ES2874901T3

ES2874901T3 - Gen de la toxina axmi477 y procedimientos para su uso

Info

Publication number: ES2874901T3
Application number: ES14835605T
Authority: ES
Inventors: Duane Lehtinen; Kimberly Sampson; Kira Roberts; Ethan Dunn; Nana Chougule
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Current assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2034-12-08
Also published as: AU2014364119A1; UA120843C2; US20180371032A1; BR112016012643B1; AU2014364119C1; MX2019010451A; UY35866A; UA122475C2; MX367958B; AU2014364119B2; EP3080277B1; JP2021072796A; EP3800259B1; KR20210135638A; AU2021201939B2; EP3800259C0; CA2931259A1; JP2019141078A; KR20210135637A; BR112016012643A2

Abstract

Una construcción que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida contra los lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10; c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen de la toxina axmi477 y procedimientos para su uso

Descripción

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva del suelo formadora de esporas, que se caracteriza por su capacidad de producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero que son inofensivas para las plantas y otros organismos que no son su diana. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thuringiensis, o sus proteínas insecticidas, pueden usarse como insecticidas medioambientalmente aceptables para controlar las plagas de insectos agrícolas o los insectos que vectores de diversas enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristalinas (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis tienen una potente actividad insecticida contra larvas, predominantemente, de lepidópteros, hemípteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra los órdenes de organismos perjudiciales Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga y Acari, así como otros órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhelminthes y Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.) Estas proteínas se clasificaron originalmente como CryI a CryV basándose principalmente en su actividad insecticida. Las principales clases eran específicas de lepidópteros (I), específicas de lepidópteros y dípteros (II), específicas de coleópteros (III), específicas de dípteros (IV) y específicas de nematodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron además en subfamilias; a las proteínas más relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras de división tales como CrylA, CrylB, CrylC, etc. Las proteínas aún más relacionadas dentro de cada división recibieron nombres como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Se ha descrito una nomenclatura para los genes Cry basada en la homología de la secuencia de aminoácidos y no en la especificidad de los insectos ( Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813 ). En esta clasificación, a cada toxina se le asigna un nombre único que incorpora un rango primario (un número arábigo), un rango secundario (una letra mayúscula), un rango terciario (una letra minúscula) y un rango cuaternario (otro número arábigo). Los números romanos se han sustituido por números arábigos en el rango primario. Las proteínas con una identidad de secuencia inferior al 45 % tienen diferentes rangos primarios, y los criterios para los rangos secundarios y terciarios son del 78 % y el 95 %, respectivamente. En W. Ye et al. (Applied and Environmental Microbiology, 2012, vol 78, n° 14, 4795-4801 ), en el documento US 2006/156432A1 y en el documento WO 2011/014749 A1, se han identificado nuevos genes de proteínas cristalinas o nuevas proteínas insecticidas de B. thuringiensis respectivamente. Otros autores informan sobre la identificación y la construcción de genes insecticidas sintéticos para la protección de cultivos (Kaur, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, vol. 22, no. 3, 233-253; US 5380831A ).

La proteína cristalina no muestra actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por proteasas en el tracto digestivo del insecto hasta convertirse en una molécula tóxica activa. ( Hofte y Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255 ). Esta toxina se une a los receptores del borde en cepillo apical en el intestino medio de las larvas diana y se inserta en la membrana apical creando canales o poros iónicos, lo que provoca la muerte de las larvas.

Las delta-endotoxinas suelen tener cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199 ). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y está implicado en la inserción en la membrana y en la formación de los poros. El dominio II consiste en tres hojas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos hojas beta antiparalelas en formación de "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001, supra). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión de los receptores, por lo que se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Debido a la devastación que pueden causar los insectos y a la mejora del rendimiento mediante el control de las plagas de insectos, existe una necesidad continua de descubrir nuevas formas de toxinas pesticidas.

En el presente documento se proporcionan composiciones y procedimientos para dotar de actividad pesticida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos pesticidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos pesticidas y los anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en construcciones de ADN o casetes de expresión para su transformación y su expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que han sido diseñadas para su expresión en un organismo, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas que comprenden la secuencia de nucleótidos de la invención.

En particular, se proporcionan aquí moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que codifican una proteína pesticida. Además, se engloban aquí las secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína plaguicida. La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en los SEQ ID NO: 5-10, o una secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1, así como variantes biológicamente activas y fragmentos de las mismas. También se incluyen secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que hibridan con una secuencia de la invención o un complemento de la misma. Además, se proporcionan vectores, células huésped, plantas y semillas que comprenden las secuencias de nucleótidos de la invención, o secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de la invención, así como variantes y fragmentos biológicamente activos de las mismas.

La presente invención se refiere a una construcción que comprende un promotor heterólogo unido de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida para lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10.

Además, la presente invención se refiere a un polipéptido recombinante con actividad plaguicida para lepidópteros, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10; y

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10.

Las composiciones según la presente invención comprenden dicho polipéptido recombinante con actividad pesticida para lepidópteros.

Se proporcionan procedimientos para producir los polipéptidos de la invención, y para usar esos polipéptidos según la invención para controlar o destruir una plaga de lepidópteros. También se incluyen procedimientos y kits para detectar los ácidos nucleicos y los polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y los procedimientos de la invención son útiles para la producción de organismos con mayor resistencia o tolerancia a las plagas. Estos organismos y las composiciones que comprenden los organismos resultan apropiados para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tengan actividad plaguicida, o para detectar la presencia de proteínas o de ácidos nucleicos plaguicidas en productos u organismos.

Además, la presente invención se refiere a una planta o a una célula vegetal que tienen incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad plaguicida para lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10; y

Además, la presente invención incluye un procedimiento para proteger una planta frente a una plaga de lepidópteros, que comprende expresar en una planta, o en una célula de la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1;

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para regular la resistencia o la tolerancia a las plagas en los organismos, en particular las plantas o las células vegetales. Por "resistencia" se entiende que el organismo perjudicial (por ejemplo, un insecto) muere tras la ingestión u otro contacto con los polipéptidos de la invención. Por "tolerancia" se entiende una alteración o una reducción de movimientos, la alimentación, la reproducción u otras funciones del organismo perjudicial. Los procedimientos implican la transformación de los organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida. De este modo, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas pesticidas de Bacillus o de otros géneros. Las secuencias se usan en la construcción de vectores de expresión para su posterior transformación en los organismos que interesan, tales como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de proteínas pesticidas alteradas por procedimientos conocidos en la técnica, tales como el intercambio de dominios o la mezcla de ADN, por ejemplo, con miembros de las familias de endotoxinas Cry1, Cry2 y Cry9. Las proteínas se usan para controlar o matar poblaciones de plagas de lepidópteros y para producir composiciones con actividad pesticida.

Por "toxina plaguicida" o "proteína plaguicida" se entiende una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, miembros de los órdenes Lepidoptera, Diptera, Hemiptera y Coleóptera, o del filo Nematoda, o una proteína que tiene homología con dicha proteína. Las proteínas pesticidas se han aislado de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas pesticidas incluyen secuencias de aminoácidos obtenidas a partir de las secuencias nucleotídicas de longitud completa divulgadas en el presente documento, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de inicio alternativo en dirección 3', o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad pesticida. El procesamiento puede tener lugar en el organismo en el que se expresa la proteína, o en el organismo perjudicial tras la ingestión de la proteína.

Por lo tanto, se proporcionan aquí nuevas secuencias de nucleótidos aisladas o recombinantes que confieren actividad pesticida. Estas secuencias de nucleótidos codifican polipéptidos con homología a las delta-endotoxinas o a las toxinas binarias conocidas. También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite a las células controlar o matar los organismos perjudiciales que la ingieren.

Los SEQ ID NOS 11-26 se divulgan únicamente con fines comparativos.

Moléculas de ácido nucleico aisladas y sus variantes y fragmentos

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos pesticidas, o porciones biológicamente activas de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas con regiones de homología de secuencia. También se incluyen en el presente documento las secuencias de nucleótidos capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos de la invención en condiciones estrictas como se define en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o del ARN generados mediante análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.

En el presente documento se usa una secuencia de ácido nucleico (o ADN) "aislada" o "recombinante" para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no se encuentra en su entorno natural, por ejemplo, en una célula huésped bacteriana o vegetal in vitro o recombinante. En algunas realizaciones, un ácido nucleico aislado o recombinante carece de las secuencias (preferentemente secuencias codificadoras de proteínas) que de manera natural rodean el ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se obtiene el ácido nucleico. A efectos de la invención, "aislado", cuando se usa para referirse a las moléculas de ácido nucleico, excluye los cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada que codifica la delta-endotoxina puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que de modo natural rodean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se obtiene el ácido nucleico. En varias realizaciones, una proteína de delta-endotoxina que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de proteína que no es delta-endotoxina (también denominada aquí "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia establecida en el SEQ ID NO: 1, y sus variantes, fragmentos y complementos. Por "complemento" se entiende una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada, de manera que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos dada para formar un dúplex estable. Las correspondientes secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas codificadas por estas secuencias de nucleótidos se exponen en el SEQ ID NO: 5-10.

Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican proteínas plaguicidas también están incluidas en la presente invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína plaguicida, o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o como cebador de PCR usando los procedimientos que se describen a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína plaguicida comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica una proteína plaguicida divulgada en el presente documento, dependiendo del uso previsto. Por nucleótidos "contiguos" se entienden los residuos de nucleótidos que son directamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán fragmentos de proteína que conservan la actividad biológica de la proteína plaguicida y, por tanto, conservan la actividad plaguicida. Por consiguiente, también se incluyen los fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos aquí divulgados. Por "retiene la actividad" se entiende que el fragmento tendrá al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de la actividad plaguicida de la proteína plaguicida. En un aspecto de la divulgación, la actividad pesticida es la actividad coleoptericida. Según la invención, la actividad pesticida es una actividad lepidoptericida. En otro aspecto de la divulgación, la actividad pesticida es una actividad nematocida. En otro aspecto de la divulgación, la actividad plaguicida es una actividad diptericida. En otro aspecto de la divulgación, la actividad plaguicida es una actividad hemiptericida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 y la patente de Estados Unidos N°.

5.743477.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína pesticida de longitud completa de la invención. En algunas realizaciones, el fragmento es un fragmento de escisión proteolítica. Por ejemplo, el fragmento de escisión proteolítica puede tener un corte en los extremos N-terminal o C-terminal de al menos aproximadamente 30 aminoácidos, al menos aproximadamente 40 aminoácidos, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500 o aproximadamente 550 aminoácidos en relación con los SEQ ID NO: 5, 6 o 7. En algunas realizaciones, los fragmentos comprendidos en el presente documento son el resultado de la eliminación del dominio de cristalización C-terminal, por ejemplo, por proteólisis, o por inserción de un codón de parada en la secuencia de codificación. En algunas realizaciones, los fragmentos aquí incluidos son el resultado de la eliminación del péptido señal N-terminal. Los cortes N-terminales pueden comprender además un residuo de metionina en el extremo N-terminal.

Las proteínas pesticidas preferidas de la presente invención están codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1, o las proteínas pesticidas son suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos establecida en los SEQ ID NO: 5-10. Por "suficientemente idéntica" se entiende una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que tiene al menos el aproximadamente 60 % o el 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente el 70 % o el 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente el 80 % o el 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en el presente documento usando parámetros estándar. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, etc.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para realizar una comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una forma de realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra forma de realización, el porcentaje de identidad se calcula por medio de la totalidad de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia divulgada en el presente documento como cualquiera de los SEQ ID NO: 1, 5-10). El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a las descritas a continuación, con o sin permitir huecos. Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente se cuentan las coincidencias exactas. Una brecha, es decir, una posición en un alineamiento donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera una posición con residuos no idénticos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Acad. Sci. USA 87:2264 , modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico tipo pesticida de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas pesticidas de la invención. Para obtener alineaciones separadas con fines de comparación, se puede usar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) supra. Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede realizarse manualmente mediante inspección.

Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW ( Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 ). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, por lo que puede proporcionar datos sobre la conservación de la secuencia de aminoácidos completa. El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos disponibles en el mercado, tales como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Tras la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede evaluar el porcentaje de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de un programa de software útil para el análisis de los alineamientos con ClustalW es GENEDOC™. Ge NEDOC™ (Karl Nicholas) permite evaluar la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software GCG Wisconsin Genetics, versión 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

A menos que se indique lo contrario, la versión 10 de GAP, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453 , se usará para determinar la identidad o la similitud de la secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando el peso GAP de 50 y el peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando el peso g A p de 8 y el peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden usar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genere un alineamiento que tenga idénticas coincidencias de residuos de nucleótidos y un idéntico porcentaje de identidad de secuencia cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por GAP Versión 10.

La invención también incluye moléculas de ácido nucleico variantes. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína plaguicida incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas plaguicidas divulgadas en el presente documento pero que difieren de forma conservadora debido a la degeneración del código genético, así como aquellas otras que son suficientemente idénticas, tal como se ha comentado anteriormente. Las variantes alélicas que se producen de forma natural se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación que se describen a continuación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos obtenidas por medio de síntesis que han sido generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican las proteínas pesticidas divulgadas en la presente invención, como se discute a continuación. Las proteínas variantes incluidas en la presente invención son biológicamente activas, es decir, siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, la actividad plaguicida. Por "conserva la actividad" se entiende que la variante tendrá al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 % o al menos un 80 % de la actividad pesticida de la proteína nativa. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente de los Estados Unidos N°5,743,477.

El artesano experto apreciará además que pueden introducirse cambios mediante la mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención, dando lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas pesticidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De este modo se pueden crear moléculas de ácido nucleico aisladas variantes introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento, de manera que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Estas secuencias de nucleótidos variantes también se incluyen en la presente invención.

Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de tipo salvaje de una proteína pesticida sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Las delta-endotoxinas suelen tener cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199 ). El primer dominio estructural conservado consta de siete hélices alfa y participa en la inserción en la membrana y en la formación de poros. El dominio II consiste en tres hojas beta dispuestas en una configuración de llave griega, y el dominio III consiste en dos hojas beta antiparalelas en formación de "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001, supra). Los dominios II y III están implicados en el reconocimiento y la unión de los receptores, por lo que se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que mantienen su función. En general, tales sustituciones no se harían para los residuos de aminoácidos conservados, o para los residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, cuando tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de residuos conservados que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, los residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos en un alineamiento de proteínas homólogas). Los ejemplos de residuos que se conservan pero que pueden permitir sustituciones conservadoras de aminoácidos y seguir conservando la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que solo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en un alineamiento de toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que solo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en el alineamiento de proteínas homólogas). Sin embargo, un experto en la técnica entendería que las variantes funcionales pueden tener pequeñas alteraciones conservadas o no conservadas en los residuos conservados.

Alternativamente, las secuencias de nucleótidos variantes pueden hacerse introduciendo mutaciones al azar a lo largo de toda o de parte de la secuencia codificante, como por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser examinados para ver su capacidad de conferir actividad pesticida para identificar los mutantes que retienen la actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse mediante técnicas de ensayo estándar.

Usando procedimientos tales como la PCR, la hibridación y otros similares se pueden identificar las secuencias pesticidas correspondientes, teniendo dichas secuencias una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ) y Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY ).

En un procedimiento de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos del plaguicida puede usarse para cribar bibliotecas de ADNc o genómicas. Los procedimientos para la construcción de las bibliotecas de ADNc y genómicas de este tipo son generalmente conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001, supra. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar etiquetadas con un grupo detectable, tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación pueden hacerse etiquetando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de nucleótidos codificantes de proteínas pesticidas conocida que se divulga en el presente documento. También pueden usarse cebadores degenerados diseñados sobre la base de nucleótidos conservados o residuos de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos codificada. La sonda comprende normalmente una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida de la invención o un fragmento o una variante de la misma. Los procedimientos para la preparación de sondas para la hibridación son generalmente conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook y Russell, 2001.

Por ejemplo, toda una secuencia de pesticida divulgada en el presente documento, o una o más porciones de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridar específicamente con las correspondientes secuencias similares a proteínas de pesticidas y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo diversas condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y que tienen preferentemente una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, o una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos. Dichas sondas pueden usarse para amplificar las correspondientes secuencias pesticidas de un organismo elegido mediante PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen el cribado de hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ).

Por lo tanto, la presente invención incluye sondas para la hibridación, así como secuencias de nucleótidos capaces de hibridarse con toda o una parte de una secuencia de nucleótidos de la invención (por ejemplo, al menos unos 300 nucleótidos, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, o hasta la longitud completa de una secuencia de nucleótidos divulgada en el presente documento). La hibridación de dichas secuencias puede llevarse a cabo en condiciones estrictas. Por "condiciones estrictas" o "condiciones estrictas de hibridación" se entienden las condiciones en las que una sonda se hibrida con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces por encima del fondo). Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Controlando la rigurosidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar secuencias diana que son un 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir cierto desajuste en las secuencias, de modo que se detecten grados menores de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene una longitud de menos de 1000 nucleótidos, preferentemente una longitud de menos de 500 nucleótidos.

Normalmente, las condiciones estrictas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,5 M de iones Na, normalmente entre 0,01 y 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos de aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizadores como la formamida. Las condiciones a modo de ejemplo de baja rigurosidad incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, 1 M de NaCl, el 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37 °C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCl/0, 3 M de citrato trisódico) a de 50 a 55 °C. Las condiciones a modo de ejemplo de rigor moderado incluyen la hibridación en el 40 al 45 % de formamida, 1,0 M de NaCl, el 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 0,5X a IX SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones a modo de ejemplo de alta rigurosidad incluyen la hibridación en 50 % de formamida, 1 M de NaCl, 1 % de SDS a 37 °C, y un lavado en 0.1X SSC a 60 a 65 °C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender entre un 0,1 % y un 1 % de SDS. La duración de la hibridación es generalmente inferior a aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es normalmente la función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284 : Tm = 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (% GC) - 0,61 (% forma) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente adaptada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de desajuste; por lo tanto, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90 % de identidad, la Tm puede reducirse 10 °C. Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean unos 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente estrictas pueden usar una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente estrictas pueden usar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y la Tm deseada, las personas con conocimientos ordinarios entenderán que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado de desajuste deseado da como resultado una Tm inferior a 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para poder usar una temperatura más alta. Una extensa guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York ); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York ). Véase Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Las proteínas pesticidas también están incluidas dentro de la presente invención. Por "proteína pesticida" se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en los SEQ ID NO: 5-10. También se proporcionan fragmentos, porciones biológicamente activas y variantes de las mismas, y pueden usarse para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención. Una "proteína aislada" o una "proteína recombinante" se usan para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o vegetal recombinante.

Los "fragmentos" o las "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos establecida en el SEQ ID NO: 5-10, y que exhiben actividad pesticida. Una porción biológicamente activa de una proteína pesticida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, una longitud de 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, o más aminoácidos. Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar su actividad plaguicida. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de Estados Unidos N° 5.743.477. Tal como se usa en el presente documento, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de los SEQ ID NO: 5 10. Sin embargo, la invención incluye otros fragmentos, como cualquier fragmento de la proteína con una longitud mayor de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 o más aminoácidos.

Por "variantes" se entienden las proteínas o los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10. Las variantes también incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con la molécula de ácido nucleico del SEQ ID NO: 1, o un complemento de la misma, en condiciones estrictas. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las proteínas variantes incluidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, conservando la actividad pesticida. En algunas realizaciones, las variantes tienen una actividad mejorada en relación con la proteína nativa. Los procedimientos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de los Estados Unidos N° 5.743.477.

Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de la presente invención, a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en las proximidades del comienzo del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones g Tg contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, no suele determinarse a priori cuál de estos codones se usa de forma natural en la bacteria. Por lo tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede conducir a la generación de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas están incluidas en la presente invención y pueden usarse en los procedimientos de la presente invención. Se entenderá que, cuando se exprese en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para lograr una traducción adecuada.

En varias realizaciones de la presente invención, las proteínas pesticidas incluyen secuencias de aminoácidos obtenidas de las secuencias de nucleótidos de longitud completa divulgadas en el presente documento, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa debido al uso de un sitio de inicio alternativo en dirección 3'. Así, la secuencia de nucleótidos de la invención y/o los vectores, las células huésped y las plantas que comprenden la secuencia de nucleótidos de la invención (y los procedimientos de fabricación y uso de la secuencia de nucleótidos de la invención) pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente a los SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10.

También se incluyen los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención, o contra las variantes o los fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente de los Estados Unidos N°4.196.265).

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a anticuerpos, moléculas de unión a antígeno de cadena única u otras proteínas que se unen específicamente a una o más de las moléculas de proteínas o péptidos de la invención y sus homólogos, fusiones o fragmentos. En una forma de realización particularmente preferida, el anticuerpo se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en los SEQ ID NO: 5-10 o un fragmento de la misma. En otra forma de realización, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos establecida en los SEQ ID NO: 5-10 o un fragmento de la misma.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse para detectar cuantitativa o cualitativamente las moléculas de proteínas o péptidos de la invención, o para detectar modificaciones postraduccionales de las proteínas. Tal como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo o un péptido se "unen específicamente" a una molécula de proteína o a un péptido de la invención si dicha unión no es inhibida competitivamente por la presencia de moléculas no relacionadas.

Los anticuerpos de acuerdo con esta divulgación pueden estar contenidos en un kit útil para la detección de las moléculas de proteínas o péptidos de la invención. La invención comprende además un procedimiento de detección de la molécula de proteína o péptido de la invención (particularmente una proteína codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en los SEQ ID NO: 5-10, incluyendo variantes o fragmentos de la misma que son capaces de unirse específicamente al anticuerpo de la invención) que comprende poner en contacto una muestra con el anticuerpo de la invención y determinar si la muestra contiene la molécula de proteína o péptido de la invención. Los procedimientos para usar anticuerpos para la detección de una proteína o de un péptido de interés son conocidos en la técnica.

Variantes alteradas o mejoradas

Se admite que las secuencias de ADN de una proteína pesticida pueden ser alteradas por medio de varios procedimientos, y que estas alteraciones pueden dar lugar a secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a la codificada por una proteína pesticida de la presente invención. Esta proteína puede alterarse de varias maneras, incluyendo sustituciones de aminoácidos, deleciones, cortes e inserciones de uno o más aminoácidos de los SEQ ID NO: 5-10, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130, aproximadamente 135, aproximadamente 140, aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 155, o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína pesticida mediante mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o en la evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Las variantes de este tipo poseerán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína plaguicida para conferir actividad plaguicida puede mejorarse mediante el uso de tales técnicas en las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede expresar una proteína plaguicida en células huésped que presenten altas tasas de desincorporación de bases durante la replicación del ADN, como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Tras la propagación en dichas cepas, se puede aislar el ADN (por ejemplo, preparando ADN plasmídico, o amplificando por PCR y clonando el fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la proteína pesticida en una cepa no mutagénica, e identificar los genes mutados con actividad pesticida, por ejemplo, realizando un ensayo para comprobar la actividad pesticida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Los ensayos de este tipo pueden incluir el contacto de las plantas con uno o más organismos perjudiciales y la determinación de la capacidad de la planta para sobrevivir y/o causar la muerte de los organismos perjudiciales. Ejemplos de mutaciones que dan lugar a una mayor toxicidad se encuentran en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, se pueden realizar alteraciones en la secuencia proteica de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi sin afectar sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, deleciones o alteraciones introducidas por procedimientos moleculares modernos, como la PCR, incluyendo amplificaciones de PCR que alteran o amplían la secuencia de codificación de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias de codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos usados en la amplificación de PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias completas de codificación de proteínas, como las que se usan habitualmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Dichas proteínas de fusión se usan a menudo para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2), introducir un dominio de unión, una actividad enzimática o un epítopo para facilitar la purificación de la proteína, la detección de la misma u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3), dirigir la secreción o la traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de las bacterias Gram negativas, o el retículo endoplásmico de las células eucariotas, lo que a menudo da lugar a la glicosilación de la proteína.

Las secuencias variantes de nucleótidos y aminoácidos de la presente divulgación también incluyen las secuencias obtenidas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como la mezcla de ADN. Con dicho procedimiento, se pueden usar una o más regiones codificantes de proteínas plaguicidas diferentes para crear una nueva proteína plaguicida que posea las propiedades deseadas. De este modo, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y que pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés pueden barajarse entre un gen pesticida de la invención y otros genes pesticidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifique una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como una mayor actividad insecticida. Las estrategias para una mezcla de ADN de este tipo son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de los Estados Unidos N° 5.605.793 y N° 5.837.458.

El intercambio o la mezcla de dominios es otro mecanismo para generar proteínas pesticidas alteradas. Los dominios pueden intercambiarse entre proteínas plaguicidas, dando lugar a toxinas híbridas o quiméricas con una actividad plaguicida o con un espectro diana mejorados. Los procedimientos para generar proteínas recombinantes y probar su actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol.

67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem.

266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol.

65:2918-2925 ).

Vectores

Una secuencia pesticida de la invención puede proporcionarse en un casete de expresión para su expresión en una planta de interés. Por "casete de expresión para plantas" se entiende una construcción de ADN que es capaz de dar lugar a la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal. Normalmente contienen un promotor y una secuencia codificadora. A menudo, estas construcciones también contienen una región del extremo 3' no traducida. Dichas construcciones pueden contener una "secuencia señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi.

Por "secuencia señal" se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da lugar a un transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a través de la membrana celular. En eucariotas, esto implica normalmente la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Las toxinas insecticidas de las bacterias suelen sintetizarse como protoxinas, que se activan protolíticamente en el intestino del organismo perjudicial diana ( Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516 ). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia señal está situada en la secuencia nativa, o puede obtenerse de una secuencia de la invención. Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que, cuando se traduce, da lugar a una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, esto incluye las secuencias líder que dirigen el transporte y/o la glicosilación mediante el paso al retículo endoplásmico, el paso a las vacuolas, los plastos, incluidos los cloroplastos, las mitocondrias, y similares.

Por "vector de transformación vegetal" se entiende una molécula de ADN necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión vegetal, y puede estar organizada en más de una molécula de ADN "vectorial". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que usan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de acción cis y trans necesarias para la transformación de células vegetales ( Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 ). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias o fragmentos de ADN heterólogo en una célula exógena. El casete incluirá secuencias reguladoras 5' y/o 3' operativamente unidas a una secuencia de la invención. Por "operativamente unido" se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Por lo general, operativamente unido significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificadoras de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener además al menos un gen adicional que se cotransformará en el organismo. Alternativamente, el gen o los genes adicionales se pueden proporcionar en múltiples casetes de expresión.

En varias realizaciones, la secuencia de nucleótidos de la invención está vinculada de forma operativa a un promotor, por ejemplo, a un promotor vegetal. "Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificante posterior. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y de la traducción (también denominadas "secuencias de control"), son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Un casete de expresión de este tipo está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia pesticida que estará bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación traduccional y transcripcional (es decir, una región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o exógeno o heterólogo, al huésped vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o, alternativamente, una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" al huésped vegetal, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "exógeno" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural de la secuencia de ADN operativa de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés operativamente unida, puede ser nativa con el huésped de la planta, o puede ser obtenida de otra fuente (es decir, ajena o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped de la planta, o cualquier combinación de los mismos). Existen regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y de la nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, el/los gen(es) puede(n) ser optimizado(s) para aumentar la expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse usando codones preferentes por la célula huésped para mejorar la expresión, o pueden sintetizarse usando codones con una frecuencia de uso de codones preferida por el huésped. Generalmente, se incrementará el contenido de GC en el gen. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión sobre el uso de los codones preferentes por parte del huésped. Existen procedimientos en la técnica para sintetizar genes preferentes por las plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n° 5.380.831 y 5.436.391, la publicación de patente de los Estados Unidos n° 20090137409 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

En una forma de realización, la proteína pesticida se dirige al cloroplasto para su expresión. De esta manera, cuando la proteína pesticida no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá además un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la proteína pesticida a los cloroplastos. Los péptidos de tránsito de este tipo son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen plaguicida que se va a dirigir al cloroplasto puede optimizarse para su expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse usando los codones preferentes por el cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 5.380.831.

Transformación de plantas

Los procedimientos de la invención implican la introducción de una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótidos de tal manera que la construcción acceda al interior de una célula de la planta. Los procedimientos de la invención no requieren que se use un procedimiento particular para introducir una construcción nucleotídica en una planta, solo que la construcción nucleotídica acceda al interior de al menos una célula de la planta. Los procedimientos para introducir construcciones de nucleótidos en las plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, procedimientos de transformación estable, procedimientos de transformación transitoria y procedimientos mediados por virus.

Por "planta" se entienden las plantas enteras, los órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), las semillas, las células vegetales, los propágulos, los embriones y la progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de la hoja, células de la raíz, células del floema, polen).

"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o "plantas o células o tejidos transformados de forma estable" se refiere a plantas en las que se han incorporado o integrado en la célula vegetal secuencias de ácido nucleico exógenas o fragmentos de ADN. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen las que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, así como las que pueden ser endógenas, o estar presentes en la célula vegetal no transformada. "Heteróloga" se refiere generalmente a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o a parte del genoma nativo en el que están presentes, y que han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección o similares.

Las plantas transgénicas de la invención expresan una o más de las nuevas secuencias de toxinas divulgadas en el presente documento. En varias realizaciones, la planta transgénica comprende además uno o más genes adicionales para la resistencia a los insectos (por ejemplo, Cry1, talescomo los miembros de las familias Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E y CrylF; Cry2, tales como los miembros de la familia Cry2A; Cry9, tales como los miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; etc.). Un experto en la materia entenderá que la planta transgénica puede comprender cualquier gen que imparta un rasgo agronómico de interés.

La transformación de las células vegetales puede llevarse a cabo mediante una de las diversas técnicas conocidas en la técnica. El gen pesticida de la invención puede modificarse para obtener o mejorar la expresión en las células vegetales. Normalmente, una construcción que exprese dicha proteína contendría un promotor para dirigir la transcripción del gen, así como una región no traducida 3' para permitir la terminación de la transcripción y de la poliadenilación. La organización de tales construcciones es bien conocida en la técnica. En algunos casos, puede ser útil modificar el gen de manera que el péptido resultante sea secretado o dirigido de otra manera dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede modificarse para que contenga un péptido señal con objeto de facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico. También puede ser preferible diseñar el casete de expresión de la planta para que contenga un intrón, de tal manera que se requiera el procesamiento del ARNm del intrón para la expresión.

Normalmente, este "casete de expresión de la planta" se insertará en un "vector de transformación de la planta". Este vector de transformación de plantas puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN, necesarios para lograr la transformación de plantas. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica usar vectores de transformación de plantas que se compongan de más de un segmento de ADN contiguo. A menudo, estos vectores se denominan en la técnica "vectores binarios". Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se usan con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente son bastante grandes, y resulta ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN distintas. Los vectores binarios suelen contener un vector plasmídico que contiene las secuencias de acción cis necesarias para la transferencia de ADN-T (tales como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que está diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen modificado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal para la que se desea generar plantas transgénicas). En este vector plasmídico también están presentes las secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias de acción cis están dispuestas de manera que permiten una transferencia eficiente a las células vegetales y su expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen pesticida están situados entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo, un segundo plásmido vector contiene los factores trans-activos que median la transferencia a las células vegetales del ADN-T de Agrobacterium. Este plásmido suele contener las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por medio de escisión en las secuencias de los bordes y la transferencia de ADN mediada por el virus, tal como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451 . Pueden usarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo vector plasmídico no es necesario para transformar las plantas por otros procedimientos como la microproyección, la microinyección, la electroporación, el polietilenglicol, etc.

En general, los procedimientos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a las células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguida de la aplicación de un nivel de umbral máximo de selección apropiado (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Los explantes suelen transferirse a un aporte fresco del mismo medio y se cultivan de manera convencional. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en un medio de regeneración, suplementado con un nivel máximo de agente seleccionador. A continuación, los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar el brote o la plántula enraizados. La plántula transgénica se desarrolla después hasta dar una planta madura que produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes se transfieren normalmente a un aporte fresco del mismo medio y se cultivan de manera convencional. Una descripción general de las técnicas y de los procedimientos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células, tanto las transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier trozo de callo o tejido diana sometido o grupo de células. La capacidad de eliminar las células no transformadas y permitir la proliferación de las células transformadas da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar las células no transformadas constituye una limitación para la rápida recuperación de las células vegetales transformadas y la generación con éxito de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para la introducción de secuencias de nucleótidos en las plantas, pueden variar en función del tipo de planta o de célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, a la que se dirige la transformación. La generación de plantas transgénicas puede llevarse a cabo mediante uno de los diversos procedimientos existentes, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, la microinyección, la electroporación, la transferencia directa de genes, la introducción de ADN exógeno heterólogo por Agrobacterium en las células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), el bombardeo de células vegetales con ADN exógeno heterólogo adherido a partículas, la aceleración de partículas balísticas, la transformación por haz de aerosol (Solicitud publicada de los Estados Unidos N° 20010026941; Patente de los Estados Unidos N14.945.050; Publicación Internacional N° WO 91/00915; Solicitud publicada de los Estados Unidos N° 2002015066), transformación Lec1, y otros varios procedimientos no mediados por partículas para transferir ADN.

Los procedimientos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El procedimiento se basa en la entrega con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y en la orientación del ADN al genoma del plástido mediante recombinación homóloga. Además, la transformación de los plastos puede llevarse a cabo mediante la transactivación de un transgén silencioso transportado por los plastos mediante la expresión preferente en el tejido de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida por los plastos. Este sistema se ha descrito en McBride et al. (1994) Proc. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Tras la integración del ADN exógeno heterólogo en las células vegetales, se aplica un nivel máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no transformadas y se separan y proliferan las células supuestamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de selección, transfiriéndolas regularmente a un medio fresco. Mediante el paso continuo y el desafío con una selección apropiada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. Se pueden usar entonces procedimientos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo de interés integrado en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas pueden ser cultivadas en plantas conforme a las técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden ser cultivadas y polinizadas con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y se puede identificar el híbrido resultante con expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda, y luego se cosechan las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, la presente invención proporciona semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que tienen incorporadoade forma estable en su genoma una construcción nucleotídica de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención.

Evaluación de la transformación de plantas

Tras la introducción del ADN exógeno heterólogo en las células vegetales, la transformación o la integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos procedimientos, tales como el análisis de los ácidos nucleicos, de las proteínas y de los metabolitos asociados al gen integrado.

El análisis de PCR es un procedimiento rápido para examinar las células transformadas, los tejidos o los brotes con el fin de detectar la presencia del gen incorporado en la etapa inicial antes de trasplantar al suelo ( Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ). La PCR se lleva a cabo usando cebadores de oligonucleótidos específicos del gen de interés o del fondo del vector Agrobacterium, etc.

La transformación de la planta puede confirmarse mediante el análisis de Southern blot del ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con las enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. La membrana, o "blot", se sondea entonces, por ejemplo, con un fragmento de ADN diana marcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta según las técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de Northern blot, el ARN se aísla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído y se coloca en un filtro de nylon de acuerdo con los procedimientos estándar que se usan habitualmente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión del ARN codificado por el gen plaguicida se comprueba entonces hibridando el filtro con una sonda radiactiva obtenida de un gen plaguicida, por procedimientos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En las plantas transgénicas se pueden realizar ensayos de Western blot, ensayos bioquímicos y similares para confirmar la presencia de la proteína codificada por el gen del pesticida mediante procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001, supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína del pesticida.

Actividad plaguicida en las plantas

En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresen la proteína pesticida según la invención que tiene actividad pesticida. Los procedimientos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden usarse para generar plantas transgénicas, pero la manera en que se generan las células de la planta transgénica no es crítica para la presente invención. Los procedimientos conocidos o descritos en la técnica, tales como la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación biolística y los procedimientos no mediados por partículas, pueden usarse a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una proteína plaguicida según la invención pueden aislarse por procedimientos comunes descritos en la técnica, por ejemplo, mediante la transformación de callo, la selección de callo transformado y la regeneración de plantas fértiles a partir de dicho callo transgénico. En dicho proceso, se puede usar cualquier gen como marcador seleccionable, siempre que su expresión en las células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar las células transformadas.

Se han desarrollado varios marcadores para su uso con células vegetales, tales como la resistencia al cloranfenicol, al aminoglucósido G418, a la higromicina o similares. Otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo del cloroplasto también pueden usarse como marcadores seleccionables. Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a las plantas frente a los herbicidas tales como el glifosato, el bromoxinil o la imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Se ha informado de tales genes ( Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de la nitrilasa resistente al bromoxinil); y Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a la imidazolinona AHAS). Además, los genes aquí divulgados son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o vegetales. Los procedimientos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de la misma son bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, la presencia del transgén se detecta mediante pruebas de actividad plaguicida.

Las plantas fértiles que expresan una proteína plaguicida pueden someterse a pruebas de actividad plaguicida, y las plantas que muestran una actividad óptima se seleccionan para su posterior reproducción. Existen procedimientos en la técnica para ensayar la actividad plaguicida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede usarse para transformar cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las monocotiledóneas y las dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero sin limitaciones, el maíz, el sorgo, el trigo, el girasol, el tomate, las crucíferas, los pimientos, la patata, el algodón, el arroz, la soja, la remolacha azucarera, la caña de azúcar, el tabaco, la cebada y la colza, Brassica sp, alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuetes, batata, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, anacardo, macadamia, almendra, avena, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las hortalizas incluyen, pero sin limtarse a ellas, tomates, lechuga, judías verdes, habas, guisantes y miembros del género Cucumis tales como el pepino, el melón y el melón piel de sapo. Las plantas ornamentales incluyen, entre otras, la azalea, la hortensia, el hibisco, las rosas, los tulipanes, los narcisos, las petunias, el clavel, la poinsettia y el crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo agrícola (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en el control de plaguicidas

Los procedimientos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en el control de plagas o en la ingeniería de otros organismos como agentes pesticidas son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido modificados genéticamente para contener un gen plaguicida de la invención y una proteína pueden usarse para proteger los cultivos y los productos agrícolas frente a las plagas. En un aspecto de la invención, las células enteras, es decir, no lisadas, de un organismo productor de toxina (pesticida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando ésta se aplica al entorno del o de los organismos perjudiciales diana.

Alternativamente, el pesticida se produce introduciendo un gen pesticida en un huésped celular. La expresión del gen pesticida da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del pesticida. En un aspecto de la presente invención, estas células se tratan entonces en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando ésta se aplica al entorno del o de los organismos perjudiciales diana. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos plaguicidas encapsulados de forma natural pueden formularse entonces de acuerdo con las técnicas convencionales para su aplicación al entorno que alberga un organismo perjudicial diana, por ejemplo, el suelo, el agua y el follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319 y las referencias citadas en él. Alternativamente, se pueden formular las células que expresan un gen de la presente invención para permitir la aplicación del material resultante como pesticida.

Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en forma de composiciones y pueden aplicarse a la zona de cultivo o a la planta que hay que tratar, simultáneamente o de manera sucesiva, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites latentes, polímeros y/o formulaciones portadoras de liberación prolongada o biodegradables que permiten la dosificación a largo plazo de una zona diana tras una única aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, viricidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si se desea, junto con otros vehículos agrícolamente aceptables, tensioactivos o adyuvantes promotores de la aplicación empleados habitualmente en las técnicas de formulación. Los vehículos y los adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias empleadas habitualmente en la tecnología de la formulación, por ejemplo, sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones pueden prepararse en forma de "cebos" comestibles o convertirse en "trampas" para organismos perjudiciales que permitan la alimentación o la ingestión de la formulación plaguicida por parte del organismo perjudicial diana.

Los procedimientos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención, o de una composición agroquímica de la presente invención que contenga al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacterianas de la presente invención, incluyen la aplicación foliar, el recubrimiento de la semillas y la aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

La composición puede formularse en forma de polvo, gránulos, aerosol, emulsión, coloide, solución o similar, y puede prepararse por medios convencionales tales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprenda el polipéptido. En todas las composiciones que contienen al menos un polipéptido pesticida según la invención, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % en peso.

Las plagas de lepidópteros pueden destruirse o reducir su número en un área determinada mediante los procedimientos de la invención, o pueden aplicarse estos profilácticamente a un área medioambiental para prevenir la infestación por una plaga susceptible. Preferentemente, el organismo perjudicial ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad plaguicida eficaz del polipéptido. Por "cantidad eficaz como plaguicida" se entiende una cantidad del plaguicida capaz de provocar la muerte de al menos un organismo perjudicial, o de reducir notablemente su crecimiento, alimentación o desarrollo fisiológico normal. Esta cantidad variará en función de factores tales como, por ejemplo, las plagas específicas que deben controlarse, el entorno específico, la ubicación, la planta, el cultivo o el lugar agrícola que debe tratarse, las condiciones ambientales y el procedimiento, la tasa, la concentración, la estabilidad y la cantidad de aplicación de la composición polipeptídica con eficacia plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones medioambientales, y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de la plaga.

Las composiciones plaguicidas descritas pueden prepararse formulando la célula bacteriana, el cristal y/o la suspensión de esporas, o el componente proteico aislado con el vehículo conveniente, aceptable para la agricultura. Las composiciones pueden formularse antes de su administración en un medio apropiado, tal como liofilizado, liofilizado, desecado, o en un portador acuoso, medio o diluyente adecuado, como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de polvo o material granular, o como una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones de aceite/agua, o como polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material vehículo adecuado para la aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "vehículo aceptable desde el punto de vista agrícola" incluye todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, adhesivos, aglutinantes, etc. que se usan normalmente en la tecnología de formulación de plaguicidas; son bien conocidos por los expertos en formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezclando, combinando y/o triturando homogéneamente la composición plaguicida con los adyuvantes adecuados usando las técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y los procedimientos de aplicación adecuados se describen en la patente de los Estados Unidos n° 6.468.523.

"Plaga u organismo perjudicial" incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Díptera, Hymenoptera, Lepídoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemíptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Síphonaptera, Tríchoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepídoptera, y Díptera.

El orden Coleoptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga. El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboídea y Gyrínoídea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophíloídea, Staphylínoídea, Cantharoídea, Cleroídea, Elateroídea, Dascílloídea, Dryopoídea, Byrrhoídea, Cucujoídea, Meloídea, Mordelloídea, Tenebríonoídea, Bostríchoídea, Scarabaeoídea, Cerambycoídea, Chrysomeloídea y Curculíonoídea. La superfamilia Caraboídea incluye las familias Cícíndelídae, Carabídae y Dytíscídae. La superfamilia Gyrínoídea incluye la familia Gyrínídae. La superfamilia Hydrophíloídea incluye la familia Hydrophílídae. La superfamilia Staphylínoídea incluye las familias Sílphídae y Staphylínídae. La superfamilia Cantharoídea incluye las familias Cantharídae y Lampyrídae. La superfamilia Cleroídea incluye las familias Clerídae y Dermestídae. La superfamilia Elateroídea incluye las familias Elaterídae y Buprestídae. La superfamilia Cucujoídea incluye la familia Coccínellídae. La superfamilia Meloídea incluye la familia Meloídae. La superfamilia Tenebríonoídea incluye la familia Tenebríonídae. La superfamilia Scarabaeoídea incluye las familias Passalídae y Scarabaeídae. La superfamilia Cerambycoídea incluye la familia Cerambycídae. La superfamilia Chrysomeloídea incluye la familia Chrysomelídae. La superfamilia Curculíonoídea incluye las familias Curculíonídae y Scolytídae.

El orden Díptera incluye los subórdenes Nematocera, Brachycera y Cyclorrhapha. El suborden Nematocera incluye las familias Típulídae, Psychodídae, Culícídae, Ceratopogonídae, Chíronomídae, Símulíídae, Bíbíonídae y Cecídomyíídae. El suborden Brachycera incluye las familias Stratíomyídae, Tabanídae, Therevídae, Asílídae, Mydídae, Bombylíídae y Dolíchopodídae. El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschíza y Aschíza. La división Aschíza incluye las familias Phoridae, Syrphidae y Conopidae. La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae. La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae y Drosophilidae. La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae y Sarcophagidae.

El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae y Tineidae.

Los nematodos incluyen nematodos parásitos como los de los nódulos de la raíz, los formadores de quistes y los que provocan lesiones, incluidos Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; en particular los miembros de los nematodos del quiste, incluidos, entre otros, Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la patata). Los nematodos que provocan lesiones incluyen Pratylenchus spp.

Las plagas de hemípteros (que incluyen especies designadas como Hemiptera, Homoptera o Heteroptera) incluyen, pero no se limitan a, Lygus spp, como el chinche de las plantas occidental (Lygus hesperus), el chinche de las plantas (Lygus lineolaris) y el chinche verde de las plantas (Lygus elisus); pulgones, como el pulgón verde del melocotón (Myzus persicae), el pulgón del algodón (Aphis gossypii), el pulgón de las cerezas o el pulgón negro de las cerezas (Myzus cerasi), el pulgón de la soja (Aphis glycines Matsumura); el saltamontes marrón de las plantas (Nilaparvata lugens), y el saltamontes verde del arroz (Nephotettix spp. ); y chinches apestosas, como la chinche apestosa verde (Acrosternum hilare), la chinche apestosa marrón (Halyomorpha halys), la chinche apestosa verde del sur (Nezara viridula), la chinche apestosa del arroz (Oebalus pugnax), la chinche de bosque (Pentatoma rufipes), la chinche apestosa europea (Rhaphigasternebulosa) y la chinche escudo (Troilus luridus).

Las plagas de insectos de la invención para los principales cultivos incluyen Maíz: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano de la espiga del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Diatraea grandiosella, barrenador del maíz del suroeste; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del maíz; Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz del oeste; Diabrotica longicornis barberi, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., Cyclocephala borealis, gusano enmascarado del norte; Cyclocephala immaculata, gusano enmascarado del sur; Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulgoso del maíz; Sphenophorus maidis, chinche del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, gusano del maíz; Agromyza parvicornis, minador del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips del césped; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, araña roja; Sorgo: Chilo partellus, barrenador del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Feltia subterranea, gusano cortador granulado; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus y Aeolus spp., Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo de la pulga del maíz; Sphenophorus maidis, chinche del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña del carmín; Tetranychus urticae, araña roja; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano militar; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador occidental; Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor del tallo del maíz; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Hypera punctata, gorgojo de la hoja del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; pulgón ruso del trigo; Schizaphis graminum, chinche verde; Macrosiphum avenae, pulgón inglés del grano; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro del rizado del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla de la yema del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosca de la semilla del girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Spodoptera exigua, gusano de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado de la cápsula; Anthonomus grandis, gorgojo de la cápsula; Aphis gossypii, pulgón del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, pulgón del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca de las bandas; Lygus lineolaris, chinche de las plantas; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña del carmín; Tetranychus urticae, araña de dos manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano militar del otoño; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo del agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, saltahojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, chicharrita de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga del frijol terciopelo; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano de la remolacha; Heliothis virescens, gusano del algodón; Helicoverpa zea, gusano del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo mexicano de la judía; Myzus persicae, pulgón verde del melocotón; Empoasca fabae, chicharrita de la patata; Acrosternum hilare, chinche verde; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, gusano de las semillas; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña de la fresa; Tetranychus urticae, araña roja; Cebada: Ostrinia nubilalis, barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, chinche verde; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche apestosa verde; Euschistus servus, chinche apestosa marrón; Delia platura, gusano de las semillas; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro marrón del trigo; Colza: Brevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo de la pulga; Mamestra configurata, gusano militar de Bertha; Plutella xylostella, polilla del dorso del diamante; Delia ssp., Gusanos de la raíz.

Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como los de los nódulos de la raíz, los nematodos del quiste y los nematodos causantes de lesiones, incluidos Heterodera spp., Meloidogyne spp, y Globodera spp.; en particular los miembros de los nematodos del quiste, incluidos, entre otros, Heterodera glycines (nematodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la patata). Los nematodos causantes de lesiones incluyen Pratylenchus spp.

Procedimientos para aumentar el rendimiento de las plantas

Se proporcionan procedimientos para aumentar el rendimiento de las plantas. Estos procedimientos comprenden proporcionar una planta o una célula vegetal que exprese un polinucleótido que codifique la secuencia del polipéptido pesticida divulgado en el presente documento y cultivar la planta o una semilla de la misma en un campo infestado con (o susceptible de infestación por) una plaga contra la que dicho polipéptido tiene actividad pesticida. En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido tiene actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos, y dicho campo está infestado por una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros o nematodos. Tal y como se define aquí, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o la cantidad de biomasa producida por la planta. Por "biomasa" se entiende cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. Aumentar el rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de las hojas de la planta puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Además, el aumento de la biomasa foliar puede usarse para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales obtenidos de las plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluya, pero no se limite a, al menos un aumento del 1 %, al menos un aumento del 3 %, al menos un aumento del 5 %, al menos un aumento del 10 %, al menos un aumento del 20 %, al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 100 % o un aumento mayor del rendimiento en comparación con una planta que no exprese la secuencia pesticida. En algunos procedimientos concretos, el rendimiento de la planta se incrementa como resultado de la mejora de la resistencia a las plagas de una planta que expresa una proteína pesticida divulgada en el presente documento. La expresión de la proteína plaguicida da lugar a una reducción de la capacidad de un organismo perjudicial para infestar o alimentarse.

Las plantas también pueden ser tratadas con una o más composiciones químicas, incluyendo uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas. Las composiciones químicas a modo de ejemplo incluyen: Herbicidas para frutas y hortalizas: Atrazina, Bromacil, Diurón, Glifosato, Linurón, Metribuzin, Simazina, Trifluralina, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfurón Gowan, Paraquat, Propizamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfurón, Indaziflam; Insecticidas para frutas y hortalizas: Aldicarb , Bacillus thuriengiensis, Carbaril, Carbofuran, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Ciflutrina/beta-ciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrina, Acequinocilo, Bifenazato, Metoxifenozida, Novalurón, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Fluacripirima, Espirodiclofeno, Gamma-cihalotrina, Spiromesifen, Spinosad, Rynaxypyr, Cyazypyr, Triflumuron,Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamide, Thiodicarb, Metaflumizone, Sulfoxaflor, Cyflumetofen, Cyanopyrafen, Clothianidin, Thiamethoxam, Spinotoram, Thiodicarb, Flonicamid, Methiocarb, Emamectin-benzoate, Indoxacarb, Fenamiphos, Pyriproxifen, Fenbutatin-oxid; Fungicidas para frutas y hortalizas: Ametoctradin, Azoxystrobin, Benthiavalicarb, Boscalid, Captan, Carbendazim, Chlorothalonil, Copper, Cyazofamid, Cyflufenamid, Cymoxanil, Cyproconazole, Cyprodinil, Difenoconazole, Dimetomorph, Dithianon, Fenamidona, Fenhexamid, Fluazinam, Fludioxonil, Fluopicolide, Fluopyram, Fluoxastrobin, Fluxapyroxad, Folpet, Fosetyl, Iprodione, Iprovalicarb, Isopirazam, Kresoxim-metilo, Mancozeb, Mandipropamid, Metalaxil/mefenoxam, Metiram, Metrafenona, Miclobutanil, Penconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propamocarb, Propiconazol, Propineb, Proquinazid, Protioconazol, Piraclostrobina, Pirimetanil, Quinoxifeno, Espiroxamina, Azufre, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina; Herbicidas para cereales: 2.4-D, Amidosulfurón, Bromoxinil, Carfentrazona-E, Clorotolurón, Clorsulfurón, Clodinafop-P, Clopiralid, Dicamba, Diclofop-M, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Flucarbazona-NA, Flufenacet, Flupirosulfurón-M, Fluroxipir, Flurtamona, Glifosato, Iodosulfurón, Ioxinil, Isoproturón, MCPA, Mesosulfurón, Metsulfurón, Pendimetalina, Pinoxaden, Propoxicarbazona, Prosulfocarb, Piroxsulam, Sulfosulfurón, Thifensulfurón, Tralkoxydim, Triasulfurón, Tribenurón, Trifluralina, Tritosulfurón; Fungicidas para cereales: Azoxistrobin, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Chlorothalonil, Cyflufenamid, Cyproconazole, Cyprodinil, Dimoxystrobin, Epoxiconazole, Fenpropidin, Fenpropimorph, Fluopyram, Fluoxastrobin, Fluquinconazole, Fluxapyroxad, Isopyrazam, Kresoxim-metilo, Metconazole, Metrafenone, Penthiopyrad, Picoxystrobin, Prochloraz, Propiconazole, Proquinazid, Prothioconazole, Pyraclostrobin, Quinoxyfen, Spiroxamine, Tebuconazole, Thiophanatemethyl, Trifloxystrobin; Insecticidas para cereales: Dimetoato, Lambda-cihaltrina, Deltametrina, alfa-cipermetrina, pciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Clorfirifos, Pirimicarb, Metiocarb, Sulfoxaflor; Herbicidas para maíz: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, (S-)Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotrione, Foramsulfuron, Topramezone, Tembotrione, Saflufenacil, Thiencarbazone, Flufenacet, Pyroxasulfon; Insecticidas para el maíz: Carbofurano, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufos, Tiametoxam, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumurón, Rynaxypyr, Deltamethrin, Thiodicarb, p-Cyfluthrin, Cypermethrin, Bifenthrin, Lufenuron, Tebupirimphos, Ethiprole, Cyazypyr, Thiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Avermectin; Fungicidas para el maíz: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Ciproconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenitropan, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapyroxad, Isopirazam, Metconazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propiconazol, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina; Herbicidas para el arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfurón, Bensulfurón, Cihalofop, Daimurón, Fentrazamida, Imazosulfurón, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfurón, Pributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfurón, Oxaziclomefona, Benzobiciclón, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargilo, Etoxisulfurón, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfán; Insecticidas para el arroz: Diazinon, Fenobucarb, Benfuracarb, Buprofezin, Dinotefuran, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Thiacloprid, Chromafenozide, Clothianidin, Ethiprole, Flubendiamide, Rynaxypyr, Deltametrina, Acetamiprid, Tiametoxam, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, Emamectin-Benzoate, Cipermetrina, Clorpirifos, Etofenprox, Carbofuran, Benfuracarb, Sulfoxaflor; Fungicidas para el arroz: Azoxistrobin, Carbendazim, Carpropamid, Diclocymet, Difenoconazol, Edifenphos, Ferimzone, Gentamicina, Hexaconazol, Hymexazol, Iprobenfos (IBP), Isoprotiolano, Isotianil, Kasugamicina, Mancozeb, Metominostrobin, Orysastrobin, Pencycuron, Probenazole, Propiconazole, Propineb, Pyroquilon, Tebuconazole, Thiophanate-methyl, Tiadinil, Tricyclazole, Trifloxystrobin, Validamycin; Herbicidas para el algodón: Diurón, Fluometurón, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butilo, Glifosato, Norflurazón, Pendimetalina, Piritibac-sodio, Trifloxisulfurón, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazurón; Insecticidas para el algodón: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamiprid, Benzoato de Emamectina, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-Chalotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gamma-Chalotrina, Espiromesifeno, Piridalil, Flonicamid Flubendiamida, Triflumurón,Rynaxypyr,Beta-Ciflutrina,Spirotetramat, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, dinetofurano, flubendiamida, ciazipir, espinosad, espinotoram, gamma cialotrina, 4-[(6-clorpiridina-3-il)metil](2,2-difluoroetil)amino]furan-2(5H)-on, tiodicarb, avermectina, flonicamid, piridalil, espiromesifen, sulfoxaflor; Fungicidas para el algodón: Azoxistrobin, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Chlorothalonil, Copper, Cyproconazole, Difenoconazole, Dimoxystrobin, Epoxiconazole, Fenamidone, Fluazinam, Fluopyram, Fluoxastrobin, Fluxapyroxad, Iprodione, Isopirazam, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metominostrobin, Penthiopyrad, Picoxystrobin, Propineb, Prothioconazole, Pyraclostrobin, Quintozene, Tebuconazole, Tetraconazole, Thiophanate-methyl, Trifloxystrobin; Herbicidas para la soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimurón-Etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazethapyr, (S-)Metolacloro, Metribuzin, Pendimetalina, Tepraloxydim, Glufosinato; Insecticidas para la soja: Lambda-cihalotrina, metomilo, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, espinosad, espinotoram, benzoato de emamectina, fipronil, etiprol, Deltametrina, p-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, 4-[(6-Clorpiridina-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano-2(5H)-on, Espirotetramat, Espinodiclofeno, Triflumurón, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas para la soja: Azoxistrobin, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Chlorothalonil, Copper, Cyproconazole, Difenoconazole, Dimoxystrobin, Epoxiconazole, Fluazinam, Fluopyram, Fluoxastrobin, Flutriafol, Fluxapyroxad, Isopyrazam, Iprodione, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metconazol, Metominostrobin, Myclobutanil, Penthiopyrad, Picoxystrobin, Propiconazole, Propineb, Prothioconazole, Pyraclostrobin, Tebuconazole, Tetraconazole, Thiophanate-methyl, Trifloxystrobin; Herbicidas para la remolacha: Cloridazón, Desmedipham, Etofumesato, Fenmedipham, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitrón, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfurón, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas para remolacha: Imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, deltametrina, p-ciflutrina, gamma/lambda cihalotrina, 4-[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Teflutrin, Rynaxypyr, Cyaxypyr, Fipronil, Carbofuran; Herbicidas para la colza: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina Etametsulfurón, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para colza: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Flusilazol, Fluxapyroxad, Iprodiona, Isopirazam, Cloruro de Mepiquat, Metconazol, Metominostrobina, Paclobutrazol, Pentiopirad, Picoxistrobina, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Tiofanato-metilo, Trifloxistrobina, Vinclozolina; Insecticidas para colza: Carbofurano. Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofurano, p-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, tau-Fluvaleriate, Ethiprole, Spinosad, Spinotoram, Flubendiamide, Rynaxypyr, Cyazypyr, 4-[(6-Chlorpyridin-3-yl)methyl](2,2-difluorethyl)amino]furan-2(5H)-on.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no son limitantes. Las tablas 2-4 y 6-8 se presentan únicamente con fines comparativos.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

Ejemplo 1. Descubrimiento de nuevos genes pesticidas de Bacillus thuringiensis

Se identificaron nuevos genes pesticidas a partir de las cepas bacterianas ATX47307 y ATX65002 mediante los siguientes pasos:

• Preparación del ADN total de la cepa. El ADN total contiene tanto ADN genómico como ADN extracromosómico. El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o la totalidad de los siguientes elementos: plásmidos de diversos tamaños; cromosomas de fagos; otras moléculas extracromosómicas no caracterizadas.

• Secuenciación del ADN. El ADN total se secuencia mediante procedimientos de secuenciación de próxima generación.

• Identificación de genes putativos de toxinas a través de análisis de homología y/u otros análisis computacionales.

• Si es necesario, el acabado de la secuencia del gen de interés mediante una de las diversas estrategias de PCR o de clonación (por ejemplo, TAIL-PCR).

Tabla 1. Nuevo en identificado en la cepa ATX47307

Tabla 2 Nuevo en identificado en la cepa ATX47307

Tabla 3. Nuevo en identificado en la cepa ATX65002

Tabla 4. Nuevo gen identificado en la cepa ATX65002

Ejemplo 2. Ensayos de actividad plaguicida

Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden someter a ensayo para comprobar su capacidad de producir proteínas pesticidas. La capacidad de una proteína pesticida para actuar como pesticida sobre una plaga se evalúa a menudo de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. En dicho ensayo de alimentación, se expone al organismo perjudicial a una muestra que contiene los compuestos a ensayar o muestras de control. A menudo, esto se lleva a cabo colocando el material a ensayar, o una dilución adecuada de dicho material, en un material que el organismo perjudicial ingerirá, a modo de una dieta artificial. El material a ensayar puede estar compuesto por un líquido, un sólido o una infusión. El material a ensayar puede colocarse sobre la superficie y luego dejarse secar. Alternativamente, el material a ensayar puede mezclarse con una dieta artificial fundida, y luego dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pozo de una placa de microtitulación.

Los ensayos para organismos perjudiciales chupadores (por ejemplo, áfidos) pueden implicar la separación del material de ensayo del insecto mediante partición, idealmente una porción que pueda ser perforada por las piezas bucales chupadoras del insecto chupador, para permitir la ingestión del material de ensayo. A menudo, el material de prueba se mezcla con un estimulante de la alimentación, tal como la sacarosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de prueba en la boca, o el intestino del organismo perjudicial, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido de la prueba de la capacidad del organismo perjudicial para alimentarse de la planta transgénica. Las pruebas en plantas pueden implicar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo, pequeñas jaulas unidas a una hoja, o el aislamiento de plantas enteras en jaulas que contienen insectos.

Otros procedimientos y enfoques para someter los organismos perjudiciales a ensayo son conocidos en la técnica, y pueden encontrarse, por ejemplo, en Robertson y Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. También se describen ensayos en las revistas Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o en conversaciones con miembros de la Entomological Society of America (ESA).

En algunas realizaciones, las regiones de ADN que codifican la región de la toxina de las proteínas pesticidas aquí divulgadas se clonan en el vector de expresión de E. coli pMAL-C4x detrás del gen malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP). Estas fusiones dentro del marco dan lugar a la expresión de proteínas de fusión MBP-Axmi en E. coli.

Para la expresión en E. coli, se transforman BL21*DE3 con plásmidos individuales. Se inoculan colonias individuales en LB suplementado con carbenicilina y glucosa, y se cultivan durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se inocula medio fresco con el 1 % del cultivo de la noche y se hace crecer a 37 °C hasta la fase logarítmica. Posteriormente, los cultivos se inducen con 0,3 mM de IPTG durante la noche a 20 °C. Cada pellet de células se suspende en tampón Tris-Cl 20 mM, pH 7,4 200 mM NaCl 1 mM DTT inhibidores de proteasa y se sonican. El análisis por SDS-PAGE puede usarse para confirmar la expresión de las proteínas de fusión.

Los extractos totales libres de células se pasan por una columna de amilosa unido a una cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) para la purificación por afinidad de las proteínas de fusión MBP-axmi. Las proteínas de fusión unidas se eluyen de la resina con una solución de maltosa 10 mM. Las proteínas de fusión purificadas se escinden con Factor Xa o tripsina para eliminar la etiqueta aminoterminal MBP de la proteína Axmi. La escisión y la solubilidad de las proteínas pueden determinarse mediante SDS-PAGE

Ejemplo 3. Expresión y purificación

Las variantes truncadas de Axmi477 (que se establece en este documento como SEQ ID NO: 8), Axmi482 (que se establece en este documento como SEQ ID NO: 13), Axmi486 (que se establece en este documento como SEQ ID NO: 16) y Axmi525 (que se establece en este documento como SEQ ID NO: 26), fueron expresadas y ensayadas para su bioactividad. Los genes se amplificaron por PCR a partir de sus respectivas cepas usando la a Dn polimerasa de fusión HERCULASE® II con cebadores que incorporaban un enlazador AscI en el extremo 3'. El producto de PCR amplificado se digirió con AscI y se ligó al vector pMalC4X. Los clones se confirmaron mediante secuenciación y se transformaron en células competentes B121. Se inoculó una sola colonia de cada una en medio LB y se cultivó a 37 °C hasta la fase logarítmica, y se indujo con 0,5 mM de IPTG a 20 °C durante 18 horas. La proteína purificada se digirió con Factor Xa en una proporción de 1:50 a temperatura ambiente durante la noche. La proteína purificada se sometió a un bioensayo frente a plagas de insectos seleccionadas según el protocolo estándar. Los resultados se muestran en las tablas 5-8.

Tabla 5. Puntuaciones de mortalidad retraso en el crecimiento para Axmi477

Tabla 6. Puntuaciones de mortalidad retraso en el crecimiento para Axmi482

Tabla 7. Puntuaciones de mortalidad retraso en el crecimiento para Axmi486

Tabla 8. Puntuaciones de mortalidad retraso en el crecimiento para Axmi525

Puntuación de aturdimiento:

0 - Sin actividad

1- Aturdimiento no uniforme

2- Ligero aturdimiento de uniformidad

3 - Aturdimiento uniforme fuerte

4 - Atundimiento uniforme severo

Ejemplo 4. Vectorización de genes para la expresión en plantas

Las regiones codificantes de la invención están conectadas a secuencias promotoras y terminadoras apropiadas para la expresión en plantas. Tales secuencias son bien conocidas en la técnica y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor UBQ3 de Arabidopsis o el promotor CaMV 35S para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o PinlI. Las técnicas para producir y confirmar construcciones promotoras-gen-terminador también son bien conocidas en la técnica.

En un aspecto de la invención, se diseñan y generan secuencias sintéticas de ADN. Estas secuencias sintéticas tienen una secuencia de nucleótidos alterada en relación con la secuencia madre, pero codifican proteínas que son esencialmente idénticas a la secuencia madre.

En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de los genes sintéticos de manera que el péptido resultante se dirija a un orgánulo vegetal, tal como el retículo endoplásmico o el apoplasto. Las secuencias peptídicas que se sabe que dan lugar a la orientación de las proteínas de fusión a los orgánulos de la planta son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco Lupinus albus (GENBANK® ID Gl:14276838, Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606 ) es conocida en la técnica por dar lugar a la orientación al retículo endoplásmico de proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante también contiene una secuencia de retención en el retículo endoplásmico que comprende el péptido N-terminal-ácido lisina-ácido aspárticoácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL", SEQ ID NO: 27) en el extremo C-terminal, la proteína de fusión se dirigirá al retículo endoplásmico. Si la proteína de fusión carece de una secuencia de orientación al retículo endoplásmico en el extremo C, la proteína se dirigirá al retículo endoplásmico, pero en última instancia se secuestrará en el apoplasto.

Así, este gen codifica una proteína de fusión que contiene los treinta y un aminoácidos N-terminales del gen de la fosfatasa ácida del altramuz blanco Lupinus albus (GENBANK® ID Gl:14276838 , Miller et al., 2001, supra) fusionado al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la invención, así como la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 27) en el extremo C-terminal. Así, se predice que la proteína resultante se dirige al retículo endoplásmico de la planta tras su expresión en una célula vegetal.

Los casetes de expresión de plantas descritos anteriormente se combinan con un marcador seleccionable de plantas, apropiado para ayudar a la selección de células y tejidos transformados, y se unen en vectores de transformación de plantas. Estos pueden incluir vectores binarios de transformación mediada por Agrobacterium o vectores plasmídicos simples para la transformación por aerosol o biolística.

Ejemplo 5. Transformación de células de maíz con los genes de las proteínas pesticidas descritas en el presente documento

Las mazorcas de maíz se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas y para su uso en la transformación se prefieren los de un tamaño de 0,8-1,5 mm . Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como el medio DN62A5S (3,98 g/L de sales N6; 1 mL/L (de 1000x Stock) de vitaminas N6; 800 mg/L de L-asparagina; 100 mg/L de mio-inositol; 1,4 g/L de L-prolina; 100 mg/L de ácidos Casamino; 50 g/L de sacarosa; 1 mL/L (de 1 mg/mL Stock) de 2,4-D). Sin embargo, los medios y las sales distintos del DN62A5S son adecuados y se conocen en la técnica. Los embriones se incuban durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche.

Los explantes resultantes se transfieren a cuadrados de malla (30-40 por placa), se transfieren a un medio osmótico durante aproximadamente 30-45 minutos y luego se transfieren a una placa de irradiación (véase, por ejemplo, la publicación PCT n° WO/0138514 y la patente de los Estados Unidos n° 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para los genes de la invención en las células de la planta se aceleran en el tejido de la planta usando un acelerador de haz de aerosol, usando esencialmente las condiciones tal como se describen en la Publicación PCT No. WO/0138514. Después de la emisión, los embriones se incuban durante aproximadamente 30 minutos en un medio osmótico y se colocan en un medio de incubación durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Para evitar dañar indebidamente los explantes radiados, se incuban durante al menos 24 horas antes de transferirlos a los medios de recuperación. A continuación, los embriones se extienden en los medios del período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, a 25 °C en la oscuridad, y luego se transfieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección durante un máximo de ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular usada. Tras el periodo de selección, el callo resultante se transfiere a un medio de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan entonces bajo luz tenue, y se inicia el proceso de regeneración por procedimientos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se dejan enraizar en medios de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas de vivero y se propagan como plantas transgénicas.

Materiales

DN62A5S Medios

El pH de la solución se ajusta a un pH de 5,8 con IN KOH/1N KCl, se añade Gelrite (Sigma) a una concentración de hasta 3g/L, y se autoclava el medio. Después de enfriar a 50 °C, se añaden 2 ml/L de una solución madre de 5 mg/ml de nitrato de plata (Phytotechnology Labs).

Ejemplo 6. Transformación de genes de la invención en células vegetales mediante transformación mediada por Agrobacterium

Se recogen las mazorcas mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas y se prefieren los de un tamaño de 0,8-1,5 mm para su uso en la transformación. Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado y se incuban durante la noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es imprescindible incubar los embriones durante la noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contenga los vectores apropiados para la transferencia mediada por plásmidos Ti durante unos 5 10 minutos, y luego se colocan en placas con medios de co-cultivo durante unos 3 días (25 °C en la oscuridad). Tras el co-cultivo, los explantes se transfieren a medios de período de recuperación durante aproximadamente cinco días (a 25 °C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medios de selección durante un máximo de ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y de las características de la selección particular usada. Tras el periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración de embriones, hasta que se observa la formación de embriones

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad plaguicida contra los lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10.

2. La construcción de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos es:

a) una secuencia sintética que ha sido diseñada para su expresión en una planta; o

b) unido operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos en una célula vegetal.

3. Un vector que comprende la construcción de la reivindicación 1.

4. Una célula huésped que contiene la construcción de las reivindicaciones 1 o 2 o el vector de la reivindicación 3, preferentemente que es una célula huésped bacteriana o es una célula vegetal.

5. Una semilla transgénica que comprende la construcción de la reivindicación 1.

6. Un polipéptido recombinante con actividad plaguicida para lepidópteros, seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10; y b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10.

7. El polipéptido de la reivindicación 6 comprende, además, secuencias de aminoácidos heterólogas.

8. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 6.

9. La composición de la reivindicación 8, en donde dicha composición:

a) se selecciona entre el grupo que consiste en un polvo, un polvo fino, un pellet, un gránulo, un rociado, una emulsión, un coloide y una solución;

b) se prepara por desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas; o

c) comprende desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el 99 % en peso de dicho polipéptido.

10. Un procedimiento para destruir una plaga de lepidópteros o para controlar una población de plagas de lepidópteros, que comprende poner en contacto dicho organismo perjudicial o dicha población con, o alimentar a dicho organismo perjudicial o dicha población con una cantidad plaguicida eficaz del polipéptido de la reivindicación 6.

11. Un procedimiento para producir un polipéptido con actividad plaguicida contra lepidópteros, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

12. Una planta o una célula vegetal que tiene incorporada de forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida contra los lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se seleccione del grupo formado por:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5-10; y

13. La planta de la reivindicación 12, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada y colza.

14. Un procedimiento para proteger una planta contra una plaga de lepidópteros, que comprende expresar en una planta o en una célula suya una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida que tiene actividad pesticida contra una plaga de lepidópteros, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos establecida en el SEQ ID NO: 1;