ES2864641T3

ES2864641T3 - Una familia de proteínas pesticidas y procedimientos para su uso

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Publication number: ES2864641T3
Application number: ES16194435T
Authority: ES
Inventors: Michael Koziel; Nalini Desai; Rebekah Deter; Daniel Tomso; Tracy Hargiss; Nicholas Duck; Nadine Carozzi; Rong Guo
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2027-06-15
Also published as: EP2455392A3; US20080070829A1; EP2455394A3; WO2007147096A3; EP2455393A3; EP2455394A2; WO2007147096A2; US20140344999A1; EP2041163A2; AR061491A1; US20110263488A1; EP3150625A3; EP2455392A2; EP2455394B1; EP3150625B1; EP2455393A2; EP2455391A2; EP2455391A3; EP3800198A1; US8829279B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida, en la que dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos; b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61; d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61; e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B- 30961, o uno de sus complementos.

Description

DESCRIPCIÓN

Una familia de proteínas pesticidas y procedimientos para su uso

Campo de la invención

La presente invención se refiereal campo de la biología molecular. Son proporcionados genes novedosos que codifican las proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Antecedentes de la invención

Bacillus thuringiensises es una bacteria del suelo Gram-positiva formadora de esporas caracterizada por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertas órdenes y especies de insectos, pero son inofensivas para las plantas y otros organismos no focalizados. Por esta razón, las composiciones que incluyen las cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas pueden ser utilizadas como insecticidas ambientalmente aceptables para el control de plagas de insectos agrícolas o vectores de insectos para una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas (delta-endotoxinas) de cristal (Cry) deBacillus thuringiensistienen una potente actividad insecticida contra larvas predominantemente de Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra órdenes de plagas Hymenoptera, Homoptera, Phtiraptera, Mallophaga,y Acari, así como otras órdenes de invertebrados comoNemathelminthes, Platyhelminthes,ySarcomastigorphora(Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.).Estas proteínas fueron originalmente clasificadas como CryI a CryV en base principalmente a su actividad insecticida. Las clases principales fueronespecíficas de Lepidoptera(I),específicas de LepidopterayDiptera(II),específicas de Coleoptera(NI),específicas de Diptera(IV) y específicas de nematodos (V) y (VI). Las proteínas fueron además clasificadas en subfamilias; a las proteínas más altamente relacionadas dentro de cada familia le fueron asignadas letras de división tal comoCry IA, CrylB, Cly JC, etc. Las proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división recibieron nombres tal comoCrylCJ, C,yJC2, etc.

Recientemente ha sido descritauna nueva nomenclatura para los genes Cry en basea la homología de la secuencia de aminoácidos en lugar de la especificidad diana de los insectos (Crickmore et al. (1998) Microbial. Mol. Biol. Rev.

62:807-813). En la nueva clasificación, a cada toxina le es asignado un nombre único que incorpora un rango primario (un número árabe), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula) y un rango cuaternario (otro número árabe). En la nueva clasificación, los números romanos han sido cambiados por números árabes en el rango primario. Las proteínas con una identidad de secuencia inferior al 45% tienen rangos primarios diferentes, y los criterios para los rangos secundario y terciario son 78% y 95%, respectivamente.

La proteína de cristal no exhibe actividad insecticida hasta que haya sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo del insecto a una molécula tóxica activa. (Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores de borde de cepillo apical en el intestino medio de las larvas diana y se inserta en la membrana apical creando canales iónicos o poros, lo que resulta en la muerte larval.

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa y está implicado en la inserción de membranas y la formación de poros. El dominio II consiste en tres hojas beta dispuestas en una configuración de clave griega, y el dominio III consiste en dos hojas beta antiparalelas en la formación de "rollo de gelatina" (de Maagd et al., 2001, supra). Los dominios II y III intervienen en el reconocimiento y la unión de los receptores y, por lo tanto, se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Debido a la devastación que los insectos pueden conferir, y la mejora en el rendimiento controlando las plagas de insectos, hay una necesidad continua de descubrir nuevas formas de toxinas pesticidas.

El documento WO95/35378se refiere a las cepas novedosas de Bacillus thuringiensis activas contra las plagas de lepidópteros y coleópteros.

Sumario de la invención

Son descritos composiciones y procedimientos para conferir actividad pesticida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos pesticidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptido pesticida y los anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden ser usadas en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para su expresión en un organismo, incluyendo, pero sin limitación, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias transformadas, plantas, células vegetales, tejidos y semillas.

En particular, son proporcionadas moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican una proteína pesticida.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida, en la quedicha secuencia de nucleótido es seleccionada del grupo que consiste en:

1. a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

2. b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

3. c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61;

4. d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61; 5. e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961, o uno de sus complementos

La presente invención proporciona además:

• un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención;

• una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención; y.

• una planta transgénica, célula vegetal o semilla vegetal que comprende una molécula de ácido nucleico, vector o célula huésped vegetal de la invención.

Además, están incluidas las secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína pesticida. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un polipéptido aislado con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en:

1. a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61;

2. b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 2 o 61, en el que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

3. c) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60;

4. d) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, en el que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

5. e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961.

Son proporcionadosprocedimientos de producción de polipéptidos de la invención, y para uso de esos polipéptidos para control o exterminio de una plaga de Lepidópteros, Coleópteros, Nematodos o Dípteros.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de control o exterminio deunapoblación de una plaga Lepidópteros, Coleópteros, Nematodos o Dípteros que comprende el contacto de dicha población con una cantidad efectiva para uso pesticida de un polipéptido de la invención.

La invención proporciona además un procedimiento de protección de una planta de una plaga, que comprende la introducción en dicha planta o célula de al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido pesticida, en el que dicha secuencia de nucleótido es seleccionada del grupo que consiste en:

1. a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60;

2. b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60;

4. d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61;

5. e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961.

La invención además proporciona un procedimiento de producción de un polipéptido con actividad pesticida, que comprende cultivar una célula huésped de la invención bajo condiciones en las cuales es expresada la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

También son descritos procedimientos y kits de detección de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para la producción de organismos con resistencia o tolerancia mejorada a plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son deseables para fines agrícolas. Las composiciones de la invención son también útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad pesticida, o para detectar la presencia de pesticidas proteínas o ácidos nucleicos en productos u organismos.

Descripción de figuras

La Figura 1 muestra una alineación de AXMI-022 con la Iota 1b deClostridium perfringens(SEQ ID NÚM.:49), Isp 1A deBrevibacillus laterosporus(SEQ ID NÚM.:50), Isp 1B deBrevibacillus laterosporus(SEQ ID NÚM.:51), Vip lAc deBacillus thuringiensis (SEQ ID NÚM.:52)y ViplAc de Bacillus thuringiensis (S^eQ ID NÚM.: 53). La alineación muestra los residuos de aminoácidos más altamente conservados resaltados en negro, y los residuos de aminoácidos altamente conservados resaltados en gris.

La Figura 2 muestra una alineación de AXMI-022 con ViplAb (SEQ ID NÚM.:52). La alineación muestra los residuos de aminoácidos más altamente conservados resaltados en negro, y los residuos de aminoácidos altamente conservados resaltados en gris.

La Figura 3 muestra una alineación de AXMI-022 con Cry 37Aal deBacillus thuringiensis(SEQ ID NÚM.:54). La alineación muestra los residuos de aminoácidos más altamente conservados resaltados en negro, y los residuos de aminoácidos altamente conservados resaltados en gris.

La Figura 4 muestra una alineación de AXMI-023 con la proteína pesticida Vip2 (SEQ ID NÚM.:55), Isp2a deBrevibacillus laterosporus(SEQ ID NÚM.:56) y el componente de toxina Iota Ia de Clostridium perfringens (SEQ ID NÚM.:57). La alineación muestra los residuos de aminoácidos más altamente conservados resaltados en negro, y los residuos de aminoácidos altamente conservados resaltados en gris.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos de regulación de resistencia o tolerancia a plagas en organismos, particularmente plantas o células vegetales. Por "resistencia" se pretende que la plaga (por ejemplo, el insecto) seaexterminadatras la ingesta u otro contacto con los polipéptidos de la invención. Por "tolerancia" se pretende un impedimento o reducción en el movimiento, alimentación, reproducción u otras funciones de la plaga. Los procedimientos implican la transformación de organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida de la invención. En particular, las secuencias nucleótidas de la invención son útiles para la preparación de plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida. De este modo, sonproporcionados bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son ácidos nucleicos pesticidas y proteínas deBacillusu otras especies. Las secuencias son utilizadas en la construcción de vectores de expresión para su posterior transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de proteínas plaguicidas alteradas mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como el intercambio de dominios o transposición de ADN. Las proteínas son utilizadaspara control o exterminio de las poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros y nematodos, así como para la producción de composiciones con actividad pesticida.

Los plásmidos que contenían una secuencia de nucleótidos de la invención fueron depositados en la colección permanente de la Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, United States of America, de acuerdo con la Tabla 1. Este depósito se mantendrá de conformidad con lo dispuesto en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Efectos delosProcedimientos de Patente. Este depósito fue hecho simplemente como una conveniencia para aquellos con experiencia en la técnicay no es una admisión de que es requerido un depósito bajo 35 U.S.C. Sección 112.

Tabla 1. Depósito de microorganismos

Por "toxina pesticida" o "proteína pesticida" se pretende una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, pero sin limitación, los miembros de las órdenes de Lepidoptera, Díptera, y Coleóptera, oelphylum de Nematoda,o una proteínaque tiene homología con talproteína. Las proteínas plaguicidas han sido aisladas de organismos tal como, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentansyPaenibacillus popilliae. Las proteínas pesticidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos de longitud completa divulgadas en la presente memoria, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de inicio alternativo corriente abajo, o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad pesticida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que es expresada la proteína o en la plaga tras la ingestión de la proteína.

Las proteínas pesticidas proporcionadas por la invención son polipéptidos aislados con actividad pesticida, seleccionados del grupo que consiste en:

Las proteínas pesticidas abarcan las delta-endotoxinas. Las delta-endotoxinas incluyen proteínas identificadas comocry I acry43, citlycyt2,y toxina similar a Cit. Actualmente existen más de 250 especies conocidas de deltaendotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Para una lista expansiva véaseCrickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y para actualizaciones regulares véase Crickmore et al.(2003) " Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Et/index.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61;

d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61; e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961, o uno de sus complementos.

También son descritas en la presente memoria secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con homología con varias otras clases conocidas de toxinas de proteínas pesticidas. Por ejemplo, axmi-011, axmi-012, axmi-015, axmi-032, axmi-044, axmi-033, axmi-034, axmi-022, axmi-063,y axmi-064demuestran homología con las toxinas binarias pesticidas tal como las toxinas VIP, Bin y MTX. Las toxinas VIP1/VIP2 (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.770.696) son toxinas plaguicidas binarias que exhiben una fuerte actividad en los insectos por un mecanismo que se presume implica endocitosis mediada por receptores seguida de la toxificación celular, similar al modo de acción de otras toxinas binarias ("A/B"). Las toxinas A/B tal como VIP, C2, CDT, CST, oel edema B. anthracis y las toxinas letales interactúan inicialmente con las células diana a través de una unión específica mediada por el receptor de los componentes "B" como monómeros. Estos monómeros luego forman homoheptámeros. El complejo heptámero-receptor "B" actúa entonces como una plataforma de acoplamiento que posteriormente se une y permite la translocación de un componente enzimático "A" en el citosol a través de la endocitosis mediada por el receptor. Una vez dentro del citosol de la célula, los componentes "A" inhiben la función celular normal, por ejemplo, la ADP- ribosilación de G-actina, o el aumento de los niveles intracelulares de AMP cíclico (Camp). VéaseBarth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev. 68:373--402.

Independientemente de las toxinas binarias de tipo A/B, son conocidas en la técnica otros tipos de toxinas binarias que actúan como proteínas pesticidas. Cry34Abl y Cry35Abl comprenden una toxina binaria con actividad pesticida identificada a partir de la cepa PS149B1 (Ellis et al. (2002) Appl Environ Microbiol. 68:1137-45). Estas toxinas tienen masas moleculares de aproximadamente 14 y 44 kDa, respectivamente. Han sido identificadas otras toxinas binarias con una organización y homología similares a Cry34Aa y Cry34Ab (Baum et al. (2004) Appl Environ Microbiol.

70:4889-98).

BinA y BinB son proteínas deBacillus sphaericusque comprenden una proteína de toxina binaria de mosquitocida (Baumann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425-36). Cry35 muestra la similitud de aminoácidos con estas proteínas BinA y BinB. Cry36 (^eT69) y Cry38 (ET75) (Solicitud de Patente Internacional Núm. WO/00/66742-B) son péptidos aislados de forma independiente que también presentan una similitud de aminoácidos con BinA y BinB, y por lo tanto, es probable que incluyan toxinas binarias.

Cry23 (también conocida como cryET33; Patente de los Estados Unidos Núm. 6.063.756) y Cry37 (también conocida como cryET34; Patente de los Estados Unidos Núm. 6.063.756) también aparentan ser toxinas plaguicidas binarias. Cry23 también exhibe homología con toxinas MTX2 y MTX3. El término "MTX" es utilizado en la técnica para delinear un conjunto de proteínas pesticidas que son producidas porBacillus sphaericus. La primera de estas, a menudo referida en la técnica como MTX1, es sintetizada como un cristal parasporal que es tóxico para los mosquitos. Los componentes principales del cristal son dos proteínas de 51 y 42 kDa, ya que la presencia de ambas proteínas es necesaria para la toxicidad, MTX1 es considerada una toxina "binaria" (Baumann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425--436).

Mediante el análisis dediferentes cepas de Bacillus sphaericus con diferentes toxicidades, han sido identificadas dos nuevas clases de toxinas MTX. MTX2 y MTX3 representan clases separadas y relacionadas de toxinas plaguicidas que exhiben actividad pesticida. Véase, por ejemplo, Baumann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425-436. MTX2 es una toxina de 100 kDa. Más recientemente MTX3 ha sido identificada como una toxina separada, aunque la secuencia de aminoácidos de MTX3 deB. sphaericus es 38% idéntica a la toxina de MTX2de B. SphaericusSS\\-1 (Liu, et al. (1996) Appl. Environ. Microbial. 62: 2174-2176).

De este modo, son proporcionadas en la presente memoriasecuencias novedosas de nucleótidos aislados que confieren actividad pesticida. En particular, la molécula de ácido nucleico proporcionada por la invención es una que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en:

1. a) la secuencia de nucleótidos de SEQ \D NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

2. b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ \D NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

3. c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ\D NÚM.: 2 o 61;

4. d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ\D NÚM.: 2 o 61; 5. e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961, o uno de sus complementos.

Estas secuencias de nucleótidos aislados codifican polipéptidos con homología con las delta-endotoxinas o toxinas binarias conocidas. También son proporcionadas secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite que las células controlen o exterminen las plagas que lo ingieren.

Por lo tanto, la presente invención proporciona además un polipéptido aislado con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en:

1. a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ\D NÚM.: 2 o 61;

2. b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ \D NÚM.: 2 o 61, en el que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

3. c) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ \D NÚM.: 1 o 60;

4. d) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ \D NÚM.: 1 o 60, en el que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

Moléculas de ácido nucleico aisladas, sus variantes y fragmentos

Un aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos pesticidas o sus porciones biológicamente activas. En particular, la molécula de ácido nucleico proporcionada es una que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

Como se usa en la presente memoria, el término "molécula de ácido nucleico" tiene por objeto incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados mediante análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, pero preferentemente es ADN bicatenario.

Una molécula o proteína de ácido nucleico "aislada" o "purificada", o una de sus porciones biológicamente activas, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando es producida por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando es sintetizada químicamente. Preferentemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferentemente secuencias de codificación de proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos de 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Para los propósitos de la invención, "aislado" cuando es utilizado para hacer referencia a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína pesticida puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que es derivado el ácido nucleico. Una proteína pesticida que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de 30%, 20%, 10%, o 5% (por peso seco) de proteína no pesticida (también conocida en la presente memoria como "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia establecida en SEQ ID NÚM.: 1, 60, o la secuencia de nucleótidos depositada en un huésped bacteriano como Núm. de Acceso NRRL B-30961 y sus variantes, fragmentos y complementos, que tienen al menos un 80% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 60 o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961 y que codifican un polipéptido con actividad pesticida. Por "complemento" se pretende una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de manera tal que pueda hibridarse a la secuencia de nucleótidos dada para así formar un dúplex estable. La secuencia de aminoácidos correspondiente para la proteína pesticida codificada por esta secuencia de nucleótidos se establece en el NÚMERO de ID de SEQ: 2, 61, o el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican proteínas pesticidas también están abarcadas por la presente invención, a condición de que tengan al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 60, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961, o uno de sus complementos, y dicho fragmento codifique un polipéptido que tiene actividad pesticida. Por "fragmento" se pretende por lo tanto una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos codificará una porción biológicamente activa de una proteína pesticida. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica una proteína pesticida divulgada en la presente memoria (por ejemplo, 957 nucleótidos para SEQ ID N^úM.:1;) dependiendo del uso previsto. Por nucleótidos "contiguos" se pretenden los residuos de nucleótidos previstos que son inmediatamente adyacentes uno al otro. Los fragmentos de las secuencias nucleótidas de la presente invención codifican fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína pesticida y, por lo tanto, retienen la actividad pesticida. Por "retiene la actividad" se pretende que el fragmento tenga al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad pesticida de la proteína pesticida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol.

83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199- 206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína pesticida de longitud completa de la invención (por ejemplo, 318 aminoácidos para SEQ ID NÚM.:2).

Las proteínas pesticidaspreferentes de la presente invenciónsoncodificadas por una secuencia de nucleótidossuficientemente idénticaalasecuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60. Por "suficientemente idéntica" se pretende una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% deidentidad de secuencia o superior en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineación descritos en la presente memoria utilizando parámetros estándar. Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán que estos valores pueden ser ajustados adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud de aminoácidos, la lectura de la posición del marco, y similares.

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas para fines de comparación óptimos. El código porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad porcentual= número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede ser determinado utilizando técnicas similares a las descritas a continuación, permitiendo o no huecos. Al calcular la identidad porcentual, típicamente se recuentan las coincidencias exactas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo deKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como enKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Este algoritmo es incorporado en los programas BLASTN y BLASTX deAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico tipo pesticida de la invención. Las búsquedas de la proteína BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias del aminoácido homólogas a las moléculas de la proteína pesticida de la invención. Para obtener alineaciones con huecos para propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST 2.0) puede ser utilizadosegún lo descrito enAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast puede ser utilizado para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschulet al. (1997)supra. Cuando son utilzados los programas BLAST, GAP BLAST y PSI-Blast, pueden ser utilizados los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede ser realizada manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara las secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o ADN, y por lo tanto puede proporcionar datos sobre la conservación de la secuencia completa de aminoácidos. El algoritmo ClustalWes utilizadoen varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles comercialmente, tal como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para el análisis de alineaciones de ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite evaluar la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo deMyers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo es incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del Paquete de Software de GCG Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EE.UU.). Cuando es utilizado el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede ser utilizada una tabla de residuos de peso de PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

A menos que se indique lo contrario, GAP Versión 10, que utiliza el algoritmode Needleman and Wunsch (1970) J. Mal. Biol. 48(3):443-453, será utilizado para determinar la identidad o similitud de la secuencia utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando Peso de GAP de 50 y Peso de Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando Peso de GAP de 8 y Peso de Longitud de 2, y el programa de puntuación de BLOSUM62. También pueden ser utilizados programas equivalentes. Por "programa equivalente" se pretende cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera una alineación con idénticas coincidencias de residuos de nucleótidos y una identidad de secuencia de porcentaje idéntica en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. La invención también abarca variantes moléculas de ácido nucleico. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos de codificación de la proteína pesticida incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas plaguicidas divulgadas en la presente memoria, pero que difieren en términos de conservación debido a la degeneración del código genético, así como las que son suficientemente idénticas como se discutió anteriormente. Las variantes alélicas naturales pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación, como se describe a continuación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente que se han generado, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, pero que todavía codifican las proteínas pesticidas divulgadas en la presente invención como se discute a continuación. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad pesticida. Por "retiene la actividad" se pretende que la variante tendrá al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80% de la actividad pesticida de la proteína nativa. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206;Marrone et al. (1985) J. ofEconomic Entomology 78:290-293;y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477.

Aquellos con experiencia en la técnica apreciará además que pueden ser introducidos cambios por la mutación de las secuencias nucleótidas de la invención, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas pesticidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De este modo, las moléculas de ácido nucleico aisladas variantes pueden ser creadas introduciendo una o más sustituciones, adiciones, o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos correspondiente divulgada en la presente memoria, de manera tal que una o más sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones se introduzcan en la proteína codificada, a condición de que tengan al menos 80% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 60, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961 o uno de sus complementos y codifiquen un polipéptido que tenga actividad pesticida. Las mutaciones pueden ser introducidas mediante técnicas estándar, tal como la mutagénesis dirigida por el sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias de nucleótidos variantes también están abarcadas por la presente invención, a condición de que tengan al menos 80% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 60, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961 o uno de sus complementos y codifiquen un polipéptido que tenga actividad pesticida.

Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser realizadas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia de tipo silvestre de una proteína pesticida sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácidos es sustituido por un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado consiste en siete hélices alfa y está implicado en la inserción de membranas y la formación de poros. El dominio II consiste en tres hojas beta dispuestas en una configuración de clave griega, y el dominio III consiste en dos hojas beta antiparalelas en la formación de "rollo de gelatina" (de Maagdet al.,2001, supra). Los dominios II y III intervienen en el reconocimiento y la unión de los receptores y, por lo tanto, se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser realizadas en regiones no conservadas que conservan su función. En general, tales sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácidos conservados, ni para residuos de aminoácidos que residan dentro de un motivo conservado, cuando tales residuos sean esenciales para la actividad proteica. Los ejemplos de residuos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de las proteínas incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en la alineación en las Figuras 1, 2, 3, o 4). Los ejemplos de residuos que se conservan, pero que pueden permitir sustituciones conservadoras de aminoácidos y aún mantener la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que sólo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que solo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en la alineación en las Figuras 1, 2, 3 o 4). Sin embargo, aquellos con experiencia en la técnica comprenderán que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes pueden ser realizadas introduciendo mutaciones al azar a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia de codificación, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser examinados para determinar la capacidad de conferir actividad pesticida para identificar mutantes que retienen la actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse mediante técnicas de ensayo estándar.

Usando procedimientos tal como PCR, hibridación, y similares pueden ser identificadas secuencias de pesticidas correspondientes, tales secuencias teniendo una identidad sustancial con las secuencias de la invención, es decir, a condición de que tengan al menos 80% de identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1, SEQ ID NÚM.: 60, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961, o uno de sus complementos, y codifiquen un polipéptido que tenga actividad pesticida. Véase, por ejemplo, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

En un procedimiento de hibridación, la totalidad o parte de la secuencia de nucleótido pesticida puede ser usada para detectar el ADNc o las bibliotecas genómicas. Los procedimientos para la construcción de tales bibliotecas de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnicay sondesvelados en Sambrook and Russell, 2001, supra. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden etiquetarse con un grupo detectable tal como32P, o cualquier otro marcador detectable, como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para hibridación pueden ser fabricadas etiquetando oligonucleótidos sintéticos en basea la secuencia de nucleótidos conocida que codifica proteínas pesticidas divulgada en la presente memoria. Además, se pueden utilizar cebadores degenerados diseñados sobre la base de nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o en la secuencia de aminoácidos codificados. La sonda típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que es hibridada bajo condiciones estrictas a al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, o 200 nucleótidos consecutivos de secuencia de nucleótidos que codifican una proteína pesticida de la invención o uno de sus fragmentos o variantes. Los procedimientos para la preparación de sondas para la hibridación son generalmente conocidos en la técnica y son desvelados en Sambrook and Russell, 2001.

Por ejemplo, una secuencia completa de proteínas pesticidas divulgada en la presente memoria, o una o más de sus porciones, puede ser usada como una sonda capaz de hibridarse específicamente a las secuencias similares a las proteínas pesticidas correspondientes y a los ARN mensajero. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y son preferentemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Dichas sondas pueden ser utilizadas para amplificar las secuencias plaguicidas correspondientes de un organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica puede ser utilizada para aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la detección de hibridación de bibliotecas de ADN chapadas (ya sea placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrookef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

La hibridación de dichas secuencias puede ser realizada en condiciones estrictas. Por "condiciones estrictas" o "condiciones estrictas de hibridación" se pretenden condiciones bajo las cuales una sonda eshibridada a su secuencia objetivo en un grado de forma detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Mediante el control de la severidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ajustarse para permitir una cierta falta de correspondencia en secuencias de modo que se detecten grados más bajos de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,5 M iones de Na, típicamenteconcentración de 0,01 a 1,0 M iones de Na (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones estrictas con la adición de agentes desestabilizadores tal como formamida. Las condiciones ejemplares de baja severidad incluyen hibridación con una solución tampón de formamida de 30 a 35%, NaCl de 1 M, ^sD^sde 1% (sulfato de dodecilo sódico) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC= 3,0 M NaCl/0,3 M de citrato de trisódico) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen hibridación en formamida de 40 a 45%, NaCl de 1,0 M, SDS de 1% a 37°C, y lavado en 0,5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Entre las condiciones ejemplares de alta severidad se incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl a 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 1% de SDS. La duración de la hibridación es generalmente inferior a aproximadamente 24 horas, generalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad suele ser la función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tmpuede aproximarse a partir de la ecuación deMeinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: TM= 81,5°C 16,6 (log M) 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de forma) - 500/L; Donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de base. La Tmes la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH) a la que el 50% de una secuencia de blanco complementaria se hibrida en una sonda perfectamente emparejada. Tmse reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de desajuste; por lo tanto, Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridarse a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad del 90%, la Tmpuede reducirse a 10°C. En general, se seleccionan condiciones estrictas para que sean aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, condiciones muy estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente estrictas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C menos que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y Tm deseados, aquellos con experiencia en la técnica comprenderán que las variaciones en la severidad de la hibridación y/o soluciones de lavado están inherentemente descritas. Si el grado deseado de desajuste resulta en un Tmmenor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución formamida), es preferente aumentar la concentración de SSC para que se pueda utilizar una temperatura más alta. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra enTijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2° ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Proteínas aisladas y sus variantes y fragmentos

Las proteínas pesticidas también están incluidas dentro de la presente invención. Por "proteína pesticida" se pretende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NÚM.:2 o 61.

También son proporcionados fragmentos, porciones biológicamente activas, y sus variantes, y pueden ser utilizados para practicar los procedimientos de la presente invención, a condición de que tengan al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 2 o 61, y tengan actividad pesticida.

Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptido que comprenden secuencias de aminoácidos al menos al 80% idénticas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NÚM.:2, o 61, y que exhiben actividad pesticida. Una porción biológicamente activa de una proteína pesticida puede ser un polipéptido que es de, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden ser preparadas por técnicas recombinantes y evaluadas para la actividad pesticida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477. Como se usa en la presente memoria, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQID NÚM.:2 o 61. La invención abarca otros fragmentos, sin embargo, tal como cualquier fragmento en la proteína mayor que 50, 100, 150, 200, 250, o 300 aminoácidos.

Por "variantes" se pretende proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.:2 o 61. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se hibrida a la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos, en condiciones estrictas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis, a condición de que tengan al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos deSEQ ID NÚM.: 2 o 61, o uno de sus complementos, y codifiquen un polipéptido que tenga actividad pesticida. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, reteniendo actividad pesticida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.743.477.

Los genes bacterianos, tal comolos genes axmi de la presente invención, muy a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en proximidad al comienzo del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de iniciollevará a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tal comoBacillus sp.también reconocen el codón GTG como un codón inicial, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. Además, a menudo no se determinaa prioricuál de estos codones son utilizados naturalmente en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede conducir a la generación de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas están abarcadas en la presente invención y pueden usarse en los procedimientos de la presente invención.

También se hace referencia a los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o a sus variantes o fragmentos. Los procedimientos de producción de anticuerpos son bien conocidos en la técnica(véase, por ejemplo,Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.196.265).

Variantes alteradas o mejoradas

Es reconocido que las secuencias de ADN de una proteína pesticida pueden ser alteradas por diversosprocedimientos, y que estas alteraciones pueden resultar en secuencias de ADN codificando proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por una proteína pesticida de la presente invención. Esta proteína puede ser alterada de varias maneras incluyendo sustituciones, deleciones, truncaciones, e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de SEQ ID NÚM.:2 o 61, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, Aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, a condición de que tengan al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 2 o 61, o uno de sus complementos, y codificar un polipéptido que tenga actividad pesticida. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína pesticida pueden ser preparadas por mutaciones en el ADN. Esto también puede ser logrado por una de varias formas de mutagénesis y/o en la evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína pesticida para conferir actividad pesticida puede ser mejorada por el uso de tales técnicas sobre las composiciones de esta invención. Por ejemplo, se puede expresar una proteína pesticida en las células huésped que exhiben altas tasas de incorporación incorrecta de la base durante la replicación del ADN, tal como XL-I Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en tales cepas, se puede aislar el ADN (por ejemplo, por preparación de ADN plasmídico, o amplificación por PCR y clonacióndel fragmento PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la proteína pesticida en una cepa no mutagénica, e identificar genes mutados con actividad pesticida, por ejemplo realizando un ensayo para probar la actividad pesticida. Por lo general, la proteína es mezclada y utilizada en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir el contacto de plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de las plagas. Se encuentran ejemplos de mutaciones que dan lugar a un aumento de la toxicidad enSchnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev.62:775-806.

Alternativamente, se pueden realizar alteraciones en la secuencia de proteínas de muchas proteínas en el terminal amino o carboxi sin afectar sustancialmente la actividad. Esto puede incluir inserciones, deleciones o alteraciones introducidas por procedimientos moleculares modernos, tal como PCR, incluyendo amplificaciones de PCR que alteran o extienden la secuencia de codificación de proteínas mediante la inclusión de secuencias de codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación de PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias completas de codificación de proteínas, como las utilizadas comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Tales proteínas de fusión a menudo son utilizadas para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática, o epítopo para facilitar la purificación de proteínas, la detección de proteínas, u otros usos experimentales conocidos en la técnica,(3) dirigir la secreción o la traducción de una proteína a un organelo subcelular, tal como el espacio periplásmico de bacterias Gram-negativas, o el retículo endoplásmico de células eucariotas, el último de los cuales a menudo resulta en la glicosilación de la proteína.

Las secuencias variantes de nucleótido y aminoácidos de la presente invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénico y recombinogénicos tal como transposición de ADN. Con tal procedimiento, una o más diferentes regiones de codificación de proteínas pesticidas pueden ser utilizadas para crear una nueva proteína pesticida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes son generadas a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionados que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden ser recombinadas de forma homologadain vitrooin vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden ser mezclados entre un gen pesticida de la invención y otros genes pesticidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como un aumento de la actividad insecticida. Las estrategias para tal transposición de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol.

272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291;y las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.605.793y5.837.458.

El intercambio de dominios o la transposición es otro mecanismo para generar proteínas plaguicidas alteradas. Los dominios pueden intercambiarse entre proteínas pesticidas, lo que resulta en toxinas híbridas o quiméricas con una mejor actividad pesticida o espectro objetivo. Los procedimientos para generar proteínas recombinantes y probarlas para la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo,Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330;de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge etal. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958;Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930;Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-252925).

Vectores

Una secuencia pesticida de la invención puede ser proporcionada en un casete de expresión para expresión en una planta de interés. Por "casete de expresión vegetal" se pretende una construcción de ADN que es capaz de resultar en la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula de planta. Típicamente contienen un promotor y una secuencia de codificación. A menudo, tales construcciones también contendrán una región no traducida de 3'. Tales construcciones pueden contener una "secuencia de señal" o "secuencia de líder" para facilitar el transporte cotranslacional o postranslacional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tal como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi.

Por "secuencia de señal" se pretende una secuencia que se sabe o se sospecha que da lugar a transporte de péptidos cotranslacionales o postranslacionales a través de la membrana celular. En los eucariotas, esto típicamente implica secreción en el aparato de Golgi, con algún resultado de glicosilación. Las toxinas insecticidas de las bacterias a menudo son sintetizadas como protoxinas, que son protolíticamente activadas en el intestino de la plaga objetivo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia de señal se encuentra en la secuencia nativa, o puede ser derivada de una secuencia de la invención. Por "secuencia de líder" se pretende cualquier secuencia que, cuando se traduce, resulta en una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraslacional de la cadena peptídica a un organelo subcelular. De este modo, esto incluye secuencias de líderes dirigidas al transporte y/o la glicosilación por el paso en el retículo endoplásmico, pasos a vacuolas, plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondrias, y similares.

Por "vector de transformación vegetal" se pretende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Tal molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión vegetal, y puede organizarse en más de una molécula de ADN "vectorial". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetal que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones actoras cis y trans necesarias para la transformación de células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogos en una célula extraña. El casete incluye secuencias reguladoras de 5' y 3' vinculadas operativamente a una secuencia de la invención. Por "ligado operativamente" se pretende un vínculo funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, ligado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. Además, el casete puede contener al menos un gen adicional que se cotransforme en el organismo. Alternativamente, el gen adicional puede ser proporcionado en casetes de expresión múltiple.

"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para la transcripción directa de una secuencia de codificación descendente. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y translacionales (también denominadas "secuencias de control"), es necesario para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Tal casete de expresión es proporcionado con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia pesticida para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en la dirección de transcripción de 5'-3', una región de iniciación transcripcional y translacional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación translacional y transcripcional (es decir, una región de terminación) funcional en las plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extranjero o heterólogo, al huéspedvegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" o "homólogo" al huésped vegetal, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extranjero" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o naturalmente que ocurre para la secuencia de ADN ligadaoperativamente de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés ligada operativamente, puede ser nativa con el huésped vegetal, o puede derivarse de otra fuente (es decir, extranjera o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped vegetal, o cualquiera de sus combinaciones). Las regiones de terminación convenientes están disponibles en el TI-plásmido deA tumefaciens,tal como las regiones de terminación de la sintasa de la octopina y de la sintasa de la nopalina. Véase tambiénGuerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627- 9639. Cuando sea adecuado, el gen puede ser optimizado para aumentar la expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden ser sintetizados utilizando codones preferentes por células huésped para mejorar la expresión, o pueden ser sintetizados usando codones en una frecuencia de uso de codones preferentes por el huésped. Por lo general, el contenido de GC del gen aumentará. Véase, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso del codón preferente por el huésped. Los procedimientos están disponibles en la técnicapara sintetizar los genes vegetales preferentes. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.380.831y5.436.391yMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una realización, la proteína pesticida está dirigida al cloroplasto para su expresión. De esta manera, cuando la proteína pesticida no es insertada directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contiene además un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína pesticida a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126;Clark et al. (1989).J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968;Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421;y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen pesticida a ser dirigido al cloroplasto puede ser optimizado para su expresión en el cloroplasto para considerar las diferencias en el uso de codón entre el núcleo vegetal y este organelo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados utilizando codones preferentes por el cloroplasto. Véase, por ejemplo,la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.380.831.

Transformación vegetal

Los procedimientos de la invención implican introducir una construcción de nucleótido en una planta. Por "introducir" se pretende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de manera tal que la construcción gane acceso al interior de una célula vegetal. Los procedimientos de la invención no requieren que sea utilizado un procedimientoparticular para introducir una construcción de nucleótido a una, sólo que la construcción de nucleótido gane acceso al interior de al menos una célula vegetal. Los procedimientos para introducir construcciones de nucleótidos en las plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, procedimientos de transformación estables, procedimientos de transformación transitorios, y procedimientos mediados por virus.

Por "planta" se pretende plantas enteras, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de la misma. Las células vegetales pueden diferenciarse o no diferenciarse (por ejemplo, callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hoja, células de raíz, células del floema, polen). "Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "transformadas de manera estable" se refieren a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácidos nucleicos exógenos o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como aquellas que pueden ser endógenas, o presentes en la célula vegetal no transformada.

"Heterólogo" se refiere generalmente a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas para la célula o parte del genoma nativo en el que están presentes, y que se han añadido a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similares.

La transformación de las células vegetales puede ser lograda mediante una de las diversas técnicas conocidas en la técnica. El gen pesticida de la invención puede ser modificado para obtener o mejorar la expresión en células de planta. Típicamente una construcción que expresa tal proteína contendría un promotor para conducir la transcripción del gen, así como una región no traducida de 3' para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación. La organización de tales construcciones es bien conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil diseñar el gen de manera tal que el péptido resultante sea secretado, o de otra manera dirigido dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede ser diseñado para contener un péptido de señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferente diseñar el casete de expresión vegetal para que contenga un intrón, de manera que el procesamiento de ARNm del intrón sea requerido para la expresión.

Típicamente este "casete de expresión vegetal" será insertado en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación vegetalcompuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores son a menudo referidos en la técnicacomo "vectores binarios". Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, son utilizados con mayor frecuencia parala transformación mediada por Agrobacterium, en la que el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente son bastante grandes, y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios suelen contener un vector plasmídico que contiene las secuencias de acción cis necesarias para la transferencia de ADN T (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para la que se desea generar plantas transgénicas). También están presentes en este vector plasmídico las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias de acción cis están dispuestas de manera que permiten una transferencia eficiente a las células vegetales y su expresión. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen pesticida se encuentran entre los bordes izquierdos y derechos. A menudo, un segundo vector plasmídico contiene los factores de transacción que median la transferencia de ADN T deAgrobacteriuma las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales porAgrobacterium, y la transferencia de ADN por la escisión en las secuencias fronterizas y la transferencia de ADN mediada por vir, como se comprende en la técnica(Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Varios tipos decepas de Agrobacterium (por ej., LBA4404, GV3101, eHa101, EHA105, etc.) pueden ser usados para la transformación vegetal. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas mediante otros procedimientos tal como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

En general, los procedimientos de transformación vegetal implican la transferencia de ADN heterólogo a las células vegetalesdiana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), a continuación, es aplicado un nivel de umbral máximo de selección adecuada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Los explantos son típicamente transferidos a un suministro fresco del mismo medio y cultivados rutinariamente. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes tras colocar el medio de regeneración complementado con un nivel de umbral máximo del agente de selección. Después, los brotes son transferidos a un medio de enraizamiento selectivo para la recuperación de la raíz o plántula. La plántula transgénica crece hasta convertirse en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282;Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantos son típicamente transferidos a un suministro fresco del mismo medio y cultivados rutinariamente. Una descripción general de las técnicas y procedimientos para generar plantas transgénicas se encuentra enAyres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239y Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene numerosas células; tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier fragmento de callo o tejido o grupo de células diana sometido. La capacidad de exterminar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da lugar a cultivos vegetales transformados. A menudo, la capacidad de eliminar células no transformadas es una limitación a la recuperación rápida de células vegetales transformadas y a la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en las plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, destinado a la transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse mediante uno de varios procedimientos, incluyendo, pero sin limitación, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo porAgrobacteriumen células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extranjero heterólogo adherido a partículas, aceleración de partículas balísticas, transformación de haces en aerosol (Publicación de Solicitud de los Estados Unidos Núm. 20010026941; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.945.050, Publicación Internacional Núm. WO 91/00915; Publicación de Solicitud de los Estados Unidos Núm. 2002015066), transformación Lec1, y varios otros procedimientos no mediados por partícula directa para transferir ADN.

Los procedimientos para la transformación de los cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El procedimientodepende de la administración de una administración de ADN por arma de partículas que contiene un marcador seleccionable y la focalización del ADN al genoma plástido a través de la recombinación homóloga. Además, la transformación de plástidos se puede lograr mediante la transactivación de un transgen silencioso transmitido por plástidos mediante la expresión de tejido preferente de una ARN polimerasa codificada y dirigida por plástidos. Tal sistema ha sido informado enMcBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Tras de la integración del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, se aplica un nivel umbral máximo de selección adecuada en el medio para exterminar las células no transformadas y separar y proliferar las células transformadas putativamente que sobreviven de este tratamiento de selección mediante la transferencia regular a un medio fresco. Mediante el paso continuo y el desafío con la selección adecuada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. Se pueden utilizar procedimientos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con las formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden ser cultivadas, y polinizadas con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y herede de manera estable y luego se cosechan semillas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona una semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") teniendo un nucleótido construcción de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

Evaluación de la transformación vegetal

Tras la introducción del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma vegetal se confirma mediante diversos procedimientos, como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis de PCR es un procedimiento rápido para detectar células, tejidos o brotes transformados en busca de la presencia de genes incorporados en la fase anterior antes del trasplante al suelo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). La PCR se lleva a cabo utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos del gen de interés odel vector Agrobacterium de fondo, etc.

La transformación vegetal puede confirmarse mediante el análisis Southern Blot de ADN genómico (Sambrook and Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con enzimas de restricción adecuadas, se fracciona en ungel de agarosa y se transfiere a una membrana de nilón o nitrocelulosa. La membrana o "blot" es entonces sondeada con, por ejemplo,el fragmento de ADN blanco 32P radiomarcado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma vegetal de acuerdo con las técnicas estándar (Sambrook and Russell, 2001 , supra).

En el análisis Northern blot, se aísla ARN de tejidos específicos de transformante, se fracciona en un gel de agarosa formaldehído, y se transfiere en un filtro de nylon de acuerdo con los procedimientos estándar que se utilizan rutinariamente en la técnica (Sambrook and Russell, 2001,supra). La expresión del ARN codificado por el gen pesticida es entonces probada hibridando el filtro a una sonda radiactiva derivada de un gen pesticida, por procedimientos conocidos en la técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra).

Se pueden realizar Western blot, ensayos bioquímicos y similares en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteínas codificadas por el gen pesticida mediante procedimientos estándar (Sambrook and Russell, 2001,supra)utilizando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína pesticida.

Actividad pesticida en plantas

En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresen una proteína pesticida que tiene actividad pesticida. Los procedimientos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la forma en que se generan las células vegetales transgénicas no es crítica para esta invención. Los procedimientos conocidos o descritos en la técnica, tal comola transformación mediada por Agrobacterium, la transformación biolística y los procedimientos no mediados por partículas pueden usarse a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una proteína pesticida pueden aislarse mediante procedimientos comunes descritos en la técnica, por ejemplo, mediante la transformación del callo, la selección del callo transformado y la regeneración de plantas fértiles a partir de tal callo transgénico. En ese proceso, se puede utilizar cualquier gen como marcador seleccionable a condición de que su expresión en las células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar células transformadas.

Se han desarrollado una serie de marcadores para su uso con células vegetales, tal como la resistencia al cloranfenicol, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo del cloroplasto también pueden usarse como marcadores seleccionables. Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tal como el glifosato, el bromoxinilo o la imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Tales genes han sido informados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314(gen de la nitrilasa de resistencia al bromoxinilo);y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188(gen de resistencia a imidazolinona AHAS). Además, los genes divulgados en la presente memoria son útiles como marcadores para evaluar la transformación de las células bacterianas o vegetales.

Losprocedimientos para detectar la presencia de un transgen en una planta, un órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), su semilla, célula vegetal, propagación, embrión o progenie son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgen se detecta mediante pruebas de actividad pesticida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína pesticida pueden ser probadas para la actividad pesticida, y las plantas que muestran la actividad óptima pueden ser seleccionadas para la mejora. Los procedimientos están disponibles en la técnicapara el ensayo para la actividad de la plaga. Por lo general, la proteína se mezcla y se utiliza en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitación, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero sin limitación, maíz (mazorca), sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, Cebada, y colza,Brassicasp., alfalfa, centeno, mijo, azafrán, cacahuetes, batata, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, verduras, plantas ornamentales y coníferas.

Los vegetalesincluyen, pero sin limitación, tomates, lechuga, judías verdes, habas de lima, Guisantes, y miembros del géneroCurcumistal como pepino, melón de cantalupo, y melón de almizcle. Las plantas ornamentales incluyen, pero sin limitación, azalea, hydrangea, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, poinsettia, y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en control pesticida

Los procedimientos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una de sus variantes, en el control de pesticidas o en la ingeniería de otros organismos como agentes pesticidas son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.039.523y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una de sus variantes, o los microorganismos que han sido genéticamente alterados para contener un gen y proteína pesticida pueden usarse para proteger los cultivos agrícolas y los productos de las plagas. En un aspecto de la invención, células enteras, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (pesticida) son tratadas con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de plagas objetivo.

Alternativamente, el pesticida se produce introduciendo un gen pesticida en un huésped celular. La expresión del gen pesticida resulta, directa o indirectamente, en la producción y mantenimiento intracelular del pesticida. En un aspecto de esta invención, estas células son entonces tratadas bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de plagas objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas naturalmente encapsulados pueden ser formulados de acuerdo con las técnicas convencionales para su aplicación en el medio ambiente que alberga una plaga objetivo, por ejemplo, el suelo, el agua y el follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, EPA 0192319, y las referencias citadas allí.

Alternativamente, se pueden formular células que expresan un gen de esta invención tal como para permitir la aplicación del material resultante como un pesticida.

Los ingredientes activos de la presente invención se aplican típicamente en la forma de composiciones y se pueden aplicar a la superficie de cultivo o planta a ser tratada, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones pesticidas, aceites inactivos, polímeros y/o formulaciones de portador biodegradables o de liberación temporal que permiten la dosificación a largo plazo de un área objetivo tras una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bacteriocidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varios de estos preparados, si se desea, junto con otros portadores, tensioactivos o adyuvantes de aplicación que se emplean habitualmente en la técnicade la formulación. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias que típicamente se emplean en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, espesantes, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones pueden prepararse en "cebos" comestibles o convertirse en "trampas" de plagas para permitir la alimentación o ingestión por una plaga objetivo de la formulación pesticida.

Los procedimientos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen aplicación en hojas, revestimiento de semilla y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La presente invención también proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención. La composición puede formularse como material pulverulento, polvo, microgránulos, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, solución, o similar, y puede ser preparada por medios convencionales tal como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas esas composiciones que contienen al menos un polipéptido pesticida de este tipo, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% en peso.

Las plagas de Lepidópteros, Dípteros o Coleópteros pueden ser exterminadas o reducidas en número en un área dada por los procedimientos de la invención, o pueden ser aplicadas profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere, o entra en contacto con, una cantidad efectiva para uso pesticida del polipéptido. Por "cantidad efectiva para uso pesticida" se pretende una cantidad del pesticida que es capaz de llevar a cabo el exterminio deal menos una plaga, o de reducir notablemente el crecimiento, la alimentación, o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tal como, por ejemplo, las plagas objetivo específicas a ser controladas, el ambiente específico, la ubicación, la planta, el cultivo, o el sitio agrícola a ser tratado, las condiciones ambientales, y el procedimiento, la velocidad, la concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición de polipéptido pesticida eficaz. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales, y/o frecuencia de aplicación y/o gravedad de la infestación de plagas.

Las composiciones de pesticidas descritas pueden ser fabricadas formulando la suspensión de células bacterianas, cristales y/o esporas, o componentes de proteínas aisladas con el portador adecuado para uso agrícola. Las composiciones podrán ser formuladas antes de su administración en un medio adecuado, tal como liofilizado, secado por congelación, desecado o en un soporte, medio o diluyente acuoso adecuado, tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden ser en forma de polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o emulsiones de agua o aceite/agua, o como polvo húmedo, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "portador agrícola-aceptable" abarca todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, espesantes, aglutinantes, etc., utilizados habitualmente en la tecnología de formulación de plaguicidas; estos son bien conocidos por los expertos en formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden ser mezcladas con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y preparadas por diversos medios, por ejemplo, por mezcla, combinación y/o molienda homogénea de la composición pesticida con adyuvantes adecuados utilizando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y procedimientos de aplicación adecuadas son descritos enla Patente de los Estados UnidosNúm. 6.468.523.

"Plaga" incluye pero sin limitación, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenesColeoptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera,etc., particularmenteColeoptera, Lepidoptera, y Diptera.

El ordenColeopteraincluye los subórdenesAdephagayPolyphaga. El subordenAdephagaincluye las superfamiliasCaraboideayGyrinoidea,mientras que el subordenPolyphagaincluye las superfamiliasHydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrroidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Crisomieloidea yCurculionoidea. La superfamiliaCaraboideaincluye las familiasCicindelidae, Carabidae yDytiscidae. La superfamiliaGyrinoideaincluye la familiaGyrinidae. La superfamiliaHydrophiloideaincluye la familiaHydrophilidae. La superfamiliaStaphylinoideaincluye las familiasSilphidaeyStaphylinidae. La superfamiliaCantharoideaincluye las familiasCantharidaeyLampyridae. La superfamiliaCleroideaincluye las familiasCleridae y Dermestidae. La superfamiliaElateroideaincluye las familiasElateridaeyBuprestigidae. La superfamiliaCucu/oideaincluye la familiaCoccinellidae. La superfamiliaMeloideaincluye la familiaMeloidae. La superfamiliaTenebrionoideaincluye la familiaTenebrionidae.La superfamiliaScarabaeoideaincluye las familiasPassalidaeyScarabaeidae. La superfamilia Cerambycoideaincluye la familia Cerambycidae. La superfamilia Chrysomeloideaincluye la familiaChrysomelidae. La superfamilia Curculionoideaincluye las familiasCurculionidaeyScolytidae.

El ordenDipteraincluye los subórdenesNematocera, Brachycera,yCyclorrhapha. El subordenNematoceraincluye las familiasTipulidae, Aychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae,yCecidomyiidae.El subordenBrachyceraincluye las familiasStratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae yDolichopodidae. El subordenCyclorrhaphaincluye las DivisionesAschiza y Aschiza. La divisiónAschizaincluye las familiasPhoridae, Syrphidae yConopidae. La división Aschiza incluye las seccionesAcalyptrataeyCalyptratae. La secciónAcalyptrataeincluye las familiasOtitidae, Tephritidae, Agromyzidae yDrosophilidae. La secciónCalyptrataeincluye las familiasHippoboscidae,Oestridae,Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae, y Sarcophagidae.

El ordenLepidopteraincluye las familiasPapilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae,y Tineidae.

Las plagas de insectos de la invención para los cultivos principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis,barrenador de maíz europeo;Agrotis ipsilon, gusano negro; Helicoverpa zea,gusano de mazorca de maíz;Spodopterafrugiperda, gusano de armiño de otoño;Diatraea grandiosella, barrenador de maíz del sudoeste;Elasmopalpus lignosellus, barrenador de mazorca de maíz menor;Diatraea saccharalis; barrenador de caña de azúcar, Diabrotica virgifera; gusano de la raíz del maíz occidental, Diabrotica longicornis barberi; gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi; gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis,escarabajo enmascarado del sur (larva blanca); Popilia japonica,escarabajo japonés;Chaetocnema pulicaria,escarabajo de maíz; Sphenophorus maidis, escarabajo picudo del maíz, pulgón de la hoja de maíz, Anuraphis maidiradicis; pulgón de la raíz de maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinches;Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorios; Hylemya platura, larvas de la hoja de maíz; Agromyza parvicornis, minador de hojas del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips del césped; Solenopsis milesta, hormigas ladronas; Tetranychus urticae, araña de dos puntos; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca del maíz; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz menor; Feltia subterranea, gusano cortador; Phyllophaga crinita, larva blanca; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos de alambre; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo de pulga del maíz; Sphenophorus maidis, escarabajo picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón de la hoja del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinches; Contarinia sorghicola, jején del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña carmesí; Tetranychus urticae, araña de dos puntos; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano militar; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz menor; Agrotis orthogonia, gusano cortado occidental; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del tallo del maíz menor; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereal; Hypera punctata, gorgojo de la hoja de trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón del trigo ruso; Schizaphis graminum, pulgón de los cereales; Macrosiphum avenae, pulgón del grano inglés; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca de Hess; Sitodiplosis mosellana, jején del trigo; Meromyza americana, larva del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca sierra del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro del enrollamiento del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla del capullo girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, jején de la semilla del girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano del capullo del algodón; Helicoverpa zea, gusano moteado del algodón; Spodoptera exigua, gusano militar de la colza; Pectinophora gossypiella, gusano moteado rosa; Anthonomus grandis, gorgojo moteado; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulgón del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca; Lygus lineolaris, chinche opaca de las plantas; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña carmesí; Tetranychus urticae, araña de dos puntos; Rice: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Helicoverpa zea, gusano del tallo del maíz; Colaspis brunnea, escarabajo de colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo acuático del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Soja: Pseudoplusia includens, oruga agrimensora de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga aterciopelada; Plathypena scabra, gusano del trébol verde; Ostrinia nubilalis, barrenador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortado negro; Spodoptera exigua, gusano militar de la colza; Heliothis virescens, gusano del capullo del algodón; Helicoverpa zea, gusano moteado del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo del frijol mejicano; Myzus persicae, pulgón del durazno verde; Empoasca fabae, saltahojas de la patata; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, larva de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña de la fresa; Tetranychus urticae, araña de dos puntos; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador del maíz europeo; Agrotis ipsilon, gusano cortado negro; Schizaphis graminum, escarabajo verde; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Euschistus servus, chinche apestosa marrón; Delia platura, larva de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosca de Hess; Petrobia latens, araña del trigo marrón; Colza Oleaginosa: Brevicoryne brassicae, pulgón del zapallo; Phyllotreta cruciferae, escarabajo pulgón; Mamestra configurata, gusano militar Bertha; Plutella xylostella, polilla de lomo diamante; Delia ssp., larvas de la raíz.

Los nematodos incluyen nematodos parasitarios tal como los nematodos de nudo radicular, quiste y lesión, incluyendoHeteroderaspp.,Meloidogynespp. y Globoderaspp.; particularmente los miembros de los nematodos de quiste, incluyendo, pero sin limitación, Heterodera glicines(nematodo de quiste de soja);Heterodera schachtii(nematodo del quiste de la colza); Heterodera avenae (nematodo del quiste del cereal); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodo del quiste de la patata). Los nematodos de la lesión incluyenPratylenchusspp.

Procedimientos para aumentar el rendimiento vegetal

Son descritosprocedimientos para aumentar el rendimiento vegetal. Los procedimientos comprenden la introducción en una planta o célula vegetal de un polinucleótido que comprende una secuencia de pesticidas divulgada en la presente memoria. Como se define en la presente memoria, el "rendimiento" vegetal se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se pretende a cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento vegetal tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de las hojas de las plantas puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Además, el aumento de la biomasa foliar puede utilizarse para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de las plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo incluyendo, pero sin limitación, al menos un aumento del 1%, al menos un aumento del 3%, al menos un aumento del 5%, al menos un aumento del 10%, al menos un aumento del 20%, al menos un aumento del 30%, al menos un aumento del 50%, al menos un aumento del 70%, al menos un aumento del 100% o un aumento mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia pesticida.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

Experimentos

Ejemplo 1. Extracción de ADN plasmídico

Lascepas ATX14759, ATX14875, ATX13026, ATX13002, ATX9387, ATX13045, ATX21738, ATX14833, ATX1489, ATX15398 y ATX12972 fueron seleccionadas para su análisis. Los cultivos puros de cada cepa fueron cultivados en grandes cantidades de medios ricos. Los cultivos fueron centrifugados para cosechar el microgránulo celular. El microgránulo celular fue preparado por tratamiento con SDS por procedimientos conocidos en la técnica, resultando en rotura de la pared celular y liberación de ADN. Las proteínas y el ADN genómico de gran tamaño fueron precipitados por una alta concentración de sal. El ADN plasmídico fue precipitado con etanol. En varios casos, el ADN plasmídico fue separado de cualquier ADN cromosómico restante por centrifugación de alta velocidad a través de un gradiente de cloruro de cesio. Alternativamente, el ADN plasmídico fue purificado por unión a una resina, como se conoce en la técnica. Para cada cepa, la calidad del ADN fue verificada mediante la visualización en un gel de agarosa mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Ejemplo 2. Clonación de genes

Fueron preparadas bibliotecas de ADN a partir del ADN plasmídico o de cada cepa. Esto puede lograrse de muchas maneras como se conoce en la técnica. Por ejemplo, el ADN plasmídico purificado puede ser cizallado en fragmentos de tamaño de 5-10 kb y los voladizos monocatenarios de 5' y 3' reparados usando ADN polimerasa T4 y fragmento Klenow en presencia de los cuatro dNTP, como se conoce en la técnica. Los fosfatos pueden ser adheridos a los extremos de 5' por tratamiento con polinucleótidos quinasa T4, como se conoce en la técnica. Entonces, los fragmentos de ADN reparados pueden ser ligados durante la noche en un vector estándar de alta copia (es decir, pBLUESCRIPT™ SK+), adecuadamente preparado para aceptar las inserciones como se conoce en la técnica (por ejemplo, mediante la digestión con una enzima de restricción que produce extremos romos).

La calidad de las bibliotecas de ADN resultantes fue analizada mediante la digestión de un subconjunto de clones con una enzima de restricción conocida por tener un sitio de hendidura que flanqueaba el sitio de clonación. Fue determinado que un alto porcentaje de clones contenían insertos, idealmente con un tamaño promedio de inserto de 5-6 kb.

Ejemplo 3. Secuenciación de placas de biblioteca de alto rendimiento

Una vez verificada y confirmada la calidad de la biblioteca de ADN, fueron cultivadas colonias en un caldo rico en bloques de 96 pocillos 2m1 durante la noche a 37°C, típicamente a una velocidad de agitación de 350 rpm. Los bloques fueron centrifugados para cosechar las células hasta el fondo del bloque. Los bloques fueron preparados por la preparación de lisis alcalina estándar en un formato de alto rendimiento

Las secuencias finales de clones de esta biblioteca fueron entonces determinadas para un gran número de clones de cada bloque de la siguiente manera: la secuencia de ADN de cada clon seleccionado para el análisis fue determinada mediante la técnica de secuenciación de un terminador de tinte fluorescente (Applied Biosystems), mediante procedimientos conocidos en la técnicautilizando una máquina de secuenciación de ADN automatizada, y cebadores oligonucleótidos estándar que hibridan al vector plasmídico en la región que flanqueaba el inserto.

Ejemplo 4. Montaje y detección de datos de secuenciación

Las secuencias de ADN obtenidas fueron compiladas en un proyecto de ensamblaje y alineadas para formar cóntigos. Esto se puede hacer eficientemente usando un programa informático, tal como Vector NTI, o alternativamente usando el conjunto de programas de alineación y análisis de ADN Phred/Phrap. Estos cóntigos, junto con cualquier lectura individual que pudiera no haber sido añadida a un cóntigo, fueron comparados con una base de datos compilada de todas las clases de genes pesticidas conocidos. Se analizaron más a exhaustivamente los cóntigos o las lecturas individuales identificadas como identificativos de un gen endotoxina o pesticida conocido.

Ejemplo 5.axmi-037

A partir de la cepa ATX1489, ha sido descubierto que el clon pAX2558 contenía un marco de lectura abierto con homología para delta-endotoxinas de tipo "cry". Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-037(SEQ ID NÚM.:16). La inspección delmarco de lectura abierto axmi-037 sugiere que puede haber más de un codón de inicio. Los dos codones de inicio previstos son el codón ATG que comienza en la posición de nucleótido 1 de SEQID NÚM.: 16, y un codón ATG descendente (representado por S^eQ ID NÚM.: 18). El ATG en el nucleótido 77 de SEQ ID NÚM.:16 tiene una secuencia de sitio de unión al ribosoma (5'-G-G-A-G-G-3'), localizado en las posiciones de nucleótidos 63-67 de SEQ ID NÚM.: 16. En basea la presencia de esta fuerte secuencia de consenso de unión al ribosoma inmediatamente anterior a este segundo sitio de inicio, y la homología de las dos proteínas predichas a otras endotoxinas, el producto de traducción del sitio de inicio posterior es denominado AXMI-037 (SEQ ID NÚM.: 19). El producto de traducción más largo, comenzando en el ATG en la posición de nucleótido 1 de SEQ ID NÚM.: 16, es designado AXMI-37-2 (y se establece en SEQ ID NÚM.:17). pAx2558 fue depositado en la Colección de Cepas de Patentes de ARS el 15 de junio de 2006, y se le asignó ⁿR^rL B-30939. AXMI-37-2 muestra una identidad 60% de aminoácidos a la endotoxina Cry7Aa1.

Ejemplo 6.axmi-019

A partir de la cepa ATX14875, ha sido descubierto que un clon contenía un marco de lectura abierto con homología con las toxinas de la familia MTX. Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-019(SEQ ID NÚM.:10), y la proteína codificada fue designada AXMI-019 (SEQ ID NÚM.:11). Mediante la búsqueda de bases de datos públicas de secuencias de proteínas, tal como la base de datos GenPept, la región de extremo C terminal de AXMI-019 (a partir de aproximadamente el aminoácido 123 de SEQ ID NÚM.:11) tuvo una homología baja a una clase de toxinas, incluyendo la toxina Cry14-4 Bacillus thuringiensis serovar darmstadiensis(SEQ ID NÚM.:42; codificada por GENBANK® ID AAV70918.1), y la proteína MTX2 Bacillus sphaericus (SEQ ID NÚM.:16, GENBANK® ID AAC44124.1).

Ejemplo 7.axmi-011.axmi-012 y axmi-015.

A partirde la cepa ATX13026, ha sido descubierto que tres clones individuales contenían marcos de lectura abiertos con homología con toxinas similares a MTX. Estos marcos de lectura abiertos fueron designadosaxmi-011(SEQ ID NÚM.:1),axmi-012(SEQ ID NÚM.:3) yaxmi-015(SEQ ID NÚM.:8), y las proteínas codificadas se designan a Xm I-011 (SEQ ID NÚM.:2), AXMI-012 (SEQ ID NÚM.:4) y AXMI-015 (SEQ ID NÚM.:9), respectivamente. Mediante la búsqueda de bases de datos públicas de secuencias de proteínas, ha sido descubierto que AXMI-011 tenía una homología baja para una clase de toxinas incluyendo MTX2 (SEQ ID NÚM.:16); AXMI-015 tenía una homología baja (aproximadamente 35 % de aminoácidos identifican más de 178 aminoácidos) para una toxina mosquitocida deBacillus thuringiensis israelensisRBTH_02046 (SEQ ID NÚM.: 41, GENBANK® ID gi|75761628:1-79; AXMI-01279 tiene una homología (29% sobre 217 aminoácidos) con una clase de toxinas incluyendola toxina binaria p42 de Bacillus sphaericus (SEQ ID NÚM.: 39; GENBANK® ID CAA73761).

La inspección dela región codificadora axmi-011 revela la existencia de un sitio de inicio alternativo de traducción de 12 nucleótidos corriente arriba del inicio ATG deaxmi-011. Este marco de lectura abierto contiene una extensión de 5' de los siguientes doce nucleótidos 5'-G-T-G-A-T-G-A-A-A-A-A-A-3' (SEQ ID NÚM.:59) inmediatamente corriente arriba y adyacentesalmarco de lectura abierto axmi-11. Este marco de lectura abiertoes designado comoaxmi-011 (largo)(SEQ ID NÚM.:60). La traducción de axmi-011 utilizando el GTG de inicio putativo resultaría en una proteína AXMI-011 modificada que contiene una extensión de extremo N terminal de cuatro aminoácidos (residuos de aminoácidos 1 a 4 de SEQ ID NÚM.:61).

El análisis del contexto de ADN que rodea los dos sitios potenciales de inicio revela una secuencia con una buena coincidencia con el consenso para un sitio de unión al ribosoma 5' G-T-G-A- T-G-3' (SEQ ID NÚM.:62) colocado de -10 a -6 nt con relación al codón de inicio ATG de SEQ ID NÚM.:1. Esta es una posición adecuada para un sitio de unión del ribosoma bacteriano. No se observa ninguna homología obvia al sitio de inicio del ribosoma de consenso en la posición 15 nt corriente arriba del sitio de inicio del GTG putativo. Por lo tanto, la proteína iniciada desde el codón ATG de inicio se designa como AXMI-011 (SEQ ID NÚM.:2). La proteína codificada por la traducción iniciada en el codón GTG de inicio se designa como AXMI-011(LONG) (SEQ ID NÚM.:61).

Ejemplo 8.axmi-032

A partir de la cepa ATX9387, ha sido descubierto que un plásmido contenía un marco de lectura abierto con homología con toxinas pesticidas. Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-032(SEQ ID NÚM.: 12), y la proteína codificada fue designada AXMI-032 (SEQ ID NÚM.:13). Mediante la búsqueda de bases de datos públicas de secuencias de proteínas, tal como la base de datos GenPept, ha sido descubierto que AXMI-032 tenía homología con una clase de toxinas, incluida una supuesta toxina binaria deBacillus thuringiensis(SEQ ID NÚM.:43;GENBANK® Número de Acceso CAD30104.1) que es una posible toxina de dos dominios deBacillus thuringiensis serovarisraelensis.

Ejemplo 9.axmi-013.

A partir de la cepa ATX13002, ha sido descubierto que un clon contenía un marco de lectura abierto con homología para delta-endotoxinas tipo "cry". Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-013(SEQ ID NÚM.:5), y la proteína codificada fue designada AXMI-013 (SEQ ID NÚM.:6). Mediante la búsqueda de bases de datos públicas de secuencias de proteínas, ha sido descubierto que la región de extremo Cterminal de AXMI-013 tenía una identidad del 52% con la toxina MTX3 (SEQ ID NÚM.:40: GENBANK® ID AAB36661).

Ejemplo 10. Expresión de AXMI-013 enBacillus

El gen insecticida AXMI-013 es amplificado por PCR y clonado enel vector de expresión Bacillus pAX916 por procedimientos bien conocidos en la técnica. El clon resultante es analizado para la expresión de la proteína AXMI-013 después de la transformación en células deuna cepa cry(-) Bacillus thuringiensis. Unacepa de Bacillus que contieneel clon de axmi-013 y expresa la proteína insecticida AXMI-013 es cultivada, por ejemplo, en medio de CYS (10 g/l de Bacto-casitona; 3 g/l de extracto de levadura; 6 g/lKH2PO4; 14 g/Lk2HPO4; 0,5 mm de Mgmt4; 0,05 mm de MnCh; 0,05 mm de FeSO4), hasta que es evidente la esporulación por examen microscópico. Las muestras se preparan y analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). AXMI-013 ha sido probada para detectar la actividad insecticida en bioensayos contra plagas de insectos importantes.

La inspección de la secuencia de aminoácidos prevista de AXMI-013 (SEQ ID NÚM.:6) sugirió que el extremo N terminal de la proteína AXMI-013 de longitud completa puede comprender un péptido de señal para la secreción. Se estimó que el sitio previsto de la hendidura se encontraba entre la alanina en la posición 27 y la lisina en la posición 28 de SEQID NÚM.:6. De manera similar, se predice que MTX3 (SEQ ID NÚM.:40) posee un péptido de señal de secreción en su extremo N terminal (Liu, et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:2174-2176).

La proteína AXMI-013 expresada fue extirpada de un gel de poliacrilamida y sometida a análisis de secuencia de extremo N terminal, como se conoce en la técnica. La secuencia de extremo N terminal identificada por este análisis correspondió a un truncamiento de extremo N terminal de la proteína AXMI-013, resultando en un péptido truncado con un extremo N terminal correspondiente a la glutamina (Q) en la posición de aminoácido 40 de SEQ ID NÚM.:6. Esta proteína truncada se denomina en la presente memoria AXMI-013(Q), y la secuencia de aminoácidos de esta proteína se proporciona en SEQ ID NÚM.:7. Como es sabido en la técnica, la predicción del sitio exacto de la hendidura es algo difícil. Sin embargo, la escisión en aproximadamente la posición de aminoácidos 40 de SEQ ID NÚM.:6 sugiere que cualquiera de (1) AXMI-013 se procesa en forma adicional tras la escisión inicial en las posiciones de aminoácidos 27/28, o AXMI-013 tiene una señal de secreción nueva. Para confirmar esto, aquellos con experiencia en la técnicapueden hacer construcciones de fusión génica utilizando (1) una proteína heteróloga y (2) usando porciones de longitud creciente de AXMI-013. Entoncesse puedeprobar la secreción de la proteína del marcador y determinar los sitios de procesamiento por la secuenciación de extremo N terminal. Otros procedimientos para determinar la extensión de la secuencia de señales son conocidos en la técnica.

Ejemplo 11.axmi-023 y axmi-041.

A partir de la cepa ATX13045, ha sido descubierto que un clon plasmídico contenía un marco de lectura abierto con homología para delta-endotoxinas tipo "cry". Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-023(SEQ ID NÚM.:30), y la proteína codificada fue designada AXMI-023 (SEQ ID NÚM.:31). La búsqueda BLAST de la base de datos no redundante 'nr' demuestra que AXMI-023 tiene una baja identidad de aminoácidos (menos del 30% de identidad de aminoácidos) con la toxina de la proteína VIP2, así como varias otras toxinas supuestas o conocidas. (GENBANK® Núm. de Acceso AA086513.1, SEQ ID NÚM.:55).

A partir de la cepa ATX21738, ha sido descubierto que un clon plasmídico contenía un marco de lectura abierto con homología para delta-endotoxinas tipo “cry”. Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-041(SEQ ID NÚM.:32), y la proteína codificada fue designada AXMI-041 (SEQ ID NÚM.:33). pAX4310 fue depositado en la Colección de Cepas de Patentes de ARS el 15 de junio de 2006, y se le asignó N^rRL B-30943. A^xMⁱ-041 es 21% idéntico a AXMI-023, y de manera similar muestra baja identidad de aminoácidos (menos de 30% identidad de aminoácidos) con la toxina de la proteína VIP2, así como varias otras toxinas supuestas o conocidas.

Una búsqueda de bases de datos de ADN y proteínas con las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos de AXMI-023 y AXMI-041 reveló que son homólogos de proteínas pesticidas conocidas. La Figura 4 muestra una alineación de AXMI-023 con la proteína pesticida VIP2 (s Eq ID NÚM.:55), y varias toxinas relacionadas. AXMI-041 también muestra homología con esta clase de toxinas.

Ejemplo 12. AXMI-022 define una clase novedosa de proteínas pesticidas

A partir de la cepa ATX13045, ha sido descubierto que un clon plasmídico contenía un marco de lectura abierto con homología con toxinas de insectos conocidas. Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-022(SEQ ID NÚM.:28), y la proteína codificada fue designada AXMI-022 (SEQ ID NÚM.:29).

La secuencia de aminoácidos de AXMI-022 es 64,9% idéntica a ViplA(b) (SEQ ID NÚM.:52; véase tambiénla Patente de los Estados Unidos Núm. 5.770.696) a lo largo de la longitud de ViplA(b), y tiene una identidad significativa de aminoácidos con varias otras toxinas de proteínas binarias. Un análisis posterior de AXMI-022 reveló las siguientes características de este polipéptido:

AXMI-022 es significativamente más largo que otras proteínas binarias con las que comparte homología, y codifica un péptido de 1003 aminoácidos. Por ejemplo, la proteína ViplA(b) tiene una longitud de 834 aminoácidos.

La inspección de la región de ADN que rodea elmarco de lectura abiertoaxmi-022 no muestra evidencia de un segundo ORF que codifica un dominio de toxina. Los genes que codifican las toxinas binarias suelen estar estrechamente vinculados físicamente. La mayoría de las veces, tanto la toxina como la proteína del receptor se organizan como marcos de lectura abiertos adyacentes, y a menudo están transcripcionalmente vinculados en un operón.

La región de unión del receptor de AXMI-022 (de aproximadamente el aminoácido 640 a aproximadamente el aminoácido 770 de SEQID NÚM.:29) es diferente de otras toxinas binarias. La región de AXMI-022 correspondiente a la región de proteínas binarias involucradas en la unión de receptores es muy diferente en AXMI-022 en comparación con otras proteínas binarias. Esto sugiere que AXMI-022 se une a un receptor diferente que otras proteínas binarias.

Los aminoácidos del extremo C terminal 133 de AXMI-022 (empezando por el aminoácido 870 de SEQ ID NÚM.:29) muestran homología de aminoácidos con la proteína binaria de Cry37Aa (SEQ ID NÚM.:54; GENBANK® Núm. de Acceso AAF76376;Patente de los Estados Unidos Núm. 6.063.756). Esta región tiene homología con Cry37Aa en una secuencia de identidad de aproximadamente 36%. Cry37Aa está en una clase diferente de toxinas binarias que las toxinas tipo Vipl. Cry37Aa pertenece a la familia Cry34, que forma una toxina binaria con la familia Cry35. Cry34Abl es principalmente responsable de la formación de poros en las membranas lipídicas, mientras que Cry35Abl mejora la formación de poros (Masson, et al. (2004) Biochemistry 43:12349-57).

Por lo tanto, AXMI-022 aparenta ser un nuevo tipo de toxina binaria de "péptido único", teniendo homología con múltiples clases de proteínas binarias, con un componente de unión al receptor de una clase de toxinas binarias directamente fusionadas a un componente de toxina de una clase diferente de toxinas binarias. Esta organización de dominios no ha sido predicha anteriormente en la técnica.

Ejemplo 13. axmi-043

A partir de la cepa ATX15398, ha sido descubierto que pAX2597 contenía un marco de lectura abierto con homología para delta-endotoxinas tipo “cry”. Este marco de lectura abierto fue designadocomo axmi-043. pAX2597 fue depositado en la Colección de Cepas de Patentes deARS el 15 de junio de 2006, y se le asignó el NRRL B30941. La inspección delmarco de lectura abierto axmi-043 sugiere que puede haber más de un codón de inicio. El ATG en la posición 46 de SEQ ID NÚM.:20 tiene un sitio de unión al ribosoma (5' G-G-A-G-A-3') (SEQ ID NÚM.:63) a partir del nucleótido 33 de SEQ ID NÚM.:20. Sobre la base de la presencia de esta fuerte secuencia de consenso de unión al ribosoma inmediatamente corriente arriba de este segundo sitio de inicio, y la homología de las dos proteínas predichas a otras endotoxinas, en la presente memoria se designa el producto de traducción del sitio de inicio interno (representado por SEQ ID NÚM.:22) como AXMI-043 (SEQ ID NÚM.:23), y la proteína más larga como AXMI-043-2 (SEQ ID NÚM.:21). AXMI-043 muestra una identidad de 93% de aminoácidos con la endotoxina AXMI-028, y AXMI-43-2 es 90% idéntico a AXMI-028 (SEQ ID NÚM.:45 de esta solicitud, véase tambiénla solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 11/416.261). AXMI-043 aparenta ser una "endotoxina de longitud completa", y contiene una región de extremo C terminal (después del residuo aspártico en la posición 629 de la secuencia de aminoácidos AXMI-043) a menudo referida en la técnicacomo un dominio no tóxico o un "dominio de cristal". AXMI-043 muestra una identidad de 54% de aminoácidos con la endotoxina Cry7Aal (SEQ ID NÚM.:46) a lo largo de toda la longitud de la proteína.

Ejemplo 14.axmi-44.

A partir de la cepa ATX14759, ha sido descubierto que pAX2599 contenía un marco de lectura abierto con homología para delta-endotoxinas tipo “cry”. Este marco de lectura abierto fue designado como axmi-044(SEQ ID NÚM.:14), y la proteína codificada fue designada AXMI-044 (SEQ ID NÚM.:15). pAX2599 fue depositado en la Colección de Cepas de Patentes de ARS el 15 de junio de 2006, y se le asignó el Número de Acceso NRRL B-30942. Mediante la búsqueda de bases de datos públicas de secuencias de proteínas, tal como la base de datos GenPept mantenida por el NCBI (National Center for Biotechnology Information), ha sido descubierto que AXMI-044 tenía baja homología con la familia cry-15Aa/cry33de toxinas (S^eQ ID NÚM.:44, GENBANK® ID 8928022), y MTX2 (SEQ ID NÚM.:38).

Ejemplo 15.axmi-033 y axmi-034

A partir de la cepa ATX14833, ha sido descubierto que un clon plasmídico contenía dos marcos de lectura abiertos con homología para insectos toxinas. El primer marco de lectura abierto fue designado como axmi-033(SEQ ID NÚM.:24), y la proteína codificada fue designada AXMI-033 (SEQ ID NÚM.:25). AXMI-33 muestra una identidad de 61% de aminoácidos en la toxina de CryC35 aminoácidos 326 (SEQ ID NÚM.:47, codificada por la referencia de GENBANK® CAA63374). El segundo marco de lectura abierto fue designado como axmi-034(SEQ ID NÚM.:26), y la proteína codificada fue designada AXMI-034 (SEQ ID NÚM.:27). AXMI-34 muestra una identidad 45% de aminoácidos con la endotoxina CryC53. (SEQ ID N^úM.:48, codificado por la referencia de GENBANK® CAA67205). axmi-033yaxmi-034aparentan comprender un operón. El ATG de inicio de axmi-034es inmediatamente 3' a, y en proximidad cercana de (15 nucleótidos inmediatamente corriente abajo de), el codón de parada TAA deaxmi-033. Esta organización es bien conocida en la técnicapara sugerir que dos genes componen un operón. Por lo tanto, las proteínas AXMI-033 y AXMI-034 probablemente sean coexpresadas en su cepa nativa. Es probable que las actividades de las dos proteínas expresadas en conjunto puedan ser sinérgicas y superiores a la actividad de las proteínas expresadas por separado. pAX4341, un clon que contieneambos marcos de lectura abiertos axmi-033 y axmi-034, fue depositado en la Colección de Cepas de Patentes de ARS el 29 de mayo de 2007, y se le asignó el Número de Acceso NRRL B-50047.

Ejemplo 16.axmi-063y axmi-064.

A partir de la cepa ATX12972, ha sido descubierto que un clon plasmídico contenía dos marcos de lectura abiertos con homología para toxinas de insectos. El primer marco de lectura abierto fue designado como axmi-063(SEQ ID NÚM.:34), y la proteína codificada fue designada AXMI-063 (SEQ ID NÚM.:35). AXMI-63 muestra una identidad de 53,1% de aminoácidos a la toxina de insectos de CryC35 (SEQ ID NÚM.:47, codificada por la referencia de GENBANK® CAA63374). El segundo marco de lectura abierto fue designado como axmi-064(SEQ ID NÚM.:36), y la proteína codificada fue designada AXMI-064 (SEQ ID NÚM.:37). AXMI-64 muestra una identidad 44,3% de aminoácidos con la endotoxina CryC53 (SEQID NÚM.:48, codificada por la referencia de GENBANK® CAA67205). axmi-063yaxmi-064aparentan comprender un operón. El ATG de inicio de axmi-064es inmediatamente 3' en, y muy cerca del, codón de parada TAAde axmi-063. Esta es una organización bien conocida en la técnicapara sugerir que dos genes componen un operón. Por lo tanto, las proteínas AXMI-063 y AXMI-064 probablemente sean coexpresadas en su cepa nativa. Es probable que las actividades de las dos proteínas expresadas en conjunto puedan ser sinérgicas y superiores a la actividad de las proteínas expresadas por separado. pAX5036, un clon que contieneambos marcos de lectura abiertos axmi-063 y axmi-064, fue depositado en la Colección de Cepas de Patentes de ARS el 29 de mayo de 2007, y se le asignó NRRL B-50048.

AXMI-033/AXMI-034 son similares a AXMI-063/AXMI-064. El análisis de la secuencia de aminoácidos de AXMI-033, AXMI-043, AXMI-063 y AXMI-064 revela que AXMI-033 y AXMI-063 comparten una identidad significativa de aminoácidos, y son 69% idénticos. Del mismo modo, AXMI-034 y AXMI-064 comparten una similitud significativa de aminoácidos (52% idéntica).

Ejemplo 17. Homología de AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-032, Y AXMT-044 con genes conocidos de proteína pesticida

Una búsqueda de bases de datos de proteínas con las secuencias de aminoácidos de las proteínas descritas en la presente memoria revela que son homólogos de las proteínas pesticidas conocidas. La comparación de las secuencias de aminoácidos en la presente memoria descritas con la base de datos no redundante (nr) mantenida por el NCBI utilizando el algoritmo BLAST reveló las siguientes proteínas como teniendo el bloque más fuerte de identidad de aminoácidos a las secuencias de la invención (Tabla 2). Por lo tanto, las proteínas son "proteínas pesticidas".

Tabla 2. Identidad de aminoácidos de AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-032, y AXMI-044 para toxinas de mosquitos en bases de datos públicas

Ejemplo 18. Ensayos adicionales para actividad pesticida

La capacidad de una proteína pesticida para actuar como un pesticida sobre una plaga es a menudo evaluada de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnicaes realizar un ensayo de alimentación. En un ensayo de alimentación tal, se expone la plaga a una muestra que contiene cualquiera de los compuestos a sersometido a prueba, o muestras de control. A menudo, esto se realiza colocando el material a ser sometido a prueba, o una dilución adecuada de dicho material, en un material que la plaga ingerirá, tal como una dieta artificial. El material a ser sometido a prueba puede estar compuesto por un líquido, sólido o pulpa. El material a ser sometido a prueba puede colocarse sobre la superficie y luego dejar que se seque. Alternativamente, el material a ser sometido a prueba puede mezclarse con una dieta artificial fundida, y luego dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pocillo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para las plagas de succión (por ejemplo, pulgones) pueden implicar la separación del material de prueba del insecto por una partición, idealmente una porción que puede ser perforada por las partes de la boca de succión del insecto de succión, para permitir la ingestión del material de prueba. A menudo, el material de pruebaes mezclado con un estimulante de alimentación, tal como sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca, o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido de la prueba de la capacidad de la plaga para alimentarse de la planta transgénica. Las pruebas de la planta pueden implicar el aislamiento de las partes de la planta típicamente consumidas, por ejemplo, pequeñas jaulas adheridas a una hoja, o el aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

Otros procedimientos y procedimientos para ensayar plagas son conocidos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo enRobertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, los ensayos son comúnmente descritos en las publicaciones Arthropod Management Tests and Journal of Economic Entomologyo por discusión con miembros de la Entomological Society of America (ESA).

Ejemplo 19. Vectorizaciónde genes axmi para expresión en plantas

Las regiones de codificación de la invención están conectadas con secuencias promotoras y terminadoras adecuadas para expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en la técnicay pueden incluir el promotor de la actina del arroz o el promotor de la ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas,el promotor de Arabidopsis UBQ3 o el promotor de la expresión de CaMV 35S en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinII. Las técnicas para producir y confirmar construcciones de promotor - gen - terminador también son bien conocidas en la técnica. En un aspecto de la invención,las secuencias de ADN sintético son diseñadas y generadas. Estas secuencias sintéticas tiene alterada la secuencia de nucleótidos con relación a la secuencia padre, pero codifican proteínas que son esencialmente idénticas a la proteína madre AXMI.

En otro aspecto de la invención, versiones modificadas de los genes sintéticos están diseñados de manera tal que el péptido resultante es dirigido a un organelo de vegetal, tal como el retículo endoplasmático o el apoplasto. Las secuencias peptídicas conocidas para dar lugar a la selección de proteínas de fusión para plantar organelos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la región de extremo N terminal del gen de la fosfatasa ácida del Lupino BlancoLupinus albus(GENEBANK® ID GI:14276838,Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) es conocido en la técnicaporque da lugar a un retículo endoplásmico blanco de proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención del retículo endoplásmico que comprende el péptido de extremo N-terminal-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEQ ID NÚM.:58)) en el extremo C terminal, la proteína de fusión será dirigida al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de un retículo endoplásmico dirigido a la secuencia en el extremo C terminal, la proteína será dirigida al retículo endoplásmico, pero en última instancia será secuestada en el apoplasto.

De este modo, este gen codifica una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos de extremo N terminal del gen de la fosfatasa ácida del Lupino BlancoLupinus albus(GENBANK®ID GI: 14276838, Milleret a/.,2001,supra)fusionados con el extremo N terminal de la secuencia AXMI, así como con la secuencia KDEL en el extremo C terminal. Por lo tanto, se predice que la proteína resultante será dirigida al retículo endoplásmico de la planta al expresarse en una célula vegetal.

Los casetes de expresión vegetal descritos anteriormente se combinan con un marcador adecuado seleccionable de plantas para ayudar en la selección de células y tejidos transformados, y se ligan en vectores de transformación vegetal. Estos pueden incluir vectores binarios dela transformación mediada por Agrobacterium o vectores plasmídicos simples para la transformación en aerosol o biolística.

Ejemplo 20. Vectorizaciónde genes axmi para expresión en plantas

El ADN de la región de codificación delos genes axmi de la invención está conectadooperativamente con secuencias promotoras y terminadoras adecuadas para la expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en la técnicay pueden incluir el promotor de la actina del arroz o el promotor de la ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas,el promotor de Arabidopsis UBQ3 o el promotor de la expresión de CaMV 35S en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinII. Las técnicas para producir y confirmar construcciones de promotor-gen-terminador también son bien conocidas en la técnica.

Ejemplo 21. Transformación de las células de maíz con los genes de la proteína pesticida descritosen la presente memoria

Las mazorcas de maíz se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y esos embriones de 1,5-0,8 mm de tamaño son preferentes para su uso en la transformación. Los embriones están revestidos con ellado del escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como el medio DN62A5S (3,98 g/L de Sales N6; 1 ml/L (de Madre 1000x) de Vitaminas N6; 800 mg/L de L-Asparagina; 100 mg/L de Myo-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (de 1 mg/ml de Madre) 2,4-D). Sin embargo, medios y sales diferentesa DN62A5S son adecuados y conocidos en la técnica. Los embriones son incubados durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesarioincubar los embriones durante la noche.

Los explantos resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a los medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos y luego se transfieren a una placa de haces (véase, por ejemplo,la Publicación PCT Núm. WO/0138514yla Patente de los Estados Unidos Núm. 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para los genes de la invención en células vegetales se aceleran en tejido vegetal utilizando un acelerador de haces en aerosol, utilizando condiciones esencialmente según lo descrito enla Publicación PCT Núm. WO/0138514. Tras la exposición a los haces, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 minutos en medios osmóticos, y se colocan en medios de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar dañar indebidamente los explantos expuestos a los haces, se incuban durante al menos 24 horas antes de la transferencia a los medios de recuperación. Los embriones se propagan a los medios del período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25°C en la oscuridad, y luego se transfieren a un medio de selección. Los explantos se incuban en medios de selección hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Tras el período de selección, el callo resultante se transfiere a los medios de maduración embrionaria, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan bajo poca luz, y el proceso de regeneración se inicia mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes pueden enraizarse en los medios de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

Medios DN62A5S

El pH de la solución se ajusta a un pH de 5,8 con 1N de KOH/1N de KCl, se añade Gelrite (Sigma) a una concentración de hasta 3 g/L, y el medio se autoclava. Después de enfriar a 50°C, se añaden 2 ml/L de una solución madre de nitrato de plata de 5 mg/ml (Phytotechnology Labs).

Ejemplo 22. Transformación de los genes pesticidas de la invención en células vegetales por transformación mediada por Aerobacterium

Las mazorcas se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y esos embriones de 1,5-0,8 mm de tamaño son preferentes para su uso en la transformación. Los embriones son preparados con el ladodel escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, e incubados durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesarioincubar los embriones durante la noche. Los embriones son contactados conuna cepa de Agrobacterium que contiene los vectores adecuados para la transferencia mediada por el plásmido de Ti durante aproximadamente 5-10 minutos, y luego se laminan sobre medios de cultivo durante aproximadamente 3 días (25°C en la oscuridad). Después del cocultivo, los explantos se transfieren a los medios del período de recuperación durante aproximadamente cinco días (a 25°C en la oscuridad). Los explantos se incuban en medios de selección hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada. Después del período de selección, el callo resultante se transfiere a los medios de maduración embrionaria, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan bajo poca luz, y el proceso de regeneración se inicia como se conoce en la técnica.

Ejemplo 23. Infestación del suelo de plantas que expresan un gen de la invención con el gusano de la raíz del maíz Occidental

Las plantas transgénicas que contienenun gen axmi de la invención bajo el control de un promotor de la planta son probadas para resistencia a la infestación por el gusano de la raíz del maíz Occidental (WCRW). Las plántulas se trasplantan de los medios de cultivo de tejidos a las macetas de raíz de entrenamiento (tipo concha) conocidas en la técnicacomo útiles para el crecimiento de plántulas en el suelo. Las plantas se cultivan durante aproximadamente 2 semanas en un invernadero. Las plantas transgénicas, así como los controles no transformados, están infestados con aproximadamente 1.000 huevos de WCRW. Los huevos de WCRW se preincuban de manera tal que los huevos estén en el punto de eclosión cuando se infestan en las plantas. Las plantas se mantienen durante aproximadamente cuatro semanas, o hasta que los controles exhiban daños evidentes debido a los gusanos de la raíz. En esta etapa, las plantas son sacadas de las macetas, las raíces son lavadas, y el daño evaluado. Varios eventos independientes son examinados para reducir el daño de la infestación de WCRW en relación con plantas de control no transformadas.

Los brotes resultantes pueden enraizarse en medios de enraizamiento, y las plantas resultantes son transferidas a macetas de vivero y propagadas como plantas transgénicas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad pesticida, en la que dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60, o uno de sus complementos;

d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61;

e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961, o uno de sus complementos.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para la expresión en una planta.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha molécula de ácido nucleico está operativamente ligada a un promotor capaz de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una célula vegetal.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3, opcionalmente en el que dicho vector comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

5. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3, o el vector de la reivindicación 4.

6. La célula huésped de la reivindicación 5 que es una célula huésped vegetal o una célula huésped bacteriana.

7. Una planta transgénica, célula vegetal o semilla vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 1, 2 o 3, el vector de la reivindicación 4 o la célula huésped de la reivindicación 6.

8. La planta transgénica de la reivindicación 7, en la que dicha planta es seleccionada del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

9. Un polipéptido aislado con actividad pesticida, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQID NÚM.: 2 o 61;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 2 o 61, en el que dicho polipéptido tiene actividad pesticida;

c) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQID NÚM.:1 o 60;

d) un polipéptido que está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.:1 o 60, en el que dicho polipéptido tiene actividad pesticida; e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961.

10. El polipéptido de la reivindicación 9 que comprende además secuencias de aminoácidos heterólogos.

11. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 10, opcionalmente en la que dicha composición se selecciona del grupo que consiste en un material pulverulento, polvo, microgránulo, gránulo, aerosol, emulsión, coloide, y solución, y opcionalmente en la que dicha composición es preparada por desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas.

12. Un procedimiento de control o exterminio de una población de plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros que comprende el contacto de dicha población con una cantidad efectiva para uso pesticida de un polipéptido de la reivindicación 9.

13. Un procedimiento de producción de un polipéptido con actividad pesticida, que comprende el cultivo de la célula huésped de las reivindicaciones 5 o 6 en condiciones en las que es expresada la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

14. Un procedimiento de protección de una planta de una plaga, que comprende la introducción en dicha planta o célula de al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, en el que dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NÚM.: 1 o 60;

e) la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado como Núm. de Acceso NRRL B-30961.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicha planta produce un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, nematodos o dípteros.