JP6518668B2 - Axmi477、axmi482、axmi486およびaxmi525毒素遺伝子およびそれらの使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる2013年12月9日に出願された米国仮特許出願第61/913,905号明細書、および2013年12月9日に出願された米国仮特許出願第61/913,911号明細書の利益を主張する。
配列表の公式コピーは、2014年11月14日に作成され、97キロバイトのサイズを有するファイル名「APA136054_ST25.txt」を有するASCII形式の配列表として、本明細書と同時にEFS−Webを介して電子的に提出されている。このASCII形式の文書中に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明の一態様は、殺虫タンパク質およびポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸分子、ならびに配列相同性の領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子に関する。本明細書において、本明細書の他箇所に定義されるストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列も包含される。本明細書において使用される用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、組換えDNA、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)ならびにヌクレオチド類似体を使用して生成されたDNAまたはRNAの類似体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖DNAである。
ブリダイゼーションに対する詳細なガイドは、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2(Elsevier,New York);およびAusubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York)に見出される。Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)を参照されたい。
殺虫タンパク質も本発明に包含される。「殺虫タンパク質」は、配列番号5〜26に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を意図する。その断片、生物学的に活性な部分、および変異体も提供され、本発明の方法を実施するために使用することができる。「単離タンパク質」または「組換えタンパク質」は、もはや天然環境中に存在せず、例えば、インビトロまたは組換え細菌もしくは植物宿主細胞中に存在するタンパク質を指すために使用される。
殺虫タンパク質のDNA配列は種々の方法により変更することができること、およびこれらの変更は、本発明の殺虫タンパク質によりコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列をもたらし得ることが認識される。このタンパク質は、種々の手法、例として、配列番号5〜26の1つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入、例として、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155、またはそれより多い数までのアミノ酸置換、欠失または挿入において変更することができる。このような操作のための方法は一般に当技術分野において公知である。例えば、殺虫タンパク質のアミノ酸配列変異体は、DNA中の突然変異により調製することができる。これはまた、突然変異誘発のいくつかの形態の1つにより、および/または指向進化で達成することができる。一部の態様において、アミノ酸配列中でコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさない。このような変異体は所望の殺虫活性を保有する。しかしながら、殺虫タンパク質が殺虫活性を付与する能力は、本発明の組成物にこのような技術を使用することにより改善することができることが理解される。例えば、DNA複製の間に高い割合の塩基の誤取り込みを示す宿主細胞、例えば、XL−1Red(Stratagene,La Jolla,CA)中で殺虫タンパク質を発現させることができる。このような株中で増殖させた後、DNAを単離し(例えば、プラスミドDNAを調製することにより、またはPCRにより増幅させ、得られたPCR断片をベクター中にクローニングすることにより)、非突然変異誘発株中で殺虫タンパク質突然変異を培養し、例えば、殺虫活性について試験するためのアッセイを実施することにより、殺虫活性を有する突然変異した遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質は混合され、摂食アッセイにおいて使用される。例えば、Marrone et al.(1985)J.of Economic Entomology 78:290−293を参照されたい。このようなアッセイは、植物を1つ以上の害虫と接触させ、かつ植物が生存する能力および/または植物が害虫の死滅を引き起こす能力を決定することを含み得る。毒性の増加をもたらす突然変異の例は、Schnepf et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775−806に見出される。
本発明の殺虫配列は、目的植物中での発現のための発現カセット中で提供することができる。「植物発現カセット」は、植物細胞中でのオープンリーディングフレームからのタンパク質の発現をもたらし得るDNA構築物を意図する。典型的には、これらはプロモーターおよびコード配列を含有する。このような構築物はまた、3’非翻訳領域を含有することも多い。このような構築物は、ある細胞内構造、例えば、葉緑体(または他のプラスチド)、小胞体、またはゴルジ装置へのペプチドの同時翻訳または翻訳後輸送を容易にするための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有し得る。
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物中に導入することを含む。「導入」は、構築物が植物の細胞内部に近づけるように、植物にヌクレオチド構築物を提供することを意図する。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入する特定の方法を使用することを要求せず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも1つの細胞の内部に近づけることのみを要求する。ヌクレオチド構築物を植物中に導入する方法は当技術分野において公知であり、それとしては、限定されるものではないが、安定的形質転換法、一過的形質転換法、およびウイルス媒介法が挙げられる。
植物細胞中に異種外来DNAを導入した後、植物ゲノム中の異種遺伝子の形質転換または組込みは、種々の方法、例えば、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝産物の分析などにより確認される。
本発明の別の態様において、殺虫活性を有する殺虫タンパク質を発現するトランスジェニック植物を生成することができる。例として、上記の方法を利用してトランスジェニック植物を生成することができるが、トランスジェニック植物細胞を生成する方法は本発明にとって重要でない。当技術分野において公知のまたは記載された方法、例えば、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)媒介形質転換、微粒子銃形質転換、および非粒子媒介方法を、実験者の裁量で使用することができる。殺虫タンパク質を発現する植物は、当技術分野において記載される一般的な方法、例えば、カルスの形質転換、形質転換されたカルスの選択、およびそのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生により単離することができる。このようなプロセスにおいて、植物細胞中での発現が、形質転換細胞を同定および選択する能力を付与する限り、任意の遺伝子を選択マーカーとして使用することができる。
害虫防除において、または殺虫剤として他の生物を遺伝子操作する際に、本発明のヌクレオチド配列またはその変異体を含む株を用いる一般的な方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第5,039,523号明細書および欧州特許出願公開第0480762A2号明細書を参照されたい。
(Dermestidae)が挙げられる。コメツキムシ上科(Elateroidea)としては、コメツキムシ科(Elateridae)およびタマムシ科(Buprestidae)が挙げられる。ヒラタムシ上科(Cucujoidea)としては、テントウムシ科(Coccinellidae)が挙げられる。ツチハンミョウ上科(Meloidea)としては、ツチハンミョウ科(Meloidae)が挙げられる。ゴミムシダマシ上科(Tenebrionoidea)としては、ゴミムシダマシ科(Tenebrionidae)が挙げられる。コガネムシ上科(Scarabaeoidea)としては、クロツヤムシ科(Passalidae)およびコガネムシ科(Scarabaeidae)が挙げられる。カミキリムシ上科(Cerambycoidea)としては、カミキリムシ科(Cerambycidae)が挙げられる。ハムシ上科(Chrysomeloidea)としては、ハムシ科(Chrysomelidae)が挙げられる。ゾウムシ上科(Curculionoidea)としては、ゾウムシ科(Curculionidae)およびキクイムシ科(Scolytidae)が挙げられる。
nopsis milesta);ナミハダニ(Tetranychus urticae);ソルガム:ソルガムボーラー(Chilo partellus)(sorghum borer);ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda);オオタバコガ(Helicoverpa zea);モロコシマダラメイガ(Elasmopalpus lignosellus);グラニュレートカットワーム(Feltia subterranea)(granulate cutworm);アオドウガネ(Phyllophaga crinita);エレオデス属(Eleodes)、
コノデルス属(Conoderus)、およびアエオルス属(Aeolus)、ハリガネムシ;クビアカクビホソムシ(Oulema melanopus);トウモロコシノミハムシ(Chaetocnema pulicaria);メイズゾウムシ(Sphenophorus maidis);トウモロコシアブラムシ(Rhopalosiphum maidis);キイロサトウキビアブラムシ(Sipha flava);アメリカコバネナガカメムシ(Blissus leucopterus leucopterus);ソルガムヌカカ(Contarinia sorghicola);ニセナミハダニ(Tetranychus cinnabarinus);ナミハダニ(Tetranychus urticae);コムギ:アーミーワーム(Pseudaletia unipunctata);ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda);モロコシマダラメイガ(Elasmopalpus lignosellus);セイヨウネキリムシ(Agrotis orthogonia);モロコシマダラメイガ(Elasmopalpus lignosellus);クビアカクビホソムシ(Oulema melanopus);オオタコゾウムシ(Hypera punctata);サザンコーンルートワーム(Diabrotica undecimpunctata howardi);ロシアンウィートアフィッド(Russian wheat aphid);ムギミドリアブラムシ(Schizaphis graminum);イングリッシュグレインアフィッド(Macrosiphum avenae)(En
glish grain aphid);レッドレッグドグラスホッパー(Melanoplus femurrubrum);ディファレンシャルグラスホッパー(Melanoplus differentialis)(differential grasshopper);渡りバッタ(Melanoplus sanguinipes);ヘシアンバエ(Mayetiola destructor);ムギアカタマバエ(Sitodiplosis mosellana);ムギキモグリバエ(Meromyza americana)(wheat stem maggot);コムギスイセンハナアブ(Hylemya coarctata)(wheat bulb fly);タバコアザミウマ(Frankliniella fusca);コムギクキバチ(Cephus cinctus);チューリップサビダニ(Aceria tulipae);ヒマワリ:サンフラワーバッドモス(Suleima helianthana)(sunflower bud moth);サンフラワーモス(Homoeosoma electellum);サンフラワービートル(zygogramma exclamationis);キャロットビートル(Bothyrus gibbosus)(carrot beetle);サンフラワーシードミッジ(Neolasioptera murtfeldtiana)(sunflower seed midge);ワタ:ニセアメリカタバコガ(Heliothis virescens);オオタバコガ(Helicoverpa zea);シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua);ワタアカミムシガ(Pectinophora gossypiella);ワタミゾウムシ(Anthonomus grandis);ワタアブラムシ(Aphis gossypii);ワタノミハムシ(Pseudatomoscelis seriatus);オンシツコナジラミ(Trialeurodes abutilonea);サビイロカスミカメ(Lygus lineolaris);レッドレッグドグラスホッパー(Melanoplus femurrubrum);ディファレンシャルグラスホッパー(Melanoplus differentialis);ネギアザミウマ(Thrip
s tabaci);タバコアザミウマ(Franklinkiella fusca);ニセナミハダニ(Tetranychus cinnabarinus);ナミハダニ(Tetranychus urticae);イネ:サトウキビズイムシ(Diatraea saccharalis);ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda);オオタバコガ(Helicoverpa zea);グレープコラスピス(Colaspis brunnea)(grape colaspis);イネミズゾウムシ(Lissorhoptrus oryzophilus);ココクゾウムシ(Sitophilus oryzae);クロスジツマグロヨコバイ(Nephotettix nigropictus);アメリカコバネナガカメムシ(Blissus leucopterus leucopterus);アオカメムシ(Acrosternum hilare);ダイズ:ダイズシャクトリムシ(Pseudoplusia includens);ビロードマメケムシ(Anticarsia gemmatalis);グリーンクローバーワーム(Plathypena scabra)(green cloverworm);ヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nubilalis);タマナヤガ(Agrotis ipsilon);シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua);ニセアメリカタバコガ(Heliothis virescens);オオタバコガ(Helicoverpa zea);インゲンテントウ(Epilachna varivestis);モモアカアブラムシ(Myzus persicae);ジャガイモヒメヨコバイ(Empoasca fabae);アオカメムシ(Acrosternum hilare);レッドレッグドグラスホッパー(Melanoplus femurrubrum);ディファレンシャルグラスホッパー(Melanoplus differentialis);タネバエ(Hylemya platura);ダイズアザミウマ(Sericothrips variabilis);ネギアザミウマ(Thrips tabaci);イチゴハダニ(Tetranychus turkestani);ナミハダニ(Tetranychus ur
ticae);オオムギ:ヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nubilalis);タマナヤガ(Agrotis ipsilon);ムギミドリアブラムシ(Schizaphis graminum);アメリカコバネナガカメムシ(Blissus leucopterus leucopterus);アオカメムシ(Acrosternum hilare);チャイロカメムシ(Euschistus servus);タネバエ(Delia platura);ヘシアンバエ(Mayetiola destructor);ホモノハダニ(Petrobia latens);アブラナ:ダイコンアブラムシ(Brevicoryne brassicae);ノミハムシ(Phyllotreta cruciferae);ベルタアワヨトウ(Mamestra configurata);コナガ(Plutella xylostella);デリア属(Delia)、ハナバエ。
植物収穫高を増加させる方法が提供される。方法は、本明細書に開示の殺虫ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現する植物または植物細胞を提供し、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫が蔓延している(またはその害虫による蔓延の影響を受けやすい)圃場中で植物またはその種子を生育させることを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、鱗翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、または線虫害虫に対して殺虫活性を有し、前記圃場は、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目、または線虫害虫が蔓延している。本明細書に定義される植物の「収穫高」は、その植物により産生されるバイオマスの質および/または量を指す。「バイオマス」は、任意の計測される植物産物を意図する。バイオマス産生の増加は、計測される植物産物の収穫高の任意の改善である。植物収穫高の増加は、いくつかの商業的用途を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトまたは動物の消費のための葉野菜の収穫高を増加させ得る。さらに、葉バイオマスの増加を使用して植物由来の医薬または工業製品の産生を増加させることができる。収穫高の増加は、殺虫配列を発現しない植物と比較して、任意の統計学的に有意な増加、例として、限定されるものではないが、収穫高の少なくとも1%増加、少なくとも3%増加、少なくとも5%増加、少なくとも10%増加、少なくとも20%増加、少なくとも30%増加、少なくとも50%増加、少なくとも70%増加、少なくとも100%またはそれより大きい増加を含み得る。特定の方法において、植物収穫高は、本明細書に開示の殺虫タンパク質を発現する植物の改善された害虫耐性の結果として増加する。殺虫タンパク質の発現は、蔓延し、または摂食する害虫の能力の低減をもたらす。
ストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン;穀物用除草剤:2.4−D、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン−E、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ−P、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ−M、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン−NA、フルフェナセット、フルピルスルフロン−M、フルロキシピル、フルルタモン、グリホサート、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソプロツロン、MCPA、メソスルフロン、メトスルフロン、ペンジメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロキシスラム、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン;穀物用殺真菌剤:アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェナミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキサピロキサド、イソピラザム、クレソキシム−メチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン;穀物用殺昆虫剤:ジメトエート、ラムダ−シハルトリン、デルタメトリン、アルファ−シペルメトリン、ベータ−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン(Dinetofuran)、クロルピリホス、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルホキサフロール;メイズ用除草剤:アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロル、ジカンバ、クロピラリド、(S−)ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、(S−)メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスル
フロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン;メイズ用殺昆虫剤:カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリムホス、エチプロール、サイアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン;メイズ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン;イネ用除草剤:ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン;イネ用殺昆虫剤:ダイアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロール;イネ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、カルベンダジム、
カルプロパミド、ジクロシメット、ジフェノコナゾール、エディフェンホス、フェリムゾン、ゲンタマイシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス(IBP)、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、チアジニル、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン;ワタ用除草剤:ジウロン、フルオメツロン、MSMA、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバック−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン;ワタ用殺昆虫剤:アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、ベータ−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、ガンマ−シハロトリン、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオロエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール;ワタ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンアミドン、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフ
ロキシストロビン;ダイズ用除草剤:アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、(S−)メトラクロール、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート;ダイズ用殺昆虫剤:ラムダ−シハロトリン、メソミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダ−シハロトリン、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオロエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン;ダイズ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン;サトウダイコン用除草剤:クロリダゾン、デスメジファム、エトフメセート、フェンメジファム、トリアラート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ;サトウダイコン用殺昆虫剤:イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ/ラムダ−シハロトリン、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオロエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、テフルトリン、リナキシピル、シ
アキシピル(Cyaxypyr)、フィプロニル、カルボフラン;キャノーラ用除草剤:クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロール、トリフルラリン、エタメツルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム;キャノーラ用殺真菌剤:アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メピコート−クロリド、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン;キャノーラ用殺昆虫剤:カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダ−シハロトリン、タウ−フルバレリエート(Fluvaleriate)、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、4−[[(6−クロルピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオロエチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン。
新規殺虫遺伝子を、細菌株ATX47307およびATX65002から以下のステップを使用して同定した:
・株からの全DNAの調製。全DNAは、ゲノムDNAおよび染色体外DNAの両方を含有する。染色体外DNAは、以下の一部または全部の混合物を含有する;種々のサイズのプラスミド;ファージ染色体;未同定の他の染色体外分子。
・DNAの配列決定。次世代配列決定法を介して全DNAを配列決定する。
・相同性および/または他のコンピュータ分析を介する推定毒素遺伝子の同定。
・必要な場合、いくつかのPCRまたはクローニング戦略の1つによる目的遺伝子の配列フィニッシング(例えば、TAIL−PCR)。
本発明のヌクレオチド配列は、殺虫タンパク質を産生するその能力について試験することができる。害虫に対して殺虫剤として作用する殺虫タンパク質の能力は、多数の手法において評価されることが多い。当技術分野において周知な1つの手法は、摂食アッセイを実施することである。このような摂食アッセイにおいて、試験すべき化合物または対照試料のいずれかを含有する試料に害虫を曝す。これは試験すべき材料またはこのような材料の適切な希釈剤を、害虫が摂取する材料、例えば、人工食餌上に置くことにより実施されることが多い。試験すべき材料は、液体、固体、またはスラリーから構成され得る。試験すべき材料を表面上に置き、次いで乾燥させておくことができる。あるいは、試験すべき材料を溶融した人工食餌と混合し、次いでアッセイチャンバ中に分注することができる。アッセイチャンバは、例えば、カップ、皿、またはマイクロタイタープレートのウェルであり得る。
Axmi477(本明細書において配列番号8に記載される)、Axmi482(本明細書において配列番号13に記載される)、Axmi486(本明細書において配列番号16に記載される)、およびAxmi525(本明細書において配列番号26に記載される)のトランケート変異体を発現させ、生物活性についてアッセイした。3’末端においてAscIリンカーを取り込むプライマーを用いてHERCULASE(登録商標)II Fusion DNA Polymeraseを使用して遺伝子をそれらのそれぞれの株からPCR増幅させた。増幅したPCR産物をAscIにより消化し、pMalC4Xベクター中にライゲートした。クローンを配列決定により確認し、Bl21コンピテント細胞中で形質転換した。それぞれの単一コロニーをLB培地中に接種し、37℃において対数期まで増殖させ、0.5mMのIPTGにより20℃において18時間誘導した。精製タンパク質を、第Xa因子により1:50の比で室温において一晩消化した。精製タンパク質をバイオアッセイに選択昆虫害虫に対して標準的なプロトコルに従って供した。結果を表5〜8に示す。
0 − 活性なし
1 − 均一な成長阻害なし
2 − わずかな均一な成長阻害
3 − 強力な均一な成長阻害
4 − 重度の均一な成長阻害
本発明のコード領域を、植物中での発現のために適切なプロモーターおよびターミネーター配列と接続する。このような配列は当技術分野において周知であり、それとしては、単子葉植物中での発現のためのイネアクチンプロモーターまたはメイズユビキチンプロモーター、双子葉植物中での発現のためのアラビドプシス属(Arabidopsis)UBQ3プロモーターまたはCaMV35Sプロモーター、およびnosまたはPinIIターミネーターを挙げることができる。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を産生および確認するための技術も、当技術分野において周知である。
メイズの穂を受粉から8〜12日後に最良に収集する。胚を穂から単離し、0.8〜1.5mmサイズのそのような胚が形質転換における使用に好ましい。胚を、好適なインキュベーション培地、例えば、DN62A5S培地(3.98g/LのN6塩;1mL/L(1000×原液)のN6ビタミン;800mg/LのL−アスパラギン;100mg/Lのミオ−イノシトール;1.4g/LのL−プロリン;100mg/Lのカザミノ酸;50g/Lのスクロース;1mL/L(1mg/mLの原液)の2,4−D)上に胚盤側を上にしてプレーティングする。しかしながら、DN62A5S以外の培地および塩が好適であり、当技術分野において公知である。胚を暗所で25℃において一晩インキュベートする。しかしながら、胚を一晩インキュベートすることは必ずしも必要でない。
穂を受粉の8〜12日後に最良に収集する。胚を穂から単離し、0.8〜1.5mmサイズのそれらの胚が、形質転換における使用に好ましい。胚を、好適なインキュベーション培地上に胚盤側を上にしてプレーティングし、暗所で25℃において一晩インキュベートする。しかしながら、胚を一晩インキュベートすることは必ずしも必要でない。胚を、約5〜10分間、Tiプラスミド媒介移行のための適切なベクターを含有するアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株と接触させ、次いで約3日間(25℃で暗所)共培養培地上にプレーティングする。共培養後、外植片を約5日間(25℃で暗所)回復期間培地に移す。外植片を、利用される特定の選択の性質および特徴に応じて8週間まで選択培地中でインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。次いで、得られた成熟体細胞胚を微光の下に置き、再生プロセスを当技術分野において公知のとおり開始させる。
Claims (24)
- 殺虫活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換え核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列は、
a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列;
b)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
c)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、組換え核酸分子。 - 前記ヌクレオチド配列が、植物中での発現のために設計された合成配列である、請求項1に記載の組換え核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中での前記ヌクレオチド配列の発現を指向し得るプロモーターに作動可能に連結している、請求項1に記載の組換え核酸分子。
- 請求項1に記載の組換え核酸分子を含んでなる、ベクター。
- 異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含んでなる、請求項4に記載のベクター。
- 請求項1に記載の組換え核酸を含有する、宿主細胞。
- 細菌宿主細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞を含んでなる、トランスジェニック植物。
- 植物が、メイズ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナからなる群から選択される、請求項9に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項1に記載の核酸分子を含んでなる、トランスジェニック種子。
- 殺虫活性を有する組換えポリペプチドであって、
a)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;および
b)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド
からなる群から選択される、組換えポリペプチド。 - 異種アミノ酸配列をさらに含んでなる、請求項12に記載のポリペプチド。
- 請求項12に記載のポリペプチドを含んでなる、組成物。
- 粉末、粉剤、ペレット、粒剤、噴霧剤、乳剤、コロイド、および液剤からなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。
- 細菌細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮により調製される、請求項14に記載の組成物。
- 約1重量%〜約99重量%の前記ポリペプチドを含む、請求項14に記載の組成物。
- 鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫集団を防除する方法であって、前記集団を殺虫有効量の請求項12に記載のポリペプチドと接触させることを含んでなる、方法。
- 鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫を殺滅する方法であって、前記害虫を殺虫有効量の請求項12に記載のポリペプチドと接触させること、または前記害虫に殺虫有効量の請求項12に記載のポリペプチドを摂食させることを含んでなる、方法。
- 殺虫活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、請求項6に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件下で培養することを含んでなる、方法。
- 殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるDNA構築物をゲノム中に安定的に取り込んだ植物または植物細胞であって、前記ヌクレオチド配列は、
a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列;
b)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
c)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、植物または植物細胞。 - 植物を害虫から保護する方法であって、植物またはその細胞中で殺虫ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含み、前記ヌクレオチド配列は、
a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列;
b)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
c)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、方法。 - 前記植物が、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅目の害虫に対して殺虫活性を有する殺虫ポリペプチドを産生する、請求項22に記載の方法。
- 植物の収穫高を増加させる方法であって、殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるDNA構築物をゲノム中に安定的に取り込んだ植物またはその種子を圃場中で生長させることを含み、前記ヌクレオチド配列は、
a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列;
b)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
c)配列番号5〜10のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され;
前記圃場は、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫が蔓延している、方法。
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