KR20210135637A - 바실루스 투린기엔시스 유래의 ａｘｍｉ４７７, ａｘｍｉ４８２, ａｘｍｉ４８６ 및 ａｘｍｉ５２５ 독소 유전자 및 그의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

살충 활성을 박테리아, 식물, 식물 세포, 조직 및 종자에 부여하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 독소 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 조성물이 제공된다. 코딩 서열은 식물 및 박테리아에서 형질전환 및 발현을 위한 DNA 구성물(contruct) 또는 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 조성물은 또한 형질전환된 박테리아, 식물, 식물 세포, 조직 및 종자를 포함한다. 특히, 단리된 독소 핵산 분자가 제공된다. 부가적으로, 본 폴리뉴클레오티드에 상응하는 아미노산 서열, 및 이러한 아미노산 서열에 특이적으로 결합되는 항체가 포함된다. 특히, 본 발명은 서열 번호 5 내지 26으로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 1 내지 4에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자와, 이의 변이체 및 단편을 제공한다.

Description

바실루스 투린기엔시스 유래의 ＡＸＭＩ４７７, ＡＸＭＩ４８２, ＡＸＭＩ４８６ 및 ＡＸＭＩ５２５ 독소 유전자 및 그의 사용 방법{AXMI477, AXMI482, AXMI486 AND AXMI525 TOXIN GENES FROM BACILLUS THURINGIENSIS AND METHODS FOR THEIR USE}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 2013년 12월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/913,905호 및 2013년 12월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/913,911호의 이득을 청구하며, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

전자 파일로 제출된 서열 목록에 대한 언급

서열 목록의 공식 사본은 2014년 11월 14일자로 생성되고 크기가 97 킬로바이트인, 파일명이 "APA136054_ST25.txt"인 ASCII 포맷 서열로서 EFS-Web를 통하여 전자 파일로 제출되며, 본 명세서와 동시에 출원된다. 이러한 ASCII 포맷 서류에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 살충 단백질을 코딩하는 신규한 유전자가 제공된다. 이러한 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 살충 제형의 제조 및 트랜스제닉(transgenic) 해충-저항성 식물의 생성에 유용하다.

바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)는 특정한 목 및 종의 곤충에 대하여 특이적으로 독성을 갖지만 식물 및 다른 비-표적화 유기체에는 무해한 결정성 봉입체를 생성하는 그의 능력을 특징으로 하는 그람-양성(Gram-positive) 포자 형성 토양 박테리아이다. 이러한 이유 때문에, 바실루스 투린기엔시스 주 또는 이의 살곤충 단백질을 포함하는 조성물은 농업적 곤충 해충을 방제하기 위한 환경적으로 허용가능한 살곤충제 또는 다양한 인간 또는 동물 질환을 위한 곤충 벡터로서 사용될 수 있다.

바실루스 투린기엔시스 유래의 결정성(Cry) 단백질 (델타-내독소)은 주로 인시류(Lepidopteran), 반시류(Hemipteran), 쌍시류(Dipteran), 및 초시류(Coleopteran) 유충에 대하여 강한 살곤충 활성을 갖는다. 이러한 단백질은 또한 막시목(Hymenoptera order), 동시아목(Homoptera order), 이목(Phthiraptera order), 식모목(Mallophaga order), 및 응애목(Acari order) 해충과, 기타 무척추 동물 목, 예컨대 선형동물문(Nemathelminthes), 편형동물문(Platyhelminthes), 및 육질편모충문(Sarcomastigorphora)에 대하여 활성을 나타냈다 (문헌[Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.]). 원래 이러한 단백질은 일차적으로 그의 살곤충 활성을 기반으로 하여 CryI 내지 CryV로 분류되었다. 주요 클래스로는 인시목(Lepidoptera)-특이적 (I), 인시목- 및 쌍시목(Diptera)-특이적 (II), 초시목(Coleoptera)-특이적 (III), 쌍시목-특이적 (IV) 및 선충-특이적 (V) 및 (VI)가 있었다. 상기 단백질은 서브패밀리(subfamily)로 추가로 분류되었으며, 각각의 패밀리 내의 더 고도로 관련된 단백질에는 Cry1A, Cry1B, Cry1C 등과 같은 구분적인 문자가 할당되었다. 각각의 구분 내에서의 더욱 더 가깝게 관련된 단백질에는 Cry1C1, Cry1C2 등과 같은 명칭이 주어졌다.

곤충 표적 특이성이라기보다는 오히려 아미노산 서열 상동성을 기반으로 하여 Cry 유전자에 대한 명명법이 기술되었다 (문헌[Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813]). 이러한 분류에서, 각각의 독소에게는 일차 신분(rank) (아라비아 숫자), 이차 신분 (대문자), 삼차 신분 (소문자), 및 사차 신분 (또 다른 아라비아 숫자)을 포함하는 독특한 명칭이 할당된다. 로마 숫자가 일차 신분에서의 아라비아 숫자와 교환되었다. 서열 동일성이 45% 미만인 단백질들은 상이한 일차 신분을 가지며, 이차 및 삼차 신분의 기준은 각각 78% 및 95%이다.

상기 결정성 단백질은 이것이 곤충 중장에서 섭취되고 가용화될 때까지는 살곤충 활성을 나타내지 않는다. 섭취된 전독소(protoxin)는 곤충 소화관에서 프로테아제에 의해 활성 독성 분자로 가수분해된다. (문헌[

and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255]). 이 독소는 표적 유충의 중장에서 첨부 솔 변연(apical brush border) 수용체에 결합하며 첨부 막 내로 삽입되어 이온 채널 또는 기공을 생성하며, 이는 유충 죽음을 야기한다.

일반적으로 델타-내독소는 5개의 보존된 서열 도메인 및 3개의 보존된 구조 도메인을 갖는다 (예를 들어, 문헌[de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199] 참조). 첫 번째의 보존된 구조 도메인은 7개의 알파 나선으로 이루어지며 막 삽입 및 기공 형성에 연루되어 있다. 도메인 II는 그릭 키 배열(Greek key configuration)로 배열된 3개의 베타-시트로 이루어지며, 도메인 III은 "젤리-롤(jelly-roll)" 대형의 2개의 역평행 베타-시트로 이루어진다 (상기 문헌[de Maagd et al., 2001]). 도메인 II 및 III은 수용체 인식 및 결합에 연루되어 있으며, 따라서 독소 특이성의 결정자로 간주된다.

곤충이 부여할 수 있는 황폐화 때문에, 그리고 곤충 해충의 방제에 의한 수율의 개선 때문에, 새로운 형태의 살충 독소를 발견할 필요성이 계속적으로 있다.

살충 활성을 박테리아, 식물, 식물 세포, 조직 및 종자에 부여하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물은 살충 및 살곤충 폴리펩티드의 서열을 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 이 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 또한 조성물은 살충 폴리펩티드 서열 및 이 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 본 뉴클레오티드 서열은 미생물 및 식물을 포함하는 유기체에서 형질전환 및 발현을 위한 DNA 구성물(contruct) 또는 발현 카세트에서 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 미생물 또는 식물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유기체에서의 발현을 위하여 설계된 합성 서열일 수 있다. 조성물은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 박테리아, 식물, 식물 세포, 조직 및 종자를 또한 포함한다.

특히, 살충 단백질을 코딩하는 단리 또는 재조합 핵산 분자가 제공된다. 부가적으로, 살충 단백질에 상응하는 아미노산 서열이 포함된다. 특히, 본 발명은 서열 번호 5 내지 26으로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 서열 번호 1 내지 4에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 또는 재조합 핵산 분자와, 이의 생물학적 활성 변이체 및 단편을 제공한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 또는 본 발명의 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보체가 또한 포함된다. 추가로 제공되는 것은 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 또는 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 이의 생물학적 활성 변이체 및 단편을 포함하는 벡터, 숙주 세포, 식물 및 종자이다.

본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 그리고 인시류, 반시류, 초시류, 선충 또는 쌍시류 해충을 방제하거나 사멸시키기 위한 폴리펩티드를 사용하는 방법이 제공된다. 샘플에서 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법 및 키트가 또한 포함된다.

본 발명의 조성물 및 방법은 해충 저항성 또는 내성이 향상된 유기체의 생성에 유용하다. 이러한 유기체 및 이 유기체를 포함하는 조성물이 농업적 목적에 바람직하다. 또한 본 발명의 조성물은 살충 활성을 갖는 변경된 또는 개선된 단백질의 생성, 또는 생성물 또는 유기체에서의 살충 단백질 또는 핵산의 존재의 검출에 유용하다.

구체적으로, 본 발명은 하기를 포함한다.

[1] 살충 활성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자:

a) 서열 번호 1 내지 4에 개시된 뉴클레오티드 서열;

b) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;

c) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.

[2] [1]에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 식물에서의 발현용으로 설계된 합성 서열인 재조합 핵산 분자.

[3] [1]에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 식물 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자.

[4] [1]의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터.

[5] [4]에 있어서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 벡터.

[6] [1]의 재조합 핵산을 함유하는 숙주 세포.

[7] [6]에 있어서, 박테리아 숙주 세포인 숙주 세포.

[8] [6]에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.

[9] [8]의 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 식물.

[10] [9]에 있어서, 옥수수, 수수, 밀, 양배추, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물(crucifer), 페퍼(pepper), 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 및 유채로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 식물.

[11] [1]의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자.

[12] 살충 활성을 갖고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 폴리펩티드:

a) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

b) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.

[13] [12]에 있어서, 이종 아미노산 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드.

[14] [12]의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.

[15] [14]에 있어서, 산제, 분제, 펠렛, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드 및 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.

[16] [14]에 있어서, 박테리아 세포의 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 농축에 의해 제조된 조성물.

[17] [14]에 있어서, 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물.

[18] 인시류, 반시류, 초시류, 선충 또는 쌍시류 해충 집단을 [12]의 폴리펩티드의 살충적 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인시류, 반시류, 초시류, 선충 또는 쌍시류 해충 집단을 방제하는 방법.

[19] 인시류, 반시류, 초시류, 선충 또는 쌍시류 해충을 [12]의 폴리펩티드의 살충적 유효량과 접촉시키거나 상기 해충에게 [12]의 폴리펩티드의 살충적 유효량을 급이하는 단계를 포함하는, 인시류, 반시류, 초시류, 선충 또는 쌍시류 해충을 사멸시키는 방법.

[20] [6]의 숙주 세포를 살충 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 살충 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법.

[21] 살충 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구성물(contruct)이 게놈 내에 안정하게 포함된 식물 또는 식물 세포:

a) 서열 번호 1 내지 4에 개시된 뉴클레오티드 서열;

b) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및

c) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.

[22] 살충 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 식물 또는 이의 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 식물을 해충으로부터 보호하는 방법:

a) 서열 번호 1 내지 4에 개시된 뉴클레오티드 서열;

b) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및

c) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.

[23] [22]에 있어서, 상기 식물은 인시류, 반시류, 초시류, 선충 또는 쌍시류 해충에 대하여 살충 활성을 갖는 살충 폴리펩티드를 생성하는 방법.

[24] 살충 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구성물이 게놈 내로 안정하게 포함된 식물 또는 이의 종자를 들판에서 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 들판은 상기 폴리펩티드가 살충 활성을 갖는 해충으로 만연된, 식물의 수율을 증가시키는 방법:

a) 서열 번호 1 내지 4에 개시된 뉴클레오티드 서열;

b) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및

c) 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.

본 발명은 유기체, 특히 식물 또는 식물 세포에서 해충 저항성 또는 내성을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. "저항성"은 해충 (예를 들어, 곤충)이 본 발명의 폴리펩티드의 섭취시에 또는 본 발명의 폴리펩티드와의 기타 접촉시에 사멸됨을 의도한다. "내성"은 해충의 이동, 급이, 생식 또는 기타 기능의 손상 또는 감소를 의도한다. 본 방법은 본 발명의 살충 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 유기체를 형질전환시키는 것을 수반한다. 특히, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 살충 활성을 보유하는 식물 및 미생물의 제조에 유용하다. 따라서, 형질전환된 박테리아, 식물, 식물 세포, 식물 조직 및 종자가 제공된다. 조성물은 바실루스 또는 기타 종의 살충 핵산 및 단백질이다. 그 서열은 관심 대상의 유기체를 후속적으로 형질전환시키기 위한 발현 벡터의 구성에서, 다른 상동 (또는 부분 상동) 유전자의 단리를 위한 그리고 본 기술 분야에 공지된 방법에 의한 변경된 살충 단백질의 생성, 예컨대 예를 들어 Cry1, Cry2, 및 Cry9 패밀리의 내독소의 구성원에서의 도메인 스와핑(swapping) 또는 DNA 셔플링(shuffling)을 위한 프로브로서 그 용도가 찾아진다. 본 단백질은 인시류, 반시류, 초시류, 쌍시류, 및 선충 해충 집단의 방제 또는 사멸에서 그리고 살충 활성을 갖는 조성물의 생성에 있어서 그 용도가 찾아진다.

"살충 독소" 또는 "살충 단백질"은 인시목, 쌍시목, 반시목(Hemiptera order) 및 초시목, 또는 선형 동물문(Nematoda phylum)의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 1가지 이상의 해충에 대하여 독성 활성을 갖는 독소, 또는 그러한 단백질에 대하여 상동성을 갖는 단백질을 의도한다. 살충 단백질은 예를 들어 바실루스 sp., 클로스트리듐 비페르멘탄스(Clostridium bifermentans) 및 파에니바실루스 포필리아에(Paenibacillus popilliae)를 포함하는 유기체로부터 단리되었다. 살충 단백질은 본원에 개시된 전장 뉴클레오티드 서열로부터 추정된 아미노산 서열, 및 다른 하류 개시 부위의 사용으로 인한 또는 살충 활성을 갖는 더 짧은 단백질을 생성하는 프로세싱(processing)으로 인한, 전장 서열보다 더 짧은 아미노산 서열을 포함한다. 프로세싱은 상기 단백질이 발현되는 유기체에서 또는 상기 단백질의 섭취 후 해충에서 일어날 수 있다.

따라서, 살충 활성을 부여하는 신규한 단리 또는 재조합 뉴클레오티드 서열이 본원에서 제공된다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 공지된 델타-내독소 또는 이원(binary) 독소에 대하여 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 살충 단백질의 아미노산 서열이 또한 제공된다. 이러한 유전자의 번역에서 생긴 단백질은 이를 섭취하는 해충을 세포가 방제하게 하거나 사멸시키게 한다.

단리된 핵산 분자 및 이의 변이체 및 단편

본 발명의 일 측면은 살충 단백질 및 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 또는 재조합 핵산 분자와, 서열 상동성 영역을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 확인하기 위한 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서 다른 곳에 정의된 엄격한 조건 하에 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열이 또한 본원에 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 (예를 들어, 재조합 DNA, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, mRAN)와, 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하도록 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.

본원에서 "단리" 또는 "재조합" 핵산 서열 (또는 DNA)은 더 이상 그의 자연적인 환경에 있지 않은, 예를 들어, 시험관 내 상태로 있거나 재조합 박테리아 또는 식물 숙주 세포 내에 있는 핵산 서열 (또는 DNA)을 나타내기 위하여 사용된다. 일부 실시 양태에서, 단리 또는 재조합 핵산에는 이 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 천연적으로 이 핵산의 측면에 있는 서열(즉, 이 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열) (바람직하게는 단백질 코딩 서열)이 없다. 본 발명의 목적상, 핵산 분자를 나타내기 위하여 사용될 경우 "단리된"은 단리된 염색체를 배제한다. 예를 들어, 다양한 실시 양태에서, 단리된 델타-내독소 코딩 핵산 분자는 이 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA에서 천연적으로 이 핵산 분자의 측면에 있는 약 5 kb 미만, 4 kb 미만, 3 kb 미만, 2 kb 미만, 1 kb 미만, 0.5 kb 미만, 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시 양태에서, 세포 물질이 실질적으로 없는 델타-내독소 단백질은 약 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만 (건조 중량 기준)의 비-델타-내독소 단백질 (본원에서 "오염 단백질"로도 칭해짐)을 갖는 단백질 제제를 포함한다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 내지 4에 나타낸 서열, 및 이의 변이체, 단편 및 상보체를 포함한다. "상보체"는 이것이 주어진 뉴클레오티드 서열에 혼성화됨으로써 안정한 이중 가닥을 형성할 수 있도록 상기 주어진 뉴클레오티드 서열에 대하여 충분히 상보성인 뉴클레오티드 서열을 의도한다. 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 살충 단백질의 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 5 내지 26에 개시되어 있다.

살충 단백질을 코딩하는 이러한 뉴클레오티드 서열의 단편인 핵산 분자가 또한 본 발명에 포함된다. "단편"은 살충 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부분을 의도한다. 뉴클레오티드 서열의 단편은 살충 단백질의 생물학적 활성 부분을 코딩할 수 있거나, 이것은 하기에 개시된 방법을 이용하여 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있는 단편일 수 있다. 살충 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 단편인 핵산 분자는 의도되는 용도에 따라 약 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 500개 이상, 600개 이상, 700개 이상, 800개 이상, 900개 이상, 1000개 이상, 1100개 이상, 1200개 이상, 1300개 이상, 1350개 이상, 1400개 이상의 연접 뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 살충 단백질을 코딩하는 전장 뉴클레오티드 서열에 존재하는 뉴클레오티드의 수 이하의 것을 포함한다. "연접" 뉴클레오티드는 서로에게 바로 인접한 의도된 뉴클레오티드 잔기이다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 단편은 살충 단백질의 생물학적 활성을 유지하며 따라서 살충 활성을 유지하는 단백질 단편을 코딩한다. 따라서, 본원에 개시된 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편이 또한 포함된다. "활성을 유지하다"라는 것은 그 단편이 살충 단백질의 살충 활성의 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95% 또는 이보다 더 높은 활성을 가짐을 의도한다. 일 실시 양태에서, 살충 활성은 살초시류(coleoptericidal) 활성이다. 또 다른 실시 양태에서, 살충 활성은 살인시류(lepidoptericidal) 활성이다. 또 다른 실시 양태에서, 살충 활성은 살선충 활성이다. 또 다른 실시 양태에서, 살충 활성은 살쌍시류(diptericidal) 활성이다. 또 다른 실시 양태에서, 살충 활성은 살반시류 활성이다. 살충 활성의 측정 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485]; 문헌[Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206]; 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293]; 및 미국 특허 제5,743,477호를 참조하며, 이들 전부는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

본 발명의 단백질의 생물학적 활성 부분을 코딩하는, 살충 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 단편은 약 15개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 500개 이상, 550개 이상, 600개 이상, 650개 이상, 700개 이상, 750개 이상, 800개 이상, 850개 이상, 900개 이상, 950개 이상, 1000개 이상, 1050개 이상의 연접 아미노산, 또는 본 발명의 전장 살충 단백질에 존재하는 아미노산의 총 수 이하의 것을 코딩한다. 일부 실시 양태에서, 단편은 단백질 분해 절단 단편이다. 예를 들어, 단백질 분해 절단 단편은 서열 번호 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7과 관련하여 적어도 약 30개의 아미노산, 적어도 약 40개의 아미노산, 적어도 약 50개의 아미노산, 적어도 약 100개의 아미노산, 약 120개, 약 130개, 약 140개, 약 150개, 약 160개, 약 170개, 약 180개, 약 190개, 약 200개, 약 210개, 약 220개, 약 230개, 약 240개, 약 250개, 약 275개, 약 300개, 약 350개, 약 400개, 약 450개, 약 500개, 또는 약 550개의 아미노산의 N-말단 또는 C-말단 절단을 가질 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본원에 포함되는 단편은 예를 들어 단백질 분해에 의해, 또는 코딩 서열 내에 종결 코돈을 삽입함에 의한 C-말단 결정화 도메인의 제거에서 생긴다. 일부 실시 양태에서, 본원에 포함된 단편은 N-말단 시그널(signal) 펩티드의 제거에서 생긴다. N-말단 절단은 N-말단의 메티오닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 살충 단백질은 서열 번호 1 내지 4의 뉴클레오티드 서열과 충분히 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나, 살충 단백질은 서열 번호 5 내지 26에 개시된 아미노산 서열과 충분히 동일하다. "충분히 동일한"은 표준 파라미터를 이용하여 본원에 기술된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 기준 서열과 비교할 경우 적어도 약 60% 또는 65%의 서열 동일성, 약 70% 또는 75%의 서열 동일성, 약 80% 또는 85%의 서열 동일성, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이보다 더 큰 서열 동일성을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 의도한다. 당업자라면 이러한 값이 코돈 축퇴성(codon degeneracy), 아미노산 유사성, 리딩 프레임(reading frame) 위치화 등을 고려함으로써 두 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 결정하도록 적절하게 조정될 수 있음을 인식할 것이다.

두 아미노산 서열의 또는 두 핵산의 동일성 퍼센트를 결정하기 위하여, 서열들은 최적 비교 목적으로 정렬된다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 상기 서열들에 의해 공유되는 동일 위치의 수(즉, 동일성 퍼센트 = 동일 위치의 수/위치의 총 수 (예를 들어, 중첩 위치) x 100)의 함수이다. 일 실시 양태에서, 두 서열은 동일한 길이이다. 또 다른 실시 양태에서, 동일성 퍼센트는 기준 서열(즉, 서열 번호 1 내지 26 중 임의의 것으로 본원에 개시된 서열) 전체에 걸쳐 계산된다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 갭을 허용하거나 허용하지 않고서 하기에 기술된 것과 유사한 기법을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 퍼센트의 계산에 있어서, 전형적으로 정확한 매치(match)가 카운팅된다(counted). 갭, 즉, 잔기가 하나의 서열에는 존재하지만 다른 하나에는 존재하지 않는 정렬 내의 위치는 동일하지 않은 잔기를 갖는 위치로 간주된다.

두 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 성취될 수 있다. 두 서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 비제한적 예로는 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264]의 알고리즘이 있다. 그러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403]의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램 내로 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본 발명의 살충제-유사 핵산 분자에 대하여 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여 BLASTN 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12를 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 살충 단백질 분자에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위하여 BLASTX 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3을 이용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 형성된(gapped) 정렬을 얻기 위하여, 갭트(Gapped) BLAST (BLAST 2.0 내)가 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 이용하여 분자들 사이의 특유한 관계를 탐지하는 반복된 검색을 수행할 수 있다. 상기 문헌[Altschul et al. (1997)]을 참조한다. BLAST, 갭트 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트(default) 파라미터가 이용될 수 있다. 정렬은 또한 검증에 의해 수동으로 수행될 수 있다.

서열들의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비제한적인 예로는 ClustalW 알고리즘이 있다 (문헌[Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680]). ClustalW는 서열들을 비교하여 아미노산 또는 DNA 서열 전체를 정렬하며, 따라서 전체 아미노산 서열의 서열 보존에 관한 데이터를 제공할 수 있다. ClustalW 알고리즘은 벡터 NTI 프로그램 스위트(Vector NTI Program Suite) (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))의 ALIGNX 모듈과 같은 몇몇 구매가능한 DNA/아미노산 분석 소프트웨어 패키지에서 사용된다. ClustalW를 이용한 아미노산 서열들의 정렬 후, 아미노산 동일성 퍼센트가 평가될 수 있다. ClustalW 정렬의 분석에 유용한 소프트웨어 프로그램의 비제한적 예로는 진독(GENEDOC)™이 있다. 진독™ (칼 니콜라스(Karl Nicholas))은 다수의 단백질간의 아미노산 (또는 DNA) 유사성 및 동일성의 평가를 허용한다. 서열들의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 비제한적 예로는 문헌[Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이 있다. 그러한 알고리즘은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내에 포함되는데, 이는 지시지 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(GCG Wisconsin Genetics Software Package), 버전 10 (미국 캘리포니아주 샌디에고 스크란턴 로드 9685 소재의 악셀리스, 인크.(Accelrys, Inc.,)로부터 입수가능함)의 일부이다. 아미노산 서열들의 비교를 위하여 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 이용될 수 있다.

달리 진술되지 않으면, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453]의 알고리즘을 이용하는 GAP 버전 10이 하기 파라미터를 이용한 서열 동일성 또는 유사성의 결정에 이용될 것이다: 50의 갭 가중치 및 3의 길이 가중치와, nwsgapdna.cmp 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 사용한 뉴클레오티드 서열의 동일성 % 및 유사성 %; 8의 갭 가중치 및 2의 길이 가중치와, BLOSUM62 스코어링 프로그램을 사용한 아미노산 서열의 동일성 % 또는 유사성 %. 등가의 프로그램이 또한 이용될 수 있다. "등가의 프로그램"은 당해의 임의의 두 서열에 있어서 GAP 버전 10에 의해 생성되는 상응하는 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오티드 잔기 매치 및 동일한 서열 동일성 퍼센트를 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 의도한다.

또한 본 발명은 변이형 핵산 분자를 포함한다. 살충 단백질 코딩 뉴클레오티드 서열의 "변이체"는 본원에 개시된 살충 단백질을 코딩하지만 유전 암호의 축퇴성 때문에 보존성이 상이한 서열과, 상기에 논의된 충분히 동일한 것을 포함한다. 천연 발생 대립유전자 변이체는 하기에 약술된 바와 같이 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 및 혼성화 기법과 같은 잘 알려진 분자 생물학 기법을 이용하여 확인될 수 있다. 변이형 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 사용하여 생성된, 그러나 본 발명에 개시된 살충 단백질을 여전히 코딩하는 합성 유도된 뉴클레오티드 서열을 또한 포함하는데, 이는 하기에 논의된 바와 같다. 본 발명에 포함되는 변이형 단백질은 생물학적 활성을 가지며, 즉, 이는 천연 단백질의 요망되는 생물학적 활성, 즉, 살충 활성을 계속하여 보유한다. "활성을 유지하다"라는 것은 변이체가 천연 단백질의 살충 활성의 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%를 가짐을 의도한다. 살충 활성의 측정 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485]; 문헌[Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206]; 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293]; 및 미국 특허 제5,743,477호를 참조하는데, 이들 전부는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

추가로 당업자라면 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 변화가 도입되어서 코딩된 살충 단백질의 아미노산 서열을 이 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않고서 변화시킬 수 있음을 알 것이다. 따라서, 변이형 단리 핵산 분자는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 코딩된 단백질 내로 도입되도록 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 본원에 개시된 상응하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다. 그러한 변이형 뉴클레오티드 서열이 또한 본 발명에 포함된다.

예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경시키지 않고서 살충 단백질의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이며, 반면에 "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 요구된다. "보존적 아미노산 치환"은 그 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 본 기술 분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.

일반적으로 델타-내독소는 5개의 보존된 서열 도메인 및 3개의 보존된 구조 도메인을 갖는다 (예를 들어, 문헌[de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199] 참조). 첫 번째의 보존된 구조 도메인은 7개의 알파 나선으로 이루어지며 막 삽입 및 기공 형성에 연루되어 있다. 도메인 II는 그릭 키 배열로 배열된 3개의 베타-시트로 이루어지며, 도메인 III은 "젤리-롤" 대형의 2개의 역평행 베타-시트로 이루어진다 (상기 문헌[de Maagd et al., 2001]). 도메인 II 및 III은 수용체 인식 및 결합에 연루되어 있으며, 따라서 독소 특이성의 결정자로 간주된다.

아미노산 치환은 기능을 유지하는 비보존된 영역에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 그러한 치환은 보존된 아미노산 잔기, 또는 보존된 모티프 내에 있는 아미노산 잔기 (여기서, 그러한 잔기는 단백질 활성에 필수적임)에 대해서는 이루어지지 않는다. 보존된 그리고 단백질 활성에 필수적일 수 있는 잔기의 예는 예를 들어 본 발명의 서열에 대한 유사하거나 관련된 독소의 정렬에 포함되는 모든 단백질간에 동일한 잔기 (예를 들어, 상동 단백질의 정렬에서 동일한 잔기)를 포함한다. 보존된 그러나 보존적 아미노산 치환을 허용하고 활성을 여전히 유지할 수 있는 잔기의 예는 예를 들어 본 발명의 서열에 대한 유사하거나 관련된 독소의 정렬에 포함된 모든 단백질간에 단지 보존적 치환을 갖는 잔기 (예를 들어, 상동 단백질 정렬에 포함된 모든 단백질간에 단지 보존적 치환을 갖는 잔기)를 포함한다. 그러나, 당업자라면, 기능성 변이체가 보존된 잔기에 있어서 소수의 보존된 또는 비보존된 변경을 가질 수 있음을 이해할 것이다.

대안적으로, 변이형 뉴클레오티드 서열은 포화 돌연변이 유발에 의한 것과 같이, 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라서 랜덤하게 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있으며, 생성된 돌연변이체는 활성을 유지하는 돌연변이체를 확인하기 위하여 살충 활성을 부여하는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 유발 후, 코딩된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있으며, 단백질의 활성은 표준 분석 기법을 이용하여 결정될 수 있다. PCR, 혼성화 등과 같은 방법을 이용하여, 본 발명의 서열에 대하여 상당한 동일성을 갖는 서열과 같은 상응하는 살충 서열이 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)]을 참조한다.

혼성화 방법에서, 살충 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 이용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리(library)를 스크리닝할 수 있다. 그러한 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구성 방법은 일반적으로 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001]에 개시되어 있다. 소위 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편, 또는 기타 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 검출가능한 기, 예컨대 ³²P, 또는 임의의 다른 검출가능한 마커, 예컨대 다른 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조 인자로 표지될 수 있다. 혼성화를 위한 프로브는 본원에 개시된 공지된 살충 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 기반으로 한 합성 올리고뉴클레오티드의 표지에 의해 만들어질 수 있다. 뉴클레오티드 서열 또는 코딩된 아미노산 서열 중의 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 기반으로 하여 설계된 축퇴성 프라이머가 부가적으로 사용될 수 있다. 전형적으로 프로브는 엄격한 조건 하에, 본 발명의 살충 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체의 적어도 약 12개, 적어도 약 25개, 적어도 약 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 또는 200개의 연속 뉴클레오티드에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함한다. 혼성화를 위한 프로브의 제조 방법은 일반적으로 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 본원에 참고로 포함된 상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001]에 개시되어 있다.

예를 들어, 본원에 개시된 전체 살충 서열, 또는 이의 하나 이상의 부분이 상응하는 살충 단백질-유사 서열 및 메신저(messenger) RNA에 특이적으로 혼성화될 수 있는 프로브로서 사용될 수 있다. 다양한 조건 하에서의 특이적 혼성화의 달성을 위하여, 그러한 프로브는 독특한 그리고 바람직하게는 길이가 약 10개 이상의 뉴클레오티드이거나 길이가 약 20개 이상의 뉴클레오티드인 서열을 포함한다. 그러한 프로브는 PCR에 의해 선택된 유기체로부터의 상응하는 살충 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 기법은 요망되는 유기체로부터 추가의 코딩 서열을 단리하는 데 사용되거나 유기체에서 코딩 서열의 존재를 결정하기 위한 진단 분석법으로서 사용될 수 있다. 혼성화 기법은 도말된 DNA 라이브러리 (플라크(plaque) 또는 콜로니 중 어느 하나)의 혼성화 스크리닝을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)] 참조).

따라서, 본 발명은 혼성화를 위한 프로브와, 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부분에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 적어도 약 300개의 뉴클레오티드, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 1000개, 1200개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개의, 또는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 전장 이하의 것)을 포함한다. 그러한 서열들의 혼성화는 엄격한 조건 하에 실시될 수 있다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 그의 표적 서열에, 다른 서열에 혼성화되는 것보다 검출가능하게 더 큰 정도로 (예를 들어, 배경에 비하여 2배 이상) 혼성화되는 조건을 의도한다. 엄격한 조건은 서열-의존성이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다.혼성화의 엄격도 및/또는 세척 조건을 제어함으로써, 프로브에 대하여 100% 상보성인 표적 서열이 확인될 수 있다 (상동 프로빙). 대안적으로, 엄격성 조건은 더 낮은 정도의 유사성이 탐지되도록 서열들의 약간의 미스매칭(mismatching)을 허용하도록 조정될 수 있다 (이종 프로빙). 일반적으로, 프로브는 길이가 약 100개 미만의 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 500개 미만의 뉴클레오티드이다.

전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 Na 이온 농도 (또는 기타 염)이며, 온도는 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)의 경우 약 30℃, 그리고 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)의 경우 약 60℃ 이상이다. 또한 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 불안정화제(destabilizing agent)의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 저 엄격성 조건은 37℃에서 30 내지 35%의 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS(소듐 도데실 술페이트)의 완충액을 이용한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)에서의 세척을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격성 조건은 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화 및 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC에서의 세척을 포함한다. 예시적인 고 엄격성 조건은 37℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화 및 60 내지 65℃에서 0.1X SSC에서의 세척을 포함한다. 임의로, 세척 완충제는 약 0.1% 내지 약 1%의 SDS를 포함할 수 있다. 일반적으로, 혼성화의 지속 시간은 약 24시간 미만, 일반적으로 약 4 내지 약 12시간이다.

전형적으로 특이성은 혼성화 후 세척의 함수이며, 결정적인 인자는 최종 세척액의 이온 강도 및 온도이다. DNA-DNA 혼성체에 있어서, T_m은 문헌[Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284]의 방정식: T_m = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L (여기서, M은 1가 양이온의 몰농도이며, %GC는 DNA 중 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이며, % form은 혼성화 용액 중 포름아미드의 백분율이며, L은 염기쌍 중 혼성체의 길이임)으로부터 근사치를 구할 수 있다. T_m은 (정의된 이온 강도 및 pH 하에서) 상보성 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화되는 온도이다. T_m은 각각 1%의 미스매칭에 대하여 약 1℃만큼 감소되며; 따라서, T_m, 혼성화, 및/또는 세척 조건은 요망되는 동일성의 서열에 혼성화되도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 90% 이상의 동일성을 갖는 서열들이 탐색될 경우, T_m은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 상보체에 있어서 열용융점(thermal melting point; T_m)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 심하게 엄격한 조건은 열용융점(T_m)보다 1, 2, 3, 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 중간 정도로 엄격한 조건은 열용융점(T_m)보다 6, 7, 8, 9, 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 저 엄격성 조건은 열용융점(T_m)보다 11, 12, 13, 14, 15, 또는 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 당업자라면, 상기 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 요망되는 T_m을 이용하면 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도의 변이가 내재적으로 설명됨을 이해할 것이다. 요망되는 미스매칭 정도가 45℃ 미만 (수성 용액) 또는 32℃ 미만 (포름아미드 용액)의 T_m을 생성할 경우, 더 높은 온도가 이용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침이 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology―Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)]; 및 문헌[Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]에서 발견된다. 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., ColdSpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)을 참조한다.

단리된 단백질 및 이의 변이체 및 단편

살충 단백질이 본 발명 내에 또한 포함된다. "살충 단백질"은 서열 번호 5 내지 26에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의도한다. 이의 단편, 생물학적 활성 부분 및 변이체가 또한 제공되며, 이는 본 발명의 방법의 실행에 이용될 수 있다. "단리된 단백질" 또는 "재조합 단백질"은 그의 자연적인 환경에서는 더 이상 존재하지 않는 단백질, 예를 들어, 시험관 내 또는 재조합 박테리아 또는 식물 숙주 세포 내에 있는 단백질을 나타내기 위하여 사용된다.

"단편" 또는 "생물학적 활성 부분"은 살충 활성을 나타내는 그리고 서열 번호 5 내지 26에 개시된 아미노산 서열과 충분히 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 살충 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어 길이가 10개, 25개, 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1050개, 1100개, 1150개, 1200개, 1250개, 1300개, 1350개인, 또는 이보다 더 많은 아미노산인 폴리펩티드일 수 있다. 그러한 생물학적 활성 부분은 재조합 기법에 의해 제조될 수 있고 살충 활성에 대하여 평가될 수 있다. 살충 활성의 측정 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485]; 문헌[Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206]; 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293]; 및 미국 특허 제5,743,477호를 참조하는데, 이들 전부는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 여기에서 사용되는 바와 같이, 단편은 서열 번호 5 내지 26의 8개 이상의 연접 아미노산을 포함한다. 그러나 본 발명은 기타 단편, 예컨대 길이가 약 10개 초과, 20개 초과, 30개 초과, 50개 초과, 100개 초과, 150개 초과, 200개 초과, 250개 초과, 300개 초과, 350개 초과, 400개 초과, 450개 초과, 500개 초과, 550개 초과, 600개 초과, 650개 초과, 700개 초과, 750개 초과, 800개 초과, 850개 초과, 900개 초과, 950개 초과, 1000개 초과, 1050개 초과, 1100개 초과, 1150개 초과, 1200개 초과, 1250개 초과, 1300개 초과, 1350개 초과의 또는 이보다 더 많은 아미노산의 단백질 내의 임의의 단편을 포함한다.

"변이체"는 서열 번호 5 내지 26 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 65%, 약 70%, 75%, 약 80%, 85%, 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 의도한다. 또한 변이체는 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1 내지 4의 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자 또는 이의 상보체에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 돌연변이 유발로 인하여 아미노산 서열이 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에 포함되는 변이형 단백질은 생물학적 활성을 가지며, 즉, 이는 천연 단백질의 요망되는 생물학적 활성을 계속하여 보유하며, 즉, 살충 활성을 유지한다. 일부 실시 양태에서, 변이체는 천연 단백질에 비하여 개선된 활성을 갖는다. 살충 활성의 측정 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485]; 문헌[Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206]; 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293]; 및 미국 특허 제5,743,477호를 참조하는데, 이들 전부는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

본 발명의 axmi 유전자와 같은 박테리아 유전자는 꽤 종종 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 개시부에 근접한 다수의 메티오닌 개시 코돈을 보유한다. 종종, 이러한 개시 코돈 중 하나 이상에서의 번역 개시는 기능성 단백질의 생성을 초래한다. 이러한 개시 코돈은 ATG 코돈을 포함할 수 있다. 그러나, 바실루스 sp.와 같은 박테리아는 또한 코돈 GTG를 개시 코돈으로서 인식하며, GTG 코돈에서 번역을 개시하는 단백질은 제1 아미노산에서 메티오닌을 함유한다. 드물게는, 박테리아 시스템에서의 번역은 TTG 코돈에서 개시될 수 있지만, 이러한 이벤트(event)에서 TTG는 메티오닌을 코딩한다. 더욱이, 이러한 코돈 중 어떤 것이 박테리아에서 천연적으로 사용되는지는 종종 선험적으로 결정되지 않는다. 따라서, 다른 메티오닌 코돈들 중 하나의 사용이 살충 단백질의 생성을 또한 초래할 수 있음이 이해된다. 이러한 살충 단백질은 본 발명에 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 식물에서 발현될 때 적당한 번역을 위하여 다른 개시 코돈을 ATG로 변경시키는 것이 필요함이 이해된다.

본 발명의 다양한 실시 양태에서, 살충 단백질은 본원에 개시된 전장 뉴클레오티드 서열로부터 추정된 아미노산 서열 및 다른 하류 개시 부위의 이용으로 인하여 전장 서열보다 더 짧은 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및/또는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 숙주 세포 및 식물 (및 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 제조하는 그리고 사용하는 방법)은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 26에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체, 또는 이의 변이체 또는 단편이 또한 포함된다. 항체의 제조 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] 및 미국 특허 제4,196,265호 참조).

따라서, 본 발명의 일 측면은 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체, 단쇄 항원 결합 분자 또는 기타 단백질 및 이의 상동체, 융합물 또는 단편에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 항체는 서열 번호 5 내지 26에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시 양태에서, 항체는 서열 번호 5 내지 26에 개시된 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 항체는 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자를 정량적으로 또는 정성적으로 탐지하는 데 사용되거나 이 단백질의 번역 후 변형을 탐지하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 펩티드는 결합이 관련되지 않은 분자의 존재에 의해 경쟁적으로 억제되는 것이 아닐 경우 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자에 "특이적으로 결합한다"라고 한다.

본 발명의 항체는 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자의 검출에 유용한 키트 내에 포함될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자 (특히, 서열 번호 5 내지 26에 개시된 아미노산 서열에 의해 코딩되는 단백질 (본 발명의 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 이의 변이체 또는 단편을 포함함))를 검출하는 방법을 추가로 포함하며, 이는 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및 샘플이 본 발명의 단백질 또는 펩티드 분자를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 관심 대상의 단백질 또는 펩티드의 검출을 위한 항체의 이용 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.

변경되거나 개선된 변이체

살충 단백질의 DNA 서열은 다양한 방법에 의해 변경될 수 있으며, 이러한 변경은 본 발명의 살충 단백질에 의해 코딩되는 것과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 생성할 수 있음이 인식된다. 이러한 단백질은 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 15개, 약 20개, 약 25개, 약 30개, 약 35개, 약 40개, 약 45개, 약 50개, 약 55개, 약 60개, 약 65개, 약 70개, 약 75개, 약 80개, 약 85개, 약 90개, 약 100개, 약 105개, 약 110개, 약 115개, 약 120개, 약 125개, 약 130개, 약 135개, 약 140개, 약 145개, 약 150개, 약 155개까지의, 또는 이보다 더 많은 것까지의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는, 서열 번호 5 내지 26의 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 그러한 조작 방법은 일반적으로 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 살충 단백질의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 이는 또한 돌연변이 유발의 몇몇 형태 중 하나에 의해 및/또는 지향 진화에서 성취될 수 있다. 일부 측면에서, 아미노산 서열에서의 코딩된 변화는 당해 단백질의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는다. 그러한 변이체는 요망되는 살충 활성을 보유한다. 그러나, 살충 단백질이 살충 활성을 부여하는 능력은 본 발명의 조성물에 그러한 기법을 사용함으로써 개선될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, XL-1 레드(Red) (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))와 같이, DNA 복제 동안 높은 비율의 염기 오혼입(misincorporation)을 나타내는 숙주 세포에서 살충 단백질을 발현시킬 수 있다. 그러한 주에서의 증식 후, (예를 들어, 플라스미드 DNA의 제조에 의해, 또는 PCR 및 생성된 PCR 단편을 벡터 내로 클로닝함에 의해 증폭시킴으로써) DNA를 단리하고, 비-돌연변이 유발 주에서 살충 단백질 돌연변이를 배양하고, 예를 들어 살충 활성을 테스트하는 분석을 수행함으로써 살충 활성을 갖는 돌연변이된 유전자를 확인할 수 있다. 일반적으로, 단백질은 혼합되어 급이 분석(feeding assay)에서 이용된다. 예를 들어, 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293]을 참조한다. 그러한 분석법은 식물을 하나 이상의 해충과 접촉시키는 단계 및 식물이 생존하는 능력 및/또는 해충의 사멸을 야기하는 능력을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 독성을 증가시키는 돌연변이의 예가 문헌[Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806]에서 발견된다.

대안적으로, 활성에 실질적으로 영향을 주지 않고서 아미노 또는 카르복시 말단에서 다수의 단백질의 단백질 서열에 대하여 변경이 이루어질 수 있다. 이는 PCR 증폭에서 이용되는 올리고뉴클레오티드 내에 아미노산 코딩 서열을 포함시킴에 의해 단백질 코딩 서열을 변경시키거나 연장시키는 PCR 증폭을 포함하는, PCR과 같은 현대의 분자적 방법에 의해 도입되는 삽입, 결실 또는 변경을 포함할 수 있다. 대안적으로, 부가되는 단백질 서열은 단백질 융합물을 생성하기 위하여 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 전체 단백질-코딩 서열을 포함할 수 있다. 그러한 융합 단백질은 종종 (1) 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키기 위하여, (2) 단백질 정제, 단백질 검출, 또는 본 기술 분야에 공지된 다른 실험적 사용 중 어느 하나를 용이하게 하기 위하여 결합 도메인, 효소 활성 또는 에피토프를 도입하기 위하여, (3) 단백질의 분비 또는 번역을 세포 소기관(subcellular organelle), 예컨대 그람-음성 박테리아의 주변세포질 공간, 또는 진핵 세포의 소포체로 표적화하는데, 후자는 종종 단백질의 글리코실화를 생성한다.

본 발명의 변이형 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 돌연변이 유발 및 레콤비노제닉(recombinogenic) 절차, 예컨대 DNA 셔플링으로부터 유도되는 서열을 또한 포함한다. 그러한 절차를 이용하여, 하나 이상의 상이한 살충 단백질 코딩 영역을 이용하여 요망되는 특성을 보유하는 새로운 살충 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 방식으로, 재조합 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 상당한 서열 동일성을 갖는 그리고 시험관 내에서 또는 생체 내에서 상동 재조합될 수 있는 서열 영역들을 포함하는 관련 서열 폴리뉴클레오티드들의 집단으로부터 생성된다. 예를 들어, 이러한 접근법을 이용하여, 관심 대상의 도메인을 코딩하는 서열 모티프를 본 발명의 살충 유전자와 다른 공지된 살충 유전자 사이에서 셔플링시켜 관심 대상의 특성이 개선된, 예컨대 살곤충 활성이 증가된 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 얻을 수 있다. 그러한 DNA 셔플링의 전략은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751]; 문헌[Stemmer (1994) Nature 370:389-391]; 문헌[Crameri et al.(1997) Nature Biotech. 15:436-438]; 문헌[Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347]; 문헌[Zhang et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509]; 문헌[Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291]; 및 미국 특허 제5,605,793호 및 미국 특허 제5,837,458호를 참조한다.

도메인 스와핑 또는 셔플링은 변경된 살충 단백질을 생성하는 또 다른 기작이다. 도메인은 살충 단백질들 사이에서 스와핑되어 개선된 살충 활성 또는 표적 스펙트럼을 갖는 하이브리드(hybrid) 또는 키메라(chimeric) 독소를 생성할 수 있다. 재조합 단백질을 생성하는 그리고 이를 살충 활성에 대하여 테스트하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌[Naimov et al.(2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330]; 문헌[de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543]; 문헌[Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958]; 문헌[Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930]; 문헌[Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925] 참조).

벡터

본 발명의 살충 서열은 관심 대상의 식물에서의 발현을 위한 발현 카세트 중에 제공될 수 있다. "식물 발현 카세트"는 식물 세포에서 오픈 리딩 프레임으로부터 단백질을 발현시킬 수 있는 DNA 구성물을 의도한다. 전형적으로, 이는 프로모터 및 코딩 서열을 함유한다. 종종, 그러한 구성물은 3' 비번역 영역을 또한 함유한다. 그러한 구성물은 엽록체 (또는 다른 색소체), 소포체, 또는 골지체(Golgi apparatus)와 같은 특정한 세포내 구조체로 펩티드를 번역과 동시에 수송하거나 번역 후 수송하는 것을 용이하게 하기 위하여 "시그널 서열" 또는 "리더(leader) 서열"을 함유할 수 있다.

"시그널 서열"은 펩티드를 세포막을 가로질러서 번역과 동시에 또는 번역 후에 수송하는 것으로 공지되거나 의심되는 서열을 의도한다. 진핵 생물에서, 이는 전형적으로 골지체 내로의 분비를 수반하며, 이때 일부는 글리코실화를 생성한다. 박테리아의 살곤충 독소는 종종 전독소로서 합성되며, 이는 표적 해충의 소화관에서 단백질 분해에 의해 활성화된다 (문헌[Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516]). 본 발명의 일부 실시 양태에서, 시그널 서열은 천연 서열 중에 위치하거나, 본 발명의 서열로부터 유래될 수 있다. "리더 서열"은 번역될 때, 펩티드 사슬을 세포 소기관으로 번역과 동시에 수송하는 것을 트리거(trigger)하기에 충분한 아미노산 서열을 생성하는 임의의 서열을 의도한다. 따라서 이것은 소포체 내로의 통과, 액포, 엽록체를 포함하는 색소체, 미토콘드리아 등으로의 통과에 의한 수송 및/또는 글리코실화를 표적화하는 리더 서열을 포함한다.

"식물 형질전환용 벡터"는 식물 세포의 효율적인 형질전환에 필요한 DNA 분자를 의도한다. 그러한 분자는 하나 이상의 식물 발현 카세트로 이루어질 수 있으며, 하나 초과의 "벡터" DNA 분자로 조직화될 수 있다. 예를 들어, 이원 벡터는 식물 세포의 형질전환을 위하여 모든 필요한 시스- 및 트랜스-작용 기능을 코딩하도록 2개의 비-연접 DNA 벡터를 이용하는 식물 형질전환용 벡터이다 (문헌[Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451]). "벡터"는 상이한 숙주 세포들 사이에서의 이전용으로 설계된 핵산 구성물을 나타낸다. "발현 벡터"는 외래 세포 내에 이종 DNA 서열 또는 단편을 포함시키고, 통합하고, 상기 세포 내에서 이를 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 카세트는 본 발명의 서열에 작동가능하게 연결된 5' 및/또는 3' 조절 서열을 포함한다. "작동가능하게 연결된"은 프로모터와 제2 서열 사이의 기능적 연결을 의도하며, 여기서, 프로모터 서열은 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된이라는 것은 연결되는 핵산 서열들이 연접하며, 두 단백질 코딩 영역을 연결하는 데 필요할 경우, 연접하고 동일 리딩 프레임 내에 있음을 의미한다. 카세트는 유기체를 동시 형질전환시킬 하나 이상의 추가의 유전자를 부가적으로 함유할 수 있다. 대안적으로, 추가의 유전자(들)는 다수의 발현 카세트에 제공될 수 있다.

다양한 실시 양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 프로모터, 예를 들어, 식물 프로모터에 작동가능하게 연결된다. "프로모터"는 하류 코딩 서열의 전사를 지시하는 기능을 하는 핵산 서열을 나타낸다. 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 ("제어 서열"로도 칭해짐)과 함께 프로모터는 관심 대상의 DNA 서열의 발현에 필요하다.

그러한 발현 카세트에는 조절 영역의 전사적 조절 하에 있도록 살충 서열의 삽입을 위한 복수의 제한효소 부위가 제공된다.

발현 카세트는 5'-3' 방향의 전사에서, 전사 및 번역 개시 영역(즉, 프로모터), 본 발명의 DNA 서열 및 번역 및 전사 종결 영역(즉, 종결 영역) (식물에서 기능성임)을 포함한다. 프로모터는 본 발명의 DNA 서열 및/또는 식물 숙주에 대하여 외래 또는 이종 프로모터이거나 천연 또는 유사 프로모터일 수 있다. 부가적으로, 프로모터는 천연 서열이거나 대안적으로 합성 서열일 수 있다. 프로모터가 "식물 숙주에 대하여 "상동성"이거나 "천연"일 경우, 프로모터는 프로모터가 도입되는 천연 식물에서 발견되는 것으로 의도된다. 프로모터가 본 발명의 DNA 서열에 대하여 "외래"이거나 "이종성"인 경우, 프로모터는 본 발명의 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 위한 천연 또는 자연 발생 프로모터가 아닌 것으로 의도된다.

종결 영역은 전사 개시 영역에 대해 천연일 수 있거나, 관심 대상의 작동가능하게 연결된 DNA 서열에 대해 천연일 수 있거나, 식물 숙주에 대해 천연일 수 있거나, 또 다른 소스(source)(즉, 프로모터, 관심 대상의 DNA 서열, 식물 숙주, 또는 이의 임의의 조합에 대하여 외래이거나 이종성임)로부터 유래될 수 있다. 편리한 종결 영역은 옥토핀 신타아제 및 노팔린 신타아제 종결 영역과 같이 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 Ti 플라스미드로부터 이용가능하다. 문헌[Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144]; 문헌[Proudfoot (1991) Cell 64:671-674]; 문헌[Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149]; 문헌[Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272]; 문헌[Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158]; 문헌[Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903]; 및 문헌[Joshi et al.(1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639]을 또한 참조한다.

적절할 경우, 유전자(들)는 형질전환된 숙주 세포에서의 발현의 증가에 최적화될 수 있다. 즉, 유전자는 개선된 발현을 위하여 숙주 세포에 바람직한 코돈을 이용하여 합성될 수 있거나, 숙주에 바람직한 코돈 사용 빈도의 코돈을 이용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 GC 함량은 증가된다. 예를 들어, 숙주에 바람직한 코돈 사용의 논의에 대해서는 문헌[Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11]을 참조한다. 식물에 바람직한 유전자의 합성에 대한 방법이 본 기술 분야에서 이용가능하다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,380,831호 및 미국 특허 제5,436,391호, 미국 특허 공개 제20090137409호 및 문헌[Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498을 참조한다.

일 실시 양태에서, 살충 단백질은 발현을 위하여 엽록체로 표적화된다. 이러한 방식으로, 살충 단백질이 엽록체 내로 직접적으로 삽입되는 것이 아닌 경우, 발현 카세트는 살충 단백질을 엽록체로 인도하기 위하여 수송 펩티드(transit peptide)를 코딩하는 핵산을 부가적으로 함유한다. 그러한 수송 펩티드는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126]; 문헌[Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; 문헌[Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; 문헌[Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421]; 및 문헌[Shah et al. (1986) Science 233:478-481]을 참조한다.

엽록체로 표적화될 살충 유전자는 식물 핵과 이러한 소기관 사이의 코돈 사용의 차이를 설명하기 위하여 엽록체에서의 발현에 최적화될 수 있다. 이러한 방식으로, 관심 대상의 핵산은 엽록체에 바람직한 코돈을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,380,831호를 참조한다.

식물의 형질전환

본 발명의 방법은 뉴클레오티드 구성물을 식물 내로 도입하는 것을 수반한다. "도입하는"은 뉴클레오티드 구성물이 식물의 세포 내부로 접근하는 그러한 방식으로 식물에게 뉴클레오티드 구성물을 제시함을 의도한다. 본 발명의 방법은 식물에게 뉴클레오티드 구성물을 도입하는 특별한 방법을 사용하는 것을 요구하는 것이 아니고 뉴클레오티드 구성물이 식물의 적어도 하나의 세포의 내부에 접근하는 것을 요구할 뿐이다. 뉴클레오티드 구성물을 식물 내로 도입하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 안정한 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스-매개된 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

"식물"은 전체 식물, 이의 식물 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포, 번식체, 배아 및 자손을 의도한다. 식물 세포는 분화되거나 미분화될 수 있다 (예를 들어, 캘러스(callus), 현탁 배양 세포, 원형질체, 잎 세포, 뿌리 세포, 체관부 세포, 화분).

"트랜스제닉(transgenic) 식물" 또는 "형질전환된 식물" 또는 "안정하게 형질전환된" 식물 또는 세포 또는 조직은 외인성 핵산 서열 또는 DNA 단편이 식물 세포 내로 포함되거나 통합된 식물을 나타낸다. 이러한 핵산 서열은 외인성인, 또는 비형질전환된 식물 세포에는 존재하지 않는 것과, 내인성이거나 비형질전환된 식물 세포에 존재할 수 있는 것을 포함한다. 일반적으로, "이종성"은 세포에 대하여 내인성이 아니거나 핵산 서열이 존재하는 천연 게놈의 일부가 아닌, 그리고 감염, 형질감염, 미세주입, 전기천공, 마이크로프로젝션(microprojection) 등에 의해 세포에 첨가된 핵산 서열을 나타낸다.

본 발명의 트랜스제닉 식물은 본원에 개시된 신규한 독소 서열 중 하나 이상을 발현한다. 다양한 실시 양태에서, 트랜스제닉 식물은 곤충 내성을 위한 하나 이상의 추가의 유전자 (예를 들어, Cry1, 예컨대 Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, 및 Cry1F 패밀리의 구성원; Cry2, 예컨대 Cry2A 패밀리의 구성원; Cry9, 예컨대 Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E, 및 Cry9F 패밀리의 구성원 등)를 추가로 포함한다. 당업자라면 트랜스제닉 식물이 관심 대상의 농업 형질(agronomic trait)을 부여하는 임의의 유전자를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.

식물 세포의 형질전환은 본 기술 분야에 공지된 몇몇 기법 중 하나에 의해 성취될 수 있다. 본 발명의 살충 유전자는 식물 세포에서 발현을 얻거나 향상시키도록 변형될 수 있다. 전형적으로, 그러한 단백질을 발현하는 구성물은 유전자의 전사를 지시하는 프로모터와, 전사 종결 및 폴리아데닐화를 허용하는 3' 비번역 영역을 함유한다. 그러한 구성물의 조직화는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 예에서, 생성된 펩티드가 분비되거나 또는 달리, 식물 세포 내에 표적화되도록 유전자를 엔지니어링(engineer)하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 유전자는 펩티드를 소포체로 이전시키는 것을 용이하게 하기 위하여 시그널 펩티드를 함유하도록 엔지니어링될 수 있다. 인트론의 mRNA 프로세싱이 발현에 요구되도록, 인트론을 함유하도록 식물 발현 카세트를 엔지니어링하는 것이 또한 바람직할 수 있다.

전형적으로, 이러한 "식물 발현 카세트"는 "식물 형질전환용 벡터" 내로 삽입된다. 이러한 식물 형질전환용 벡터는 식물 형질전환을 달성하는 데 필요한 하나 이상의 DNA 벡터로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 연접 DNA 절편으로 이루어진 식물 형질전환용 벡터를 이용하는 것이 본 기술 분야에서 일반적인 관행이다. 이러한 벡터는 종종 본 기술 분야에서 "이원 벡터"로 지칭된다. 이원 벡터와, 헬퍼 플라스미드를 포함하는 벡터가 아그로박테륨(Agrobacterium)-매개된 형질전환에 가장 흔히 사용되며, 여기서, 효율적인 형질전환을 달성하는 데 필요한 DNA 절편의 크기 및 복잡성은 꽤 크며, 기능들을 별도의 DNA 분자 상에 분리시키는 것이 유리하다. 전형적으로, 이원 벡터는 T-DNA 이전에 요구되는 시스-작용 서열 (예컨대 좌측 경계부 및 우측 경계부), 식물 세포에서 발현 가능하도록 엔지니어링된 선발가능한 마커, 및 "관심 대상의 유전자" (트랜스제닉 식물의 생성이 요구되는 식물 세포에서 발현이 가능하도록 엔지니어링된 유전자)를 함유하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 이러한 플라스미드 벡터에 또한 존재하는 것은 박테리아 복제에 요구되는 서열이다. 시스-작용 서열들은 식물 세포 내로의 효율적인 이전 및 그 안에서의 발현을 허용하는 방식으로 배열된다. 예를 들어, 선발가능한 마커 유전자 및 살충 유전자는 좌측 경계부와 우측 경계부 사이에 위치된다. 종종, 제2 플라스미드 벡터는 아그로박테륨으로부터 식물 세포로의 T-DNA 이전을 매개하는 트랜스-작용 인자를 함유한다. 종종 이러한 플라스미드는 아그로박테륨에 의한 식물 세포의 감염과 경계부 서열에서의 절단 및 vir-매개된 DNA 이전에 의한 DNA의 이전을 허용하는 병독력 기능 (Vir 유전자)을 함유하며, 이는 본 기술 분야에서 이해되는 바와 같다 (문헌[Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science5:446-451]). 몇몇 유형의 아그로박테륨 주 (예를 들어, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 등)가 식물 형질전환에 이용될 수 있다. 제2 플라스미드 벡터는 마이크로프로젝션, 미세주입, 전기천공, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 다른 방법에 의해 식물을 형질전환시키는 데에는 필요하지 않다.

일반적으로, 식물 형질전환 방법은 이종성 DNA를 표적 식물 세포 (예를 들어, 미성숙 또는 성숙 배아, 현탁 배양물, 미분화 캘러스, 원형질체 등) 내로 이전시키는 단계, 이어서 (선발가능한 마커 유전자에 따라) 최대 역치 수준의 적절한 선발을 적용하여 비형질전환된 세포 매스(mass)의 그룹으로부터 형질전환된 식물 세포를 회수하는 단계를 수반한다. 전형적으로, 외식체는 신선하게 공급되는 동일 배지로 이전되어 일상적으로 배양된다. 후속적으로, 형질전환된 세포는 최대 역치 수준의 선발제가 보충된 재생 배지 상에 두어진 후 신초(shoot)로 분화된다. 그 후 신초는 발근(rooted) 신초 또는 묘목을 회수하기 위한 발근용 선발 배지로 이전시킨다. 그 후, 트랜스제닉 묘목은 성숙 식물로 성장하며, 수정 능력을 가진 종자(fertile seed)를 생성한다 (예를 들어, 문헌[Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282]; 문헌[Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750]). 전형적으로 외식체는 신선하게 공급되는 상기 배지로 이전되며 일상적으로 배양된다. 트랜스제닉 식물의 생성을 위한 기법 및 방법의 일반적인 설명은 문헌[Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239] 및 문헌[Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120]에서 발견된다. 형질전환된 물질은 많은 세포를 함유하기 때문에, 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 둘 모두는 이를 받은 표적 캘러스 또는 조직 또는 세포 군의 임의의 조각에 존재한다. 형질전환되지 않은 세포를 사멸시키고 형질전환된 세포가 증식되게 하는 능력은 형질전환된 식물의 배양으로 이어진다. 종종, 형질전환되지 않은 세포를 제거하는 능력은 형질전환된 식물 세포의 빠른 회수 및 트랜스제닉 식물의 성공적인 생성에 대한 제한이다.

형질전환 프로토콜과, 뉴클레오티드 서열을 식물 내로 도입하는 프로토콜은 형질전환에 대하여 표적화된 식물 또는 식물 세포의 유형, 즉, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물에 따라 달라질 수 있다. 트랜스제닉 식물의 생성은 미세주입, 전기천공, 직접적인 유전자 전달, 아그로박테륨에 의한 식물 세포 내로의 이종 DNA의 도입 (아그로박테륨-매개된 형질전환), 입자에 부착된 이종 외래 DNA를 이용한 식물 세포의 폭격(bombardment), 탄도 입자 가속화(ballistic particle acceleration), 에어로졸 빔 형질전환 (미국 특허 공개 제20010026941호; 미국 특허 제4,945,050호, 국제 공개 제91/00915호; 미국 특허 공개 제2002015066호), Lec1 형질전환, 및 DNA를 전달하기 위한 다양한 다른 비-입자에 의해 직접적으로 매개된 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 몇몇 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다.

엽록체의 형질전환 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530]; 문헌[Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917]; 문헌[Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606]을 참조한다. 상기 방법은 선발가능한 마커를 함유하는 DNA의 입자 총(gun) 전달 (이는 상기 DNA를 상동 재조합을 통하여 색소체 게놈에 표적화함)에 의존한다. 부가적으로, 색소체 형질전환은 핵-코딩되고 색소체-지시되는 RNA 폴리머라아제의 조직에 바람직한 발현에 의해 색소체-유래 사일런트(silent) 트랜스진(transgene)의 트랜스활성화(transactivation)에 의해 성취될 수 있다. 그러한 시스템은 문헌[McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305]에 보고되었다.

이종성 외래 DNA를 식물 세포 내로 통합시킨 후, 배지에서의 최대 역치 수준의 적절한 선발을 그 후에 적용하여 비형질전환된 세포를 사멸시키고 신선 배지로 정기적으로 이전시킴에 의해 이러한 선발 처리에서 살아남은 추정상 형질전환된 세포를 분리하여 증식시킨다. 적절한 선발을 이용한 연속 계대 및 챌린지(challange)에 의해, 플라스미드 벡터로 형질전환된 세포를 확인하고 증식시킨다. 그 후, 분자적 및 생화학적 방법을 이용하여, 트랜스제닉 식물의 게놈 내로 통합된 관심 대상의 이종 유전자의 존재를 확증할 수 있다.

형질전환된 세포를 통상적인 방식에 따라 식물로 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84]을 참조한다. 그 후, 이러한 식물을 성장시키고, 동일한 형질전환된 주 또는 상이한 주를 이용하여 수분시킬 수 있으며, 요망되는 표현형 특성의 항시 발현(constitutive expression)을 갖는 생성된 하이브리드가 확인될 수 있다. 2 이상의 세대를 성장시켜서 요망되는 표현형 특성의 발현이 안정하게 유지되어 유전됨을 보장할 수 있으며 그 후 종자를 수확하여 요망되는 표현형 특성의 발현이 달성되었음을 보장할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명은 그 게놈 내로 안정하게 포함된 본 발명의 뉴클레오티드 구성물, 예를 들어, 본 발명의 발현 카세트를 갖는 형질전환된 종자 ("트랜스제닉 종자"로도 지칭됨)를 제공한다.

식물 형질전환의 평가

이종성 외래 DNA를 식물 세포 내로 도입한 후, 식물 게놈에서의 이종 유전자의 통합 또는 형질전환은 다양한 방법, 예컨대 통합된 유전자와 연관된 핵산, 단백질 및 대사산물의 분석에 의해 확증된다.

PCR 분석은 토양에 옮겨 심기 전 더 이른 단계에서 포함된 유전자의 존재에 대하여 형질전환된 세포, 조직 또는 신초를 스크리닝하는 빠른 방법이다 (문헌[Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]). PCR은 관심 대상의 유전자 또는 아그로박테륨 벡터 배경 등에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 실시된다.

식물 형질전환은 게놈 DNA의 서던 블롯(Southern blot) 분석에 의해 확증될 수 있다 (상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001]). 일반적으로, 전체 DNA는 형질전환체로부터 추출되고, 적절한 제한 효소로 절단되고, 아가로스 겔에서 분획화되고, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막으로 이전된다. 그 후, 상기 막 또는 "블롯"은 표준 기법에 따라 식물 게놈 내로의 도입된 유전자의 통합을 확증하기 위하여 예를 들어 방사성 표지된 ³²P 표적 DNA 단편으로 프로빙된다 (상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001]).

노던 블롯(Northern blot) 분석에서, RNA는 형질전환체의 특정 조직으로부터 단리되고, 포름알데히드 아가로스 겔에서 분획화되고, 나일론 필터 상에 블로팅되며, 이는 본 기술 분야에서 일상적으로 사용되는 표준 절차에 따른 것이다 (상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001]). 그 후, 살충 유전자에 의해 코딩되는 RNA의 발현은 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 필터를 살충 유전자로부터 유래된 방사성 프로브에 혼성화함으로써 테스트된다 (상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001]).

웨스턴 블롯(Western blot), 생화학적 분석 등이, 살충 단백질 상에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 이용하여 표준 절차 (상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001])에 의해 살충 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 존재를 확증하기 위하여 트랜스제닉 식물에서 실시될 수 있다.

식물에서의 살충 활성

본 발명의 또 다른 측면에서, 살충 활성을 갖는 살충 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물을 생성할 수 있다. 예로서 상기에 기술된 방법을 이용하여 트랜스제닉 식물을 생성할 수 있지만, 트랜스제닉 식물 세포가 생성되는 방식은 본 발명에 결정적이지 않다. 본 기술 분야에 공지되거나 기술된 방법, 예컨대 아그로박테륨-매개된 형질전환, 바이오리스틱(biolistic) 형질전환, 및 비-입자-매개된 방법이 실험자의 재량으로 사용될 수 있다. 살충 단백질을 발현하는 식물은 본 기술 분야에 기술된 일반적인 방법에 의해, 예를 들어, 캘러스의 형질전환, 형질전환된 캘러스의 선발, 및 그러한 트랜스제닉 캘러스로부터의 수정 능력을 가진 식물의 재생에 의해 단리될 수 있다. 그러한 공정에서 임의의 유전자를 선발가능한 마커로서 사용할 수 있으며, 이는 식물 세포에서의 그의 발현이 형질전환된 세포를 확인하거나 이를 선발하는 능력을 부여하는 한 그러하다.

다수의 마커, 예컨대 클로람페니콜, 아미노글리코시드 G418, 하이그로마이신 등에 대한 저항성이 식물 세포에서의 사용용으로 개발되었다. 엽록체 대사에 연루된 생성물을 코딩하는 다른 유전자가 선발가능한 마커로서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 식물용 제초제, 예컨대 글리포세이트(glyphosate), 브로목시닐(bromoxynil) 또는 이미다졸리논에 대한 저항성을 제공하는 유전자에서 그 특별한 용도를 찾을 수 있다. 그러한 유전자는 보고되었다 (문헌[Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314] (브로목시닐 저항성 니트릴라아제 유전자); 및 문헌[Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188] (AHAS 이미다졸리논 저항성 유전자)). 부가적으로, 본원에 개시된 유전자는 박테리아 또는 식물 세포의 형질전환을 평가하기 위한 마커로서 유용하다. 식물, 식물 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 식물의 종자, 식물 세포, 번식체, 배아 또는 자손에서의 트랜스진의 존재의 탐지 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일 실시 양태에서, 트랜스진의 존재는 살충 활성에 대하여 테스트함으로써 탐지된다.

살충 단백질을 발현하는, 수정 능력을 가진 식물은 살충 활성에 대하여 테스트될 수 있으며, 최적 활성을 나타내는 식물은 추가의 교배에 대하여 선발된다. 해충 활성에 대하여 분석하기 위한 방법이 본 기술 분야에서 이용가능하다. 일반적으로, 상기 단백질은 급이 분석에서 혼합되어 사용된다. 예를 들어, 문헌[Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293]을 참조한다.

본 발명은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환에 이용될 수 있다. 관심 대상의 식물의 예는 콘 (옥수수), 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물(crucifer), 페퍼(pepper), 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 및 유채, 브라시카(Brassica) sp., 알팔파, 호밀, 기장, 잇꽃, 땅콩, 고구마, 카사바, 커피, 코코넛, 파인애플, 감귤 나무, 코코아, 차, 바나나, 아보카도, 무화과, 구아바, 망고, 올리브, 파파야, 캐슈, 마카다미아, 아몬드, 귀리, 야채류, 관상용 식물(ornamental) 및 구과 식물(conifer)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

야채류는 토마토, 상추, 그린 빈(green bean), 리마콩(lima bean), 완두 및 쿠르쿠미스(Curcumis) 속의 구성원, 예컨대 오이, 캔털루프(cantaloupe) 및 머스크 멜론(musk melon)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 관상용 식물은 진달래, 수국, 히비스커스, 장미, 튤립, 나팔수선화, 페튜니아, 카네이션, 포인세티아, 및 국화를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 식물은 작물(crop plant) (예를 들어, 옥수수, 수수, 밀, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물, 페퍼, 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 유채 등)이다.

살충 방제에서의 용도

해충 방제에서 또는 살충제로서의 기타 유기체의 엔지니어링에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 주를 이용하는 일반적인 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,039,523호 및 유럽 특허 제0480762A2호를 참조한다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 바실루스 주, 또는 본 발명의 살충 유전자 및 단백질을 함유하도록 유전적으로 변경된 미생물이 농작물 및 농산물을 해충으로부터 보호하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 독소(살충제)-생성 유기체의 전체 세포, 즉, 비용해된(unlysed) 세포는 세포가 표적 해충(들)의 환경에 적용될 때 세포에서 생성되는 독소의 활성을 연장시키는 시약으로 처리된다.

대안적으로, 살충제는 살충 유전자를 세포 숙주 내로 도입함으로써 생성된다. 살충 유전자의 발현은 직접적으로 또는 간접적으로, 살충제의 세포내 생성 및 유지로 이어진다. 본 발명의 일 측면에서, 이러한 세포는 그 후 세포가 표적 해충(들)의 환경에 적용될 때 세포에서 생성되는 독소의 활성을 연장시키는 조건 하에서 처리된다. 생성된 생성물은 독소의 독성을 유지한다. 그 후, 이러한 천연적으로 캡슐화된(encapsulated) 살충제는 표적 해충을 호스팅하는(hosting) 환경, 예를 들어, 토양, 물, 및 식물의 군엽에 적용하기 위한 통상적인 기법에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 제0192319호 및 그 안에 인용된 참고 문헌을 참조한다. 대안적으로, 생성된 물질을 살충제로서 적용하는 것을 허용하도록 본 발명의 유전자를 발현하는 세포를 제형화할 수 있다.

본 발명의 활성 성분은 보통 조성물의 형태로 적용되며, 처리될 작물 지역 또는 식물에 다른 화합물과 동시에 또는 연이어서 적용될 수 있다. 이러한 화합물은 비료, 잡초 제거제(weed killer), 동해 방지제, 계면활성제, 세제, 살충 비누, 휴면 오일(dormant oil), 중합체 및/또는 제형의 단회 적용 후 표적 지역의 장시간 투약을 허용하는 지효성(time-release) 또는 생물분해성 단체 제형일 수 있다. 이는 또한 선택적 제초제, 화학적 살곤충제, 바이러스 박멸제(virucide), 살미생물제, 아메바 박멸제(amoebicide), 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 살연체동물제, 또는 이들 제제 중 몇몇의 혼합물 (요망될 경우, 추가의 농업적으로 허용가능한 담체, 계면활성제 또는 제형화 분야에서 관례상 이용되는 적용-촉진 아쥬반트(adjuvant)와 함께임)일 수 있다. 적합한 담체 및 아쥬반트는 고체 또는 액체일 수 있으며, 제형화 기술에서 보통 이용되는 물질, 예를 들어, 천연 또는 재생 미네랄 물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착성 부여제(tackifier), 결합제 또는 비료에 상응할 수 있다. 마찬가지로, 제형은 살충 제형의 표적 해충에 의한 급이 또는 섭취를 허용하기 위하여 식용 "미끼"로 제조되거나 해충 "트랩(trap)"식으로 될 수 있다.

본 발명의 박테리아 주에 의해 생성된 살충 단백질 중 적어도 하나를 함유하는 본 발명의 농약 조성물 또는 본 발명의 활성 성분을 적용하는 방법은 엽면 적용, 종자 코팅 및 토양 적용을 포함한다. 적용의 수 및 적용률은 상응하는 해충에 의한 만연 강도에 따라 달라진다.

조성물은 산제, 분제, 펠렛, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드, 용액 등으로 제형화될 수 있으며, 폴리펩티드를 포함하는 세포의 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 농축과 같은 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 적어도 하나의 그러한 살충 폴리펩티드를 함유하는 모든 그러한 조성물에서, 폴리펩티드는 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 농도로 존재할 수 있다.

인시류, 반시류, 쌍시류, 또는 초시류 해충은 본 발명의 방법에 의해 주어진 지역에서 사멸되거나 수가 감소될 수 있거나, 감수성 해충이 만연하는 것을 방지하기 위하여 환경 지역에 예방적으로 적용될 수 있다. 바람직하게는 해충은 살충적 유효량의 본 폴리펩티드를 섭취하거나 살충적 유효량의 본 폴리펩티드와 접촉된다. "살충적 유효량"은 적어도 하나의 해충에게 사멸을 야기할 수 있거나 해충의 성장, 급이 또는 정상적인 생리학적 발달을 현저히 감소시킬 수 있는 살충제의 양을 의도한다. 이러한 양은 예를 들어 방제될 특정한 표적 해충, 처리될 특정 환경, 위치, 식물, 작물, 또는 농업적 장소, 환경 조건, 및 살충적으로 유효한 폴리펩티드 조성물의 적용 방법, 적용률, 적용 농도, 적용 안정성 및 적용량과 같은 요인에 따라 달라진다. 또한 제형은 기후 조건, 환경적 고려 사항, 및/또는 적용 빈도 및/또는 해충 만연의 심각도와 관련하여 달라질 수 있다.

기술된 살충제 조성물은 박테리아 세포, 결정체 및/또는 포자 현탁물, 또는 단리된 단백질 성분을 요망되는 농업적으로 허용가능한 담체를 이용하여 제형화함으로써 만들어질 수 있다. 조성물은 투입 전에 동결건조, 냉동 건조, 건조와 같은 적절한 수단으로, 또는 수성 담체, 매질 또는 적합한 희석제, 예컨대 염수 또는 기타 완충제 중에 제형화될 수 있다. 제형화된 조성물은 분제 또는 과립형 물질, 또는 오일 (야채유 또는 광유) 중 현탁물의 형태로, 또는 물 또는 오일/물 에멀젼의 형태로, 또는 습윤가능한 분제로서, 또는 농업적 응용에 적합한 임의의 다른 담체 물질과 조합되어 존재할 수 있다. 적합한 농업적 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며, 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. "농업적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 살충제 제형 기술에서 보통 사용되는 모든 아쥬반트, 불활성 성분, 분산제, 계면활성제, 점착성 부여제, 결합제 등을 포함하며; 이는 살충제 제형에 있어서의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 제형은 하나 이상의 고체 또는 액체 아쥬반트와 혼합될 수 있으며 다양한 수단에 의해, 예를 들어, 통상적인 제형화 기법을 이용하여 살충 조성물을 적합한 아쥬반트와 균질하게 혼합하고/하거나 블렌딩하고/하거나 살충 조성물을 적합한 아쥬반트를 이용하여 분쇄함으로써 제조될 수 있다. 적합한 제형 및 적용 방법은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,468,523호에 기술되어 있다.

"해충"은 곤충, 진균류, 박테리아, 선충류, 진드기(mite), 참진드기(tick) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 곤충 해충은 초시목, 쌍시목, 막시목, 인시목, 식모목, 동시아목, 반시목, 직시목(order Orthroptera), 총채벌레목(order Thysanoptera), 집게벌레목(order Dermaptera), 흰개미목(order Isoptera), 이목(order Anoplura), 벼룩목(order Siphonaptera), 날도래목(order Trichoptera) 등, 특히 초시목, 인시목, 및 쌍시목으로부터 선택되는 곤충을 포함한다.

초시목은 식육아목(suborder Adephaga) 및 다식아목(suborder Polyphaga)을 포함한다. 식육아목은 딱정벌레상과(superfamily Caraboidea) 및 물맴이상과(superfamily Gyrinoidea)의 아과를 포함하는 반면, 다식아목은 물땡땡이상과(superfamily Hydrophiloidea), 반날개상과(superfamily Staphylinoidea), 병대벌레상과(superfamily Cantharoidea), 개미붙이상과(superfamily Cleroidea), 방아벌레상과(superfamily Elateroidea), 다스킬루스상과(superfamily Dascilloidea), 여울벌레상과(superfamily Dryopoidea), 둥근가시벌레상과(superfamily Byrrhoidea), 머리대장상과(superfamily Cucujoidea), 가뢰상과(superfamily Meloidea), 꽃벼룩상과(superfamily Mordelloidea), 거저리상과(superfamily Tenebrionoidea), 개나무좀상과(superfamily Bostrichoidea), 풍뎅이상과(superfamily Scarabaeoidea), 하늘소상과(superfamily Cerambycoidea), 잎벌레상과(superfamily Chrysomeloidea), 및 바구미상과(superfamily Curculionoidea)를 포함한다. 딱정벌레상과는 길앞잡이과(family Cicindelidae), 딱정벌레과(family Carabidae), 및 물방개과(family Dytiscidae)를 포함한다. 물맴이상과는 물맴이과(family Gyrinidae)를 포함한다. 물땡땡이상과는 물땡땡이과(family Hydrophilidae)를 포함한다. 반날개상과는 송장벌레과(family Silphidae) 및 반날개과(family Staphylinidae)를 포함한다. 병대벌레상과는 병대벌레과(family Cantharidae) 및 반딧불이과(family Lampyridae)를 포함한다. 개미붙이상과는 개미붙이과(family Cleridae) 및 수시렁이과(family Dermestidae)를 포함한다. 방아벌레상과는 방아벌레과(family Elateridae) 및 비단벌레과(family Buprestidae)를 포함한다. 머리대장상과는 무당벌레과(family Coccinellidae)를 포함한다. 가뢰상과는 가뢰과(family Meloidae)를 포함한다. 거저리상과는 거저리과(family Tenebrionidae)를 포함한다. 풍뎅이상과는 사슴벌레붙이과(family Passalidae) 및 소똥구리과(family Scarabaeidae)를 포함한다. 하늘소상과는 하늘소과(family Cerambycidae)를 포함한다. 잎벌레상과는 잎벌레과(family Chrysomelidae)를 포함한다. 바구미상과는 바구미과(family Curculionidae) 및 나무좀과(family Scolytidae)를 포함한다.

쌍시목은 긴뿔파리아목(suborder Nematocera), 짧은뿔파리아목(suborder Brachycera), 및 환봉아목(suborder Cyclorrhapha)을 포함한다. 긴뿔파리아목은 각다귀과(family Tipulidae), 나방파리과(family Psychodidae), 모기과(family Culicidae), 등에모기과(family Ceratopogonidae), 깔따구과(family Chironomidae), 먹파리과(family Simuliidae), 털파리과(family Bibionidae), 및 혹파리과(family Cecidomyiidae)를 포함한다. 짧은뿔파리아목은 동애등에과(family Stratiomyidae), 등에과(family Tabanidae), 좀파리매과(family Therevidae), 파리매과(family Asilidae), 마이디다에과(family Mydidae), 재니등에과(family Bombyliidae), 및 장다리파리과(family Dolichopodidae)를 포함한다. 환봉아목은 분열이마무리 구분(division Aschiza) 및 분열이마무리 구분을 포함한다. 분열이마무리 구분은 벼룩파리과(family Phoridae), 꽃등에과(family Syrphidae) 및 벌붙이파리과(family Conopidae)를 포함한다. 분열이마무리 구분은 아칼립트라타에 분과(Section Acalyptratae) 및 칼립트라타에 분과(Section Calyptratae)를 포함한다. 아칼립트라타에 분과는 오티티다에과(family Otitidae), 과실파리과(family Tephritidae), 굴파리과(family Agromyzidae) 및 초파리과(family Drosophilidae)를 포함한다. 칼립트라타에 분과는 이파리과(family Hippoboscidae), 쇠파리과(family Oestridae), 기생파리과(family Tachinidae), 꽃파리과(family Anthomyiidae), 집파리과(family Muscidae), 검정파리과(family Calliphoridae), 및 쉬파리과(family Sarcophagidae)를 포함한다.

인시목은 호랑나비과(family Papilionidae), 흰나비과(family Pieridae), 부전나비과(family Lycaenidae), 네발나비과(family Nymphalidae), 왕나비과(family Danaidae), 뱀눈나비과(family Satyridae), 팔랑나비과(family Hesperiidae), 박각시과(family Sphingidae), 산누에나방과(family Saturniidae), 자나방과(family Geometridae), 불나방과(family Arctiidae), 밤나방과(family Noctuidae), 독나방과(family Lymantriidae), 유리나방과(family Sesiidae), 및 곡식좀나방과(family Tineidae)를 포함한다.

선충류는 헤테로데라(Heterodera) spp., 멜로이도기네(Meloidogyne) spp., 및 글로보데라(Globodera) spp.를 포함하는, 뿌리혹 선충(root-knot nematode), 씨스트 선충(cyst nematode) 및 뿌리썩이 선충(lesion nematode)과 같은 기생 선충; 특히, 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines) (대두 씨스트 선충); 헤테로데라 샤크티이(Heterodera schachtii) (비트 씨스트 선충); 헤테로데라 아베나에(Heterodera avenae) (곡류 씨스트 선충); 및 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis) 및 글로보데라 파일리다(Globodera pailida) (감자 씨스트 선충)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 씨스트 선충의 구성원을 포함한다. 뿌리썩이 선충은 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) spp.를 포함한다.

반시류 해충 (반시목, 동시아목 또는 이시목으로 표기되는 종을 포함함)은 리구스(Lygus) spp., 예컨대 미국 서부 녹노린재(Western tarnished plant bug) (리구스 헤스페루스(Lygus hesperus)), 녹노린재(tarnished plant bug) (리구스 리네올라리스(Lygus lineolaris)), 및 녹색 노린재 (리구스 엘리수스(Lygus elisus)); 진딧물, 예컨대 녹색 복숭아 진딧물 (마이주스 페르시카에(Myzus persicae)), 목화 진딧물 (아피스 고시피이(Aphis gossypii)), 체리 진딧물 또는 블랙 체리 진딧물 (마이주스 세라시(Myzus cerasi)), 대두 진딧물 (아피스 글리시네스 마추무라(Aphis glycines Matsumura)); 벼멸구(brown plant hopper) (닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens)), 및 끝동매미충(rice green leafhopper) (네포테틱스 spp.(Nephotettix spp.); 및 방귀 벌레(stink bug), 예컨대 녹색 방귀 벌레(green stink bug) (아크로스테르눔 힐라레(Acrosternum hilare)), 썩덩나무노린재(brown marmorated stink bug) (할리오모르파 할리스(Halyomorpha halys)), 미국 남부 녹색 방귀 벌레(southern green stink bug) (네자라 비리둘라(Nezara viridula)), 벼 방귀 벌레(rice stink bug) (오에발루스 푸그낙스(Oebalus pugnax)), 포리스트 버그(forest bug) (펜타토마 루피페스(Pentatoma rufipes)), 유럽 방귀 벌레(European stink bug) (라피가스테르 네불로사(Rhaphigaster nebulosa)), 및 금노린재(shield bug) (트로이루스 루리두스(Troilus luridus)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

주요 작물에 대한 본 발명의 곤충 해충은 하기를 포함한다: 옥수수: 유럽 조명충(European corn borer), 오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis); 검거세미나방(black cutworm), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon); 왕담배나방(corn earworm), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea); 거염벌레(fall armyworm), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda); 미국 남서부 조명나방(southwestern corn borer), 디아트라에아 그란디오셀라(Diatraea grandiosella); 레서 콘스톡 보어러(lesser cornstalk borer), 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus); 사탕수수 명나방(surgarcane borer), 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis); 미국 서부 옥수수 뿌리벌레(western corn rootworm), 디아브로티카 비르기페라(Diabrotica virgifera); 미국 북부 옥수수 뿌리벌레(northern corn rootworm), 디아브로티카 롱기코르니스 바르베리(Diabrotica longicornis barberi); 미국 남부 옥수수 뿌리벌레(southern corn rootworm), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi); 철선충(wireworm), 멜라노투스(Melanotus) spp.; 미국 북부 마스크 체이퍼(northern masked chafer) (굼벵이), 사이클로세팔라 보레알리스(Cyclocephala borealis); 미국 남부 마스크 체이퍼 (굼벵이), 사이클로세팔라 임마쿨라타(Cyclocephala immaculata); 알풍뎅이(Japanese beetle), 포필리아 자포니카(Popillia japonica); 옥수수 청동벼룩벌레(corn flea beetle), 카에토크네마 풀리카리아(Chaetocnema pulicaria); 옥수수 바구미(maize billbug), 스페노포루스 마이디스(Sphenophorus maidis); 옥수수 테두리 진딧물(corn leaf aphid), 로팔로시품 마이디스(Rhopalosiphum maidis); 옥수수 뿌리 진딧물(corn root aphid), 아누라피스 마이디라디시스(Anuraphis maidiradicis); 친치 벌레(chinch bug), 블리수스 류코프테루스 류코프테루스(Blissus leucopterus leucopterus); 붉은 다리 메뚜기(redlegged grasshopper), 멜라노플루스 페무루브룸(Melanoplus femurrubrum); 이주성 메뚜기(migratory grasshopper), 멜라노플루스 상귀니페스(Melanoplus sanguinipes); 옥수수씨 구더기(seedcorn maggot), 하일레미아 플라투라(Hylemya platura); 콘 블롯 리프마이너(corn blot leafminer), 아그로마이자 파르비코르니스(Agromyza parvicornis); 잔디 총채벌레(grass thrip), 아나포트립스 옵스크루루스(Anaphothrips obscrurus); 붉고 작은 개미(thief ant) (솔레놉시스 밀레스타(Solenopsis milesta); 점박이 응애(twospotted spider mite), 테트라니쿠스 우르티카에(Tetranychus urticae); 수수: 수수 천공충(sorghum borer), 칠로 파르텔루스(Chilo partellus); 거염벌레, 스포도프테라 프루기페르다; 왕담배나방, 헬리코베르파 제아; 레서 콘스톡 보어러 엘라스모팔푸스 리그노셀루스; 과립상 거세미나방(granulate cutworm), 펠티아 서브테라네아(Feltia subterranea); 굼벵이, 필로파가 크리니타(Phyllophaga crinita); 철선충, 엘레오데스(Eleodes), 코노데루스(Conoderus), 및 아에올루스(Aeolus) spp.; 곡물 잎벌레(cereal leaf beetle), 오울레마 멜라노푸스(Oulema melanopus); 옥수수 청동벼룩벌레, 카에톡네마 풀리카리아; 옥수수 바구미, 스페노포루스 마이디스; 옥수수 테두리 진딧물, 로팔로시품 마이디스; 황색 사탕수수 진딧물, 시파 플라바(Sipha flava); 친치 벌레, 블리수스 류코프테루스 류코프테루스; 수수 깔따구(sorghum midge), 콘타리니아 소르기콜라(Contarinia sorghicola); 점박이응애 붙이(carmine spider mite), 테트라니쿠스 신나바리누스(Tetranychus cinnabarinus); 점박이 응애, 테트라니쿠스 우르티카에; 밀: 멸강 나방(army worm), 슈달레티아 우니푼크타타(Pseudaletia unipunctata); 거염벌레, 스포도프테라 프루기페르다; 레서 콘스톡 보어러, 엘라스모팔푸스 리그노셀루스; 미국 서부 거세미나방(western cutworm), 아그로티스 오르토고니아(Agrotis orthogonia); 레서 콘스톡 보어러, 엘라스모팔푸스 리그노셀루스; 곡물 잎벌레, 오울레마 멜라노푸스; 클로버잎 바구미(clover leaf weevil), 하이페라 푼크타타(Hypera punctata); 미국 남부 옥수수 뿌리벌레(southern corn rootworm), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi); 러시아 밀 진딧물(Russian wheat aphid); 그린버그(greenbug), 쉬자피스 그라미눔(Schizaphis graminum); 보리수염 진딧물(English grain aphid), 마크로시품 아베나에(Macrosiphum avenae); 붉은 다리 메뚜기, 멜라노플루스 페무루브룸; 디퍼렌셜 메뚜기(differential grasshopper), 멜라노플루스 디퍼렌티알리스(Melanoplus differentialis); 이주성 메뚜기, 멜라노플루스 상귀니페스; 헤션 플라이(Hessian fly), 마예티올라 데스트룩토르(Mayetiola destructor); 밀 깔따구(wheat midge), 시토디플로시스 모셀라나(Sitodiplosis mosellana); 밀 줄기 구더기(wheat stem maggot), 메로마이자 아메리카나(Meromyza americana); 밀 벌브 플라이(wheat bulb fly), 하이레미아 코아르크타타(Hylemya coarctata); 담배 총채벌레(tobacco thrip), 프란클리니엘라 푸스카(Frankliniella fusca); 밀줄기잎벌(wheat stem sawfly), 세푸스 신크투스(Cephus cinctus); 밀 컬 진드기(wheat curl mite), 아세리아 툴리파에(Aceria tulipae); 해바라기: 해바라기 순나방(sunflower bud moth), 술레이마 헬리안타나(Suleima helianthana); 해바라기 나방(sunflower moth), 호모에오소마 엘렉텔룸(Homoeosoma electellum); 해바라기 딱정벌레(sunflower beetle), 자이고그람마 엑클라마티오니스(zygogramma exclamationis); 당근 딱정벌레(carrot beetle), 보티루스 기보수스(Bothyrus gibbosus); 해바라기씨 깔따구(sunflower seed midge), 네오라시오프테라 무르트펠티아나(Neolasioptera murtfeldtiana); 목화: 목화 버드웜(cotton budworm), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens); 목화씨벌레(cotton bollworm), 헬리코베르파 제아; 파밤나방(beet armyworm), 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua); 분홍 목화씨벌레(pink bollworm), 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella); 목화 바구미(boll weevil), 안토노무스 그란디스(Anthonomus grandis); 목화 진딧물, 아피스 고시피이; 목화 플리호퍼(cotton fleahopper), 슈다토모셀리스 세리아투스(Pseudatomoscelis seriatus); 밴드드 윙드 화이트플라이(bandedwinged whitefly), 트리알레우로데스 아부틸로네아(Trialeurodes abutilonea); 녹노린재, 리구스 리네올라리스; 붉은 다리 메뚜기, 멜라노플루스 페무루브룸; 디퍼렌셜 메뚜기, 멜라노플루스 디퍼렌티알리스; 양파 총채벌레(onion thrips), 트립스 타바시(Thrips tabaci); 담배 총채벌레, 프란클린키엘라 푸스카(Franklinkiella fusca); 점박이응애 붙이, 테트라니쿠스 신나바리누스; 점박이 응애, 테트라니쿠스 우르티카에; 벼: 사탕수수 명나방, 디아트라에아 사카랄리스; 거염벌레, 스포도프테라 프루기페르다; 왕담배나방, 헬리코베르파 제아; 포도 콜라스피스(grape colaspis), 콜라스피스 브룬네아(Colaspis brunnea); 벼 물바구미(rice water weevil), 리소르홉트루스 오리조필루스(Lissorhoptrus oryzophilus); 쌀 바구미(rice weevil), 시토필루스 오리자에(Sitophilus oryzae); 벼 매미충(rice leafhopper), 네포테틱스 니그로픽투스(Nephotettix nigropictus); 친치 벌레, 블리수스 류코프테루스 류코프테루스; 녹색 방귀 벌레, 아크로스테르눔 힐라레; 대두: 대두 자나방(soybean looper), 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens); 벨벳빈 캐터필러(velvetbean caterpillar), 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis); 그린 클로버웜(green cloverworm), 플라티페나 스카브라(Plathypena scabra); 유럽 조명충, 오스트리니아 누빌랄리스; 검거세미나방, 아그로티스 입실론; 파밤나방, 스포도프테라 엑시구아; 목화 버드웜, 헬리오티스 비레센스; 목화씨벌레, 헬리코베르파 제아; 멕시코 콩 딱정벌레(Mexican bean beetle), 에필라크나 바리베스티스(Epilachna varivestis); 녹색 복숭아 진딧물(green peach aphid), 마이주스 페르시카에(Myzus persicae); 감자 매미충(potato leafhopper), 엠포아스카 파바에(Empoasca fabae); 녹색 방귀 벌레, 아크로스테르눔 힐라레; 붉은 다리 메뚜기, 멜라노플루스 페무루브룸; 디퍼렌셜 메뚜기, 멜라노플루스 디퍼렌티알리스; 옥수수씨 구더기, 하일레미아 플라투라; 대두 총채벌레, 세리코트립스 바리아빌리스(Sericothrips variabilis); 양파 총채벌레, 트립스 타바시; 딸기 응애(strawberry spider mite), 테트라니쿠스 투르케스타니(Tetranychus turkestani); 점박이 응애, 테트라니쿠스 우르티카에; 보리: 유럽 조명충, 오스트리니아 누빌랄리스; 검거세미나방, 아그로티스 입실론; 그린버그, 쉬자피스 그라미눔; 친치 벌레, 블리수스 류코프테루스 류코프테루스; 녹색 방귀 벌레, 아크로스테르눔 힐라레; 갈색 방귀 벌레(brown stink bug), 유쉬스투스 세르부스(Euschistus servus); 옥수수씨 구더기, 델리아 플라투라(Delia platura); 헤션 플라이, 마예티올라 데스트룩토르; 갈색 밀 진드기(brown wheat mite), 페트로비아 라텐스(Petrobia latens); 유채: 양배추 진딧물, 브레비코리네 브라시카에(Brevicoryne brassicae); 뜀벼룩갑충(Flea beetle), 필로트레타 크루시페라에(Phyllotreta cruciferae); 베르타 밤나방(Bertha armyworm), 마메스트라 콘피구라타(Mamestra configurata); 배추좀나방(Diamond-back moth), 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella); 뿌리 구더기(Root maggot), 델리아(Delia) ssp..

선충류는 헤테로데라 spp., 멜로이도기네 spp., 및 글로보데라 spp.를 포함하는, 뿌리혹 선충, 씨스트 선충 및 뿌리썩이 선충과 같은 기생 선충; 특히, 헤테로데라 글리시네스 (대두 씨스트 선충); 헤테로데라 샤크티이 (비트 씨스트 선충); 헤테로데라 아베나에 (곡류 씨스트 선충); 및 글로보데라 로스토키엔시스 및 글로보데라 파일리다 (감자 씨스트 선충)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 씨스트 선충의 구성원을 포함한다. 뿌리썩이 선충은 프라틸렌쿠스 spp.를 포함한다.

식물 수율의 증가 방법

식물 수율의 증가 방법이 제공된다. 본 방법은 본원에 개시된 살충 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 식물 또는 식물 세포를 제공하는 단계 및 이 식물 또는 이의 종자를 상기 폴리펩티드가 살충 활성을 갖는 해충이 만연하는 (또는 상기 해충에 의한 만연에 감수성인) 들판에서 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 폴리펩티드는 인시류, 초시류, 쌍시류, 반시류, 또는 선충 해충에 대하여 살충 활성을 가지며, 상기 들판에는 인시류, 반시류, 초시류, 쌍시류, 또는 선충 해충이 만연한다. 본원에 정의된 바와 같이, 식물의 "수율"은 식물에 의해 생산되는 바이오매스(biomass)의 품질 및/또는 양을 나타낸다. "바이오매스"는 임의의 측정되는 식물 생성물을 의도한다. 바이오매스 생산의 증가는 측정되는 식물 생성물의 수율의 임의의 향상이다. 식물 수율의 증가는 몇몇의 상업적인 응용을 갖는다. 예를 들어, 식물 잎 바이오매스의 증가는 것은 인간 또는 동물 소비용의 엽채류의 수율을 증가시킬 수 있다. 부가적으로, 잎 바이오매스의 증가는 식물-유래된 의약품 또는 공산품의 생성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 수율의 증가는 살충 서열을 발현하지 않는 식과 비교하여 수율의 적어도 1% 증가, 적어도 3% 증가, 적어도 5% 증가, 적어도 10% 증가, 적어도 20% 증가, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 100%의 또는 이보다 더 큰 증가를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 통계적으로 유의한 증가를 포함할 수 있다. 특정한 방법에서, 식물 수율은 본원에 개시된 살충 단백질을 발현하는 식물의 개선된 해충 저항성의 결과로서 증가된다. 살충 단백질의 발현은 해충의 만연 능력 또는 급이 능력을 감소시킨다.

식물은 또한 하나 이상의 제초제, 살곤충제 또는 살진균제를 포함하는 하나 이상의 화학 조성물로 처리될 수 있다. 예시적인 화학 조성물은 하기를 포함한다: 과실/야채용 제초제: 아트라진(Atrazine), 브로마실(Bromacil), 디우론(Diuron), 글리포세이트, 리누론(Linuron), 메트리부진(Metribuzin), 시마진(Simazine), 트리플루랄린(Trifluralin), 플루아지포프(Fluazifop), 글루포시네이트(Glufosinate), 할로술푸론 고완(Halosulfuron Gowan), 파라쿼트(Paraquat), 프로피자미드(Propyzamide), 세톡시딤(Sethoxydim), 부타페나실(Butafenacil), 할로술푸론(Halosulfuron), 인다지플람(Indaziflam); 과실/야채용 살곤충제: 알디카르브(Aldicarb), 바실루스 투리엔기엔시스(Bacillus thuriengiensis), 카르바릴(Carbaryl), 카르보푸란(Carbo푸란), 클로르피리포스(Chlorpyrifos), 사이퍼메트린(Cypermethrin), 델타메트린(Deltamethrin), 아바멕틴(Abamectin), 사이플루트린(Cyfluthrin)/베타-사이플루트린, 에스펜발레레이트(Esfenvalerate), 람다-사이할로트린(Lambda-cyhalothrin), 아세퀴노실(Acequinocyl), 비페나제이트(Bifenazate), 메톡시페노지드(Methoxyfenozide), 노발루론(Novaluron), 크로마페노지드(Chromafenozide), 티아클로프리드(Thiacloprid), 디노테푸란(Dinote푸란), 플루아크리피림(Fluacrypyrim), 스피로디클로펜(Spirodiclofen), 감마-사이할로트린(Gamma-cyhalothrin), 스피로메시펜(Spiromesifen), 스피노사드(Spinosad), 리낙시피르(Rynaxypyr), 사이아지피르(Cyazypyr), 트리플루뮤론(Triflumuron), 스피로테트라매트(Spirotetramat), 이미다클로프리드(Imidacloprid), 플루벤디아미드(Flubendiamide), 티오디카르브(Thiodicarb), 메타플루미존(Metaflumizone), 술폭사플로르(Sulfoxaflor), 사이플루메토펜(Cyflumetofen), 시아노피라펜(Cyanopyrafen), 클로티아니딘(Clothianidin), 티아메톡삼(Thiamethoxam), 스피노토람(Spinotoram), 티오디카르브, 플로니카미드(Flonicamid), 메티오카르브(Methiocarb), 에마멕틴-벤조에이트(Emamectin-benzoate), 인독사카르브(Indoxacarb), 페나미포스(Fenamiphos), 피리프록시펜(Pyriproxifen), 펜부타틴-옥시드(Fenbutatin-oxid); 과실/야채용 살진균제: 아메톡트라딘(Ametoctradin), 아족시스트로빈(Azoxystrobin), 벤티아발리카르브(Benthiavalicarb), 보스칼리드(Boscalid), 캅탄(Captan), 카르벤다짐(Carbendazim), 클로로탈로닐(Chlorothalonil), 구리, 사이아조파미드(Cyazofamid), 사이플루페나미드(Cyflufenamid), 사이목사닐(Cymoxanil), 사이프로코나졸(Cyproconazole), 사이프로디닐(Cyprodinil), 디페노코나졸(Difenoconazole), 디메토모르프(Dimetomorph), 디티아논(Dithianon), 페나미돈(Fenamidone), 펜헥사미드(Fenhexamid), 플루아지남(플루아지남), 플루디옥소닐(Fludioxonil), 플루오피콜리드(Fluopicolide), 플루오피람(Fluopyram), 플루옥사스트로빈(Fluoxastrobin), 플룩사피록사드(Fluxapyroxad), 폴펫(Folpet), 포세틸(Fosetyl), 이프로디온(Iprodione), 이프로발리카르브(Iprovalicarb), 이소피라잠(Isopyrazam), 크레속심-메틸(Kresoxim-메틸), 만코젭(Mancozeb), 만디프로파미드(Mandipropamid), 메탈락실(Metalaxyl)/메페녹삼(mefenoxam), 메티람(Metiram), 메트라페논(Metrafenone), 마이클로부타닐(Myclobutanil), 펜코나졸(Penconazole), 펜티오피라드(Penthiopyrad), 피콕시스트로빈(Picoxystrobin), 프로파모카르브(Propamocarb), 프로피코나졸(Propiconazole), 프로피넵(Propineb), 프로퀴나지드(Proquinazid), 프로티오코나졸(Prothioconazole), 피라클로스트로빈(Pyraclostrobin), 피리메타닐(Pyrimethanil), 퀴녹시펜(Quinoxyfen), 스피록사민(Spiroxamine), 황, 테부코나졸(Tebuconazole), 티오파네이트-메틸(Thiophanate-메틸), 트리플록시스트로빈(Trifloxystrobin); 곡류용 제초제: 2.4-D, 아미도술푸론(Amidosulfuron), 브로목시닐, 카르펜트라존(Carfentrazone)-E, 클로로톨루론(Chlorotoluron), 클로르술푸론(Chlorsulfuron), 클로디나포프(Clodinafop)-P, 클로피랄리드(Clopyralid), 디캄바(Dicamba), 디클로포프(Diclofop)-M, 디플루페니칸(Diflufenican), 페녹사프로프(Fenoxaprop), 플로라술람(Florasulam), 플루카르바존(Flucarbazone)-NA, 플루페나세트(플루페나세트), 플루피로술푸론(Flupyrosulfuron)-M, 플루록시피르(Fluroxypyr), 플루르타몬(Flurtamone), 글리포세이트, 요오도술푸론(Iodosulfuron), 이옥시닐(Ioxynil), 이소프로튜론(Isoproturon), MCPA, 메소술푸론(Mesosulfuron), 메트술푸론(Metsulfuron), 펜디메탈린(Pendimethalin), 피녹사덴(Pinoxaden), 프로폭시카르바존(Propoxycarbazone), 프로술포카르브(Prosulfocarb), 피록스술람(Pyroxsulam), 술포술푸론(Sulfosulfuron), 티펜술푸론(Thifensulfuron), 트랄콕시딤(Tralkoxydim), 트리아술푸론(Triasulfuron), 트리베누론(Tribenuron), 트리플루랄린, 트리토술푸론(Tritosulfuron); 곡류용 살진균제: 아족시스트로빈, 빅사펜(Bixafen), 보스칼리드, 카르벤다짐, 클로로탈로닐, 사이플루페나미드, 사이프로코나졸, 사이프로디닐, 디목시스트로빈(Dimoxystrobin), 에폭시코나졸(Epoxiconazole), 펜프로피딘(Fenpropidin), 펜프로피모르프(Fenpropimorph), 플루오피람, 플루옥사스트로빈, 플루퀸코나졸(Fluquinconazole), 플룩사피록사드, 이소피라잠, 크레속심-메틸, 메트코나졸(Metconazole), 메트라페논, 펜티오피라드, 피콕시스트로빈, 프로클로라즈(Prochloraz), 프로피코나졸, 프로퀴나지드, 프로티오코나졸, 파이라클로스트로빈, 퀴녹시펜, 스피록사민, 테부코나졸, 티오파네이트-메틸, 트리플록시스트로빈; 곡류용 살곤충제: 디메토에이트(Dimethoate), 람다-사이할트린(Lambda-cyhalthrin), 델타메트린, 알파-사이퍼메트린, β-사이플루트린, 비펜트린(Bifenthrin), 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세타미프리드(Acetamiprid), 디네토푸란(Dineto푸란), 클로르피리포스(Clorphyriphos), 피리미카르브(Pirimicarb), 메티오카르브, 술폭사플로르; 옥수수용 제초제: 아트라진, 알라클로르(Alachlor), 브로목시닐, 아세토클로르(Acetochlor), 디캄바, 클로피랄리드, (S-)디메테나미드(Dimethenamid), 글루포시네이트, 글리포세이트, 이속사플루톨(Isoxaflutole), (S-)메톨라클로르(Metolachlor), 메소트리온(Mesotrione), 니코술푸론(Nicosulfuron), 프리미술푸론(Primisulfuron), 림술푸론(Rimsulfuron), 술코트리온(Sulcotrione), 포람술푸론(Foramsulfuron), 토프라메존(Topramezone), 템보트리온(Tembotrione), 사플루페나실(Saflufenacil), 티엔카르바존(Thiencarbazone), 플루페나세트(Flufenacet), 파이록사술폰(Pyroxasulfon); 옥수수용 살곤충제: 카르보푸란, 클로르피리포스, 비펜트린, 피프로닐(Fipronil), 이미다클로프리드, 람다-사이할로트린, 테플루트린(Tefluthrin), 테르부포스(Terbufos), 티아메톡삼, 클로티아니딘, 스피로메시펜, 플루벤디아미드, 트리플루뮤론, 리낙시피르, 델타메트린, 티오디카르브, β-사이플루트린, 사이퍼메트린, 비펜트린, 루페누론(Lufenuron), 테부피림포스(Tebupirimphos), 에티프롤(Ethiprole), 사이아지피르, 티아클로프리드, 아세타미프리드, 디네토푸란, 아베르멕틴(Avermectin); 옥수수용 살진균제: 아족시스트로빈, 빅사펜, 보스칼리드, 사이프로코나졸, 디목시스트로빈, 에폭시코나졸, 페니트로판(Fenitropan), 플루오피람, 플루옥사스트로빈, 플룩사피록사드, 이소피라잠, 메트코나졸, 펜티오피라드, 피콕시스트로빈, 프로피코나졸, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 테부코나졸, 트리플록시스트로빈; 벼용 제초제: 부타클로르(Butachlor), 프로파닐(Propanil), 아짐술푸론(Azimsulfuron), 벤술푸론(Bensulfuron), 사이할로포프(Cyhalofop), 다이뮤론(Daimuron), 펜트라자미드(Fentrazamide), 이마조술푸론(Imazosulfuron), 메페나세트(Mefenacet), 옥사지클로메폰(Oxaziclomefone), 피라조술푸론(Pyrazosulfuron), 피리부티카르브(Pyributicarb), 퀸클로락(Quinclorac), 티오벤카르브(Thiobencarb), 인다노판(Indanofan), 플루페나세트, 펜트라자미드, 할로술푸론, 옥사지클로메폰, 벤조비사이클론(Benzobicyclon), 피리프탈리드(Pyriftalid), 페녹스술람(Penoxsulam), 비스피리박(Bispyribac), 옥사디아르길(Oxadiargyl), 에톡시술푸론(Ethoxysulfuron), 프레틸라클로르(Pretilachlor), 메소트리온, 테푸릴트리온(Tefuryltrione), 옥사디아존(Oxadiazone), 페녹사프로프, 피리미술판(Pyrimisulfan); 벼용 살곤충제: 디아지논(Diazinon), 페노부카르브(Fenobucarb), 벤푸라카르브(Benfuracarb), 부프로페진(Buprofezin), 디노테푸란, 피프로닐, 이미다클로프리드, 이소프로카르브(Isoprocarb), 티아클로프리드, 크로마페노지드, 클로티아니딘, 에티프롤, 플루벤디아미드, 리낙시피르, 델타메트린, 아세타미프리드, 티아메톡삼, 사이아지피르, 스피노사드, 스피노토람, 에마멕틴-벤조에이트, 사이퍼메트린, 클로르피리포스(Chlorpyriphos), 에토펜프록스(Etofenprox), 카르보푸란, 벤푸라카르브, 술폭사플로르; 벼용 살진균제: 아족시스트로빈, 카르벤다짐, 카르프로파미드(Carpropamid), 디클로사이메트(Diclocymet), 디페노코나졸, 에디펜포스(Edifenphos), 페림존(Ferimzone), 젠타마이신(Gentamycin), 헥사코나졸(Hexaconazole), 하이멕사졸(Hymexazol), 이프로벤포스(Iprobenfos) (IBP), 이소프로티올란(Isoprothiolane), 이소티아닐(Isotianil), 카수가마이신(Kasugamycin), 만코젭, 메토미노스트로빈(Metominostrobin), 오리사스트로빈(Orysastrobin), 펜사이큐론(Pencycuron), 프로베나졸(Probenazole), 프로피코나졸, 프로피넵, 파이로퀼론(Pyroquilon), 테부코나졸, 티오파네이트-메틸, 티아디닐(Tiadinil), 트리사이클라졸(Tricyclazole), 트리플록시스트로빈, 발리다마이신(Validamycin); 목화용 제초제: 디우론, 플루오메투론(Fluometuron), MSMA, 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 프로메트린(Prometryn), 트리플루랄린, 카르펜트라존, 클레토딤(Clethodim), 플루아지포프-부틸, 글리포세이트, 노르플루라존(Norflurazon), 펜디메탈린, 피리티오박-소듐(Pyrithiobac-sodium), 트리플록시술푸론(Trifloxysulfuron), 테프랄록시딤(Tepraloxydim), 글루포시네이트, 플루미옥사진(Flumioxazin), 티디아주론(Thidiazuron); 목화용 살곤충제: 아세페이트(Acephate), 알디카르브, 클로르피리포스, 사이퍼메트린, 델타메트린, 아바멕틴, 아세타미프리드, 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin Benzoate), 이미다클로프리드, 인독사카르브, 람다-사이할로트린, 스피노사드, 티오디카르브, 감마-사이할로트린, 스피로메시펜, 피리달릴(Pyridalyl), 플로니카미드 플루벤디아미드, 트리플루뮤론, 리낙시피르, 베타-사이플루트린,스피로테트라매트, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 디네토푸란, 플루벤디아미드, 사이아지피르, 스피노사드, 스피노토람, 감마 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 티오디카르브, 아베르멕틴, 플로니카미드, 피리달릴, 스피로메시펜, 술폭사플로르; 목화용 살진균제: 아족시스트로빈, 빅사펜, 보스칼리드, 카르벤다짐, 클로로탈로닐, 구리, 사이프로코나졸, 디페노코나졸, 디목시스트로빈, 에폭시코나졸, 페나미돈, 플루아지남(Fluazinam), 플루오피람, 플루옥사스트로빈, 플룩사피록사드, 이프로디온, 이소피라잠, 이소티아닐, 만코젭, 마넵(Maneb), 메토미노스트로빈, 펜티오피라드, 피콕시스트로빈, 프로피넵, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 퀸토젠(Quintozene), 테부코나졸, 테트라코나졸(Tetraconazole), 티오파네이트-메틸, 트리플록시스트로빈; 대두용 제초제: 알라클로르, 벤타존(Bentazone), 트리플루랄린, 클로리뮤론-에틸(Chlorimuron-Ethyl), 클로란술람-메틸(Cloransulam-Methyl), 페녹사프로프, 포메사펜(Fomesafen), 플루아지포프, 글리포세이트, 이마자목스(Imazamox), 이마자퀸(Imazaquin), 이마제타피르(Imazethapyr), (S-)메톨라클로르, 메트리부진, 펜디메탈린, 테프랄록시딤, 글루포시네이트; 대두용 살곤충제: 람다-사이할로트린, 메토밀(Methomyl), 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세타미프리드, 디네토푸란, 플루벤디아미드, 리낙시피르, 사이아지피르, 스피노사드, 스피노토람, 에마멕틴-벤조에이트, 피프로닐, 에티프롤, 델타메트린, β-사이플루트린, 감마 및 람다 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 스피로테트라매트, 스피노디클로펜(Spinodiclofen), 트리플루뮤론, 플로니카미드, 티오디카르브, 베타-사이플루트린; 대두용 살진균제: 아족시스트로빈, 빅사펜, 보스칼리드, 카르벤다짐, 클로로탈로닐, 구리, 사이프로코나졸, 디페노코나졸, 디목시스트로빈, 에폭시코나졸, 플루아지남, 플루오피람, 플루옥사스트로빈, 플루트리아폴(Flutriafol), 플룩사피록사드, 이소피라잠, 이프로디온, 이소티아닐, 만코젭, 마넵, 메트코나졸, 메토미노스트로빈, 마이클로부타닐, 펜티오피라드, 피콕시스트로빈, 프로피코나졸, 프로피넵, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 테부코나졸, 테트라코나졸, 티오파네이트-메틸, 트리플록시스트로빈; 사탕무용 제초제: 클로리다존(Chloridazon), 데스메디팜(Desmedipham), 에토푸메세이트(Ethofumesate), 펜메디팜(Phenmedipham), 트리알레이트(Triallate), 클로피랄리드, 플루아지포프, 레나실(Lenacil), 메타미트론(Metamitron), 퀸메락(Quinmerac), 사이클록시딤(Cycloxydim), 트리플루술푸론(Triflusulfuron), 테프랄록시딤, 퀴잘로포프(Quizalofop); 사탕무용 살곤충제: 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세타미프리드, 디네토푸란, 델타메트린, β-사이플루트린, 감마/람다 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 테플루트린, 리낙시피르, 사이악시피르(Cyaxypyr), 피프로닐, 카르보푸란; 캐놀라용 제초제: 클로피랄리드, 디클로포프, 플루아지포프, 글루포시네이트, 글리포세이트, Metazachlor, 트리플루랄린 에타메트술푸론(Ethametsulfuron), 퀸메락, 퀴잘로포프, 클레토딤, 테프랄록시딤; 캐놀라용 살진균제: 아족시스트로빈, 빅사펜, 보스칼리드, 카르벤다짐, 사이프로코나졸, 디페노코나졸, 디목시스트로빈, 에폭시코나졸, 플루아지남, 플루오피람, 플루옥사스트로빈, 플루실라졸(Flusilazole), 플룩사피록사드, 이프로디온, 이소피라잠, 메피쿼트-클로라이드(Mepiquat-chloride), 메트코나졸, 메토미노스트로빈, 파클로부트라졸(Paclobutrazole), 펜티오피라드., 피콕시스트로빈, 프로클로라즈, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 테부코나졸, 티오파네이트-메틸, 트리플록시스트로빈, 빈클로졸린(Vinclozolin); 캐놀라용 살곤충제: 카르보푸란, 티아클로프리드, 델타메트린, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 아세타미프리드, 디네토푸란, β-사이플루트린, 감마 및 람다 사이할로트린, 타우-플루발레리에이트(tau-Fluvaleriate), 에티프롤, 스피노사드, 스피노토람, 플루벤디아미드, 리낙시피르, 사이아지피르, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-디플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온.

하기 실시예는 예시로 제공되며, 제한하는 것으로 제공되는 것은 아니다.

실험 실시예

실시예 1. 바실루스 투린기엔시스로부터의 신규한 살충 유전자의 발견

하기의 단계를 이용하여 박테리아 주 ATX47307 및 ATX65002로부터 신규한 살충 유전자를 확인하였다:

● 주로부터의 전체 DNA의 준비. 전체 DNA는 게놈 DNA와 염색체외 DNA 둘 모두를 함유한다. 염색체외 DNA는 하기 중 일부 또는 전부의 혼합물을 함유한다: 다양한 크기의 플라스미드; 파아지 염색체; 기타 미특성화 염색체외 분자.

● DNA의 서열결정. 전체 DNA를 차세대 서열결정법을 통해 서열결정한다.

● 상동성 및/또는 기타 컴퓨터 분석을 통한 추정 독소 유전자의 확인.

● 요구될 경우, 몇몇 PCR 또는 클로닝 전략 (예를 들어, TAIL-PCR) 중 하나에 의해 관심 대상의 유전자의 서열 마무리.

실시예 2. 살충 활성의 분석

본 발명의 뉴클레오티드 서열을 살충 단백질을 생성하는 그의 능력에 대해 테스트할 수 있다. 해충에 대하여 살충제로서 작용하는 살충 단백질의 능력은 종종 많은 방식으로 평가된다. 본 기술 분야에 잘 알려진 한 가지 방법은 급이 분석을 수행하는 것이다. 그러한 급이 분석에서, 테스트할 화합물을 함유하는 샘플 또는 대조 샘플 중 어느 하나에 해충을 노출시킨다. 종종 이것은 테스트될 물질 또는 그러한 물질의 적합한 희석물을 해충이 섭취할 물질, 예컨대 인공 규정식 상에 둠으로써 수행된다. 테스트될 물질은 액체, 고체 또는 슬러리로 구성될 수 있다. 테스트될 물질을 표면 상에 둔 후 건조시킬 수 있다. 대안적으로, 테스트될 물질을 녹인 인공 규정식과 혼합할 수 있으며, 그 후 분석 챔버 내에 분배할 수 있다. 분석 챔버는 예를 들어, 컵, 디쉬(dish) 또는 마이크로타이터 플레이트의 웰일 수 있다.

흡즙성 해충(sucking pest) (예를 들어, 진딧물)의 분석은 테스트 물질을 파티션(partition), 이상적으로는 흡즙성 해충의 흡즙 입 부분에 의해 뚫릴 수 있는 부분에 의해 곤충으로부터 분리하여 테스트 물질의 섭취를 허용하는 것을 수반할 수 있다. 종종 테스트 물질을 수크로스와 같은 급이 자극제와 혼합하여 테스트 화합물의 섭취를 촉진한다.

다른 유형의 분석은 해충의 입, 또는 소화관 내로 테스트 물질을 미세주입하는 것 및 트랜스제닉 식물의 개발, 이어서 트랜스제닉 식물을 먹는 해충의 능력의 테스트를 포함할 수 있다. 식물 테스트는 보통 소비되는 식물 부분, 예를 들어, 잎에 부착된 작은 케이지의 단리, 또는 곤충이 들어있는 케이지에 있어서 전체 식물의 단리를 수반할 수 있다.

해충을 분석하는 다른 방법 및 접근법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Robertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL]에서 발견될 수 있다. 대안적으로, 분석은 저널 [Arthropod Management Tests] 및 [Journal of Economic Entomology]에 일반적으로 기술되거나 또는 미국 곤충학회(Entomological Society of America; ESA) 구성원과의 토의에 의해 개시된다.

일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 살충 단백질의 독소 영역을 코딩하는 DNA 영역을 말토스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP)을 코딩하는 malE 유전자 뒤에서 이. 콜라이(E. coli) 발현 벡터 pMAL-C4x 내로 클로닝한다. 이러한 프레임 내(in-frame) 융합은 이. 콜라이에서 MBP-Axmi 융합 단백질 발현을 야기한다.

이. 콜라이에서의 발현을 위해, BL21*DE3을 개별 플라스미드로 형질전환시킨다. 카르베니실린과 글루코스로 보충된 LB에 단일 콜로니를 접종하고, 37℃에서 하룻밤 성장시킨다. 다음 날, 1%의 하룻밤 배양물을 신선한 배지에 접종하고 대수기까지 37℃에서 성장시킨다. 후속적으로, 배양물을 20℃에서 하룻밤 0.3 mM IPTG로 유도한다. 각 세포 펠렛을 20 mM 트리스(Tris)-Cl 완충제, pH 7.4 + 200 mM NaCl + 1 mM DTT + 프로테아제 억제제에 현탁하고 초음파 처리한다. SDS-PAGE에 의한 분석을 이용하여 융합 단백질의 발현을 확증할 수 있다.

그 후 MBP-axmi 융합 단백질의 친화성 정제를 위하여 전체 무세포 추출물을 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)에 부착된 아밀로스 컬럼에서 진행시킨다. 결합된 융합 단백질을 10 mM 말토스 용액으로 수지로부터 용출시킨다. 그 후, 정제된 융합 단백질을 인자 Xa 또는 트립신으로 절단하여 Axmi 단백질로부터 아미노 말단 MBP 태그를 제거한다. 단백질의 용해도 및 절단을 SDS-PAGE로 결정할 수 있다.

실시예 3. 발현 및 정제

Axmi477 (본원에서 서열 번호 8로 개시됨), Axmi482 (본원에서 서열 번호 13으로 개시됨), Axmi486 (본원에서 서열 번호 16으로 개시됨), 및 Axmi525 (본원에서 서열 번호 26으로 개시됨)의 절단된 변이체들을 발현시키고 생물활성에 대하여 분석하였다. 3' 말단에 AscI 링커를 포함시키는 프라이머를 이용하여 헤르쿨라아제(HERCULASE)^® II 퓨전(Fusion) DNA 폴리머라아제를 이용하여 유전자를 그의 각 주로부터 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물을 AscI로 분해하고 pMalC4X 벡터 내로 라이게이션시켰다. 클론을 서열결정에 의해 확인하고 Bl21 컴피턴트(competent) 세포를 형질전환시켰다. 각각의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하고 대수기까지 37℃에서 성장시키고, 18시간 동안 20℃에서 0.5 mM IPTG로 유도하였다. 정제된 단백질을 실온에서 하룻밤 1:50의 비로 인자 Xa로 분해시켰다. 정제된 단백질을 표준 프로토콜에 따라, 선택된 곤충 해충에 대하여 생물학적 분석을 하였다. 결과를 표 5 내지 8에 나타낸다.

발육 저지 점수:

0 - 활성 없음

1 - 균일하지 않은 발육 저지

2 - 약간 균일한 발육 저지

3 - 강하고 균일한 발육 저지

4 - 심하게 균일한 발육 저지

실시예 4. 식물 발현을 위한 유전자의 벡터링(Vectoring)

본 발명의 코딩 영역을 식물에서의 발현을 위하여 적절한 프로모터와 종결 서열에 연결시킨다. 그러한 서열은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며 단자엽 식물에서의 발현을 위한 벼 액틴 프로모터 또는 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 쌍자엽 식물에서의 발현을 위한 아라비돕시스(Arabidopsis) UBQ3 프로모터 또는 CaMV 35S 프로모터, 및 nos 또는 PinII 종결자를 포함할 수 있다. 프로모터 - 유전자 - 종결자 구성물을 생성하는 그리고 확인하는 기법이 또한 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명의 일 측면에서, 합성 DNA 서열을 설계하고 생성한다. 이들 합성 서열은 모(parent) 서열에 비하여 변경된 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 본질적으로 모 서열과 동일한 단백질을 코딩한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 생성된 펩티드가 소포체 또는 아포플라스트(apoplast)와 같은 식물 소기관에 표적화되도록 합성 유전자의 변형 버전을 설계한다. 융합 단백질을 식물 소기관으로 표적화하는 것으로 알려진 펩티드 서열은 본 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 백색 루핀 루피너스 알부스(Lupinus albus) (젠뱅크(GENBANK)^® ID GI:14276838, 문헌[Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606])로부터의 산 포스포타아제 유전자의 N-말단 영역은 이종 단백질을 소포체 표적화시키는 것으로 본 기술 분야에 알려져 있다. 생성된 융합 단백질이 C-말단에서 상기 펩티드 N-말단-라이신-아스파르트산-글루탐산-류신 (즉, "KDEL" 모티프, 서열 번호 27)을 포함하는 소포체 보유 서열을 또한 함유한다면, 융합 단백질은 소포체로 표적화될 것이다. 융합 단백질에서 C-말단에 소포체 표적화 서열이 결여된다면, 단백질은 소포체로 표적화되겠지만, 궁극적으로는 아포플라스트에 격리될 것이다.

따라서, 이 유전자는 C-말단에 KDEL 서열(서열 번호 27)뿐만 아니라, 본 발명의 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 백색 루핀 루피너스 알부스(젠뱅크^® ID GI:14276838, 상기 문헌[Miller et al., 2001])로부터의 산 포스파타아제 유전자의 N-말단의 31개 아미노산을 함유하는 융합 단백질을 코딩한다. 따라서, 생성된 단백질은 식물 세포에서의 발현시에 식물 소포체에 표적화될 것으로 예상된다.

상기한 식물 발현 카세트를 형질전환된 세포 및 조직의 선발을 돕기 위하여 적절한 식물 선발가능 마커와 조합하고, 식물 형질전환용 벡터 내로 라이게이션시킨다. 이는 아그로박테륨-매개 형질전환으로부터의 이원 벡터 또는 에어로졸 또는 바이오리스틱 형질전환을 위한 단순 플라스미드 벡터를 포함할 수 있다.

실시예 5. 본원에 기술된 살충 단백질 유전자를 이용한 옥수수 세포의 형질전환

옥수수 이삭은 수분한지 8 내지 12일 후에 가장 잘 수집된다. 배아를 상기 이삭으로부터 단리하며, 크기가 0.8 내지 1.5 mm인 배아가 형질전환에 사용하기에 바람직하다. 배아를 DN62A5S 배지 (3.98 g/L의 N6 염; 1 mL/L (1000x 스톡(Stock))의 N6 비타민; 800 mg/L의 L-아스파라긴; 100 mg/L의 미오-이노시톨; 1.4 g/L의 L-프롤린; 100 mg/L의 카사미노산(Casamino acid); 50 g/L의 수크로스; 1 mL/L (1 mg/mL의 스톡)의 2,4-D)와 같은 적합한 인큐베이션 배지 상에 배반을 위로 하여 플레이팅한다. 그러나, DN62A5S 이외의 배지 및 염이 적합하며, 이는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 배아를 암소에서 25℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 그러나, 배아를 하룻밤 인큐베이션하는 것 그 자체는 필요하지 않다.

생성된 외식체를 정방형 그물망(mesh square) (플레이트당 30 내지 40개)으로 이전시키고, 약 30 내지 45분 동안 삼투 매체 상으로 옮기고, 그 후, 빔 조사 플레이트(beaming plate)로 옮긴다. (예를 들어, 국제 공개 제0138514호 및 미국 특허 제5,240,842호 참조).

식물 세포에서의 본 발명의 유전자로 설계된 DNA 구성물을 본질적으로 국제 공개 제0138514호에 기술된 조건을 이용하여 에어로졸 빔 가속기를 이용하여 식물 조직 내로 가속화한다. 빔 조사 후, 배아를 삼투 매체 상에서 약 30분 동안 인큐베이션하고, 암소에서 25℃에서 인큐베이션 매체 상에 하룻밤 둔다. 빔 조사된 외식체의 과도한 손상을 피하기 위하여, 이를 회복 배지로 옮기기 전에 24시간 이상 동안 인큐베이션한다. 그 후, 배아를 암소에서 25℃에서 약 5일 동안 회복 기간용 배지 상에 스프레드하고(spread), 그 후 선발 배지로 옮긴다. 외식체를 이용되는 특정한 선발의 성질 및 특성에 따라 8주까지 선발 배지에서 인큐베이션한다. 선발 기간 후, 성숙 부정배의 형성이 관찰될 때까지, 생성된 캘러스를 배아 성숙용 배지로 옮긴다. 그 후, 생성된 성숙 부정배를 저광 하에 두고, 재생 과정을 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 개시한다. 생성된 신초를 발근용 배지 상에서 발근시키고, 생성된 식물을 보육 포트(nursery pot)로 옮기고, 트랜스제닉 식물로서 번식시킨다.

재료

용액의 pH를 1 N KOH/1 N KCl을 이용하여 pH 5.8로 조정하고, 젤라이트(Gelrite) (시그마)를 3 g/L까지의 농도로 첨가하고, 배지를 오토클레이브한다(autoclaved). 50℃로의 냉각 후, 질산은의 5 mg/ml 스톡 용액 (피토테크놀로지 랩스) 2 ml/L를 첨가한다.

실시예 6. 아그로박테륨-매개된 형질전환에 의한 식물 세포에서의 본 발명의 유전자의 형질전환

이삭은 수분한지 8 내지 12일 후에 가장 잘 수집된다. 배아를 상기 이삭으로부터 단리하며, 크기가 0.8 내지 1.5 mm인 배아가 형질전환에 사용하기에 바람직하다. 배아를 적합한 인큐베이션 배지 상에 배반을 위로 하여 플레이팅하고, 암소에서 25℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 그러나, 배아를 하룻밤 인큐베이션하는 것 그 자체는 필요하지 않다. 배아를 Ti 플라스미드 매개된 전달을 위한 적절한 벡터를 함유하는 아그로박테륨 주와 약 5 내지 10분 동안 접촉시키고, 그 후, 약 3일 동안 (암소에서 25℃) 동시 배양용 배지 상에 플레이팅한다. 동시 배양 후, 약 5일 동안 (암소에서 25℃에서) 외식체를 회복 기간용 배지로 옮긴다. 외식체를 이용되는 특정한 선발의 성질 및 특성에 따라 8주까지 선발 배지에서 인큐베이션한다. 선발 기간 후, 성숙 부정배의 형성이 관찰될 때까지, 생성된 캘러스를 배아 성숙용 배지로 옮긴다. 그 후, 생성된 성숙 부정배를 저광 하에 두고, 재생 과정을 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 개시한다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자의 기술의 수준을 나타내는 것이다. 모든 간행물 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 특정적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

전술한 발명은 이해의 명확성을 위하여 예시 및 실시예로 약간 상세하게 설명되었지만, 특정한 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있음이 명백하다.

<110> Athenix Corp. Lehtinen, Duane Sampson, Kimberly Roberts, Kira Dunn, Ethan Chougule, Nana <120> AXMI477, AXMI482, AXMI486 AND AXMI525 TOXIN GENES AND METHODS FOR THEIR USE <130> APA136054 <150> 61/913,905 <151> 2013-12-09 <150> 61/913,911 <151> 2013-12-09 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3695 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 1 atgaatcgaa ataatcaagg tgaatatgaa attattgacg cttccacttg tggttgttcg 60 tcagatgatg ttgttcaata tcctttggca agagatccga atgctgcatt ccaaaatatg 120 aattataaag attatttgaa aatgtctgac ggagactacg tcgattctta tataaaccca 180 ggcttatcta ttggtcgtag agatgtgacc ctaactggag ttggtattgt tgcgctaata 240 gtagggactt taggtggtcc agttgggggt atagtaactg gcttgatttc ctctctttta 300 ggattattgt ggccaagtaa tgataatgat gtatgggaag cttttatggc acaaatagaa 360 gagctaattg aacaaaggat agcagatcaa gtagtaagga atgcactcga taacttaact 420 ggattgcgcg attattataa tcaataccta ttagcattgg aggagtggca ggaaaggccg 480 aacgctgtaa gatctacctt agtttttaat agatttgaaa ccctgcattc tcactttgta 540 actagtatgc caagctttgg 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Pro Thr Ile Val Pro Val Lys Gln Thr Asn 225 230 235 240 Thr Lys <210> 20 <211> 343 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 20 Met Arg Glu Lys Asp Met Asp Lys Lys Ile Thr Lys Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Met Ile Met Gly Ile Ser Val Leu Ser Ser Pro Leu Ala Val Ala Ala 20 25 30 Lys Thr Glu Asn Asn Lys Glu Gln His Val Ile Thr Gln Phe Asn Gln 35 40 45 Arg Glu Asn Lys Phe Pro Asp Val Gly Gln Gly Ile Gln Trp Leu Ser 50 55 60 Gln Phe Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asn Asn Gly Glu Gly Tyr Ser Leu 65 70 75 80 Gly Gln Asp Val Met Ser Tyr Phe Leu Glu Val Lys Asn Ser Tyr Gly 85 90 95 Gln Leu Ala Met Glu Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp Ala 100 105 110 Gly Gln Ser Asp Leu Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu Asn 115 120 125 Ser Thr Glu Phe Lys Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr 130 135 140 Glu Asn Gly Phe Met Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly Ile 145 150 155 160 Pro Phe Val Ala Glu Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn Phe 165 170 175 Asn His Thr Asn Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile Ala 180 185 190 Pro Ser Gln Ser Ile Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val Thr 195 200 205 Ala Leu Leu Asp Val Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr Ser 210 215 220 Glu Ile Gly Leu Asn Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu Val 225 230 235 240 Tyr Lys Tyr Gly Gly Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu Tyr 245 250 255 Asp Glu Gly Tyr Lys Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly Asn 260 265 270 Val Ile Pro Glu Glu Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro Asn 275 280 285 His Leu Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly Ser 290 295 300 Val Phe Asn Val Lys Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile 305 310 315 320 Glu Lys Thr Glu Asn Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val Lys 325 330 335 Gln Thr Asn Thr Asn Thr Lys 340 <210> 21 <211> 338 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 21 Met Asp Lys Lys Ile Thr Lys Ala Ala Leu Ser Met Ile Met Gly Ile 1 5 10 15 Ser Val Leu Ser Ser Pro Leu Ala Val Ala Ala Lys Thr Glu Asn Asn 20 25 30 Lys Glu Gln His Val Ile Thr Gln Phe Asn Gln Arg Glu Asn Lys Phe 35 40 45 Pro Asp Val Gly Gln Gly Ile Gln Trp Leu Ser Gln Phe Tyr Gly Lys 50 55 60 Ser Leu Lys Asn Asn Gly Glu Gly Tyr Ser Leu Gly Gln Asp Val Met 65 70 75 80 Ser Tyr Phe Leu Glu Val Lys Asn Ser Tyr Gly Gln Leu Ala Met Glu 85 90 95 Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp Ala Gly Gln Ser Asp Leu 100 105 110 Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu Asn Ser Thr Glu Phe Lys 115 120 125 Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr Glu Asn Gly Phe Met 130 135 140 Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly Ile Pro Phe Val Ala Glu 145 150 155 160 Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn Phe Asn His Thr Asn Gly 165 170 175 Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile Ala Pro Ser Gln Ser Ile 180 185 190 Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val Thr Ala Leu Leu Asp Val 195 200 205 Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr Ser Glu Ile Gly Leu Asn 210 215 220 Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu Val Tyr Lys Tyr Gly Gly 225 230 235 240 Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu Tyr Asp Glu Gly Tyr Lys 245 250 255 Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly Asn Val Ile Pro Glu Glu 260 265 270 Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro Asn His Leu Leu Ala Ser 275 280 285 Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly Ser Val Phe Asn Val Lys 290 295 300 Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile Glu Lys Thr Glu Asn 305 310 315 320 Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val Lys Gln Thr Asn Thr Asn 325 330 335 Thr Lys <210> 22 <211> 327 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 22 Met Ile Met Gly Ile Ser Val Leu Ser Ser Pro Leu Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Lys Thr Glu Asn Asn Lys Glu Gln His Val Ile Thr Gln Phe Asn Gln 20 25 30 Arg Glu Asn Lys Phe Pro Asp Val Gly Gln Gly Ile Gln Trp Leu Ser 35 40 45 Gln Phe Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asn Asn Gly Glu Gly Tyr Ser Leu 50 55 60 Gly Gln Asp Val Met Ser Tyr Phe Leu Glu Val Lys Asn Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Gln Leu Ala Met Glu Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp Ala 85 90 95 Gly Gln Ser Asp Leu Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu Asn 100 105 110 Ser Thr Glu Phe Lys Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr 115 120 125 Glu Asn Gly Phe Met Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly Ile 130 135 140 Pro Phe Val Ala Glu Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn Phe 145 150 155 160 Asn His Thr Asn Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile Ala 165 170 175 Pro Ser Gln Ser Ile Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val Thr 180 185 190 Ala Leu Leu Asp Val Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr Ser 195 200 205 Glu Ile Gly Leu Asn Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu Val 210 215 220 Tyr Lys Tyr Gly Gly Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Asp Glu Gly Tyr Lys Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly Asn 245 250 255 Val Ile Pro Glu Glu Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro Asn 260 265 270 His Leu Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly Ser 275 280 285 Val Phe Asn Val Lys Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile 290 295 300 Glu Lys Thr Glu Asn Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val Lys 305 310 315 320 Gln Thr Asn Thr Asn Thr Lys 325 <210> 23 <211> 325 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 23 Met Gly Ile Ser Val Leu Ser Ser Pro Leu Ala Val Ala Ala Lys Thr 1 5 10 15 Glu Asn Asn Lys Glu Gln His Val Ile Thr Gln Phe Asn Gln Arg Glu 20 25 30 Asn Lys Phe Pro Asp Val Gly Gln Gly Ile Gln Trp Leu Ser Gln Phe 35 40 45 Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asn Asn Gly Glu Gly Tyr Ser Leu Gly Gln 50 55 60 Asp Val Met Ser Tyr Phe Leu Glu Val Lys Asn Ser Tyr Gly Gln Leu 65 70 75 80 Ala Met Glu Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp Ala Gly Gln 85 90 95 Ser Asp Leu Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu Asn Ser Thr 100 105 110 Glu Phe Lys Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr Glu Asn 115 120 125 Gly Phe Met Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly Ile Pro Phe 130 135 140 Val Ala Glu Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn Phe Asn His 145 150 155 160 Thr Asn Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile Ala Pro Ser 165 170 175 Gln Ser Ile Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val Thr Ala Leu 180 185 190 Leu Asp Val Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr Ser Glu Ile 195 200 205 Gly Leu Asn Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu Val Tyr Lys 210 215 220 Tyr Gly Gly Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu Tyr Asp Glu 225 230 235 240 Gly Tyr Lys Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly Asn Val Ile 245 250 255 Pro Glu Glu Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro Asn His Leu 260 265 270 Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly Ser Val Phe 275 280 285 Asn Val Lys Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile Glu Lys 290 295 300 Thr Glu Asn Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val Lys Gln Thr 305 310 315 320 Asn Thr Asn Thr Lys 325 <210> 24 <211> 259 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 24 Met Ser Tyr Phe Leu Glu Val Lys Asn Ser Tyr Gly Gln Leu Ala Met 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp Ala Gly Gln Ser Asp 20 25 30 Leu Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu Asn Ser Thr Glu Phe 35 40 45 Lys Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr Glu Asn Gly Phe 50 55 60 Met Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly Ile Pro Phe Val Ala 65 70 75 80 Glu Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn Phe Asn His Thr Asn 85 90 95 Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile Ala Pro Ser Gln Ser 100 105 110 Ile Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val Thr Ala Leu Leu Asp 115 120 125 Val Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr Ser Glu Ile Gly Leu 130 135 140 Asn Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu Val Tyr Lys Tyr Gly 145 150 155 160 Gly Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu Tyr Asp Glu Gly Tyr 165 170 175 Lys Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly Asn Val Ile Pro Glu 180 185 190 Glu Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro Asn His Leu Leu Ala 195 200 205 Ser Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly Ser Val Phe Asn Val 210 215 220 Lys Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile Glu Lys Thr Glu 225 230 235 240 Asn Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val Lys Gln Thr Asn Thr 245 250 255 Asn Thr Lys <210> 25 <211> 244 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 25 Met Glu Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp Ala Gly Gln Ser 1 5 10 15 Asp Leu Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Phe Lys Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr Glu Asn Gly 35 40 45 Phe Met Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly Ile Pro Phe Val 50 55 60 Ala Glu Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn Phe Asn His Thr 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile Ala Pro Ser Gln 85 90 95 Ser Ile Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val Thr Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Val Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr Ser Glu Ile Gly 115 120 125 Leu Asn Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu Val Tyr Lys Tyr 130 135 140 Gly Gly Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu Tyr Asp Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Lys Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly Asn Val Ile Pro 165 170 175 Glu Glu Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro Asn His Leu Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly Ser Val Phe Asn 195 200 205 Val Lys Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys Ile Glu Lys Thr 210 215 220 Glu Asn Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val Lys Gln Thr Asn 225 230 235 240 Thr Asn Thr Lys <210> 26 <211> 312 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 26 Met Lys Thr Glu Asn Asn Lys Glu Gln His Val Ile Thr Gln Phe Asn 1 5 10 15 Gln Arg Glu Asn Lys Phe Pro Asp Val Gly Gln Gly Ile Gln Trp Leu 20 25 30 Ser Gln Phe Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asn Asn Gly Glu Gly Tyr Ser 35 40 45 Leu Gly Gln Asp Val Met Ser Tyr Phe Leu Glu Val Lys Asn Ser Tyr 50 55 60 Gly Gln Leu Ala Met Glu Pro Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Leu Trp 65 70 75 80 Ala Gly Gln Ser Asp Leu Glu Asn Ala Thr Asp His Glu Gln Thr Leu 85 90 95 Asn Ser Thr Glu Phe Lys Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser 100 105 110 Thr Glu Asn Gly Phe Met Ile Gly Gln Glu Thr Glu Gly Lys Val Gly 115 120 125 Ile Pro Phe Val Ala Glu Gly Lys Val Thr Ile Lys Thr Glu Tyr Asn 130 135 140 Phe Asn His Thr Asn Gly Tyr Glu Thr Ser Glu Ser Val Glu Tyr Ile 145 150 155 160 Ala Pro Ser Gln Ser Ile Lys Val Pro Pro His Thr Ile Ala Arg Val 165 170 175 Thr Ala Leu Leu Asp Val Lys Lys Ile Lys Gly Lys Met His Leu Tyr 180 185 190 Ser Glu Ile Gly Leu Asn Lys Asp Tyr Gly Tyr Asp Met Val Pro Leu 195 200 205 Val Tyr Lys Tyr Gly Gly Pro Phe Lys Tyr Val Thr Leu Gly Thr Leu 210 215 220 Tyr Asp Glu Gly Tyr Lys Gln Ala Gln Leu Asp Tyr Phe Asn Met Gly 225 230 235 240 Asn Val Ile Pro Glu Glu Ile Glu Thr Val Ser Lys Ser Asn Asn Pro 245 250 255 Asn His Leu Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Phe Glu Ser Glu Tyr Gly 260 265 270 Ser Val Phe Asn Val Lys Val Glu Tyr Ile Asn Ile Asn Thr Lys Lys 275 280 285 Ile Glu Lys Thr Glu Asn Leu Thr Ile Glu Pro Thr Ile Val Pro Val 290 295 300 Lys Gln Thr Asn Thr Asn Thr Lys 305 310 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Endoplasmic reticulum targeting peptide <400> 27 Lys Asp Glu Leu 1

Claims (23)

1. 살충 활성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자:
   a) 서열 번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열;
   b) 서열 번호 11 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 식물에서의 발현용으로 설계된 합성 서열인 재조합 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 식물 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자.
4. 제1항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터.
5. 제4항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 벡터.
6. 제1항의 재조합 핵산을 함유하는 숙주 세포.
7. 제6항에 있어서, 박테리아 숙주 세포인 숙주 세포.
8. 제6항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
9. 제8항의 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 식물.
10. 제9항에 있어서, 옥수수, 수수, 밀, 양배추, 해바라기, 토마토, 십자화과 식물(crucifer), 페퍼(pepper), 감자, 목화, 벼, 대두, 사탕무, 사탕수수, 담배, 보리, 및 유채로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 식물.
11. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자.
12. 살충 활성을 갖고, 서열 번호 11 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 재조합 폴리펩티드.
13. 제12항의 폴리펩티드를 포함하는, 인시류 해충에 대한 살충제 조성물.
14. 제13항에 있어서, 산제, 분제, 펠렛, 과립, 스프레이, 에멀젼, 콜로이드 및 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
15. 제13항에 있어서, 박테리아 세포의 배양물의 건조, 동결건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 농축에 의해 제조된 조성물.
16. 제13항에 있어서, 1 중량% 내지 99 중량%의 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
17. 인시류 해충 집단을 제12항의 폴리펩티드의 살충적 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인시류 해충 집단을 방제하는 방법.
18. 인시류 해충을 제12항의 폴리펩티드의 살충적 유효량과 접촉시키거나 상기 해충에게 제12항의 폴리펩티드의 살충적 유효량을 급이하는 단계를 포함하는, 인시류 해충을 사멸시키는 방법.
19. 제6항의 숙주 세포를 살충 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 살충 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법.
20. 살충 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구성물(contruct)이 게놈 내에 안정하게 포함된 식물:
    a) 서열 번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 서열 번호 11 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
21. 살충 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구성물이 게놈 내에 안정하게 포함된 식물 세포:
    a) 서열 번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 서열 번호 11 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
22. 인시류 살충 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 식물 또는 이의 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 식물을 인시류 해충으로부터 보호하는 방법:
    a) 서열 번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 서열 번호 11 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
23. 인시류 살충 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구성물이 게놈 내로 안정하게 포함된 식물 또는 이의 종자를 들판에서 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 들판은 상기 폴리펩티드가 살충 활성을 갖는 인시류 해충으로 만연된, 식물의 수율을 증가시키는 방법:
    a) 서열 번호 2에 개시된 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 서열 번호 11 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.