隆载体。对得到的克隆(pAX5597)的插入物进行测序，发现和通过TAIL产生的序列相同。

DNA片段的序列如SEQ ID NO：45所提供。该DNA区域内所载的开放阅读框被指定为axn-9(SEQ ID NO：46)，它相应的蛋白质指定为AXN-9(SEQ ID NO：47)。预测的截短蛋白质对应于SEQ ID NO：47的314残基。认识到，截断位点可以是SEQ ID NO：47的314位置的赖氨酸的任一方向至少约1，至少约2，至少约3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸。

axn-9的开放阅读框的DNA序列的检验表明，有一个GTG密码子在axn-9的22-24位核苷酸。由于这个密码子接近ATG起始位点，以及一些细菌的开放阅读框倾向于容忍多个翻译起始站点，有可能从这个GTG密码子开始的翻译自然发生，产生的蛋白质有类似全长AXN-9蛋白质的属性。因此，这种蛋白质也在此处提供为SEQID NO：48并指定为AXN-9(GTG)。

实施例17.AXN-9和AXN-8以及其他多酚氧化酶蛋白质的同源 性

ANX-9和此处披露的AXN-8蛋白质是同源的。AXN-9和AXN-8具有68％的同一性。图5提供了AXN-9和AXN-8的比对。鉴于AXN-8已知是被截短的，并且也鉴于大多数多酚氧化酶是被蛋白质水解处理的，同时鉴于AXN-8和AXN-9之间的同源性，我们能预测AXN-9可能同样是被蛋白质水解截短的。

实施例18.蛋白酶活化的AXN-9蛋白在SCN的生物测试中是有 活性的

上文所述的AXN-9细菌表达载体(pAX5597)转化到BL21*DE3细胞(Invitrogen)。IPTG诱导后，离心整个细胞培养物。由此产生的沉淀颗粒悬浮在十分之一体积的缓冲液中(50mM Tris(pH8.0)，10μM CuSO₄)，然后通过超声裂解。裂解液分成2等份，1等份用新鲜配制的胰蛋白酶(0.1mg/mL的裂解液)在37℃处理2小时。用胰蛋白酶处理的AXN-9蛋白质表现出对SCN强烈的活性，而未经处理的AXN-9蛋白没有表现出对SCN的活性(表11)。

表11.AXN-9克隆对SCN的活性

克隆	样品描述	SCN分数
			阴性对照	缓冲液(50mM Tris(pH8.0)，10μM CuSO4)	0
阴性对照	缓冲液+胰蛋白酶	0
			阳性对照	缓冲液+蘑菇(Mushroom)酪氨酸酶	4
pAX5597	AXN-9蛋白质，没有处理的	0
			pAX5597	AXN-9蛋白质，胰蛋白酶处理的	5

实施例19.蘑菇酪氨酸酶对SCN的活性

由于发现AXN-1，AXN-8，AXN-9和AXN-2对SCN的活性以及AXN-1，AXN-8，AXN-9和AXN-2对多酚氧化酶/酪氨酸酶的同源性，对先前确定的酪氨酸酶测试了该性质。

蘑菇酪氨酸酶(Sigma T3824)在缓冲液中再悬浮以产生浓溶液。该溶液的稀释物如上所述在SCN上进行测试，获得了以下的试验结果。虽然不是直接由该酶的提供者陈述的，包含于“蘑菇酪氨酸酶”的该酶可能来源于白色蘑菇。

表12.蘑菇酪氨酸酶活性的滴定

试验中的[蛋白质](μg/ml)	蘑菇酪氨酸酶
		50	4
25	3.3
		12.5	3
6.25	2.7
		3.125	2.7

1.6	2
		0.8	1
0	1

获得的蘑菇酪氨酸酶制剂被证明，在相对于AXN-1和AXN-8的检测量的大致相同的相对酶浓度下，该酶对SCN有活性。

实施例20.其他多酚氧化酶具有SCN活性的可能性

由于从具有多酚氧化酶同源性的真菌和细菌蛋白质发现了抗SCN的活性，并发现蘑菇酪氨酸酶的活性，理解许多已知的多酚氧化酶/酪氨酸酶当进行如此处所述的测试时可能拥有这样的活性：例如，在SCN测试中，包含在诸如96孔板的板中的J2幼虫线虫，20mMTris，以及50mM章鱼胺，在20℃下在旋转的培养器中晃动培养3-7天。

例如，Selinheimo等人描述了真菌和植物酪氨酸酶的特征，并证明这些大类的酶之间的酶作用底物和活性不同，所述酶包括蘑菇酪氨酸酶(Fluka)，其可能和上面实施例19描述的是同一种酶。Selinheimo等人的表2表明，这样的酶对单-和多酚类化合物有不同的底物特异性。一般来说，可以理解植物酶，如Selinheimo等人研究的苹果和马铃薯酶，相对于真菌或细菌酶，对单酚底物如酪氨酸有较小的活性。此外，附图3和Selinheimo等的文字描述了，某些酶具有交联代表性的蛋白质(酪蛋白)的能力。在引用的研究中，每种酶都能交联酪蛋白，但酶在交联所需的酶量上不同。此外，除了一种酶，所有这些酶在反应中对单酚或联苯酚似乎有强烈的偏好和/或需求，以实现交联。这一要求的显著例外是从里氏木霉(T.reesei)得到的酶。

里氏木霉的酶(如此处SEQ ID NO：21和22所示)表现出区别于其他被测试的酶的底物和活性参数。值得注意的是，里氏木霉的酶在检测的两种酶浓度的较低浓度下表现出最有效的酪蛋白交联。此外，与测试的其他酶相反，里氏木霉在反应中不存在单酚或联苯酚下有很强的活性；虽然加入这类化合物显示增加了这样的交联的量。其他测试的酶显示需要单酚或联苯酚来达到这样的交联活性。Selinheimo等人在其他参考资料中提供了里氏木霉的酶关于该性质进一步的证据(Selinheimo等(2008)J Agric Food Chem.56(9)：3118-28和Selinheimo等(2007)J Agric Food Chem.55(15)：6357-65)，此处每一篇都通过引用全文被包含在本发明中。

例如，GENBANK登录号为AK246031，来自大豆(Glycinemax)的cDNA(SEQ ID NO：16和17，编码SEQ ID NO：18；Umezawa等(2008)DNA Res.15(6)：333-46)显示了和植物酚氧化酶有特征性同源性。

进一步的例子，GenBank登录号AM418385的cDNA(SEQ IDNO：19)编码和多酚氧化酶具有同源性的里氏木霉的酶(SEQ IDNO：20)，(Selinheimo等(2006)FEBS Lett.273，4322-4335)，作为本发明的多酚氧化酶的例子被提供，其可能显示对SCN的活性。

本发明包括和此处公开的序列同源的其他序列(根据GenBank登录号)。

示例(但不是限制性的)如表13所示。

表13.多酚氧化酶同源物的GENBANK登录号

AB005228.1	AB188749.1	AB277357.1	AF078789.2
				AB010101.1	AB188750.1	AB277358.1	AF136926.2
AB011827.1	AB188751.1	AB277359.1	AF183578.1
				AB011828.1	AB188752.1	AB280948.1	AF183583.1
AB011829.1	AB188753.1	AB280949.1	AF183588.1
				AB011830.1	AB188754.1	AB280950.1	AF183593.1
AB011831.1	AB188755.1	AB353113.1	AF183599.1
				AB018244.1	AB188756.1	AB430855.1	AF183604.1
AB022095.1	AB188757.1	AB430856.1	AF183609.1
				AB023291.1	AB188758.1	AC007607.6	AF183614.1
AB024278.1	AB188759.1	AC007861.5	AF183619.1
				AB024279.1	AB188760.1	AC025271.7	AF183624.1
AB024280.1	AB188761.1	AC084064.6	AF183629.1
				AB024281.1	AB188762.1	AC084197.1	AF183634.1
AB027512.1	AB188763.1	AC084321.37	AF183639.1
				AB032694.1	AB188764.1	AC084628.1	AF183644.1
AB032695.1	AB188765.1	AC090416.1	AF183649.1
				AB032696.1	AB188766.1	AC115007.6	AF183654.1
AB032697.1	AB188767.1	AC116734.14	AF183659.1
				AB033993.1	AB188768.1	AC119816.5	AF183664.1
AB038994.1	AB188769.1	AC122194.4	AF183669.1
				AB044884.1	AB207236.1	AC122517.2	AF183674.1
AB052940.1	AB207237.1	AC138173.2	AF183679.1
				AB056680.1	AB214954.1	AC138230.5	AF183684.1
AB060689.1	AB215107.1	AC157507.2	AF187155.1
				AB070938.1	AB215108.1	AC157710.2	AF216388.1
AB070939.1	AB223612.1	AC163891.2	AF237792.1
				AB081466.1	AB224151.1	AC166548.2	AF237794.1
AB107880.1	AB225958.1	AC182653.2	AF237797.1
				AB107881.1	AB238605.1	AC185364.2	AF237799.1
AB108529.1	AB254132.1	AC208369.1	AF237802.1
				AB108530.1	AB254133.1	AC210555.1	AF237804.1
AB108531.1	AB259663.1	AC214595.1	AF237807.1
				AB120567.1	AB275646.1	AC215650.1	AF237809.1
AB178936.1	AB275647.1	AC216911.1	AF249161.1
				AB178937.1	AB277347.1	AC217034.1	AF249162.1
AB178938.1	AB277348.1	AC232778.1	AF249163.1
				AB178939.1	AB277349.1	AE016825.1	AF249164.1
AB178940.1	AB277350.1	AE017195.1	AF249165.1
				AB188743.1	AB277351.1	AF001295.1	AF249166.1
AB188744.1	AB277352.1	AF020548.1	AF249167.1
				AB188745.1	AB277353.1	AF020786.1	AF249168.1
AB188746.1	AB277354.1	AF039165.1	AF249169.1
				AB188747.1	AB277355.1	AF064803.1	AF249170.1
AB188748.1	AB277356.1	AF076781.1	AF249171.2
				AF249172.1	AJ006097.1	AK191107.1	AK209365.1
AF249173.1	AJ012048.1	AK191149.1	AK209447.1

AF249174.1	AJ223816.1	AK191393.1	AK209840.1
				AF249175.1	AJ245880.1	AK192283.1	AK209886.1
AF249176.1	AJ248285.1	AK192618.1	AK209941.1
				AF249177.1	AJ250302.1	AK192643.1	AK210502.1
AF249178.1	AJ252741.1	AK192803.1	AK210623.1
				AF249179.1	AJ293806.1	AK192857.1	AK212036.1
AF249180.1	AJ297474.1	AK193779.1	AK212309.1
				AF249181.1	AJ297475.1	AK193825.1	AK212393.1
AF249182.1	AJ309175.1	AK195046.1	AK212795.1
				AF249183.1	AJ309176.1	AK195075.1	AK213314.1
AF249184.1	AJ334488.1	AK195088.1	AK213631.1
				AF249185.1	AJ547813.1	AK195144.1	AK213730.1
AF249186.1	AJ556169.1	AK195566.1	AK214235.1
				AF249187.1	AJ564729.1	AK195805.1	AK215621.1
AF249188.1	AJ574915.1	AK196684.1	AK216615.1
				AF249189.1	AJ619741.1	AK197855.1	AK216621.1
AF249190.1	AJ635323.1	AK198477.1	AK216757.1
				AF249191.1	AJ697805.1	AK198785.1	AK217145.1
AF252540.1	AJ698339.1	AK199363.1	AK217194.1
				AF255610.1	AJ698340.1	AK199676.1	AK217421.1
AF261957.1	AJ698341.1	AK201739.1	AK217687.1
				AF261958.1	AJ698342.1	AK201880.1	AK217984.1
AF263611.1	AJ786639.1	AK201909.1	AK218840.1
				AF269192.1	AJ786640.1	AK202339.1	AK219113.1
AF280808.1	AJ845083.2	AK202954.1	AK219854.1
				AF338426.3	AK014619.1	AK202956.1	AK219958.1
AF343911.2	AK027025.1	AK204044.1	AK219983.1
				AF350261.1	AK027863.1	AK204101.1	AK220030.1
AF359360.3	AK033040.1	AK204148.1	AK241303.1
				AF359361.3	AK108237.1	AK205161.1	AK246031.1
AF363027.1	AK115853.1	AK205196.1	AK247107.1
				AF368291.1	AK115906.1	AK205614.1	AK247126.1
AF380300.1	AK116290.1	AK206598.1	AK247410.1
				AF391288.1	AK148172.1	AK206970.1	AK293115.1
AF395447.2	AK148332.1	AK207020.1	AK297887.1
				AF397401.1	AK148341.1	AK207203.1	AL138753.8
AF397402.1	AK148357.1	AK207218.1	AL139318.9
				AF400250.1	AK148370.1	AK207451.1	AL591688.1
AF401231.1	AK148432.1	AK207965.1	AL606526.10
				AF445638.2	AK148441.1	AK208194.1	AL606645.2
AF473807.2	AK177534.1	AK208432.1	AL646052.1
				AF507945.1	AK190354.1	AK208651.1	AL670884.7
AJ000503.1	AK191069.1	AK208819.1	AL731611.2
				AL731637.2	AY149460.1	AY333979.1	AY812904.1
AL939108.1	AY149880.1	AY333982.1	AY815264.1
				AL939113.1	AY149881.1	AY333984.1	AY822711.1
AL954747.1	AY149882.1	AY333985.1	AY837842.1
				AM418385.1	AY162287.1	AY338251.1	AY842859.1

AM420293.1	AY236224.1	AY341747.1	AY844019.1
				AM424232.2	AY254101.1	AY341748.1	AY844020.1
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XM_652743.1
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XR_022754.1
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Z12834.1
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Z12836.1
				Z12837.1
Z12838.1
				Z27411.1

Z66559.1
				Z71261.1
Z81568.1

实施例21.其他的单酚氧化酶

鉴于来自细菌和真菌的和单酚氧化酶/酪氨酸酶具有同源性的酶证明有强SCN活性，现在看来，许多以前确定的这一类的酶将对SCN显示出活性。

实施例22.杀线虫活性试验

对本发明的核苷酸序列能检测它们生产杀线虫蛋白质的能力。通常用很多方式来评估蛋白质作为对线虫害虫的杀虫剂的能力。在本领域公知的一种方法是进行喂养实验。在这样的喂养实验中，将害虫暴露给含有待测试化合物或对照样品的样本。通常，如此这样操作：将要测试的材料，或者该材料的合适稀释物，放置到害虫将摄取的材料上，如人工饲料。被测试的材料可由液体、固体或浆状物组成。被测试的材料可放置在表面上让其干燥。或者，被测试的材料可以和熔化的人工饲料混合，然后送到检测室。该检测室可以是，例如，杯、盘或微孔板。

其他类型的实验可以包括显微注射试验材料到害虫的口中或肠道，以及开发转基因植物，接着测试害虫取食转基因植物的能力。植物测试可以涉及隔离通常被消耗的植物部分，例如，将小笼子系在一片树叶，或者将整株植物隔离在含有昆虫的笼子中。

检测害虫的其他方式和方法在本领域是公知的，并且，例如在Robertson和Preisler，编著(1992)Pesticide bioassays witharthropods，CRC，Boca Raton，FL中可以找到。另外，在ArthropodManagement Tests以及Journal of Economic Entomology都有这些测试的一般性描述，或者通过与美国昆虫学协会(the EntomologicalSociety of America(ESA))的成员进行讨论。

实施例23.人工合成基因序列

设计下面的基因，编码AXN-1，AXN-2，AXN-8，或AXN-9的氨基酸序列，但利用不同的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6描述了一种新型的编码AXN-1的核苷酸序列

SEQ ID NO：10描述了一种新型的编码AXN-2的核苷酸序列

SEQ ID NO：15描述了一种新型的编码AXN-8的核苷酸序列

SEQ ID NO：17描述了一种新型的，编码推测的来自大豆，GENEBANK登录号为AK246031的蛋白质的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21描述了一种新型的核苷酸序列，其编码的蛋白质从编码里氏木霉的酶的GenBank登录号AM418385的cDNA预测而来。

实施例24.植物表达的基因的载体化

本发明的编码区连接适当的启动子和终止序列以在植物中表达。这些序列是本领域众所周知的，可包括稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子以在单子叶植物中表达，拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子以在双子叶植物表达，以及nos或PinII终止子。生产和确认启动子-基因-终止子构建体的技术也是本领域众所周知的。

在本发明的一个方面，人工合成的DNA序列被设计和制备。这些合成的序列相对母本序列有改变的核苷酸序列，但编码和母本氨基酸序列基本上相同的蛋白质。

在本发明的另一个方面，设计合成基因的修改版本，使得得到的肽是靶向针对植物细胞器，如内质网或质外体。已知导致融合蛋白靶向针对植物细胞器的肽序列在本领域是已知的。例如，来自白羽扇豆(White Lupin Lupinus albus)的酸性磷酸酶基因的N-端区域(GENBANKID GI：14276838，Miller等(2001)PlantPhysiology 111：594-606)在本领域已知导致外源蛋白质的内质网定位。如果产生的融合蛋白在C-末端还包含一个内质网保留序列，包含肽的N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即“KDEL”基序，SEQ ID NO：30)，该融合蛋白将靶向针对内质网。如果融合蛋白在C-末端缺乏内质网靶向序列，该蛋白质将靶向内质网，但是最终在质外体汇集。

因此，该基因编码一种融合蛋白，该融合蛋白包含与本发明序列的N-末端融合的来自白色羽扇豆酸性磷酸酶基因的N-末端31个氨基酸(GENBANKID GL14276838，Miller等，2001，上文)，以及在C-末端的KDEL序列。因此，产生的蛋白质预计将在植物细胞表达时靶向于植物细胞内质网。

上文所述的植物表达盒联合适当的植物选择标记，以帮助选择转化的细胞和组织中的，以及被绑定到植物转化载体。这些可包括来自农杆菌介导转化的二元载体或气溶胶或基因枪转化用的简单的质粒载体。

实施例25.植物表达的载体化基因

此处涉及的基因编码区DNA有效地与适当的启动子和终子序列连接以在植物中表达。这些序列是本领域众所周知的，可包括稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子以在单子叶植物中表达，拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子以在双子叶植物中表达，以及nos或PinII终止子。生产和确认启动子-基因-终止子构建体的技术也是本领域众所周知的。

上文所述的植物表达盒联合适当的植物选择标记，以帮助选择转化的细胞和组织，以及被绑定到植物转化载体。这些可包括来自农杆菌介导转化的二元载体或气溶胶或基因枪转化用的简单的质粒载体。

实施例26.AXN-1蛋白质在大豆根组织中的表达

载体构建

制备pAG6004载体来以指导AXN-1蛋白质在大豆毛状根组织中过表达。pAG6004包含全长AXN-1基因，以下述方式连接3’到UBQ 10启动子(拟南芥(Arabidopsis thaliana))和5′到35S终止子(花椰菜花叶病毒)，以可能导致从UBQ 10启动子转录axn-1基因，以及通过35s终止子终止所述转录。载体中还存在可视标记(黄色荧光蛋白(YFP)，在UBQ3启动子的控制下)，在农杆菌属有功能的复制起点，以及庆大霉素抗性基因。所述载体的组织通过整个载体的DNA测序确定，接着转入发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)株K599，通过在庆大霉素上生长来繁殖。

大豆转化

如下制备大豆毛状根组织培养物。在生长室(25℃)中萌发大豆种子(品种Williams 82)1周，此时切除子叶(去掉种皮后)。子叶然后用了外科手术刀弄伤，该手术刀在用pAG6004转化了的过夜培养的发根土壤杆菌培养物中浸泡过。感染的子叶以远轴端向上的方式放在Whatman滤纸上，滤纸在培养皿中用无菌水淹没，在黑暗的生长室25℃培养3至5天。下一步，将各个子叶转移到MBcarb培养基(MS盐类，B5维生素，3％蔗糖，500mg/L羧苄青霉素，并用3g/L的Gelrite凝固)以远轴端向上的方式培养。子叶每两个星期在相同的MB carb培养基上传代培养，让毛状根再生。在带滤波器设置(激发滤波器508nm；发射滤波器524nm)的蔡司立体解剖显微镜(KL 1500LCD)下检测表达和从pAG6004衍生的AXN-1基因相关的黄色荧光蛋白(YFP)基因的根。YFP根在相同的MB carb培养基中每两个星期或者根据需要进行传代培养。

根组织中AXN-1蛋白质的检测

利用Western印迹分析鉴定AXN-1蛋白质在毛状根组织中的表达。已生长约6个星期的一克转基因和对照组织在2.5mM β-巯基乙醇的2x的LDS装载染料(Invitrogen)中悬浮，然后在珠打浆机仪器中使用不锈钢珠匀浆。匀浆提取物在4-20％Big-Tris凝胶上分离，转移到硝酸纤维素，然后用来自用纯化的AXN-1蛋白免疫的兔的兔血清孵育。经过一系列洗涤步骤和用二次抗体孵育(驴抗兔，与辣根过氧化物酶缀合，Pierce)，AXN-1的存在由ECL(Pierce)可视化。有趣的是，这个分析表明，大豆根部产生蛋白质的截短形式(约50kDa)，而不是全长蛋白质(103kDa)。这个观察和AXN-1蛋白质的翻译后加工是一致的，和从宿主菌株，ATX21995分离纯化的AXN-1蛋白质的大小相匹配。

根组织中AXN-8蛋白质的检测

利用Western印迹分析鉴定AXN-8蛋白质在毛状根组织中的表达。已生长约6个星期的一克转基因和对照组织在2.5mM β-巯基乙醇的2x的LDS装载染料(Invitrogen)中悬浮，然后在珠打浆机仪器中使用不锈钢珠匀浆。匀浆提取物在4-20％Big-Tris凝胶上分离，转移到硝酸纤维素，然后用来自用纯化的AXN-8蛋白质免疫的兔的血清孵育。经过一系列洗涤步骤和用二次抗体孵育(驴抗兔，与辣根过氧化物酶缀合，Pierce)，AXN-8的存在由ECL(Pierce)可视化。这个分析表明，大豆根部产生全长AXN-8蛋白质(大约50kDa大小)，其和从宿主菌株ATX20514分离纯化的AXN-8蛋白质的大小相匹配，以及该蛋白质的截短形式。

根组织中酚氧化酶活性的检测

几种酚氧化酶，包括AXN-1，能利用酪氨酸作为底物产生黑色素。为了确定在大豆毛状根中表达的AXN-1蛋白质是否是具有酶活性的，我们用AXN-1(pAG6004)和对照(pAG5385)根组织的蛋白提取物开展酶检测。每个组织(约1克)在液态氮中匀浆，每样品10mg悬浮在0.4mL缓冲液中(20mM Tris，pH 8.0)。每个组织悬液再以1/10的终体积加入酶测试实验体系中，该体系包含同样的缓冲液和1mM的酪氨酸。过夜孵育检测反应，一个商业化的酪氨酸酶制剂(Sigma-Aldrich)用作酶活性阳性对照。实验中AXN-1根组织以及商购酪氨酸酶都产生和黑色素吻合的褐色，而对照根组织呈阴性。颜色的形成依赖于底物酪氨酸的存在。因此，axn-1在大豆组织中有效地表达，产生有活性的多酚氧化酶活性。

实施例27.用此处描述的杀线虫基因转化玉米细胞

玉米穗最好在授粉后8-12天收集。从穗分离胚，并且0.8-1.5毫米大小的那些胚为转化所用优选。胚鳞片朝上放置在合适的培养基上，如DN62A5S培养基(3.98g/L的N6盐；1mL/L的(1000x储备液)N6维生素；800mg/L的L-天冬酰胺；100mg/L肌源肌醇；1.4g/L的L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL储备液)2，4-D)。然而，不是DN62A5S的培养基和盐类是合适的并且在本领域是公知的。胚在黑暗环境中25℃孵育过夜。但是，本身并不必须过夜培养胚。

产生的外植体转移到网状方格(每盘30-40)，转移到渗透介质约30-45分钟，然后转移到轰击(beaming)板上(参见，例如，PCT公开号WO/0138514以及U.S.Patent No.5,240,842)。

为本发明的基因设计的在植物细胞中的DNA构建体，利用气溶胶轰击加速器，使用基本上和PCT公开号WO/0138514描述的一样的条件以加速到植物组织中。轰击后，胚在渗透培养基上培养约30分钟，接着放到培养培养基上在黑暗中25℃培养过夜。为了避免不适当度轰击损害的外植体，它们转移到恢复培养基之前培养至少24小时。然后转移胚到恢复期培养基，在黑暗中25℃孵育5天左右，然后转移到选择培养基。外植体在选择培养基培育至多八个星期，根据利用的特定选择的性质和特点而定。选择期结束后，产生的愈伤组织转移到胚成熟培养基，直到观察到形成成熟的体细胞胚。产生的成熟的体细胞胚被放置在低光照的环境下，由本领域已知的方法开始再生的过程。将产生的苗在生根培养基上生根，产生的植物被转移到育苗盆，并繁育成转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl调节溶液的pH到5.8，以最多3g/L的浓度加入Gelrite(Sigma)，并且该培养基用高压灭菌。冷却到50℃后，加入2ml/L的5mg/ml硝酸银储备液(Phytotechnology Labs)。

实施例28.通过农杆菌介导的转化来转化本发明的基因到植物 细胞中

玉米穗最好在授粉后8-12天收集。从穗分离胚，并且0.8-1.5毫米大小的那些胚为转化所用优选。胚鳞片朝上放置在合适的培养基上，在黑暗环境中25℃孵育过夜。但是，本身并不必须过夜培养胚。胚接触农杆菌约5-10分钟，所述农杆菌含有Ti质粒介导的转移用的适当的载体，然后放到共培养基上约3天(25℃在黑暗中)。共培养后，外植体转移到恢复期培养基5天左右(25℃在黑暗中)。外植体在选择培养基培育至多八个星期，根据利用的特定选择的性质和特点而定。选择期结束后，产生的愈伤组织转移到胚成熟培养基，直到观察到形成成熟的体细胞胚。产生的成熟的体细胞胚被放置在低光照的环境下，根据本领域已知的技术启动再生的过程。

实施例29.玉米叶组织中AXN-8蛋白质表达

载体构建

制备pAG4146载体以指导AXN-8蛋白质在玉米组织中过表达。pAG4146包含全长AXN-8基因，以下述方式连接3’到甘蔗(甘蔗(Saccharum sp.))Ubi4遍在蛋白质启动子和连接5′到35S终止子(花椰菜花叶病毒)，以可能导致从Ubi启动子转录axn-8基因，以及通过35s终止子终止所述转录。载体中还存在选择标记，其赋予草甘膦抗性(GRG23ace5，在甘蔗Ubi4启动子控制下)，在农杆菌属有功能的复制原点，以及壮观霉素抗性基因。所述载体的组织通过整个载体的DNA测序确定。

玉米叶组织中AXN-8蛋白质的检测

利用Western印迹分析，以确定AXN-8蛋白质在根组织和叶组织中都表达。一克的转基因和对照组织在2.5mM β-巯基乙醇的2x的LDS装载染料(Invitrogen)中悬浮，然后在珠打浆机仪器中使用不锈钢珠匀浆。匀浆提取物在4-20％Big-Tris凝胶上分离，转移到硝酸纤维素，然后用来自用纯化的AXN-8蛋白免疫的兔的血清孵育。经过一系列洗涤步骤和用二次抗体孵育(驴抗兔，与辣根过氧化物酶缀合，Pierce)，AXN-8的存在由ECL(Pierce)可视化。通过Western印迹检测到来自叶和根组织的蛋白质的大小非常相似，并且和预期的全长AXN-8蛋白质(大约50kDa的尺寸)相似，其和从宿主菌株ATX20514分离纯化的AXN-8蛋白质的大小相匹配。

说明书中提到的所有出版物和专利申请是本申请相关的本领域技术人员水平的标志。此处所有出版物和专利申请通过引用被包括在内，其程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地标引出来通过引用被包括在内。

虽然上述发明通过详细说明和例子的方式已描述了一些细节以达到清晰理解的目的，但是明显的是，在附加权利要求的角度看可以实施一定的变化和修改。

Claims (15)

1.一种分离的或重组的核酸分子，包括编码具有杀线虫活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列选自：

a)核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO：5、4、8、9、13、14、47或48所示的氨基酸序列组成的多肽；以及

b)如SEQ ID NO：3、1、2、7、12、45或者46所示的核苷酸序列。

2.权利要求1的分离的或重组的核酸分子，其中所述核苷酸序列是被设计用于在植物中表达的合成序列。

3.权利要求2的分离的或重组的核酸分子，其中所述的合成序列包含SEQ ID NO：6、10或15。

4.一种载体，其包含权利要求1的核酸分子。

5.权利要求4的载体，进一步包含编码异源多肽的核酸分子。

6.一种细菌宿主细胞，其包含权利要求4的载体的插入片段。

7.一种具有杀线虫活性的分离的多肽，选自：

a)一种多肽，其由SEQ ID NO：5、4、8、9、13、14、47或48的氨基酸序列组成；以及

b)由SEQ ID NO：3、1、2、6、7、10、12，15、45或46编码的多肽。

8.权利要求7的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。

9.包含权利要求7的多肽的组合物。

10.权利要求9的组合物，其中所述组合物选自：粉末，粉剂，丸剂，颗粒剂，喷雾剂，乳液，胶体和溶液。

11.权利要求9的组合物，其中所述组合物通过将细菌细胞培养物干燥，冷冻干燥，同质化，提取，过滤，离心，沉淀或浓缩来制备。

12.权利要求9的组合物，包含1％到99％重量百分比的所述多肽。

13.一种杀死或者控制线虫害虫的方法，包括使所述害虫接触杀线虫有效量的组合物，或者包括将杀线虫有效量的组合物喂食给所述害虫，所述组合物包含多酚氧化酶，其选自：

a)一种多肽，其由SEQ ID NO：5、4、8、9、13、14、18、20、22、47或48的氨基酸序列组成；以及

b)由SEQ ID NO：3、1、2、6、7、10、12、15、16、17、19、21、45或46编码的多肽。

14.一种保护植物免受害虫侵害的方法，包括将包含编码杀线虫多酚氧化酶多肽的核苷酸序列的至少一种表达载体导入所述植物或者其细胞，其中所述植物被种植到对线虫侵袭易感的区域，并且其中所述多酚氧化酶选自：

a)一种多肽，其由SEQ ID NO：5、4、8、9、13、14、18、20、22、47或48的氨基酸序列组成；以及

b)由SEQ ID NO：3、1、2、6、7、10、12、15、16、17、19、21、45或46编码的多肽。

15.权利要求1所述的分离的或重组的编码具有杀线虫活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列选自：

a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：8或9所示的氨基酸序列；

b)如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。