UA122475C2

UA122475C2 - Ген токсину ахмі486 та спосіб його застосування

Info

Publication number: UA122475C2
Application number: UAA201910391A
Authority: UA
Inventors: Дуан Алан Лехтінен; Дуан Алан Лехтинен; Кімберлі С. Сампсон; Кимберли С. Сампсон; Кіра Робертс; Кира Робертс; Ітан Дунн; Итан Дунн; Нана Чоугулє
Original assignee: Атенікс Корп.
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2020-11-10
Also published as: US20160311865A1; CA2931259A1; CN106164274B; BR122021024287B1; UY35866A; CA3172737A1; MX367958B; US11767350B2; AU2023248098A1; AU2014364119A1; CA2931259C; WO2015088937A2; MX2019010451A; KR20210135637A; EP3800259B1; JP2021072796A; US10093946B2; ES2874901T3; EA033842B1; EP3800259C0

Abstract

Винахід стосується молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що має пестицидну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: a) нуклеотидної послідовності, викладеної під SEQ ІD NO:3; b) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність під будь-яким SEQ ID NO:15-19; c) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким SEQ ID NO:15-19. 58

Description

щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким 5ЕО ІЮ МО:15-19.

Дана заявка заявляє пріоритет відповідно до тимчасової заявки на патент США з реєстраційним Мо 61/913905, поданої 9 грудня 2013 року, і тимчасової заявки на патент США з реєстраційним Мо 61/913911, поданої 9 грудня 2013 року, вміст яких включено у даний документ за допомогою посилання у їх повному обсязі.

Офіційна копія переліку послідовностей надається у електронній формі за допомогою ЕЕ5- умер як овідформатований за АБСІЇ перелік послідовностей у файлі з назвою "АРА136054 5Т2541хі", створеному 14 листопада 2014 року, що має розмір 97 кілобайт і подається одночасно з даним описом. Перелік послідовностей, що міститься у цьому відформатованому за АЗСІЇ документі, є частиною даного опису і включений у даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Даний винахід стосується галузі молекулярної біології. Забезпечуються нові гени, які кодують пестицидні білки. Дані білки та нуклеотидні послідовності, що їх кодують, застосовуються для одержання пестицидних складів та при одержанні трансгенних рослин, стійких до сільськогосподарських шкідників.

ВасшШив (пигіпдіеп5і5 являє собою грампозитивну спороутворювальну грунтову бактерію, яка має здатність продукувати кристалічні включення, що проявляють специфічну токсичність щодо деяких рядів та видів комах, але є нешкідливими для рослин та інших нецільових організмів. У зв'язку з цим композиції, що містять штами Васіїйи5 «(пигіпдіепеіє або їх інсектицидні білки, можуть застосовуватися як екологічно прийнятні інсектициди / для контролю сільськогосподарських комах-шкідників або комах-переносників різних захворювань людей та тварин.

Кристалічні (Сту) білки (дельта-ендотоксини) від Васійн5 ІПигіпдіепбіє мають потужну інсектицидну активність щодо переважно личинок лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих та твердокрилих. Дані білки також продемонстрували активність щодо шкідників рядів

Нутепорієга, Ноторієга, РІнпігарієга, МаПорнада та Асагі, а також інших рядів безхребетних, таких як МетаїВпеїтіпіпез, РіагупеІтіп(пе5 та Загсотавіїдогрпога (РейеІзоп (1993) Тпе Васійив5

Тпишйпдієепвів Татіїу ігеє. Іп Адмапсей Епадіпеегей Резвіїсіде5, Магсе! Оеккетг, Іпс., Мем МогК, М.М.).

Дані білки первісно класифікували як СгуІ-Сгтум, переважно на основі їх інсектицидної активності. Основними класами були І ерідоріега-специфічні (І), Герідоріега-специфічні та

Зо Оіріега-специфічні (І), СоіІеоріега-специфічні (ІІ), Оіріега-специфічні (ІМ) та нематода- специфічні (М) ії (МІ). Додатково білки класифікували в підродини; більш спорідненим білкам у складі кожної родини надали кодові позначення, такі як СтутА, Сту1В, СтуїС тощо. Ще більш спорідненим білкам в рамках кожної групи надали такі позначення, як Сгу1С1, Сту1С2 тощо.

Було описано нову номенклатуру для генів Сгу, яка більше базується на основі гомології амінокислотних послідовностей, ніж специфічності щодо комахи-мішені (Стісктоге еї аї. (1998)

МісгоБбіо!. Мої. ВіоЇ. Кем. 62:807-813). (1998) МісгтобіоІ. Мої. ВіоІ. Нем. 62:807-813). У цій класифікації кожному токсину надається унікальна назва, що включає первинний ієрархічний рівень (арабська цифра), вторинний ієрархічний рівень (велика літера), третинний ієрархічний рівень (мала літера) та четвертинний ієрархічний рівень (друга арабська цифра). Римські цифри замінено арабськими цифрами у первинному ієрархічному рівні. Білки з ідентичністю послідовностей менше 45 95 мають різні первинні ієрархічні рівні, а критеріями для вторинних та третинних ієрархічних рівнів є ідентичність 78 та 95 95, відповідно.

Кристалічний білок не проявляє інсектицидної активності до моменту його поглинання та розчинення у середній кишці комахи. Поглинений протоксин зазнає гідролізу протеазами у травному тракті комахи з утворенням активної токсичної молекули. (НОПйе апа УуУпіїєЇІєу (1989)

Місторіої. Нем. 53:242-255). Даний токсин зв'язується з апікальними рецепторами щіткової облямівки у середній кишці личинок-мішеней та вбудовується в апікальну мембрану, утворюючи іонні канали або пори, що у результаті призводить до загибелі личинки.

Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домени (див., наприклад, де Маада еї аїЇ. (2001) Тгепазх Сепейс5 17:193-199). Перший консервативний структурний домен складається із семи альфа-спіралей та бере участь у проникненні через мембрану та пороутворенні. Домен ЇЇ складається з трьох складчастих бета-шарів, які упорядковані у конфігурації грецького ключа, а домен ПІ складається з двох антипаралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "|зеПу-тої" (ае

Маада еї а. 2001, вище). Домени ЇЇ та ПШ беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів і тому вважаються детермінантами специфічності токсину.

Через спустошення, яке можуть спричинити комахи, та для покращення врожайності шляхом контролю комах-шкідників, існує постійна потреба у відкритті нових форм пестицидних токсинів. 60 Забезпечуються композиції та способи для надання пестицидної активності бактеріям,

рослинам, клітинам рослин, тканинам та насінню рослин. Композиції містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують послідовності пестицидних та інсектицидних поліпептидів, вектори, які містять дані молекули нуклеїнових кислот, та клітини-хазяїни, які містять такі вектори. Композиції також містять послідовності пестицидних поліпептидів та антитіла до даних поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть застосовуватися в ДНК-конструкціях або касетах експресії для трансформації та експресії в організмах, у тому числі мікроорганізмах та рослинах. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть являти собою синтетичні послідовності, які було сконструйовано для експресії в організмі, включаючи без обмеження мікроорганізм або рослину. Композиції також містять бактерії, рослини, клітини рослин, тканини та насіння рослин, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом.

Зокрема, забезпечуються виділені або рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, які кодують пестицидний білок. Крім того, охоплені амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку. Зокрема, даний винахід забезпечує виділену або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, показану під ЗЕО ІЮ МО:5-26, або нуклеотидну послідовність, викладену під ЗЕО

ІО МО:1-4, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти. Нуклеотидні послідовності, що є комплементарними нуклеотидній послідовності за даним винаходом, або які гібридизуються з послідовністю за даним винаходом або комплементарним їй ланцюгом, також охоплюються.

Додатково забезпечуються вектори, клітини-хазяїни, рослини та насіння, які містять нуклеотидні послідовності за даним винаходом, або нуклеотидні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності за даним винаходом, а також їх біологічно-активні варіанти та фрагменти.

Забезпечуються способи одержання поліпептидів за даним винаходом та застосування даних поліпептидів для контролю або знищення комах, що відносяться до лускокрилих, напівтвердокрилих, твердокрилих, нематод або двокрилих.

Також включено способи та набори для виявлення у зразку нуклеїнових кислот та поліпептидів за даним винаходом.

Композиції та способи за даним винаходом є застосовними для одержання організмів з підвищеною стійкістю або витривалістю до шкідника. Ці організми та композиції, що включають організми, є бажаними для сільськогосподарських цілей. Композиції за даним винаходу є також

Зо застосовними для створення змінених або покращених білків, які мають пестицидну активність, або для виявлення присутності пестицидних білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.

Даний винахід відноситься до композицій та способів регулювання стійкості або витривалості до шкідників у організмів, зокрема, у рослин або клітин рослин. Під виразом "стійкість" мається на увазі, що шкідник (наприклад, комаха) гине після поглинання або при іншому контакті з поліпептидами за даним винаходом. Під виразом "витривалість" мається на увазі погіршення або зниження руху, живлення, розмноження або інших функцій шкідника.

Способи включають трансформування організмів за допомогою нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок за даним винаходом. Зокрема, нуклеотидні послідовності за даним винаходом застосовуються для одержання рослин і мікроорганізмів, які мають пестицидну активність. Таким чином, забезпечуються трансформовані бактерії, рослини, клітини рослин, тканини та насіння рослин. Композиції являють собою пестицидні нуклеїнові кислоти та білки від

Васійни5 або інших видів. Послідовності знаходять застосування в конструюванні векторів експресії для наступної трансформації в організми, що представляють інтерес, як зондів для виділення інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для створення змінених пестицидних білків із застосуванням способів, відомих з рівня техніки, таких як переміщення доменів або перестановка в ДНК, наприклад, із використанням представників родин ендотоксинів Стгу!, Стгу2 та Сту9. Білки знаходять застосування у здійсненні контролю або винищенні популяцій шкідників, що відносяться до лускокрилих, напівтвердокрилих, твердокрилих, двокрилих або нематод та для одержання композицій з пестицидною активністю.

Під виразом "пестицидний токсин" або "пестицидний білок" мають на увазі токсин, який має токсичну активність щодо одного або декількох шкідників, включаючи без обмеження представників рядів І ерідорієга, Оірієга, Нетірієга та СоІеорієга або типу Метаїйода, або білок, який характеризується гомологією до такого білка. Пестицидні білки було виділено з організмів, які включають, наприклад, Васійш5 5р., Сіовігідіит брітегптепіап5 та Раеєпірасійн5 роріїнає.

Пестицидні білки містять амінокислотні послідовності, виведені з нуклеотидних послідовностей повної довжини, розкритих у даному документі, та амінокислотні послідовності, які Є ККОротТшШИмМИ за послідовності повної довжини або через застосування альтернативного сайту ініціювання транскрипції, що розташований нижче за ходом транскрипції, або через процесинг, який дає бо більш короткий білок, що має пестицидну активність. Процесинг може мати місце у тому організмі, у якому експресується білок, або у організмі шкідника після поглинання білка.

Таким чином, у даному документі забезпечуються нові виділені або рекомбінантні нуклеотидні послідовності, які надають пестицидної активності. Дані нуклеотидні послідовності кодують поліпептиди з гомологією до відомих дельта-ендотоксинів або бінарних токсинів. Також забезпечуються амінокислотні послідовності пестицидних білків. Білок, синтезований у результаті трансляції даного гена, дозволяє клітинам контролювати або знищувати шкідників, які його поглинають.

Виділені молекули нуклеїнових кислот та їхні варіанти та фрагменти

Один аспект даного винаходу стосується виділених або рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують пестицидні білки та поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також молекул нуклеїнових кислот, які є придатними для застосування як гібридизаційні зонди для визначення молекул нуклеїнових кислот, що кодують білки з ділянками з гомологією послідовності. Також даним документом охоплені нуклеотидні послідовності, здатні до гібридизації з нуклеотидними послідовностями за даним винаходом в жорстких умовах, як визначено у іншому розділі даного документа. Як застосовується у даному документі, вираз "молекула нуклеїнової кислоти" передбачає включення в себе молекул ДНК (наприклад, рекомбінантної ДНК, кКДНК або геномної ДНК) і молекул РНК (наприклад, мРНК), а також аналогів ДНК або РНК, одержаних із застосуванням нуклеотидних аналогів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути однонитковою або двонитковою, але переважно є двонитковою ДНК.

Вираз "ізольована" або "рекомбінантна" послідовність нуклеїнової кислоти (або ДНК) застосовується у даному документі для позначення послідовності нуклеїнової кислоти (або

ДНК), яка вже не перебуває у своєму природному оточенні, наприклад, знаходиться в умовах іп міго або в рекомбінантній бактерії або клітині рослини-хазяїні. У деяких варіантах здійснення виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота не містить послідовностей (переважно послідовностей, які кодують білок), що у природному стані фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовності, які розташовані на 5'- та 3"--кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого отримана нуклеїнова кислота. В контексті даного винаходу при застосуванні виразу "виділений" стосовно молекул нуклеїнової кислоти, він не включає виділені хромосоми.

Наприклад, в різних варіантах здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує дельта-ендотоксин, може містити менше ніж приблизно 5 т.п.о, 4 т.п.о., З т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. або 0,1 т.п.о. з нуклеотидних послідовностей, які у природному стані фланкують молекулу нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої одержана нуклеїнова кислота. В різних варіантах здійснення білок дельта-ендотоксину, який практично не містить клітинний матеріал, включає в себе препарати білка, що мають менше приблизно 30, 20, 10 або 5 95 (за сухою вагою) білка, який не є дельта-ендотоксином (у даному документі також позначений як "забруднюючий білок").

Нуклеотидні послідовності, що кодують білки за даним винаходом, включають в себе послідовність, викладену під 5ЕО ІЮО МО:1-4, та її варіанти, фрагменти і комплементарні ланцюги. Під "кюмплементарною" мають на увазі нуклеотидну послідовність, яка є достатньо комплементарною даній нуклеотидній послідовності, щоб вона могла гібридизуватися із заданою нуклеотидною послідовністю з утворенням стабільного дуплекса. Відповідні амінокислотні послідовності пестицидних білків, які кодуються даними нуклеотидними послідовностями, викладені під 5ЕО ІЮ МО:5-26.

Молекули нуклеїнових кислот, які є фрагментами цих нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидні білки, також охоплюються даним винаходом. Під виразом "фрагмент" мається на увазі частина нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок. Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка, або він може являти собою фрагмент, який може бути застосований як гібридизаційний зонд або

ПЛР-праймер із застосуванням способів, розкритих нижче. Залежно від передбаченого застосування молекули нуклеїнових кислот, які є фрагментами нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, складаються із щонайменше приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 суміжних нуклеотидів або аж до числа нуклеотидів, присутніх в нуклеотидній послідовності повної довжини, що кодує пестицидний білок, розкритий у даному документі. Під виразом "суміжні" нуклеотиди мають на увазі нуклеотидні залишки, які безпосередньо прилягають один до одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей за даним винаходом будуть кодувати фрагменти білка, які зберігають біологічну активність пестицидного білка і, отже, зберігають пестицидну активність. Таким чином, також охоплюються біологічно активні фрагменти поліпептидів, розкритих у даному документі. Під бо виразом "зберігає активність" мається на увазі, що фрагмент буде характеризуватися щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 70, 80, 90, 95595 або більшою пестицидною активністю пестицидного білка. У одному варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність, спрямовану на знищення твердокрилих комах. У іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність, спрямовану на знищення лускокрилих комах. У іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність, спрямовану на знищення нематод. У іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність, спрямовану на знищення двокрилих комах. У іншому варіанті здійснення пестицидна активність являє собою активність, спрямовану на знищення напівтвердокрилих комах. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Саріа апа І апуд (1990) 9). Есоп.

Етотої. 83:2480-2485; Апагему5 єї а!. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Ма!топе еї аї. (1985) 9. ої

Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, який кодує біологічно активну частину білка за даним винаходом, буде кодувати щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 суміжних амінокислот або аж до загальної кількості амінокислот, присутніх у пестицидному білку повної довжини за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення фрагмент являє собою фрагмент, одержаний внаслідок протеолітичного розщеплення.

Наприклад, фрагмент, що утворюється у результаті протеолітичного розщеплення, може мати

М-кінцеве або С-кінцеве відсікання довжиною щонайменше приблизно 30 амінокислот, щонайменше приблизно 40 амінокислот, щонайменше приблизно 50 амінокислот, щонайменше приблизно 100 амінокислот, приблизно 120, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, приблизно 160, приблизно 170, приблизно 180, приблизно 190, приблизно 200, приблизно 210, приблизно 220, приблизно 230, приблизно 240, приблизно 250, приблизно 275, приблизно 300, приблизно 350, приблизно 400, приблизно 450, приблизно 500 або приблизно 550 амінокислот відносно 5ЕО ІЮО МО :2, 3, 4, 5, 6 або 7. У деяких варіантах здійснення фрагменти, які включено у даний документ, утворені у результаті видалення С-кінцевого домену кристалізації, наприклад, за допомогою протеолізу або за допомогою вставки стоп-кодону у кодувальну послідовність. У

Зо деяких варіантах здійснення фрагменти, які охоплені даним документом, утворені у результаті видалення М-кінцевого сигнального пептиду. М-кінцеві відсікання можуть додатково передбачати залишок метіоніну на М-кінці.

Переважні пестицидні білки за даним винаходом кодуються нуклеотидною послідовністю, яка є достатньо ідентичною нуклеотидній послідовності під 5ЕО ІЮ МО: 1-4, або пестицидні білки є достатньо ідентичними амінокислотній послідовності, викладеній під 5ХЕО ІЮ МО: 5-26.

Під виразом "достатньо ідентичний" мається на увазі амінокислотна або нуклеотидна послідовність, яка характеризується щонайменше приблизно 60 або 6595 ідентичністю послідовності, приблизно 70 або 7595 ідентичністю послідовності, приблизно 80 або 8595 ідентичністю послідовності, приблизно 90, 91 95, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 95 або більшою ідентичністю послідовності порівняно з еталонною послідовністю із застосуванням однієї з програм вирівнювання, описаних у даному документі, із застосуванням стандартних параметрів.

Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ці значення можна відповідним чином регулювати для визначення відповідної ідентичності білків, закодованих двома нуклеотидними послідовностями, з урахуванням виродженості кодонів, амінокислотної подібності, розташування рамки зчитування тощо.

Для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох послідовностей нуклеснових кислот 3 метою оптимального порівняння послідовності вирівнюють. Відсоток ідентичності між двома послідовностями являє собою функцію кількості ідентичних положень, що є загальними для послідовностей (тобто відсоток ідентичності - кількість ідентичних положень/загальна кількість положень (наприклад, положення, що перекриваються) х 100). У одному варіанті здійснення дві послідовності мають однакову довжину. У іншому варіанті здійснення відсоток ідентичності розраховують в межах усієї еталонної послідовності (тобто послідовності, розкритої у даному документі, як будь-яка з ЗЕО

ІЮ МО:1-26). Відсоток ідентичності між двома послідовностями можна визначати із застосуванням методик, подібних до описаних нижче, з введенням гепів або без нього.

Зазвичай, під час розрахунку відсотка ідентичності враховуються точні збіги. Геп, тобто положення у вирівнюванні, де залишок присутній в одній послідовності, але відсутній в іншій, вважають положенням з неідентичними залишками.

Визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями може бути досягнуто із 60 застосуванням математичного алгоритму. Необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що використовується для порівняння двох послідовностей, є алгоритм згідно Кагіїп апа Аїївспи! (1990) Ргос. Маї!. Асай. Зсі. ОБА 87: 2 264, модифікований як у Капіп апа Ак5спиі (1993) Ргос Маї!. Асад. сі. ОБА 90:5873-5877. Такий алгоритм включений в програми ВІ АЗТМ та ВГА5ТХ з Аї5спиі еї аї. (1990) 9. Мої. ВіоІ. 215:403. Нуклеотидні пошуки ВІ А5Т можуть бути виконані за допомогою програми ВІ АТМ, бал - 100, довжина слова - 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, що є гомологічними до пестицидоподібних молекул нуклеїнових кислот за даним винаходом. Білкові пошуки ВГАБТ можуть бути виконані за допомогою програми ВГ А5ТУ, бал - 50, довжина слова - 3, з одержанням амінокислотних послідовностей, що є гомологічними до молекул пестицидного білка за даним винаходом. Для одержання вирівнювань з гепами з метою порівняння може використовуватись програма Сарреа ВГ А5Т (в

ВІ АБ5Т 2.0), як описано в АЇїї5епиЇї еї аї. (1997) Мисівїс Асід5 Ке5. 25:3389. Альтернативно, для виконання ітераційного пошуку, який виявляє віддалені взаємозв'язки між молекулами, може бути застосований РБІ-Віаві. Див. Ай5епиі єї аїЇ. (1997), вище. При використанні програм ВІ АЗ5Т,

Сарреа ВІГАБТ та РБІ-ВЕГАБТ можуть бути застосовані параметри відповідних програм (наприклад, ВГАБТХ та ВІ А5ТМ) за замовчуванням. Вирівнювання також можна виконувати вручну шляхом огляду.

Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що застосовується для порівняння послідовностей, є алгоритм Сіиеїаіму (Ніддіпз еї аї. (1994) Мисієїс Асіа5 Кев5. 22:4673- 4680). СіиеїаМму порівнює послідовності, а також вирівнює всю амінокислотну послідовність або послідовність ДНК і, таким чином, може надавати дані про консервативність послідовності усієї амінокислотної послідовності. Алгоритм СіІиеїаюмуУ застосовується в декількох комерційно доступних пакетах програмного забезпечення аналізу ДНК/амінокислот, таких як АГІСМХ, що є модулем комплекту програм Месіог МТІ (Іпмігодеп Согрогайоп, Карлобад, Каліфорнія). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою СішеїаімМу можна оцінювати відсоток ідентичності амінокислотних послідовностей. Необмежувальним прикладом програмного забезпечення, застосовного для аналізу вирівнювання Сіибіаму, є СЕМЕВОС М, ЗЕМЕрОС тм (Кагі Міспоїах) створює можливість оцінки подібності амінокислотної послідовності (або ДНК) та ідентичності між декількома білками. Іншим необмежувальним прикладом математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, є алгоритм згідно з Муег5 апа

Зо МіПег (1988) САВІОБ5 4:11-17. Такий алгоритм включений в програму АГІСМ (версія 2.0), яка є частиною пакету програмного забезпечення Со Умізсопбіп Сепеїіс5, версія 10 (доступна від

Ассеїгу5, Іпс., 9685 5сгапіоп Ка., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). При використанні програми

АЦІОМ для порівняння амінокислотних послідовностей можна застосовувати таблицю ваги заміни залишку РАМ 120, штраф за подовження гепу 12 та штраф за введення гепу 4.

Якщо не вказане інше, САР версії 10, яка застосовує алгоритм згідно з Мееаієтап апа

МУипвей (1970) 9. Мої. Віої. 48 (3): 443-453, буде застосовуватись для визначення ідентичності або подібності послідовності із застосуванням наступних параметрів: 95 ідентичності та бо подібності для нуклеотидної послідовності із застосуванням штрафу за введення гепу 50 і штрафу за подовження гепу 3, а також матриці замін пууздарапа.стр; 95 ідентичності або 95 подібності амінокислотної послідовності із застосуванням штрафу за введення гепу 8 і штрафу за подовження гепу 2, а також матриці замін ВГОБИОМб2. Також можуть бути застосовані еквівалентні програми. Під виразом "еквівалентна програма" мається на увазі будь-яка програма порівняння послідовності, яка для будь-яких двох послідовностей, які розглядаються, створює вирівнювання, що характеризується ідентичними збігами нуклеотидних залишків та ідентичним відсотком ідентичності послідовності порівняно з відповідним вирівнюванням, виконаним за допомогою САР версії 10.

Даний винахід також охоплює варіанти молекул нуклеїнових кислот. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидний білок, включають ті послідовності, що кодують пестицидні білки, розкриті у даному документі, але які відрізняються за консервативними замінами внаслідок виродженості генетичного коду, а також ті, які є достатньо ідентичними, як обговорюється вище. Алельні варіанти, що зустрічаються у природі, можна визначати із застосуванням добре відомих методик молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та методики гібридизації, як вказано нижче. Варіанти нуклеотидних послідовностей також включають одержані синтетичним шляхом нуклеотидні послідовності, які були створені, наприклад, із застосуванням сайт-спрямованого мутагенезу, але які все ще кодують пестицидні білки, розкриті в даному винаході, як обговорюється нижче. Варіанти білків, охоплених даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують характеризуватися потрібною біологічною активністю нативного білка, тобто пестицидною активністю. Під виразом "зберігає активність" мається на увазі, що варіант буде бо характеризуватися щонайменше приблизно 30 95, щонайменше приблизно 50 95, щонайменше приблизно 7095, щонайменше приблизно 8095 пестицидною активністю нативного білка.

Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Сларіа апа Гапуд (1990) У. Есоп. Епіотої. 83: 2480-2485; Апагемув еї аї. (1988)

Віоспет. 9. 252:199-206; Матопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоїіоду 78:290-293; та патент

США Мо 5743477, усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Крім того, фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що зміни можна вводити шляхом здійснення мутацій у нуклеотидних послідовностях за даним винаходом, які, таким чином, призводять до змін у амінокислотній послідовності закодованих пестицидних білків без зміни біологічної активності білків. Таким чином, варіанти виділених молекул нуклеїнових кислот можна створювати шляхом введення однієї або декількох нуклеотидних замін, додавань або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, що розкрита у даному документі, таким чином, що одна або декілька амінокислотних замін, додавань або делецій вводяться у закодований білок. Мутації можна вводити за допомогою стандартних методик, таких як сайт-спрямований мутагенез та мутагенез, опосередкований ПЛР. Такі варіанти нуклеотидних послідовностей також охоплені даним винаходом.

Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можна здійснювати за одним або декількома передбаченими несуттєвими амінокислотними залишками. Вираз "несуттєвий" амінокислотний залишок позначає залишок, який може бути змінений у послідовності пестицидного білка дикого типу без зміни біологічної активності, тоді як "суттєвий" амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності. Вираз "консервативна амінокислотна заміна" являє собою заміну, за якої амінокислотний залишок заміняється на амінокислотний залишок, який має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, які мають подібні бічні ланцюги, були визначені в даній галузі техніки. Ці родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета- розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними

Зо бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин).

Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять консервативних доменів послідовностей та три консервативні структурні домени (див., наприклад, Че Маада еї аїЇ. (2001) Тгепа5 Сепеїйіс5 17:193-199). Перший консервативний структурний домен складається із семи альфа-спіралей та бере участь у проникненні через мембрану та пороутворенні. Домен ЇЇ складається з трьох складчастих бета-шарів, які упорядковані в структурі грецького ключа, а домен ІІ складається з двох антипаралельних складчастих бета-шарів у структурі типу "еПу-тої!" (де Маада еї а!., 2001, вище). Домени Ії та Ш беруть участь у розпізнаванні та зв'язуванні рецепторів, а тому вважаються детермінантами специфічності токсину.

Амінокислотні заміни можна здійснювати у неконсервативних ділянках зі збереженням функції. Як правило, такі заміни не будуть здійснювати у консервативних амінокислотних залишках або амінокислотних залишках, розташованих у межах консервативного мотиву, де такі залишки є суттєвими для активності білка. Приклади залишків, які є консервативними та можуть бути суттєвими для активності білка, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними в усіх білків, що містяться у вирівнюванні подібних або споріднених токсинів з послідовностями за даним винаходом (наприклад, залишки, які є ідентичними у вирівнюванні гомологічних білків).

Приклади залишків, які є консервативними, але які можуть дозволяти консервативні амінокислотні заміни та все ще зберігати активність, включають, наприклад, залишки, які характеризуються лише консервативними замінами в усіх білках, що містяться у вирівнюванні подібних або споріднених токсинів з послідовностями за даним винаходом (наприклад, залишки, які характеризуються лише консервативними замінами в усіх білках, що включені у вирівнювання гомологічних білків). Однак, фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні зміни у консервативних залишках.

Альтернативно, варіанти нуклеотидних послідовностей можна одержати шляхом введення мутацій випадковим чином уздовж всієї або частини кодувальної послідовності, наприклад, шляхом насичувального мутагенезу, та одержаних мутантів можна піддавати скринінгу щодо здатності надавати пестицидну активність для визначення мутантів, які зберігають активність.

Після мутагенезу, закодований білок може експресуватися рекомбінантним шляхом та активність цього білка можна визначати із застосуванням стандартних методик аналізу. 60 Із застосуванням способів, таких як ПЛР, гібридизація тощо, можна визначити відповідні послідовності, що визначають пестицидну активність, при цьому такі послідовності характеризуються суттєвою ідентичністю послідовностям за даним винаходом. Див., наприклад, затргооК апа Виззеїї (2001) МоїІесшаг Сіопіпд: А ІГарогаїгу Мапиа)ї. (Соїй Зрііпд Нагброг

Іарогаїогу Ргезв, Соїй 5ргіпд Нагбог, МУ) апа Іппі5, еї аІ. (1990) РСВА Ргоїосоїв: А Спіде о

Мештйодвз апа Арріісайопзв (Асадетіс Ргевв5, МУ).

У способі гібридизації всю нуклеотидну послідовность, що визначає пестицидну активність, або її частину можна застосовувати для скринінгу кКДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання таких кКДНК та геномних бібліотек, як правило, відомі в даній галузі техніки та розкриті у Затьгоок апа Кизз5еїЇ, 2001, вище. Так звані гібридизаційні зонди можуть являти собою фрагменти геномної ДНК, фрагменти кКДНК, фрагменти РНК або інші олігонуклеотиди, та їх можна мітити детектовною групою, такою як З2Р, або будь-яким іншим детектовним маркером, таким як інші радіоїзотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можна одержувати шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів, основаних на відомій нуклеотидній послідовності, що кодує пестицидний білок, розкритій у даному документі. Додатково можна застосовувати вироджені праймери, що розроблені на основі консервативних нуклеотидів або амінокислотних залишків у нуклеотидній послідовності або закодованій амінокислотній послідовності. Зазвичай, зонд містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується за жорстких умов з щонайменше приблизно 12, щонайменше приблизно 25, щонайменше приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 послідовними нуклеотидами нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок за даним винаходом або його фрагмент або варіант. Способи одержання зондів для гібридизації загалом відомі з рівня техніки та розкриті в зхатогоок апа Киззеїї, 2001, вище у даному документі, включеному за допомогою посилання.

Наприклад, усю послідовність, що визначає пестицидну активність, розкриту у даному документі, або одну або декілька її частин, можна застосовувати як зонд, здатний до специфічної гібридизації з відповідними послідовностями, подібними до пестицидного білка, та з матричними РНК. Для досягнення специфічної гібридизації за різних умов такі зонди включають в себе послідовності, які є унікальними і становлять переважно щонайменше приблизно 10 нуклеотидів у довжину або щонайменше приблизно 20 нуклеотидів у довжину. Такі зонди можна застосовувати для ампліфікації відповідних послідовностей, що визначають пестицидну активність, з вибраного організму за допомогою ПЛР. Цю методику можна застосовувати для виділення додаткових кодуючих послідовностей з потрібного організму або як діагностичний аналіз для визначення наявності кодуючих послідовностей в організмі. Методики гібридизації включають в себе гібридизаційний скринінг висіяних ДНК-бібліотек (або бляшок, або колоній; див., наприклад, ЗатбгоокК еї аІ. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А І абогаїгу Мапиаї! (24 єд., Соїа

Зргіпд Натог І арогайогу Ргев5, Соїд Зргіпд Нагрог, Мем/ МогК).

Таким чином, даний винахід охоплює зонди для гібридизації, а також нуклеотидні послідовності, здатні до гібридизації з усією нуклеотидною послідовністю за даним винаходом або її частиною (наприклад, із щонайменше приблизно 300, щонайменше приблизно 400, щонайменше приблизно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 нуклеотидами або аж до нуклеотидної послідовності повної довжини, розкритої у даному документі). Гібридизацію таких послідовностей можна здійснювати за жорстких умов. Під виразом "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" маються на увазі умови, за яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю з помітно більш високим ступенем, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше у 2 рази більше за фон). Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися за різних обставин. Шляхом контролю жорсткості умов гібридизації та/або відмивання, можна виявляти цільові послідовності, які на 100 95 комплементарні до зонда (гомологічне зондування). Альтернативно, умови жорсткості можна регулювати для створення можливості утворення деяких неспідпадінь у послідовності, щоб виявляти більш низькі ступені подібності (гетерологічне зондування). Як правило, довжина зонда становить менше ніж приблизно 1000 нуклеотидів, переважно менше ніж 500 нуклеотидів.

Зазвичай, жорсткі умови будуть такими, за яких концентрація солі становить менше приблизно 1,5 М іонів Ма, зазвичай приблизно 0,01-1,0 М концентрацію іонів Ма (або інших солей) з рН від 7,0 до 8,3 та температурою щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 "С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть бути також досягнуті за допомогою додавання дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію у буферному розчині, що містить 30-35 95 формаміду, 1 М Масі, 1 95

ЗО5 (додецилсульфат натрію) при 37 "С, та відмивання в 1Х-2Х 55С (20Х 550-3,0 М Ммасі/0,3 бо М тринатрійцитрат) при 50-557С. Ілюстративні умови помірної жорсткості включають гіоридизацію у розчині, що містить 40-45 95 формаміду, 1,0 М Масі, 195 505 при 37 "С, та відмивання в 0,5Х-1Х 55С при 55-60 "С. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію у розчині, що містить 5095 формаміду, 1 М Масі, 195 5О5 при 37 "С, та відмивання у 0,1Х 55С при 60-65 "С. Необов'язково буфери для відмивання можуть містити від приблизно 0,1 95 до приблизно 1 95 505. Тривалість гібридизації, як правило, становить менше ніж приблизно 24 години, як правило, від приблизно 4 до приблизно 12 годин.

Специфічність, зазвичай, залежить від відмивання після гібридизації, при цьому критичними факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання. Для гібридів ДНК-

ДНК Тт можна приблизно вирахувати за допомогою рівняння згідно з МеїпКоїй та УмМайі (1984)

Апаї. Віоспет. 138:267-284: Тл-81,5 С ж 16,6 (09 М) я 0,41 (95 С) - 0,61 (95 топт) - 500 (І); де

М являє собою молярність одновалентних катіонів, 96 (С являє собою відсоткову частку нуклеотидів гуанозину та цитозину в ДНК, 95 Тогт являє собою відсоток вмісту формаміду в розчині для гібридизації, та Її являє собою довжину гібрида у парах основ. Тя являє собою температуру (за певної іонної сили та рН), при якій 5095 комплементарної цільової послідовності гібридизується з відмінно співпадаючим зондом. Кожне зниження Тт на приблизно 1"С веде до 195 незбігу; таким чином, Тт, умови гібридизації та/або відмивання можна регулювати для гібридизації з послідовностями з потрібною ідентичністю. Наприклад, якщо шукають послідовності з »90 95 ідентичністю, Тт може бути знижена на 10 С. Як правило, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб вони були приблизно на 5 "С нижчими за точку плавлення (Тт) для конкретної послідовності та комплементарної до неї послідовності за певної іонної сили та рН. Однак гібридизацію та/або відмивання у надзвичайно жорстких умовах можна застосовувати при температурі, що на 1, 2, З або 4 "С нижча за температуру точки плавлення (Тт); гібридизацію та/або відмивання у помірно жорстких умовах можна застосовувати при температурі, що на б, 7, 8, 9 або 10"С нижча за температуру точки плавлення (Тт); гіоридизацію та/або відмивання в умовах низької жорсткості можна застосовувати при температурі, що на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 "С нижча за температуру точки плавлення (Тт). Із застосуванням рівняння, композицій для гібридизації та відмивання та потрібної Тт фахівцям у даній області буде зрозуміло, що варіації в умовах жорсткості гібридизації та/або відмивання описані за своєю суттю. Якщо потрібний ступінь незбігу призводить до Тт, меншої за 45 С

Зо (водний розчин) або 32 "С (розчин формаміду), переважним є збільшення концентрації 55С, аби можна було застосовувати більш високі температури. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведений у Тіз55еп (1993) Іарогаїогу Тесппідце5 іп Віоспетівзігу апа

Моїіесшіаг Віоіоду-Нубгіаігайоп м/йй Мисівїс Асіа Ргобез, Рап І, СНарієг 2 (ЕіІземієї, Мем/ МогкК); та

Айзирбеї еї аї., ед5. (1995) Ситепі Ргоїосої5 іп Моїесшіаг Віоіоду, Спарієг 2 (Сгеепе Рибіїзпіпа апа

УМПеу-Іпіегзсіепсе, Мем Хогк). Див. затьгоок еї аї. (1989) МоїІесшіаг Сіопіпу: А І арогаїгу Мапиаї! (24 єд., Со брііпа Нагбог І арогаюгу Ргезв, Соїй бргіпд Натфог, Мем/ мог).

Виділені білки та їх варіанти й фрагменти

Пестицидні білки також охоплені в межах даного винаходу. Під виразом "пестицидний білок" мають на увазі білок, що має амінокислотну послідовність, викладену під ЗЕО ІЮ МО:5-26.

Також передбачені фрагменти, біологічно активні частини та їх варіанти, які можуть застосовуватися при здійсненні способів за даним винаходом на практиці. Вираз "виділений білок" або "рекомбінантний білок" застосовується для позначення білка, який більше не перебуває у своєму природному оточенні, наприклад, знаходиться в умовах іп мйго або в рекомбінантній бактеріальній або клітині рослини-хазяїні.

Вираз "фрагменти" або "біологічно активні частини" включає в себе фрагменти поліпептиду, що містять амінокислотні послідовності, які є достатньо ідентичними амінокислотній послідовності, викладеній під 5ЕО 10 МО: 5-26, та які проявляють пестицидну активність.

Біологічно активна частина пестицидного білка може являти собою поліпептид, довжина якого становить, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот.

Такі біологічно активні частини можна одержувати за допомогою методик рекомбінації та оцінювати щодо пестицидної активності. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, С7аріа апа Гапу (1990) 3. Есоп. Епіотої. 83:2480- 2485; Апагемує еї аІ. (1988) Віоспет. У. 252:199-206; Магтопе еї аїЇ. (1985) 9. ої Есопотіс

Етотоїіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті. Як застосовується у даному документі, фрагмент містить щонайменше 8 суміжних амінокислот з БЕО ІЮ МО:5-26. Проте винахід охоплює інші фрагменти, такі як будь-який фрагмент у білку, довжина якого становить більше приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 60 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 або більше амінокислот.

Під виразом "варіанти" мають на увазі білки або поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше на приблизно 60, 65 95, приблизно 70 95, 75 95, приблизно 80, 8595, приблизно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентична амінокислотній послідовності під ЗЕБЕО ІЮ МО:5-26. Варіанти також включають поліпептиди, закодовані молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти під 5ЕО ІЮ

МО: 1-4 або комплементарною до неї послідовністю за жорстких умов. Варіанти включають поліпептиди, які відрізняються за амінокислотною послідовністю внаслідок мутагенезу. Варіанти білків, охоплених даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують характеризуватися потрібною біологічною активністю нативного білка, тобто зберігають пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення варіанти мають поліпшену активність відносно нативного білка. Способи вимірювання пестицидної активності добре відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Сгаріа апа І апу (1990) У. Есоп. Епютої. 83:2480-2485; Апагемув еї аї. (1988) Віоспет. 9. 252:199-206; Ма!гтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоїіоду 78:290-293; та патент США Мо 5743477, усі з яких включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.

Бактеріальні гени, такі як гени ахті за даним винаходом, доволі часто мають декілька метіонінових кодонів ініціації в безпосередній близькості від старт-кодону відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції з одного або декількох цих старт-кодонів веде до утворення функціонального білка. Ці старт-кодони можуть включати АТО-кодони. Однак бактерії, такі як Васійи5 5р., також розпізнають кодон СТО як старт-кодон, а білки, трансляція яких ініціюється з (зТО-кодонів, містять метіонін на місці першої амінокислоти. У рідкісних випадках, трансляція в бактеріальних системах може ініціюватися з ТТО-кодону, хоча в цьому випадку ТТО кодує метіонін. Крім того, не часто визначається заздалегідь, який з цих кодонів застосовується природним чином у бактерії. Таким чином, слід розуміти, що застосування одного з альтернативних кодонів метіоніну може також призвести до одержання пестицидних білків. Ці пестицидні білки охоплені даним винаходом, і їх можна застосовувати в способах за даним винаходом. Буде зрозуміло, що при експресії в рослинах необхідно змінювати альтернативний старт-кодон на АТО для правильної трансляції.

У різних варіантах здійснення даного винаходу пестицидні білки включають в себе амінокислотні послідовності, виведені з нуклеотидних послідовностей повної довжини, розкритих у даному документі, та амінокислотні послідовності, які є коротшими за послідовності повної довжини внаслідок використання альтернативного сайту ініціації транскрипції, що розташований нижче за ходом транскрипції. Таким чином, нуклеотидна послідовність за даним винаходом та/або вектори, клітини-хазяїни та рослини, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом (і способи одержання та застосування нуклеотидної послідовності за даним винаходом), можуть містити нуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО:6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25 і 26.

Також охоплюються антитіла до поліпептидів за даним винаходом або до їх варіантів або фрагментів. Способи одержання антитіл добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, Нагіом/ апа Гапе (1988) Апііродієв: А І арогаїогу Мапиаї, Соїд Зргіпа Нагбог І арогаїюгу, Соїд Зрііпа

Нагбог, МУ; патент США Мо 4196265).

Таким чином, один аспект даного винаходу стосується антитіл, молекул, що зв'язують одноланцюговий антиген, або інших білків, які специфічно зв'язуються з однією або декількома білковими або пептидними молекулами за даним винаходом та їх гомологами, молекулами злиття або фрагментами. В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, який має амінокислотну послідовність, викладену під ЗЕ ІЮ МО:5-26, або з його фрагментом. У іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується із білком злиття, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотної послідовності, викладеної під 5ЕО ІЮ МО:5-26, або його фрагментом.

Антитіла за даним винаходом можна застосовувати для кількісного або якісного виявлення білкових або пептидних молекул за даним винаходом або для виявлення посттрансляційних модифікацій білків. Як застосовується у даному документі, кажуть, що антитіло або пептид "специфічно зв'язуються" з білковою або пептидною молекулою за даним винаходом, якщо таке зв'язування конкурентно не інгібується внаслідок наявності неспоріднених молекул.

Антитіла за даним винаходом можуть входити до складу набору, застосовного для детектування білкових або пептидних молекул за даним винаходом. Даний винахід додатково охоплює спосіб детектування білкової або пептидної молекули за даним винаходом (зокрема білка, який кодується амінокислотною послідовністю, викладеною в ЗЕО ІЮ МО:5-26, у тому числі його варіантів або фрагментів, що здатні специфічно зв'язуватися з антитілом за даним 60 винаходом), який передбачає приведення зразка у контакт з антитілом за даним винаходом і детектування того, чи містить зразок білкову або пептидну молекулу за даним винаходом.

Способи застосування антитіл для детектування білка або пептида, які становлять інтерес, відомі з рівня техніки.

Змінені або покращені варіанти

Необхідно відзначити, що послідовності ДНК пестицидного білка можуть бути змінені з використанням різних способів, а також, що ці зміни можуть призвести до утворення послідовностей ДНК, які кодують білки з амінокислотними послідовностями, що відрізняються від тих, які кодують пестицидні білюи за даним винаходом. Даний білок може бути змінений різними способами, у тому числі за допомогою амінокислотних замін, делецій, відсікань та вставок однієї або декількох амінокислотних послідовностей під 5ЕО ІЮ МО:5-26, включаючи до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 або більшої кількості амінокислотних замін, делецій або вставок. Способи проведення таких маніпуляцій загалом відомі з рівня техніки. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності пестицидного білка можуть бути одержані шляхом здійснення мутацій в ДНК. Це може також бути досягнуто із застосуванням одного з декількох різновидів мутагенезу та/або шляхом спрямованої еволюції. У деяких аспектах зміни, що кодуються амінокислотними послідовностями, не будуть суттєво впливати на функцію білка. Такі варіанти будують мати необхідну пестицидну активність. Проте зрозуміло, що здатність пестицидного білка забезпечувати пестицидну активність може бути покращена шляхом застосування таких методик щодо композицій за даним винаходом. Наприклад, можна експресувати пестицидний білок у клітинах-хазяїнах, які проявляють високі рівні помилкового включення основ при реплікації ДНК, таких як ХІ-1 Кеа (5ігаїадепе, Ла-Холла, Каліфорнія). Після розмноження в таких штамах можна виділити ДНК (наприклад, шляхом одержання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікування за допомогою ПЛР та клонування отриманого у результаті ПЛР-фрагмента у

Зо вектор), провести культивування пестицидного білка з мутаціями у немутагенному штамі та ідентифікувати мутантні гени з пестицидною активністю, наприклад, шляхом проведення аналізу для дослідження пестицидної активності. Як правило, білок змішують і застосовують в аналізах із годуванням. Див., наприклад Магїтопе еї аї. (1985) 9. ої Есопотіс ЕпіотоЇоду 78:290- 293. Такі аналізи можуть включати приведення рослини у контакт з одним або декількома шкідниками та визначення здатності рослини до виживання та/або здатності викликати загибель шкідників. Приклади мутацій, які призводять до підвищення токсичності, розглянуто в Зсппері єї а!. (1998) Містобіо!. Мої. Вісі. Нем. 62:775-806.

Як альтернатива, зміни можна вносити у послідовності багатьох білків на аміно- або карбокси-кінцях, не справляючи при цьому істотного впливу на активність. Вони можуть включати вставки, делеції або зміни, введені із застосуванням сучасних способів молекулярної біології таких як ПЛР, у тому числі ПЛР-ампліфікація, які змінюють або подовжують послідовність, що кодує білок, за рахунок вставок послідовностей, що кодують амінокислоти, в олігонуклеотиди, використовувані в ПЛР-ампліфікації. Як альтернатива, додані послідовності білків можуть включати цілі послідовності, що кодують білок, такі як ті, що зазвичай застосовуються у даній галузі техніки для одержання злиття білків. Такі білки злиття часто використовують для (1) підвищення експресії білка, що представляє інтерес, (2) введення домену зв'язування, ферментативної активності або епітопу для полегшення або очищення білка, детектування білка, або для інших експериментальних застосувань, відомих у даній галузі техніки, (3) спрямовування секреції або трансляції білка в субклітинну органелу, таку як периплазматичний простір грамнегативних бактерій або ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, при цьому останнє часто призводить до глікозилювання білка.

Варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей за даним винаходом також охоплюють послідовності, одержані із застосуванням процедур мутагенезу та рекомбінації, таких як перестановка в ДНК. При виконанні такої процедури можуть використовуватися одна або декілька різних ділянок, що кодують пестицидні білки, для створення нового пестицидного білка, що має необхідні властивості. Таким чином, бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів створюють з популяції полінуклеотидів зі спорідненими послідовностями, які містять ділянки послідовності, які характеризуються суттєвою ідентичністю та можуть гомологічно рекомбінуватися іп мійго або іп мімо. Наприклад, при застосуванні даного підходу мотиви 60 послідовностей, що кодують домен, який становить інтерес, можуть бути піддані перестановці між пестицидним геном за даним винаходом та іншими відомими пестицидними генами для одержання нового гена, який кодує білок, що представляє інтерес, з покращеною властивістю, як, наприклад, з підвищеною інсектицидною активністю. Стратегії такої перестановки в ДНК відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Зіеттег (1994) Ргос. Май. Асад. сі. О5А 91:10747-10751; Теттег (1994) Маїшге 370:389-391; Статеті єї а!. (1997) Майшге Віоїесн. 15:436- 438; Мооге еї аї. (1997) 9. Мої. Віоі. 272:336-347; 7Напд еї аї. (1997) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 94:4504-4509; Статеті єї а. (1998) Майте 391:288-291; та патенти США МоМо 5605793 і 5837458.

Переміщення або перестановка доменів є ще одним механізмом створення змінених пестицидних білків. Домени можна переміщати між пестицидними білками, що призводить до утворення гібридних або химерних токсинів з покращеними пестицидною активністю або спектром мішеней. Способи створення рекомбінантних білків та їх дослідження щодо пестицидної активності добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, Маїтом еї аї!. (2001) Аррі.

Епмігоп. Містобріо!. 67:5328-5330; де Маада еї а. (1996) Аррі. Епмігоп. Місторіо!. 62:1537-1543; Се еї а). (1991) 9. Віої. Спет. 266:17954-17958; 5сппері еї аї!. (1990) 9. Віої. Снет. 265:20923-20930;

Вапо єї а). 91999) Аррі. Епмігоп. Містобіо!. 65:2918-2925).

Вектори

Послідовність, що визначає пестицидну активність, за даним винаходом може бути передбачена в касеті експресії для експресії у рослині, що представляє інтерес. Під "рослинною касетою експресії" мають на увазі ДНК-конструкцію, яка здатна призводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування у клітині рослини. Зазвичай ці конструкції містять промотор та кодувальну послідовність. Часто такі конструкції також будуть містити 3'-нетрансльовану ділянку. Такі конструкції можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (або інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або комплекс Гольджі.

Під "сигнальною послідовністю" мають на увазі послідовність, для якої відомо або передбачається, що вона призводить до котрансляційного або посттрансляційного транспорту пептидів через клітинну мембрану. У еукаріотів це зазвичай передбачає секрецію у апарат

Гольджі з одержанням деякого ступеня глікозилювання. Інсектицидні токсини бактерій часто

Зо синтезуються як протоксини, які протеолітично активуються у кишці цільового шкідника (Спапд (1987) МеїШшоай5 Епгутої. 153:507-516). У деяких варіантах здійснення за даним винаходом сигнальна послідовність локалізована у нативній послідовності, або її можна одержати із послідовності за даним винаходом. Під "лідерною послідовністю" мають на увазі будь-яку послідовність, яка під час трансляції призводить до утворення амінокислотної послідовності, достатньої для запуску котрансляційного транспорту пептидного ланцюга до субклітинної органели. Таким чином, лідерні послідовності містять у своєму складі лідерні послідовності, що спрямовують транспорт та/або глікозилювання за рахунок надходження в ендоплазматичний ретикулум, надходження у вакуолі, пластиди, у тому числі хлоропласти, мітохондрії тощо.

Під "вектором трансформації рослини" мають на увазі молекулу ДНК, яка необхідна для ефективної трансформації клітини рослини. Така молекула може містити одну або декілька рослинних касет експресії та може бути організованою у більше ніж одну "векторну" молекулу

ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою вектори трансформації рослин, в яких використовують два несуміжних ДНК-вектори для кодування усіх необхідних функцій, що діють у цис- та транс-положеннях, для трансформації клітин рослин (НеПеп5 апа Миїїїпеаих (2000)

Тгепаз іп Ріапі Зсіепсе 5:446-451). Термін "вектор" стосується конструкції нуклеїнової кислоти, розробленої для перенесення між різними клітинами-хазяїнами. Термін "вектор експресії" стосується вектора, який має здатність вбудовувати, інтегрувати та експресувати гетерологічні послідовності або фрагменти ДНК у чужорідній клітині. Касета буде мати у своєму складі 5'- та/або 3'-регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з послідовністю за даним винаходом. Під "функціонально зв'язаним" мають на увазі функціональний зв'язок між послідовністю промотору та другою послідовністю, де послідовність промотору ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає другій послідовності. Як правило, "функціонально зв'язаний" означає, що зв'язані послідовності нуклеїнових кислот є суміжними, і, якщо необхідно об'єднати дві ділянки, що кодують білок, вони є суміжними та перебувають в одній і тій самій рамці зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген, що підлягає котрансформації у організм. Як альтернатива, додатковий ген (додаткові гени) забезпечують за допомогою декількох касет експресії.

У різних варіантах здійснення нуклеотидна послідовність за даним винаходом є функціонально зв'язаною з промотором, наприклад, рослинним промотором. "Промотором" бо називається послідовність нуклеїнової кислоти, функція якої полягає у керуванні транскрипцією кодувальної послідовності, розташованої нижче за ходом транскрипції. Промотор разом з іншими транскрипційними та трансляційними регуляторними послідовностями нуклеїнових кислот (які також називаються "контрольними послідовностями") є необхідними для експресії послідовності ДНК, що становить інтерес.

Таку касету експресії забезпечують численними ділянками рестрикції для вставки послідовності, що визначає пестицидну активність, яка має перебувати під транскрипційним контролем регуляторних ділянок.

Касета експресії буде мати у своєму складі, у 5'-3--напрямку транскрипції, ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто промотор), послідовність ДНК за даним винаходом і ділянку термінації трансляції і транскрипції (тобто ділянку терминації), що функціонують у рослинах.

Промотор може бути нативним або аналогічним або може бути чужорідним або гетерологічним щодо рослини-хазяїна та/або щодо послідовності ДНК за даним винаходом. Крім того, промотор може являти собою природну послідовність або, як альтернатива, синтетичну послідовність.

Якщо промотор є "нативним" або "гомологічним" щодо рослини-хазяїна, то мають на увазі, що промотор міститься у нативній рослині, в яку цей промотор вводять. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" щодо послідовності ДНК за даним винаходом, то мають на увазі, що промотор не є нативним або таким, що зустрічається в природі, для функціонально зв'язаної послідовності ДНК за даним винаходом.

Ділянка термінації може бути нативною щодо ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною щодо функціонально зв'язаної послідовності ДНК, що представляє інтерес, може бути нативною щодо рослини-хазяїна або може бути одержана з іншого джерела (тобто, бути чужорідною або гетерологічною щодо промотору, послідовності ДНК, що представляє інтерес, рослини-хазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації можуть бути одержані з Ті-плазміди А. їшптегасієп5, такі як ділянки термінації октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також Сицегіпєеацй єї аї. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144; Ргоцагої (1991) Сеї! 64:671-674;

Запіасоп вї а. (1991) Сепез Юєу. 5:141-149; Модеп вї а)ї. (1990) Ріапі Сеї! 2:1261-1272; Мипгоє єї аІ. (1990) Сепе 91:151-158; ВаїЇІаз єї аї. (1989) Мисівїс Асіа5 Вез. 17:7891-7903; та дозпі еї аї. (1987) Мисієїс Асіа Нев. 15:9627-9639.

У разі необхідності, ген (гени) можна оптимізувати для підвищеної експресії в

Зо трансформованій клітині-хазяїні. Таким чином, гени можуть бути синтезовані з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для покращення експресії або можуть бути синтезовані з використанням кодонів з частотою використання кодонів, переважною для хазяїна. Як правило, вміст (зС у гені буде збільшено. Див., наприклад, СатрбеїЇ апа Сомлті (1990) Ріапі

РНузіої. 92: 1-11 для обговорення застосування кодонів, переважних для хазяїна. З рівня техніки доступні способи синтезу генів, переважних для рослин. Див., наприклад, патенти США МоМо 5380831 та 5436391, публікацію заявки на патент США Мо 20090137409 та Мигау еї аї!. (1989)

Мисієїс Асіад5 Везв. 17: 477-498, включені в даний документ за допомогою посилання.

У одному варіанті здійснення пестицидний білок спрямовується у хлоропласт для експресії.

Таким чином, якщо пестицидний білок не вводиться безпосередньо в хлоропласт, касета експресії буде додатково містити нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид для спрямовування пестицидного білка до хлоропластів. Такі транзитні пептиди відомі у даній галузі техніки. Див., наприклад, Моп Неї)пе еї аї. (1991) Ріапі Мої. Віо!І. Кер. 9:104-126; СіагК єї а!. (1989)

У. Віої. Спет. 264:17544-17550; РеПа-Сіорра єї а!. (1987) Ріапі Рнузіо!. 84:965-968; Вотег" еї аї. (1993) Віоспет. Віорпуз. Без. Соттип. 196:1414-1421; та 5пай еї а!. (1986) Зсіепсе 233:478-481.

Ген, що визначає пестицидну активність, який підлягає спрямовуванню у хлоропласт, може бути оптимізований для експресії у хлоропласті з урахуванням відмінностей між ядром рослини і даною органелою при використанні кодону. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, можна синтезувати з використанням кодонів, переважних для хлоропластів. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, який включено у даний документ за допомогою посилання.

Трансформація рослини

Способи за даним винаходом включають введення нуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" мають на увазі надання рослині нуклеотидної конструкції таким чином, щоб конструкція одержала доступ до внутрішнього простору клітини рослини. Способи за даним винаходом не потребують використання конкретного способу введення нуклеотидних конструкцій у використовувану рослину, лише тільки, щоб нуклеотидна конструкція одержала доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини рослини. Способи введення нуклеотидних конструкцій в рослини є відомими в даній галузі техніки, в тому числі без обмеження способи стабільної трансформації, способи транзієнтної трансформації і способи, опосередкованої вірусом. бо Під "рослиною" мають на увазі цілі рослини, органи рослини (наприклад, листки, стебла,

корені тощо), насіння, клітини рослин, паростки, зародки та потомків цих рослин. Клітини рослин можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, суспензійна культура клітин, протопласти, клітини листя, клітини кореня, клітини флоеми, пилок). "Трансгенні рослини", або "трансформовані рослини", або "стабільно трансформовані" рослини, або клітини, або тканини відносяться до рослин, які мають введені або інтегровані в клітину рослини екзогенні нуклеотидні послідовності або фрагменти ДНК. Дані послідовності нуклеїнової кислоти мають у своєму складі такі, які є екзогенними або не присутні у нетрансформованій клітині рослини, а також такі, які можуть бути ендогенними або присутніми у нетрансформованій клітині рослини. "Гетерологічний" загалом відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти, які не є ендогенними щодо клітини або частини нативного геному, у якому вони присутні, та які були внесені в клітину шляхом зараження, трансфекції, мікроін'єкції, електропорації, бомбардування мікрочастинками тощо.

Трансгенні рослини за даним винаходом експресують одну або декілька нових послідовностей токсину, розкритих у даному документі. У різних варіантах здійснення трансгенна рослина, крім того, містить один або декілька додаткових генів, що забезпечують стійкість до комах (наприклад, Сгу!т, такий як представники родин СтгутА, Сту 18, Сту1С, Сту1о,

СтутїЕ та СтуїЕ; Сту2, такий як представники родини СгугА; Сгу9, такий як представники родин

СтТу9А, Сту9В, Сту9С, Сту90, Сту9Е та Сту9Е тощо). Фахівцеві у даній галузі буде зрозуміло, що трансгенна рослина може містити будь-який ген, що забезпечує агрономічну ознаку, яка становить інтерес.

Трансформації клітин рослин можна досягати за допомогою однієї з декількох методик, відомих з рівня техніки. Ген, що визначає пестицидну активність, за даним винаходом можна модифікувати для одержання або посилення експресії в клітинах рослин. Як правило, конструкція, яка експресує такий білок, буде містити промотор для керування транскрипцією гена, а також 3'-нсетрансльовану ділянку для створення можливості термінації транскрипції та поліаденілювання. Структура таких конструкцій добре відома з рівня техніки. У деяких випадках доцільним може бути конструювання гена таким чином, щоб одержаний у результаті пептид секретувався або іншим чином спрямовувався у клітину рослини. Наприклад, ген може бути сконструйований таким чином, щоб він містив сигнальний пептид для полегшення переносу

Зо пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Також переважним може бути конструювання касети експресії, що містить інтрон, таким чином, що для експресії потрібен процесинг мРНК із видаленням інтрона.

Як правило, ця "рослинна касета експресії" буде введена до "вектора трансформації рослини". Цей вектор трансформації рослини може складатися з одного або декількох векторів

ДНК, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, використання векторів трансформації рослини, які складаються з більш ніж одного суміжного сегмента ДНК, є звичайною практикою в даній галузі. В даній галузі ці вектори часто називають "бінарними векторами". Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами, найчастіше використовуються для опосередкованої Адгорасіегішт трансформації, де розмір і складність сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є досить великими та доцільним є розділення функції за окремими молекулами ДНК. Бінарні вектори, як правило, містять плазмідний вектор, що містить послідовності, які діють у цис-положенні, які є необхідними для переносу Т-ДНК (такі як розташовані на лівій межі та на правій межі), селективний маркер, який сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у клітині рослини, та "ген, що становить інтерес" (ген, сконструйований таким чином, щоб бути здатним до експресії у клітині рослини, для якої потрібне створення трансгенних рослин). Також у даному плазмідному векторі присутні послідовності, які необхідні для реплікації бактерій.

Послідовності, що активні у цис-положенні, організовані таким чином, щоб забезпечувати можливість ефективного переносу у клітини рослин та експресії в них. Наприклад, ген селективного маркера та ген, що визначає пестицидну активність, локалізовані між лівою та правою межами. Часто другий плазмідний вектор містить фактори, що активні у транс- положенні, які опосередковують перенесення Т-ДНК з Адгобрасіегішт у клітини рослин. Ця плазміда часто містить елементи вірулентності (гени Міг), які забезпечують можливість інфікування Адгобасієгішт клітин рослин та перенесення ДНК шляхом розщеплення граничних послідовностей та міг-опосредованого переносу ДНК, які відомі у даній галузі техніки (Неїепз5 апа Миїйїїпеаих (2000) Тгепав5 іп Ріапі Зсіепсе 5:446-451). Кілька типів штамів Адгорасіегійт (наприклад, І ВА4404, (З3М3101, ЕНАТОЇ, ЕНАТО5 тощо) можуть бути використані для трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослин із застосуванням інших способів, таких як бомбардування мікрочастинками, мікроїін'єкція, бо електропорація, трансфекція за допомогою поліетиленгліколю тощо.

У цілому, способи трансформації рослин передбачають перенесення гетерологичної ДНК в цільові клітини рослин (наприклад, незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти тощо) з подальшим застосуванням максимального порогового рівня відповідного добору (залежно від гена селектовного маркера) для виділення трансформованих клітин рослин з групи нетрансформованої клітинної маси. Як правило, експлантатів переносять у свіжу порцію такого самого середовища та культивують за стандартних умов. Згодом, після поміщення на середовище для регенерації, доповнене максимальним пороговим рівнем засобу для відбору, трансформовані клітини диференціюються в пагони. Потім пагони переносять на селективне середовище вкорінення для утворення пагона з коренями або саджанця. Потім трансгенний саджанець виростає у зрілу рослину та продукує схоже насіння (наприклад, Нівї єї аї. (1994) Те Ріапі доигпа! 6:271-282;

Ібпіда єї аї. (1996) Маїшге ВіотесппоЇоду 14:745-750). Як правило, експлантатів переносять на свіжу порцію такого самого середовища та культивують за стандартних умов. Загальний опис методик та способів одержання трансгенних рослин знаходиться в Аугез апа Рагк (1994) Стіісаї

Веміємув іп Ріапі бсіепсе 13:219-239, та Воттіпепі апа дашйаг (1997) Маудіса 42:107-120. Через те, що трансформований матеріал містить багато клітин, як трансформовані, так і нетрансформовані клітини присутні в будь-якій частці підданого обробці цільового калюсу, або тканини, або групи клітин. Внаслідок можливості забезпечення загибелі нетрансформованих клітин та проліферації трансформованих клітин одержують трансформовані культури рослин.

Часто можливість видалення нетрансформованих клітин являє собою обмеження для швидкого відновлення трансформованих клітин рослин та успішного одержання трансгенних рослин.

Протоколи трансформації, а також протоколи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини можуть змінюватися залежно від типу рослини або клітини рослини, тобто однодольних або дводольних рослин, на які спрямована трансформація. Створення трансгенних рослин можна виконувати за допомогою одного з декількох способів, у тому числі без обмеження мікроін'єкції, електропорації прямого перенесення генів, введення гетерологичної ДНК в клітини рослин за допомогою Адгорасіегшт (трансформація, опосередкована Адгобрасіегішт), бомбардування клітин рослин гетерологічною чужорідною ДНК, що приєднана до частинок, балістичного прискорення частинок, трансформації із

Зо застосуванням аерозольного пучкового інжектора (опублікована заявка на патент США Мо 20010026941; патент США Мо 4945050; публікація міжнародної заявки на патент Мо УМО 91/00915; опублікована заявка на патент США Мо 2002015066), І ес1-трансформації, а також різних інших способів прямого перенесення ДНК без застосування частинок.

Способи трансформації хлоропластів добре відомі з рівня техніки. Див., наприклад, Змаб еї аї. (1990) Ргос. Маї). Асай. осі. ОБА 87:8526-8530; 5мар апа Маїїда (1993) Ргос. Маї!. Асай. зсі.

ИБА 90:913-917; 5маб апа Маїїда (1993) ЕМВО 3. 12:601-606. Спосіб залежить від доставки ДНК, що містить селектовний маркер, з використанням генної гармати та спрямування ДНК в геном пластиди шляхом гомологічної рекомбінації. Крім того, трансформації пластиди можна досягати шляхом трансактивації мовчазного трансгена, що міститься у пластиді, завдяки тканино- переважній експресії РНК-полімерази, яка кодується ядерною ДНК та спрямовується до пластиди. Про таку систему повідомляли МевВгіде еї аї. (1994) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОА 91:7301- 7305.

Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК в клітини рослин у середовищі застосовують максимальний пороговий рівень відповідного відбору для забезпечення загибелі нетрансформованих клітин, а також відокремлення та проліферації імовірно трансформованих клітин, які виживають після цієї обробки засобом для відбору, за допомогою регулярного перенесення на свіже середовище. Шляхом безперервного пересівання та стимулювання відповідним засобом для відбору виявляють та розмножують клітини, що трансформовані плазмідним вектором. Потім для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного гена, що становить інтерес, в геномі трансгенної рослини можна застосовувати молекулярні та біохімічні методи.

Клітини, які були трансформовані, можна вирощувати у рослинах згідно з традиційними методиками. Див., наприклад, МеоСогптісК еї аїЇ. (1986) Ріапі Се Керогі5 5:81-84. Потім ці рослини можна вирощувати та запилювати за допомогою тієї самої трансформованої лінії або інших ліній, та одержаний гібрид матиме конститутивну експресію визначеної потрібної фенотипічної ознаки. Щоб переконатися у тому, що експресія потрібної фенотипічної ознаки стабільно підтримується та успадковується, можна вирощувати два або більше поколінь, після чого збирають насіння, щоб переконатися у тому, що експресія потрібної фенотипічної ознаки була досягнута. Таким чином, у даному винаході передбачене трансформоване насіння (яке бо також називають "трансгенне насіння"), що має нуклеотидну конструкцію за даним винаходом,

наприклад, касету експресії за даним винаходом, яка стабільно включена в його геном.

Оцінка трансформації рослини

Після введення гетерологичної чужорідної ДНК в клітини рослин трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена в геномі рослини підтверджують за допомогою різних способів, таких як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, пов'язаних з інтегрованим геном.

ПЛР-аналіз являє собою швидкий спосіб скринінгу трансформованих клітин, тканин або пагонів на присутність включеного гена на ранній стадії, до пересадки у грунт (ЗатбгоокК апа

Виззеї! (2001) МоїІесшаг Сіопіпд: А І абогаюгту Мапиаї!. Соїй бргіпа Нагброг І абогаюгу Ргезз, Соїй зргіпд Нагрог, МУ). ПЛР проводять із застосуванням олігонуклеотидних праймерів, специфічних щодо гена, що становить інтерес, або векторної основи Адгорасієегічт тощо.

Трансформацію рослини можна підтверджувати за допомогою саузерн-блот аналізу геномної ДНК (ЗатбгооК апа КизхзеїЇ, 2001, вище). У цілому, загальну ДНК екстрагують з трансформанта, розщеплюють за допомогою відповідних рестрикційних ферментів, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану.

Потім мембрану або "блот" зондують, наприклад, за допомогою цільового фрагмента ДНК з радіоактивною міткою ЗР, щоб підтвердити інтеграцію введеного гена в геном рослини згідно із стандартними методиками (Ззатюогоок апа Киззеїї, 2001, вище).

У нозерн-блот-аналізі РНК виділяють з конкретних тканин трансформанта, фракціонують у формальдегід-агарозному гелі та переносять на найлоновий фільтр згідно зі стандартними процедурами, які зазвичай застосовуються в даній галузі техніки (ЗатргоокК апа Киззеї!, 2001, вище). Потім перевіряють експресію РНК, закодованої геном, що визначає пестицидну активність, шляхом гібридизації фільтра з радіоактивним зондом, отриманим з гена, що визначає пестицидну активність, за допомогою способів, відомих в даній галузі техніки (ЗатбгоокК апа Киззеї|, 2001, вище).

Вестерн-блот, біохімічні аналізи та подібне можна виконувати на трансгенних рослинах, щоб підтвердити присутність білка, який кодується геном, що визначає пестицидну активність, за допомогою стандартних процедур (Затюогоок апа Киззеїї, 2001, вище) із застосуванням антитіл, які зв'язуються з одним або декількома епітопами, присутніми на пестицидному білку.

Пестицидна активність в рослинах

Зо В іншому аспекті даного винаходу можна одержати трансгенні рослини, що експресують пестицидний білок, який характеризується пестицидною активністю. Способи, описані вище як приклад, можна використовувати для одержання трансгенних рослин, але спосіб, в який одержують трансгенні клітини рослин, не має вирішального значення для даного винаходу. За рішенням експериментатора можуть застосовуватися відомі або описані у рівні техніки способи, такі як трансформація, опосередкована Адгобасіегішт, біолістична трансформація та способи, не опосередковані застосуванням частинок. Рослини, які експресують пестицидний білок, можна виділяти за допомогою звичайних способів, описаних у рівні техніки, наприклад, шляхом трансформації калюсу, відбору трансформованого калюсу та регенерації здатних до розмноження рослин з такого трансгенного калюсу. У такому процесі будь-який ген можна застосовувати як селектовний маркер за умови, що його експресія в клітинах рослин надає можливість визначити або відібрати трансформовані клітини.

Була розроблена низка маркерів для застосування в клітинах рослин, таких, які надають стійкість до хлорамфеніколу, аміноглікозиду (3418, гігроміціну тощо. Інші гени, що кодують продукт, який бере участь у метаболізмі хлоропластів, також можна застосовувати як селектовні маркери. Наприклад, гени, що забезпечують стійкість до рослинних гербіцидів, таких як гліфосат, бромоксиніл або імідазолінон, можуть бути особливо застосовними. По такі гени повідомляли (ЗіаїКег єї аї. (1985) 9. ВіоІЇ. Спет. 263: 6310-6314 (ген нітрилази, що забезпечує стійкість до бромоксинілу); та Заїпавзімап еї аї. (1990) Мисі. Асід5 Кев. 18: 2188 (ген АНА5, що забезпечує стійкість до імідазолінону). Крім того, гени, розкриті в даному документі, застосовні як маркери для оцінки трансформації клітин бактерій або рослин. Способи виявлення наявності трансгена у рослині, органі рослини (наприклад, лисках, стеблах, коренях тощо), насінні, клітині рослини, паростку, зародку або його нащадках добре відомі в даній галузі техніки. У одному варіанті здійснення наявність трансгена виявляють шляхом дослідження щодо пестицидної активності.

Здатні до розмноження рослини, що експресують пестицидний білок, можна тестувати щодо пестицидної активності, та рослин, що демонструють оптимальну активність, відбирають для подальшого розведення. В даній галузі техніки є доступними способи аналізу активності проти шкідника. Як правило, білок змішують і застосовують в аналізах живлення. Див., наприклад,

Ма!ттопе еї а. (1985) 9. ої Есопотіс Епіотоіоду 78:290-293. бо Даний винахід можна застосовувати для трансформації будь-якого виду рослин, в тому числі без обмежень однодольних та дводольних рослин. Приклади рослин, що становлять інтерес, включають без обмеження кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті, різновиди перцю, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь та олійний ріпак, Вгазв5іса 5р., люцерну, жито, просо, сафлор, різновиди арахісу, солодку картоплю, маніоку, каву, кокос, ананас, цитрусові дерева, какао, чай, банан, авокадо, інжир, гуаву, манго, маслину, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини та хвойні дерева.

Овочеві культури включають без обмеження різновиди томату, латук, зелені боби, лімські боби, різновиди гороху та представників роду Сигситів, таких як огірок, канталупа та мускусна диня. Декоративні культури включають без обмеження азалію, гортензію, гібіскус, різновиди троянди, різновиди тюльпанів, різновиди нарцисів, різновиди петунії, гвоздику, пуансетію та хризантеми. Переважно рослини за даним винаходом являють собою культурні рослини (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, томат, хрестоцвіті, різновиди перцю, картопля, бавовник, рис, соя, цукровий буряк, цукрова тростина, тютюн, ячмінь, олійний ріпак тощо).

Застосування у контролі шкідників

З рівня техніки відомі загальні способи використання штамів, які містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом або її варіант, у якості пестицидних засобів у контролі шкідників або у створенні інших організмів. Дивись, наприклад, патент США Мо 5039523 та патентний документ ЕР 0480762А2.

Штами Васіїйи5, що містять нуклеотидну послідовність за даним винаходом або її варіант, або мікроорганізми, які генетично змінювали для того, щоб вони містили ген, що визначає пестицидну активність, за даним винаходом та пестицидний білок, можна застосовувати для захисту сільськогосподарських культур та продуктів від шкідників. В одному аспекті даного винаходу цілі, тобто нелізовані клітини організму, що продукує токсин (пестицид), обробляють реагентами, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, коли клітину поміщають у середовище цільового шкідника (цільових шкідників).

Як альтернатива, пестицид одержують за рахунок введення гена, що визначає пестицидну активність, у клітину-хазяїна. Експресія гена, що визначає пестицидну активність, прямо або опосередковано призводить до внутрішньоклітинного продукування та підтримання рівня пестициду. В одному аспекті даного винаходу дані клітини потім обробляють в умовах, які пролонгують активність токсину, що продукується у клітині, якщо клітину поміщають у середовище цільового шкідника (цільових шкідників). Одержаний у результаті продукт зберігає токсичність, притаманну токсину. Ці інкапсульовані природним чином пестициди можна потім складати у препарат відповідно до традиційних методик для внесення у середовище проживання цільового шкідника, наприклад, грунт, воду та листя рослин. Дивись, наприклад,

ЕРА 0192319 та посилання, які цитуються у ньому. Як альтернатива, можна скласти препарат з клітин, що експресують ген за даним винаходом, таким чином, щоб забезпечити можливість застосування отриманого у результаті матеріалу як пестициду.

Активні інгредієнти за даним винаходом зазвичай вносять у формі композицій, та їх можна застосовувати одночасно або послідовно з іншими сполуками по відношенню до посівної площі або рослини, що підлягає обробці. Цими сполуками можуть бути добрива, засоби боротьби з бур'янами, кріопротектори, поверхнево-активні речовини, детергенти, пестицидні мила, масла, використовувані у період спокою, полімери та/або склади з носіями, що повільно вивільнюються або здатні до біологічного розкладання, які роблять можливою довгострокову дозовану обробку цільової площі після одноразового внесення складу. Вони також можуть являти собою селективні гербіциди, хімічні інсектициди, віруциди, мікробіциди, амебоциди, пестициди, фунгіциди, бактеріоциди, нематоциди, молюскоциди або суміші декількох даних препаратів, за необхідності, разом з додатковими прийнятними для сільського господарства носіями, поверхнево-активними речовинами або допоміжними речовинами, що сприяють внесенню, які, зазвичай, використовують у галузі складання. Придатні носії та допоміжні речовини можуть бути твердими або рідкими та відповідають речовинам, які зазвичай використовують у технології складання, наприклад, натуральні або відновлені мінеральні речовини, розчинники, диспергувальні речовини, змочувальні засоби, засоби, що надають липкість, зв'язувальні речовини або добрива. Подібним чином склади можна приготувати у формі їстівних "принад", або їм можна надати форму "пасток" для шкідників, щоб забезпечити можливість згодовування або поглинання пестицидного складу цільовим шкідником.

Способи внесення активного інгредієнта за даним винаходом або агрохімічної композиції за даним винаходом, які містять щонайменше один пестицидний білок, що продукується бактеріальними штамами за даним винаходом, включають нанесення на листя, покриття бо насіння та внесення в грунт. Кількість нанесень та норма внесення залежить від інтенсивності зараження відповідним шкідником.

Композицію можна складати у вигляді порошку, дусту, пелети, гранули, спрею, емульсії, колоїду, розчину або подібних до них та можна одержувати за допомогою таких традиційних способів, як сушіння, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, осадження або концентрування культури клітин, що містять поліпептид. У всіх таких композиціях, які містять щонайменше один такий пестицидний поліпептид, даний поліпептид може бути присутнім у концентрації від приблизно 1 95 до приблизно 99 95 за вагою.

За допомогою способів за даним винаходом на даній площі можна знищувати або зменшувати кількості лускокрилих, напівтвердокрилих, двокрилих або твердокрилих шкідників, або ці способи можна застосовувати профілактично щодо площі у навколишньому середовищі для запобігання зараженню чутливим шкідником. Переважно шкідник поглинає пестицидно ефективну кількість поліпептиду або контактує з нею. Під "пнестицидно ефективною кількістю" мають на увазі кількість пестициду, що здатна призводити до загибелі щонайменше одного шкідника або помітно обмежувати ріст шкідника, харчування або нормальний фізіологічний розвиток. Дана кількість буде варіювати залежно від таких факторів, як, наприклад, конкретні цільові шкідники, що підлягають контролю, конкретне навколишнє середовище, місцезнаходження, рослина, сільскогосподарська культура або сільськогосподарська ділянка, що підлягають обробці, умови навколишнього середовища та спосіб, норма, концентрація, стабільність та кількість внесень пестицидно ефективної композиції поліпептиду. Склади можна також змінювати з урахуванням кліматичних умов, впливу на навколишнє середовище та/або частоти внесення та/або тяжкості зараження шкідниками.

Описані пестицидні композиції можна приготувати шляхом складання або бактеріальної клітини, кристала та/або суспензії спор, або виділеного білкового компонента з необхідним прийнятним для сільського господарства носієм. Композиції можна складати перед застосуванням за допомогою відповідних способів, таких як ліофілізація, висушування сублімацією, сушіння, або у водному носії, середовищі або придатному розріджувачі, такому як сольовий розчин або інший буфер. Складені композиції можуть бути у формі дусту, або гранульованого матеріалу, або суспензії в олії (рослинній або мінеральній), або водних, або масляних/водних емульсій, або у вигляді змочувального порошку, або у комбінації з будь-якою

Зо іншою речовиною-носієм, придатною для застосування у галузі сільського господарства.

Придатні для сільського господарства носії можуть бути твердими або рідкими, та вони добре відомі у даній галузі техніки. Вираз "прийнятний для сільського господарства" охоплює усі допоміжні речовини, інертні компоненти, диспергувальні речовини, поверхнево-активні речовини, засоби, що надають липкість, зв'язувальні речовини, тощо, які зазвичай застосовують у технології складання пестицидних препаратів; при цьому вони добре відомі фахівцям у галузі складання пестицидних препаратів. Дані склади можна змішувати з одним або декількома твердими або рідкими допоміжними речовинами та одержувати різними способами, наприклад, шляхом рівномірного змішування, перемішування та/або подрібнення пестицидної композиції з придатними допоміжними речовинами із застосуванням традиційних методик складання.

Придатні склади і способи внесення описано у патенті США Мо 6468523, який включено у даний документ за допомогою посилання. "Шкідник" включає без обмеження комах, грибів, бактерій, нематод, кліщів, іксодових кліщів та їм подібних. Комахи-шкідники включають комах, вибраних із рядів СоіІеорієега, ОРіріега,

Нутепорієга, Іерідорієга, МаїЇорнада, Ноторієга, Нетірієга, ОпПгорієга, Тнузапоріега,

Оептаріега, Ізорієга, Апоріига, зірпопаргіега, Тгіспоргіега і т.д., зокрема Соіеорієга, І ерідорієга та

Оіріега.

Ряд СоІеоріега включає підряди Адерпада та Роїурпада. Підряд Адерпада включає надродини Сагароїдеа та Сугіпоїдеа, у той час, як підряд Роіурпада включає надродини

Нуагорнісідеа, еіарнуїїпоїдеа, Сапінагоїдеа, Сіегоїдеа, ЕЇІаіегоїдєа, Оазсійоіїдеа, Огуороідєа,

Вугтоїдеа, Сисціоїдеа, Меїоіїдеа, МогаеПоідеа, Тепебгіопоїдеа, Вовігісноїдеа, 5сагараєоідеа,

Сегатрусоїдеа, Спгузотеїоіїдеа та Сигсшіопоїдеа. Надродина Сагароїдеа включає родини

Сісіпаеїйдає, Сагарічає та бБуїїзсідае. Надродина Сугіпоїдеа включає родину сСугіпідає.

Надродина Нуагорпйоіїдеа включає родину Нуагорпійїдає. Надродина 5арпуїїпоїдеа включає родини Зіїрпідає та еїарпуїіпідає. Надродина Сапіпагоїдеа включає родини Сапіпагідає та

ІГатругідае. Надродина Сіегоїдеа включає родини Сіегідає та Оегптевзіійає. Надродина

ЕІаіегоїдеа включає родини ЕПІагегідае та Виргезідаеє. Надродина Сисціоідеа включає родину

СоссіпеїПдаеє. Надродина Меїоідеа включає родину Меїоїдае. Надродина Тепебргіопоіїдеа включає родину Тепебгіопічдае. Надродина Зсагараєоїдеа включає родини Рабззаїїдає та зЗсагаравідае. Надродина Сегатрусоїдеа включає родину Сегатбрусідае. Надродина бо Спгузотеїрідеа включає родину СПпгузотеїїдає. Надродина Сигсшіопоїдеа включає родини

Сигсцшіопідає та зсоїуїаае.

Ряд бОіріега включає підряди Метаїйосега, Вгаспусега та Сусіоппарпа. Підряд Метаїйосега включає родини Тіриїдає, Рзусподідає, Сшисідає, Сегаюродопідає, Спігопотідає, Зітиїйадає,

Вібіопідае та Сесідоптуїійдає. Підряд Вгаспусега включає родини з5ігайотуїідає, Табапідає,

Тпегемідає, Авзіїйдає, Мудідає, ВотрБуїйдаеє та Ооїїспородідає. Підряд Сусіогіпарпа включає родини Аз5сопіга та Азспіга. Підряд А5спіга включає родини Ріогідає, Зугрпідає та Сопорідає.

Підряд Азспі7а включає родини Асаїурігагає та Са|урігаїає. Підряд Асаїурігаїаеє включає родини

Оїщшідає, Терпгйдає, Адготуідає та Огозорпййдаеє. Підряд Саїурігаїаеє включає родини

Нірробозсідає, Оеєзігідає, Таспіпідає, Апіпотуїдає, Мизсідає, Саїрпогідає та Ззагсорпадідає.

Порядок Іерідорієга включає родини "Раріїопідає, Ріегідає, Гусаепідає, Мутрпаїйаає,

Рапаїдає, Заїугідає, Незрепгідає, Зрпіпдідає, Заштіїдає, Сеотеїйідає, Агсійдає, Мосіцідає,

Гутапігідає, Зевзіїдає та Тіпеїдає.

Нематоди включають паразитичних нематод, таких як бульбочкові, цистоутворювальні та нематоди, що ранять, які включають Неїегодега 5рр., МеІоідодупе 5рр. та Сіородега 5рр.; зокрема, представників цистоутворювальних нематод, включаючи без обмеження Неїегодега діусіпе5 (соєву цистоутворювальну нематоду); Неїегодега зспаснії (бурякову цистоутворювальну нематоду); Неїегодега амепає (зернову цистоутворювальну нематоду) та

Сіородега го5іоспієепбоіх, та ІоБродега раййда (картопляні цистоутворювальні нематоди).

Нематоди, що ранять, включають Ргагуепсвпиз 5рр.

Напівтвердокрилі шкідники (що включають види, названі як Нептіріега, Ноторіега або

Неїегоріега) включають без обмеження ІГуди5 5рр., такі як сліпняк західний матовий (Іуди

Пезреги5), сліпняк матовий (Гудиз Імпеоїагі5) та зелений сліпняк (І удив еїїбив5); тлі, такі як тля персикова зелена (Муи5 регзісає), тля бавовникова (Арпі5 доз5зурії), тля вишнева або тля черешнева (Мулиб5 сегавзі), тля соєва (Арпі5 діусіпе5 Маїзитига); цикадка бура рисова (Міарагмаца Ісдепв) та цикадка зелена рисова (Мерпоїеціх 5рр.); а також щитники, такі як щитник зелений (Асго5іегпит Пійаге), щитник мармуровий (Наіуотогрпа Паїу5), щитник овочевий зелений (Мел7ага мігпдціа), щитник рисовий (ОебаЇш5 ридпах), щитник червононогий (Репіаюта гиїре5), щитник європейський (КПпарпідавхіег першоза) та щитник деревний Тгоїйи5 Ішгідив.

Комахи-шкідники за даним винаходом для основних сільськогосподарських культур

Зо включають: маїс: О5ігіпіа пиріїаій5, європейського кукурудзяного метелика; Адгої5 ірзіп, совку- іпсилон; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; Зродорієга їидірегада, совку трав'яну; Оіайгаєа дгапаіїозеМйа, вогнівку кукурудзяну південно-західну; ЕІазхтораїри5 ІідпозеПйи5, точильника зернового; Оіаїйаєа засспагаїй5, вогнівку цукрової тростини; ОЮіабгоїїса мігдіїтега, західного кукурудзяного кореневого жука; Оіаргоїїса Іопдісогпіз Багрегі, північного кукурудзяного кореневого жука; Оіабгоїїса ипаесітрипсіава поулагаї, південного кукурудзяного кореневого жука;

Меїапоїш5 5рр., дротяників; Сусіосерпаїа бБогеаїї5, хрущика північного (личинку хруща);

Сусіосерпаіа іттасшиіаєса, хрущика південного (личинку хруща); РоріШа |аропіса, хрущика японського; СПпаейспета риїїсагіа, земляну кукурудзяну блішку; Зрпепорпоги5 тпаїйдів, кукурудзяного довгоносика; Кпораіозірпит таїйді5, кукурудзяну листову попелицю; Апигарпів таїаігадісіз, кукурудзяну кореневу попелицю; Віїззи5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5, клопа--ерепашку пшеничного північноамериканського; МеїІапоріих5 Теппитибгит, червононогу кобилку; МеїЇапоріи5 запдиіпіре5, кобилку мексиканську; Нуіетуа ріайшга, личинку паросткової мухи; Адготуа рагмісоттів, міль-пістрянку кукурудзяну; Апарпоїйгір5 оБб5сгиги5, трипса злакового; ЗоІепорзів тіїезіа, мураху-крадія; Теігапуспи5 шипісає, звичайного павутинного кліща; сорго: Спо рапепПив, соргового точильника; Зродорієга їгидірегаа, совку трав'яну; Неїїсомегра 7єа, кукурудзяну совку;

ЕІазтораїрих5 ІщдпозеїПййи5, маленького точильника кукурядзяного стебла; ЕРеша 5и,ибБіетапеа, гусеницю озимої совки; РпуїПорпада сгіпіа, личинку хруща; ЕІеоде5, Соподеги5 та Аеоїиз 5рр., дротяників; Ошета теїапорих5, п'явицю червоногруду; Спаеїоспета риїсагіа, кукурудзяну блішку; 5рпепорпоги5 таїйдіє, кукурудзяного довгоносика; КпораїЇозірпит таїйдіє; кукурудзяну листову попелицю; зірпа Пама, жовту попелицю цукрової тростини; Віїззив5 Іеисоріеги5

Іеисоріеги5, клопа-ч-ерепашку пшеничного північноамериканського; Сопіагіпіа зогопісоїа, галицю соргову; Теїгапуспи5 сіппабагіпи5, червоного павутинного кліща; Темйгапуспи5 ипісає, звичайного павутинного кліща; пшениця: Рхецдаїейа ипірипсіада, гусінь совки лугової; Зроадорієга Ігидірегаа, совку трав'яну; ЕІазтораїривх Ідпозеїїш5, маленького точильника кукурудзяного стебла; Адгоїі5 огподопіа, прямокутну совку; ЕІазтораїриз Іїщдпозеїйи5, маленького точильника кукурудзяного стебла; Оцієта теїапори5, п'явицю червоногруду; Нурега рипсіаїа, довгоносика листового конюшинового; Оіаргоїїса ипаесітрипсіага поугагаї, південного кукурудзяного кореневого жука; російську пшеничну попелицю; Зспігарпі5 дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Масгозірпит амепає, велику злакову попелицю; МеїЇапоріи5 Тетиггибгит, червононогу кобилку; МеїЇапоріи5 бо айтегепііаай5, кобилку відмітну; МеїЇапоріи5 запдціпіре5, кобилку мексиканську; Мауеїйоїа девігисіог, гесенську муху; ЗЙйЙОоаіріобзіє тозеїйапа, помаранчеву злакову галицю; Меготу7а атегісапа, личинку американської меромізи; НуІетуа соагсіага, озиму муху; ЕгапкКіїпіеНа тизса, тютюнового трипса; Серпиб5 сіпсійи5, хлібного пильщика; Асегіа іШшіїірає, кліща цибулевого чотириногого; соняшник: ЗцйціІеїта Пеїйапіпапа, соняшникову брунькову листовійку; Нотоеозота еІесієййт, соняшникову вогнівку; 2удодгатта ехсіатайопіх5, соняшникову окличну совку;

Воїпуги5 діррози5, морквяного жука; МеоїІазіоріега тигефапа, галицю соняшникового насіння; бавовник: Неїїоїйіє мігезсеп5, бавовникову листовійку; Неїїсомегра 7еа, бавовникову совку;

Зродорієга ехідна, совку малу; Ресііпорпога до55урієйа, рожевого бавовникового хробака;

Апіпопоти5 дгапаїх, бавовникового довгоносика; Арпі5 доз5зурії, бавовникову попелицю;

Рзецдаютозвзсеїї5 з5егіа5, бавовникового гедзя; Тгіаієнгоде5 аршіопеа, бавовникову білокрилку;

Гудив Ііпеоїагіх, трав'яного клопа; Меїапоріи5 Тетигиргит, червононогу кобилку; МеїЇІапоріи5 аїнегепійай|й5, кобилку відмітну; ТПгір5 їабасі, цибулевого трипса; ЕгапкКіїпівйа їиб5са, тютюнового трипса; Теігапуспив5 сіппабвбагіпи5, червоного павутинного кліща; Теїйгапуспи5 шипісає, звичайного павутинного кліща; рис: Оіаїгаєа засспагарй5, точильника цукрової тростини; Зродоріега їгидірегда, совку трав'яну; Неїїсомегра 7єа, кукурудзяну совку; листоїда виду СоЇазрі5 Бгиппеа;

ІГів5о г порігиє огулорпйи5, рисового водяного довгоносика; ЗйЙорпйи5 огулає, рисового довгоносика; Мерпоїейціх підгорісіи5, рисову цикадку; Вії55и5 Іеисоріеги5 Іеисоріеги5, клопа- черепашку пшеничного північноамериканського; Асго5іетит Піаге, зеленого клопа-щитника; соя: Рзхецдоріивіа іпсіцаеп5, соєвого п'ядака; Апіісагзіа деттаїгаїї5, гусеницю совки оксамитових бобів; Ріаїйтурепа з5сабга, зеленого шкідника конюшини; Об5ігіпіа пибіїайє, європейського кукурудзяного метелика; Адгоїї5 ірзіоп, совку-іпсилон; Зродорієега ехідча, совку малу; Неїїйоївпів мігезсеп5, бавовникову листовійку; Неїїсомегра 7еа, кукурудзяну совку; Ерйасппа магімевії5, мексиканську бобову зернівку; Мули5 регхісає, зелену персикову попелицю; Етроавса Тарає, цикадку картопляну; Асгозієгпит Ппйаге, зеленого клопа-щитника; Меїапоріи5 Тетитиргит, червононогу кобилку; МеїЇапоріи5 айегепійайв5, кобилку відмітну, Нуіетуа ріайшга, личинку паросткової мухи; 5егісоїйгір5 магіабіїйє, трипса соєвого; ТПгір5 їабасі, трипса цибулевого;

Теїйгапуспиб5 ШштКевіапі, туркестанського павутинного кліща; Теїгапуспи5 ицпісає, звичайного павутинного кліща; ячмінь: Оз5ігіпіа пибіїаіййє, європейського кукурудзяного метелика; Аадгоїі5 ірзіоп, совку-іпсилон; Зспігарнпіх дгатіпит, звичайну злакову попелицю; Віїз5и5 Іеисоріеги5

Зо Іеисоріеги5, клопа--ерепашку пшеничного північноамериканського; Асгозіегпит Піїаге, зеленого клопа-щитника; Еиб5спізійи5 5егми5, коричневого клопа-щитника; ОЮОеїйЇйа ріайшга, личинку паросткової мухи; Мауеїйоїа аевзігисіог, гесенську муху; Реїгобіа Іаїеп5, петробію багатоїдну; ріпак олійний: Вгемісогупе Бгабхзісае, попелицю капустяну; РПУуїоїгега сгисітегає, блішку хрестоцвітну; Матезіга сопіїдигада, совку латукову; РішейПа хуїоз(еїа, капустяну совку; Оеїа 55р., личинок весняної капустяної мухи.

Нематоди включають паразитичних нематод, таких як бульбочкові, цистоутворювальні та нематоди, що ранять, які включають Неїегодега 5рр., МеІоідодупе 5рр. та Сіородега 5рр.; зокрема, представників цистоутворювальних нематод, включаючи без обмеження Неїегодега діусіпе5 (соєву цистоутворювальну нематоду); Неїегодега зспасптії (бурякову цистоутворювальну нематоду); Неїегодега амепає (зернову цистоутворювальну нематоду) та

Сіородега го5іоспіепві5х, а також Сіородега раїйда (картопляні цистоутворювальні нематоди).

Нематоди, що ранять, включають Ргаїуіепспиз5 5рр.

Способи підвищення врожайності рослини

Передбачені способи підвищення врожайності рослин. Способи включають забезпечення рослини або клітини рослини, які експресують полінуклеотид, що кодує пестицидний поліпептид, розкритий у даному документі, і вирощування рослини або одержаної з неї насінини у полі, ураженому (або сприйнятливому до ураження) шкідником, щодо якого зазначений поліпептид має пестицидну активність. У деяких варіантах здійснення поліпептид характеризується пестицидною активністю щодо лускокрилого, твердокрилого, двокрилого, напівтвердокрилого шкідника або нематоди-шкідника, а зазначене поле уражено лускокрилим, напівтвердокрилим, твердокрилим, двокрилим шкідником або нематодою-шкідником. Як визначено у даному документі, "врожайність" рослини відноситься до якості та/або кількості біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" мають на увазі будь-який визначуваний продукт рослинного походження. Підвищення продукції біомаси являє собою будь-яке покращення визначуваного виходу продукту рослинного походження. Підвищення врожайності рослин має кілька комерційних застосувань. Наприклад, зростання біомаси листя рослин може підвищувати врожайність листових овочів для споживання людиною або твариною. Додатково зростання біомаси листя можна застосовувати для збільшення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів рослинного походження. Підвищення врожайності може включати 60 будь-яке статистично значуще підвищення, включаючи без обмеження підвищення щонайменше на 1 95, підвищення щонайменше на З 95, підвищення щонайменше на 5 95, підвищення щонайменше на 10 95, підвищення щонайменше на 20 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 100 95 або більше підвищення врожайності у порівнянні з рослиною, в якій не експресується послідовність, що визначає пестицидну активність. При використанні конкретних способів врожайність рослин підвищується у результаті підвищення стійкості до шкідників рослини, яка експресує пестицидний білок, розкритий у даному документі. Експресія пестицидного білка приводить до зниження здатності шкідника до зараження або поїдання.

Рослини можна також обробляти одним або декількома хімічними композиціями, що містять один або декілька гербіцидів, інсектицидів або фунгіцидів. Ілюстративні хімічні композиції включають гербіциди для захисту плодових/овочевих культур: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метрибузин, симазин, трифлуралін, рлуазифоп, глюфосинат, галосульфурон від Соулап, паракват, пропізамід, сетоксидим, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для захисту плодових/овочевих культур: альдикарб, Васійи5 (Пигіепдіепзіз, карбарил, карбофуран, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, цифлутрин/бета-дцифлутрин, есфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацеквіноцил, біфеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, динотефуран, флуакрипірим, спіродиклофен, гамма-цигалотрин, спіромезифен, спіносад, ринаксипір, ціазипір, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодикарб, метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, ціанопірафен, клотіанідин, тіаметоксам, спіноторам, тіодикарб, флонікамід, метіокарб, емамектину бензоат, індоксакарб, фенаміфос, пірипроксифен, фенбутатин-оксид; фунгіциди для захисту плодових/овочевих культур: аметоктрадин, азоксистробін, бентіавалікарб, боскалід, каптан, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ціазофамід, цифлуфенамід, цимоксаніл, ципроконазол, ципродиніл, дифеноконазол, диметоморф, дитіанон, фенамідон, фенгексамід, флуазинам, флудіоксоніл, флуопіколід, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, фолпет, фосетил, іпродіон, іпровалікарб, ізопіразам, крезоксим-метил, манкозеб, мандипропамід, металаксил/умефеноксам, метирам, метрафенон, міклобутаніл, пенконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропамокарб, пропіконазол, пропінеб, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, піриметаніл, квіноксифен, спіроксамін,

Зо сірка, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для захисту зернових культур: 2,4-0, амідосульфурон, бромоксиніл, карфентразон-Е, хлоротолурон, хлорсульфурон, клодинафоп-Р, клопіралід, дикамба, диклофоп-М, дифлуфенікан, феноксапроп, флорасулам, флукарбазон-МА, флуфенацет, флупіросульфурон-М, флуроксипір, флуртамон, гліфосат, йодосульфурон, іоксиніл, ізопротурон, МСРА, мезосульфурон, метсульфурон, пендиметалін, піноксаден, пропоксикарбазон, просульфокарб, піроксулам, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тралкоксидим, триасульфурон, трибенурон, трифлуралін, тритосульфурон; фунгіциди для захисту зернових культур: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, цифлуфенамід, ципроконазол, ципродиніл, димоксистробін, епоксиконазол, фенпропідин, фенпропіморф, флуопірам, флуоксастробін, флуквінконазол, флуксапіроксад, ізопіразам, крезоксим-метил, метконазол, метрафенон, пентіопірад, пікоксистробін, прохлораз, пропіконазол, проквіназид, протіоконазол, піраклостробін, квіноксифен, спіроксамін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; інсектициди для захисту зернових культур: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, Б-цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, хлорпірифос, піримікарб, метіокарб, сульфоксафлор; гербіциди для захисту маїсу: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, (5)-диметенамід, глуфосинат, гліфосат, ізоксафлутол, (5)-метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, примісульфурон, римсульфурон, сулькотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флуфенацет, піроксасульфон; інсектициди для захисту маїсу: карбофуран, хлорпірифос, біфентрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромезифен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, дельтаметрин, тіодикарб, ї-цифлутрин, циперметрин, біфентрин, люфенурон, тебупіримфос, етипрол, ціазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, авермектин; фунгіциди для захисту маїсу: азоксистробін, біксафен, боскалід, ципроконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенітропан, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, ізопіразам, метконазол, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для захисту рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даіїмурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутикарб, квінклорак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, 60 оксазикломефон, бензобіциклон, пірифталід, пеноксулам, біспірибак, оксадіаргіл,

етоксисульфурон, претілахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримісульфан; інсектициди для захисту рису: діазинон, фенобукарб, бенфуракарб, бупрофезин, динотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, клотіанідин, етипрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спіноторам, емамектину бензоат, циперметрин, хлорпірифос, етофенпрокс, карбофуран, бенфуракарб, сульфоксафлор; фунгіциди для захисту рису: азоксистробін, карбендазим, карпропамід, диклоцимет, дифеноконазол, едифенфос, феримзон, гентаміцин, гексаконазол, гімексазол, іпробенфос (ІВР), ізопротіолан, ізотіаніл, касугаміцин, манкозеб, метоміностробін, орисастробін, пенцикурон, пробеназол, пропіконазол, пропінеб, піроквілон, тебуконазол, тіофанат-метил, тіадиніл, трициклазол, трифлоксистробін, валідаміцин; гербіциди для захисту бавовнику: діурон, флуометурон, МОМА, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп-бутил, гліфосат, норфлуразон, пендиметалін, піритіобак- натрій, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глуфосинат, флуміоксазин, тидіазурон; інсектициди для захисту бавовнику: ацефат, альдикарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, абамектин, ацетаміприд, емамектину бензоат, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, спіносад, тіодикарб, гамма-цигалотрин, спіромезифен, піридаліл, флонікамід флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, бета-цифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, динетофуран, флубендіамід, ціазипір, спіносад, спіноторам, гамма-цигалотрин, 4-((6б-хлорпіридин-3-іл)уметил(2,2-дифторетил)аміно|фуран- 2(5Н)-он, тіодикарб, авермектин, флонікамід, піридаліл, спіромезифен, сульфоксафлор; фунгіциди для захисту бавовнику: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, фенамідон, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флуксапіроксад, іпродіон, |ізопіразам, ізотіаніл, манкозеб, манеб, метоміностробін, пентіопірад, пікоксистробін, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, квінтозен, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для захисту сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлоримурон-етил, хлорансулам- метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазаквін, імазетапір, (5)- метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, глюфосинат; інсектициди для захисту сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, спіносад, спіноторам, емамектину бензоат, фіпроніл, етипрол, дельтаметрин, бБ-цифлутрин, гамма- та лямбда- цигалотрин, 4-((б-хлорпіридин-3-іл)уметил(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодикарб, бета-дцифлутрин; фунгіциди для захисту сої: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, хлороталоніл, мідь, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флутриафол, флуксапіроксад, ізопіразам, іпродіон, ізотіаніл, манкозеб, манеб, метконазол, метоміностробін, міклобутаніл, пентіопірад, пікоксистробін, пропіконазол, пропінеб, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тетраконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін; гербіциди для захисту цукрового буряку: хлоридазон, десмедифам, етофумезат, фенмедифам, триалат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамітрон, квінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, квізалофоп; інсектициди для захисту цукрового буряку: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, динетофуран, дельтаметрин, -цифлутрин, гамма/лямбда-цигалотрин, 4-(І(6б-хлорпіридин-3-іл)метил(2,2- дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он, тефлутрин, ринаксипір, ціаксипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для захисту каноли: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глюфосинат, гліфосат, метазахлор, трифлуралін, етаметсульфурон, квінмерак, квізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для захисту каноли: азоксистробін, біксафен, боскалід, карбендазим, ципроконазол, дифеноконазол, димоксистробін, епоксиконазол, флуазинам, флуопірам, флуоксастробін, флусилазол, флуксапіроксад, іпродіон, ізопіразам, мепікват-хлорид, метконазол, метоміностробін, паклобутразол, пентіопірад, пікоксистробін, прохлораз, протіоконазол, піраклостробін, тебуконазол, тіофанат-метил, трифлоксистробін, вінклозолін; інсектициди для захисту каноли: карбофуран, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, динетофуран, бБ-цифлутрин, гамма- та лямбда-цигалотрин, тау-флувалеріат, етипрол, спіносад, спіноторам, флубендіамід, ринаксипір, ціазипір, 4-((б-хлорпіридин-3- іл)уметил(2,2-дифторетил)аміно|фуран-2(5Н)-он.

Наступні приклади пропонуються як ілюстрація, а не як обмеження.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Виявлення нових генів, що визначають пестицидну активність, у Васі

ІШигіпдіепвів бо Ідентифікували нові гени, що визначають пестицидну активність, у бактеріальних штамів

АТХ47307 і АТХ65002 із застосуванням наступних етапів.

Одержання загальної ДНК із штаму. Загальна ДНК містить як геномну ДНК, так і позахромосомну ДНК. Позахромосомна ДНК містить суміш деяких або усіх з наступних: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; інші неописані позахромосомні молекули.

Секвенування ДНК. Загальну ДНК секвенують за допомогою способів секвенування нового покоління.

Ідентифікація передбачуваних генів токсинів за допомогою аналізів гомології та/або інших комп'ютерних аналізів.

Одержання остаточної уточненої послідовності гена, що представляє інтерес, за допомогою однієї з декількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, ТА -РСК), якщо необхідно.

Таблиця 1

Новий ген, ідентифікований у штамі АТХА4А7307

Назва гена Молекулярна Найближчий гомолог Нуклеотидна | Амінокислотна маса (кДа) ЗЕО Ю МО ЗЕО Ю МО

Ахті477 5 дхтій77.в 75 Ую СтуЗВа! б

Ахті477.3 132 60 95 Сгуоват (укороч.) 1 7

Ахті477 (укороч.) о ТУ укороч. 8

Ахіті477.2 (укороч.) 9

Ахіті477.3 (укороч.) 10

Ахті477.2 та Ахіті477.3 являють собою білки, кодування яких розпочинається із сайту ініціації транскрипції, розташованого нижче по відношенню до Ахті477.

Таблиця 2

Новий ген, ідентифікований у штамі АТХ47307

Молекулярна - - Нуклеотидна Амінокислотна 5ЕС)

Назва гена маса (кДа) Найближчий гомолог 5ЕО Ю МО Ір МО

Ахті482 11

Ахті482.2 37 94 95 Ахті486; 51 95 МІХЗ 2 12

Ахті482.3 13

Ахті482.4 14

Ахіті482.2, Ахіті482.3 та Ахіті482.4 являють собою білки, кодування яких розпочинається із сайту ініціації транскрипції, розташованого нижче відносно Ахіті482.

Таблиця З

Новий ген, ідентифікований у штамі АТХ65002

Ахті486 15

Ахті486.2 о слов. /д о 16

Ахті486 З З8 94 95 Ахті482; 49 95 МІХЗ З 17

Ахті486.4 18

Ахті486.5 19

Ахіті486.2, Ахіті486.3, Ахіті486.4 та Ахіті486.5 являють собою білки, кодування яких розпочинається із сайту ініціації транскрипції, розташованого нижче відносно Ахіті486.

Таблиця 4

Новий ген, ідентифікований у штамі АТХ65002 маса (кДа) ЗЕО Ю МО ІО МО »Ахтіб25 20 »Ахтіб25.2 21 мкл 38 97 95 Ахті486; 51 95 МІХЗ 4 58 »Ахтіб525.5 24 »Ахтіб525.6 25 »Ахтіб25.7 26

Ахтіб525.2, Ахтіб25.3, Ахіті525.4, Ахті525.5, Ахті525.6 та Ахіті525.7 являють собою білки, кодування яких розпочинається із сайту ініціації транскрипції, розташованого відносно Ахітіб525.

Приклад 2. Аналізи пестицидної активності

Нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом можна досліджувати щодо їх здатності виробляти пестицидні білки. Здатність пестицидного білка чинити вплив на шкідника як пестицид часто аналізують за допомогою ряду способів. Однин спосіб, добре відомий у даній галузі, полягає у здійсненні аналізу з годуванням. У такому аналізі з годуванням шкідника піддають впливу зразка, що містить або сполуку, яку необхідно досліджувати, або контрольні зразки. Часто його здійснюють шляхом поміщення матеріалу, який необхідно досліджувати, або придатного розчину такого матеріалу на матеріал, який шкідник буде поглинати, як наприклад, штучне живильне середовище. Матеріал, який необхідно досліджувати, може складатися з рідини, твердої речовини або суспензії. Матеріал, який необхідно досліджувати, можна помістити на поверхню і потім надати йому можливість висохнути. Як альтернатива, матеріал, який необхідно досліджувати, можна змішати з розплавленим штучним живильним середовищем і потім розподілити у камері для аналізу. Камерою для аналізу може бути, наприклад, чашка, тарілка або лунка мікротитрувального планшета.

Аналізи із сисними шкідниками (наприклад, попелицями) можуть включати відділення досліджуваного матеріалу від комахи перегородкою, в ідеальному випадку секцією, яку сисна комаха може проколоти частинами сисного ротового апарату, щоб забезпечити поглинання досліджуваного матеріалу. Часто досліджуваний матеріал змішують із стимулятором поїдання, таким як сахароза, щоб сприяти поглинанню досліджуваної сполуки.

Інші типи аналізів можуть включати мікроін'єкцію досліджуваного матеріалу у ротову порожнину або кишечник шкідника, а також розробку трансгенних рослин з наступним дослідженням здатності шкідника харчуватися на трансгенній рослині. Дослідження рослин може включати ізоляцію частин рослин, які зазвичай споживають, наприклад, у невеликі камери, прикріплені до листка, або ізоляцію цілих рослин у камерах, в яких утримуються комахи.

З рівня техніки відомі інші способи та підходи до аналізу шкідників, і їх можна знайти, наприклад, в Кобрегізоп апа Ргеївіег, ед5. (1992) Ревіїсіде Біоаззауз м/п аппгород», СВС, Воса

Каюп, ЕГ. Як альтернатива, аналізи зазвичай описані в журналах Агійпгород Мападетепі Теві5 та доигпа! ої Есопотіс Епіотоіоду, або їх обговорюють з членами Ентомологічного суспільства

Америки (ЕЗА).

У деяких варіантах здійснення ділянки ДНК, що кодують ділянку токсину в пестицидних білках, розкритих у даному документі, клонують у вектор експресії РМА! -С4х Е. соїї за геном та!ІЕ, що кодує мальтоза-зв'язувальний білок (МВР). Ці гібриди усередині рамки приводять у результаті до експресії білків злиття МВР-Ахтпті в Е. соїї.

Для експресії в Е. соїї ВГ21"0ОЕЗ трансформують окремими плазмідами. Окремі колонії інокулюють у середовище Лурія-Бертані, доповнене карбеніциліном і глюкозою, і вирощують протягом ночі при 37 "С. Наступної доби свіже середовище інокулюють 1 95 добової культури і вирощують при 37 "С до логарифмічної фази росту. Потім культури індукують 0,3 мМ ІРТО протягом ночі при 20 "С. Кожний осад клітин суспендують в 20 мМ буфері Ттгіб5-СІ, рН 7,4ж200

ММ Масіні мм ОТ ч інгібітори протеаз і руйнують ультразвуком. Для підтвердження експресії білків злиття можна застосовувати аналіз за допомогою 505-РАСЕ.

Усі безклітинні екстракти потім пропускають через колонку з амілозою, що приєднана до хроматографа для рідинної експрес-хроматографії білків (ЕРІ С) для афінного очищення білків злиття МВР-ахіті. Зв'язані білки злиття елююють зі смоли за допомогою 10 мМ розчину мальтози. Очищені білки злиття потім розщеплюють або фактором Ха, або трипсином для видалення амінокінцевої МВР-мітки з білка Ахті. Розщеплення та розчинність білків можна визначити за допомогою 505-РАСЕ.

Приклад 3. Експресія і очищення

Усічені варіанти Ахіті477 (який наведено у даному документі під 5ЕО ІЮО МО:8), Ахіті482 (який наведено у даному документі під ЗЕ ІЮО МО:13), Ахіті48б6 (який наведено у даному документі під 5ЕО ІЮ МО:16) та Ахіті525 (який наведено у даному документі під ХЕО ІЮ МО:26) експресували та аналізували щодо біологічної активності. Дані гени ампліфікували з їх відповідних штамів за допомогою ПЛР, використовуючи ДНК-полімеразу НЕКСИІ АЗЕФ ІІ Ривіоп з праймерами, які вбудовують лінкер АбсіІ на 3'-кінці Ампліфікований ПЛР-продукт розщеплювали за допомогою Абзсі та лігували у вектор рмаІС4Х. Клонування підтверджували шляхом секвенування і трансформували клони у компетентні клітини ВІ21. Окрему колонію кожного клону інокулювали у середовище Лурія-Бертані, вирощували при 37 "С до Іод-фази і індукували 0,5 мМ ІРТО при 20 "С протягом 18 годин. Очищений білок розщеплювали за допомогою фактора Ха при співвідношенні 1:50 при кімнатній температурі протягом ночі.

Очищені білки піддавали біологічному аналізу з вибраними шкідниками відповідно до стандартного протоколу. Результати показані у таблицях 5-8.

Таблиця 5

Показники смертності та затримки росту для Ахіті47 7

Оіанаєазасспагайв (ЗОВ) //////с177171711111111111361111111 11111101 оЗродорієгайидіревва(ЕАМЇГ//////177777111111111111111111Ї111111111011 оЗродорієгаехідча(ВАМ)ЇГ/////ї17777771111111111311111111Ї11111111101с1

Адгоївірвіоп(ВСММ)77777711111111111114111Ї11111111101

Таблиця 6

Показники смертності та затримки росту для Ахіті482

Оіанаєазасспагайв (ЗОВ) ////////Ї7777777777771711731111111111ї1111101с1

Неїйошівмтевсевпе(НУ)Ї///////СЇ777777711111111111111111111111011

Нейосомегеагга(НІІЇ ///////С/СЇ777771717177717171714111111111711111111111101 (Зродорієгайцидірева(РАМ)Ї ОЇ 777777777717171731111111111111711111111111101

Таблиця 7

Показники смертності та затримки росту для Ахіті486

Неїйошівмтевсепе(НУ) ///////777ССс11111111111111835611111111111101с1

Нейосомегреагга(Н)Ї //////777С7ї1711111111111111311111111ї11111101 (Рвешдоріивіаіпсімденв (ЗВІД 1 7777777777717117111111111111171111111111101

Таблиця 8

Показники смертності та затримки росту для Ахіті525

Показник затримки росту 0 - відсутність активності 1 - неоднорідна затримка росту 2 - незначна однорідна затримка росту

З - сильна однорідна затримка росту 4 - надзвичайно сильна однорідна затримка росту.

Приклад 4. Перенос генів за допомогою вектора для експресії у рослині

Кодувальні ділянки за даним винаходом з'єднують з відповідними послідовностями промоторів і термінаторів для експресії в рослинах. Такі послідовності добре відомі з рівня техніки і можуть містити актиновий промотор рису або убіквітиновий промотор маїсу для експресії в однодольних рослинах, промотор ШВОЗ Агарідорзіх або промотор Самм 355 для експресії в дводольних рослинах і термінатори по5 або Ріпії. Методики одержання і підтвердження конструкцій промотор-ген-термінатор також добре відомі з рівня техніки.

В одному аспекті даного винаходу конструюють і створюють синтетичні послідовності ДНК.

Ці синтетичні послідовності мають змінену нуклеотидну послідовність у порівнянні з вихідною послідовністю, але кодують білки, які, по суті, є ідентичними вихідній послідовності.

В іншому аспекті даного винаходу конструюють модифіковані варіанти синтетичних генів таким чином, щоб отриманий у результаті пептид був націлений на органелу рослини, таку як ендоплазматичний ретикулум або апопласт. З рівня техніки відомі послідовності пептидів, які, як відомо, приводять до націлювання білків злиття на органели рослини. Наприклад, з рівня техніки відомо, що М-кінцева ділянка білка, який кодується геном кислої фосфатази білого люпину Гиріпи5 аі(рриз (ЗЕМВАМКФ ІЮ С1:14276838, МіМег еї аї. (2001) Ріапі Рпузіоіоду 127: 594- 606), приводить до націлювання гетерологічних білків на ендоплазматичний ретикулум. Якщо одержаний у результаті білок злиття також містить на С-кінці послідовність для утримання в ендоплазматичному ретикулумі, що містить з М-кінця пептиду лізин-аспарагінову кислоту- глутамінову кислоту-лейцин (тобто мотив "КОЕЇ!", 5ЕО ІО МО:27), то білок злиття буде націлений на ендоплазматичний ретикулум. Якщо в білку злиття на С-кінці відсутня послідовність, що націлює на ендоплазматичний ретикулум, білок буде націлений на ендоплазматичний ретикулум, але в остаточному підсумку буде зв'язаний в апопласті.

Таким чином, даний ген кодує білок злиття, який містить на М-кінці тридцять одну амінокислоту з гена кислої фосфатази білого люпину ГГ иріпих5 аірби5 (ЗЕМВАМКФ ІО 1:14276838,

МіПег еї аї., 2001, вище), злиті з М-кінцем амінокислотної послідовності за даним винаходом, а також послідовність КОЕЇ (5ЕБЕО ІЮ МО:27) на С-кінці. Таким чином, передбачається, що отриманий у результаті білок націлений на ендоплазматичний ретикулум рослини при експресії у клітині рослини.

Рослинні касети експресії, описані вище, поєднують з придатним для рослини селективним маркером, щоб полегшити відбір трансформованих клітин і тканин, і лігують у вектори для трансформації рослин. Вони можуть містити бінарні вектори для опосередкованої Адгорасієгійт трансформації або прості плазмідні вектори для трансформації з використанням аерозолю або біолістичної трансформації.

Приклад 5. Трансформація клітин маїсу генами пестицидного білка, описаними в даному документі

Качани маїсу найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяють з качанів і при трансформації переважно використовують зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджують щитком угору у придатне середовище для інкубації, таке як середовище ЮОМб62А55 (3,98 г/л солей Мб; 1 мл/л (1000х маточного розчину), вітаміни Мб; 800 мг/л І -аспарагіну; 100 мг/л міо-інозитолу; 1,4 г/л І-проліну; 100 мг/л казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (маточного розчину з концентрацією 1 мг/мл) 2,4-О0). Проте придатними є середовища і солі, що відмінні від ОМб2А5Б5 і відомі з рівня техніки. Зародки інкубують протягом ночі при 25 С у темряві. Хоча інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною.

Одержані у результаті експлантати переносять у комірки сітки (30-40 на чашку), переносять на осмотичне середовище приблизно на 30-45 хвилин, потім переносять на пластину для аерозольної інжекції (див., наприклад, РСТ-публікацію М/О/0138514 і патент США Мо 5240842).

ДНК-конструкції, сконструйовані для експресії генів за даним винаходом у клітинах рослин, потрапляють за рахунок прискорення у рослинну тканину із застосуванням прискорювача пучка аерозолю, із застосуванням умов, які, по суті, описані в РСТ-публікації Ме УМО/0138514. Після аерозольної інжекції зародки інкубують протягом приблизно 30 хвилин на осмотичному середовищі і поміщають в середовище для інкубації на ніч при 25 "С у темряві. Щоб уникнути зайвого ушкодження експлантатів, підданих аерозольній інжекції, їх інкубують протягом щонайменше 24 годин до переносу в середовище для відновлення. Зародки потім розподіляють у середовищі на період відновлення тривалістю приблизно 5 діб при 25 "С у темряві, потім

Зо переносять на селективне середовище. Експлантати інкубують у селективному середовищі протягом періоду тривалістю до восьми тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного методу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносять на середовище для дозрівання зародків і культивують доти, поки не буде спостерігатися утворення зрілих соматичних зародків. Одержані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови з низьким рівнем освітленості та ініціюють процес регенерації за допомогою способів, відомих з рівня техніки. Одержаним у результаті пагонам дають можливість укорінитися на середовищі для укорінення, а одержані у результаті рослини переносять у горщики для розсади і розмножують як трансгенні рослини.

Матеріали

Середовище ОМб2А55 рН розчину доводять до рН 5,8 за допомогою 1М КОН/ЛМ КС, додають Сеїгйе (Зідта) у концентрації до З г/л і середовище автоклавують. Після охолодження до 50 "С додають 2 мл/л маточного розчину нітрату срібла з концентрацією 5 мг/мл (Рпуоїесппо!оду І абз).

Приклад 6. Трансформація генами за даним винаходом клітин рослин шляхом опосередкованої Адгобасіегішт трансформації

Качани найкраще збирати через 8-12 діб після запилення. Зародки виділяють з качанів, і при трансформації переважно застосовують зародки розміром 0,8-1,5 мм. Зародки висаджують щитком угору у придатне середовище для інкубації та інкубують протягом ночі при 25 С у темряві. Проте інкубація зародків протягом ночі як така не є необхідною. Зародки приводять у контакт із штамом Адгобрасіегішт, що містить придатні для опосередкованого Ті-плазмідою переносу вектори, протягом приблизно 5-10 хвилин і потім поміщають у середовище для спільного культивування приблизно на З доби (25 "С у темряві). Після спільного культивування експлантати переносять у середовище на період відновлення тривалістю приблизно п'ять діб (при 25 "С у темряві). Експлантати інкубують у селективному середовищі протягом періоду тривалістю до восьми тижнів залежно від природи і характеристик конкретного використовуваного способу відбору. Після періоду відбору отриманий у результаті калюс переносять у середовище для дозрівання зародка та культивують доти, поки не спостерігається утворення зрілих соматичних зародків. Отримані у результаті зрілі соматичні зародки потім поміщають в умови з низьким рівнем освітленості та ініціюють процес регенерації, як відомо з рівня техніки.

Усі публікації і заявки на патент, згадані у даному описі, свідчать про кваліфікацію фахівців у даній галузі, до якої належить даний винахід. Усі публікації і заявки на патент включені в даний документ за допомогою посилання у тому ж об'ємі, якщо б кожна окрема публікація або заявка на патент була конкретно та індивідуально вказана як така, що включена за допомогою посилання.

Хоча вищевикладений винахід був досить детально описаний з метою ілюстрації, а також як приклад для чіткості розуміння, очевидно, що при практичному здійсненні можна вносити певні зміни та модифікації у межах обсягу прикладеної формули винаходу.

Перелік послідовностей «110» Атенікс Корп.

Лєхтінен, Дуан

Сампсон, Кімберлі, С

Роберте, Кіра

Дунн, Ітан

Зо Чоугуле, Нана «120» ГЕН ТОКСИНУ АХМІ486 ТА СПОСІБ ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ «130» АРА136054 -1505 61/913905 -1515 2013-12-09 -1505» 61/913911 -1515 2013-12-09 -1605» 27 «170» Раїепіп версії 3.5 «2105 1 «2115 3695 «212» ДНК -213» Васійив ІПигіпдієпвів «4005 1 асалваєссова абваєсваза Зззасаєчав асСбассдасо ссоссвисва безос во іїсичастча я сСтесссався тесосбооса заачасссзча агчссоосаєс ссавнчатавя 120 аваксастлало астаствсаа вас стврас чодрачассвоя вда ссса їагазасста ів чЧаессагста ссСочредсач асасосчасс ставстозчаз стчдотассує сасчсетаата 240 чсазечасії стадокоуьсс зуксуачаче асваєвасва сеча се осссвсквега ач ччассастет зассаачесаа саасааєсає здбасоцучаве оббссаєсцос всавабсадаа зва чачссавзсу «асазацуас адсачассяна чсвугавуча асусвесода байсєБавсї ча здузЕвасвоз азскастасав гсзватассста сЄвасаєсовд адовУуєодоз дуєвачосоя 250 вассстасвза дассбассто вВпсЕКЕкКаає азагбссуваз сссоосаєес сгасустоуєа 54 всрачрасоє савчесесов СачЧрадессо схшзадідава заравоосзекв асзастоска В) асечсссага сасазцоеосус заассгоасає счссгастаї сзззасаєзс Застава вВ пчучсаваас поадсасосбо єдазєстсвяа асгдасусає астєсСааєда досасазвах То сицтастсєцЧаї асбатассова ковстуєсаєя астусуеася асавсззее вдазчовувга ї5О повусавсат збБсасосаво беечскЧчаде сассаєсває госусасаца Засватаєста ва асвусиєссоч апобацеаає чесбавсосоа Сабтасваєо сСвсчаувасєа гбссзавеазу запо зЗбазаескс ядексасаєсо бодзсусасає аразчакстсва СзудацЄсас фс зай чазлаєсчоу зазсазчзоває ачаасдсаЗа совка ва асастссісюв сасучвссх 108 ксучесока вазасдоаває швасбоцісса севеаєскає єспаавасаєє асобаавесєа тав асадеєсвів сеазуссоавна сзасєстачся псавоасасча застава азчасолоке 130 сочасатосса Єзасвавтає гсосткозоб васїсазсва бахЕсаєзає БавстатоацЧе 10 кессстоссас ссозессівса аасЕкскаае ссеазсіваєє ссуаєаська ссазаставе 866 асдасадсву асесіасвуч гасстссаув ассостауає єсСосауєтас вацудессаа 1320 їксасвссао учас са сксааЄвасі сассчачавєс саздоадсаху Єваасавеве. 138О тассасесав Ссссазчацьс ассазосста часосоузася аассстаєсва сздаачетахє 1549 вабсасацає сасбесдсавує бассевссає азасабасес сстсасаїтає вавісабоча 185 зїасозгаєж абасачатта Зосвачстаєя ссеєзсаєсвеу Хсуоучвсвоя Єсусовозе 1550 чассссазсва асасчаєєваєс сдседатазча ассасасавс Ссосахттацче авачцсвесе 1530 асастазосто сзачрасвас спас сваайв часссвадаї гсзсзадачу заасяквобо 1686 счавозасєва сбазбоуценс агтгчцсаса Ебасаєстає дес Енаксо асевсгаия ї745 савсватєаєс дссстаачвує бсзсссвасс Сслясаучав апоссяутає дяачузасасеес ї800 тахацдадчоце сссставосо сзакассада сЕсЧадедса свасовасач зддасвачява: ав есвасттасая азясосієсСає саесвацасвя ббасбвосая сбобссясе саассосусек із себасаскїа сасзааєїсяа адвааєсссся асазгуавтя сзадзазасяє гадсвосоде 1980 ччевзагаїї зБасбасвіяч сагссвцавс дкЕссвеєан абсезасуєз асазчуоовав жОВи чачпсзсство азусвзасзаа чавачессася цедчасссвоє скасасчсає вазчспасоаа МН. їтасавакав ач сасаоа сбассзадес чассзасозу саяавкскаче пове га. гів ксадасозає дасзечазсеа соЧасавадач абубсасвчу зачсзздсаву азсзасавяа ТЕО сусттсалос саозаєтаа стовстЕсач датссзЧчасс зсвасесзає свабастевоч ЖЕО

Ззвазазааєу сагсоуванує ваЗсавсзас чдсвастаєва ссозаоаччсоо есе ках що зазвочетуа сасррсачеє аосалцочса ададзаваєь авсосавсвба сабтлаєсяаа яп зазатавасч сатсачзоії заачссутаї асасчсгтаса чассуваво Усач ає кави зчсачЕсазу абесазаває Єчасскса сассзоисата авабссвЕс пови ЕМ чстассечаса асстачвасс сязсасттвно геоавеЗашЕ сбсасвоакоавй вассавесов 258 сптвазціявс аасачакаче азасзедсва ссопаизасад азсаєсаєса сбетсвакоае БЖ

Касссродеву сооасксавас асасчауєсх ссоссссвса Есавнсашсаца поасссанає ато сповачоусаз агсвазрове болота бсдавачЧесо паясвасстяа гу ве ка возаставдова акстждавій забададабс ацассосбає сдодіозаєс гогзозасоє нео чаастлаєза асачсчЧоодва вічазасса чадсвасва чазавасоваєс аовачоваае 288 сосугосасс алодвЕуссва азсваєсссагсо ваісвеесак стусосаЕса Єовадфатєсвв ча савсі:аааєс седазасача сабсуусацає абсассовса сісвазавесє сзбоосбаєсв з автесачакЯа аесСасачоса сосзадбассо сазагосово чзассааєсєта бчдвовеюово ав) аслплазчсьв Совнайсосоє асСааславслсва Безбакеваує аєасессекосв зазслсово зо свайвчнноазЗоа вссссвасас сусєсосвоааЕ вуз чазасе свззсазчзУч ачссгасзака зво саасаззато псавтасоусв ЄЕесебасе ссоссгсаве чодуасцеяаса звосЕсебсах 384 свастсачач сзбапссдлваа состава яс зпвасєзсцет свасаусазча давечеао ззпо пасодазаєт часасєсссас васссузаве павустсаєс абасвовава зсісасвех 3169 асгзусасчсв аєтастуасєвкЕ звасдосаєсо басозсстасбу асаасгасоса Єосзасвада Зо павзуєачсакє Бстваттсасва гаоазуаасаєсє асштосававу аочовзаУбов засздавуче 3580 чсассссасв бСадасадіве сзаактсуеє дяазасасавяа воагваєзцаж сова ксоо, 1540 азоасасаху чкасвазана сасасссся сасазавачас єскЕсдайсач аасеставає зба зазізвоцає росссчодь адослсасає дузавугсаса єсзаєстассосу зач аске. Зб пісСатасвава заасчезаке ссвсастася яса зо. «-21052 -2115 1008 «212» ДНК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «40052 зіЧдааєсєаава авпсаасзаа васазбаєса вес саа сопатасвачся гео вацрса ви собсосссбва січі вадссас азазасазозао васзасвано засзасвзачє азвсствсасад 120 гОозассаца сачечавсаз зсксссстдає зсачдочзсазу ччаєссваєсч сЕсСассгсова Іва

Бсстагудайа адессктаза увасваєоеєс уазодахзасу ссссауєва чабубааєо ша зпсбасссс сзавасівза чазсссесес дудксваєссч сзаєачавсс єсвавадеваєа ще ассзсотасас срстіБаЗУс бапессаанос часосзоава Васдсвасоца Єбаславасав Зо асЕстазавЕ ссазкеадЧааЕї сааназаасо гаїссЕвВасв сазсосассат сЕсгаснщав с автчзаїттрта гоасСазччасса чЧаавассоаа чзучавназіса «сакассоке бапсасеоаа. НУ члдвалачусз ссабаввадо Соавасабазво сгттяассата совасасата гувавеех. п чзавгчсохач вабагаткиає Босссстсваа сраєтавзче сасозссоаса Басбееоох оо

Фчадсдасаз састахтача боасдававня асгазатова ваазсгаєся асвексводва 26 актлузоссва аївяазчасса гоЧкЕасчає аєдоєЄтесяо ЕКЧескакавз асисоададтя то стастбвазб зсзсаасос здудсзсахєса себсуасувоу уссаєаяуса уасяоваєха що чаєсаєсссв абасбодската сассвеЕвсоса чазузавеєт асвесасЕгОо ЗЧавлзазав плас вабосовасс абгбабсувос вазкдонека сдааассессу аабсауваєа сучазуката зай їсІсавзідега азазссозаса сяєкаасаєт вдавастзайа вові сданав васадачвах по сгтрастіаекба аасссасазу вЧресесУєЕ даазазаєсча атасадвава 1005 «210» З «2115 1023 212» ДНК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «400» З І пгчасдсача зчЗасссцаа савазааоса асвазвузсад сасбсаачсає дасачесоує 5 зразу євасзЕскоЄ стсаЗссуса пдососаваава свсацазксаа сдлаазавасаа 155 сайосааеєта сасасества хсзаздаува аабсазусьсо содаєдтаци асадоаячяаєє ї8о севвзаєтає сксвчасісгта сзповавоссї ссавасбавта асбодеодяачо ввастества 255 чпссаззабц баасовавта Сспіттвана Чсазасаатя стави сба апсчасвакця зо зсаассгсава сзасваовс басасекосЕ баспдосаззос аааставосрЕ ссчявааслся 365 асхічассаво авсзайсвк: авкаетссаса сзасєєЄєчазаа авасзчвавти свзасасаенея ТО атсасстска савачаназроя ассствсавса счєсвавсача созчавнчазааа ессоцакавх 450

Зо сосєктіЗіса садзазуаана аЗзбсвассасв заавзссзЗавс згавосссва бсавБастває 549 часрабссавна сзбсідаваз соїасазсвс аббосєсосе сісазессає базачсаєсся БОЮ сечозбавеста срасссоваучс дасацсаєта гбззаєзусаа зазанассав ачочаазакч БЕ сесстатаєс сачазаєсад чессаагсача чветабсяУєЕ асдабаєуає досасссцЕ то бакзаасаса зчаччкосаєсх паавахасваса зоссбтазуса бвакссесасоа садах ї85 азусазуеєас авссвадавка гссоваєаєо уузавсаєва бассдцавув або Кв) пдосссвавай зсаясСавсос слессвссса Єбздовачсу Заусвоцавню себя св Зах чїзасасаЧза пса васк мав УчеЕВазУуєе чнасзсабсв зак сватиас дзалаауих ЗБ

Четйчазавасзо вчаавоебсас жваве асвагацссо соті аваст саспаиатасв того зав 1553 «2105 4 «2115 1029 «212» ДНК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «400» 4 зідадоузда азчасасода сзававазка зсавазоасао суксаласає часзваєсачи КО всадовчсьЕ шассаєсосоо сссааствра десасвайаа свпачвнасаа Сзавадавста 12 сасчравтїта сасацісєда ксачаднова заєсваюжвоо стчасцєаоаз воза 80 саасосовсає сксвасссса сузавеесоє сСсавазчвава асзсучавою асаспосься 40 чоабсаздзаєо сзасавуста ЄКсстадаа чубЄаававаєтє соссавоуєста ассучсвант Зп чаассєсаво Савзїзадсас сзсасссовє судустачео завуєдаєссї ддахаєсура зо астічеїсасу засавассеє азассссаса звассєдаза ававсясатсс Єазсасадсе МК. зссвсєстсств сацчайазвуше вессяв5саса г саацаца стозадодваз забута ав сосктгІціє) садаводяаян зухсаєсаєтв аааассчаве збаасескаа Есавастває 58 чачЧеабдава сасоїдазчач субазеаев актуєвеово своааєсеайх. сазачеасса врй ссусаєаисв свусссоває дасачсвека скадаєуєде азавзаксав аузававаєсу Бо савстасаєс бадаваєсоу Яеттавсааа зЧабтасучеєс асздасаєаць сссеаскасєе то сасазатаса чадасссяєв бвачсабуса асостачаса сасбагаєава счачаессає 7 задснчасас засксаНчасса сЕссаабаЕо Знав асов Бассудваця даскуачасе най чЕЕрсвааза зкаасавсоо сяассаєЕса сбадЗсвазчкоа чачіасдазаЄ сксклвасов Ой пнагасипуаа щсасаїтсва сохтгавачес чанасасв'са абастазтає давала зв чаанавасао асдассттає састЧаавсов ясааєаукес сеЕдЕтазася дасчальасу зео «абсесСтаца 1029 «-21055

«2115 1174 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005 5

Мес Ав ойгу два Авт біп сі сім Тук бін Т1іе Те двр о Аза бек ТВЕ 1 5 10 15

Св п1іу Сув бБет баг Авродяро маю Узі бій Тек Ске без о АТа Аку Дер г га КІ щи 5 0

Рко АввоАза Ата Ре біб АяпоМес АвпоТук Сув АвротТує цей Був Мес 35 4 45 дес АзробіУ АзротТУук Узі Асробек Тук їі ДепоБре б1у деп бех І1є в 5 пі дкга до АвроУаі Тк зеч Трек обіу Мат о біу ї1Хе Уві Аїіа епі 118 65 70 75 чо чаї бі тає без Сіу біу Вто уді біу біу Її Уві тв СТУ бе те а зо ща

Зех беж пет ба біу Бей оце Тор орто Бак о Авполдар АВ дарвочаї ТІВ ї00 105 119 сій Діва Рне Меї йіа пів Бтіє 5із с15 Без Біє сій сіб Ак Сів Аа 115 190 125 азр сій уві Ма) Агоо Ази Аза рей Авродяв Бей Тах бі Бей Аг Дар 1 3 135 о

Ту Тух Авп осТІй Туг бев бен Ага Бей бу с3з3Я Тхробіп сК1й дру Рго 145 і5О 55 1650 дев Аїа уаї ба Че ТЕ Пец маі Рне деп оАту Бве обі Тв обер; Ні 155 Її 478 зек нів Бе уаії Тк бек Мех рез бек БвВ о біу бек С1у Ро бі бББЕ 180 18 150 біз аг тує Аа ха біб Бей; пев ТВк Уві Тук Аза сів Аза Ата Ав

З 290 ?2а5 їемю Ніз їжч Бей Чец о їеи Аго АвроАіа бер Ті Тує бі Аза вра Тр 219 гЕ5 22 сі ба Акоа за бек бів 112 Авробей ТУух ре Ай Сі тей пів дви 23 235 240 пхо Тих Ар А5ротух ТБЕ Авпонів Суз Уві ТУ Аїа Тух Ави АВпоб1у а ВО 255 їм біб сій тає Ак ов Те Бех Беб Аха де тер о Гвиа Аку ТУЮ ПІВ хво га рана біб РИ Яка Акта Сів о бйс ТБх їец ті АтТа рем Ав тез Маї Аїа 16 ре но «85

Не ргостТує Теу Дяй Узі дк бій о тТук ра жів біу чаї дв вка 1 ва 295 зпа

По оТвт гу дйароча) бух Те Авб оре їїе б1у Уві Трек Бе Аа Аху зав 310 315 Зео

Ок Ав тво осів Тбпг обі Мві бін Сув Акш Бо Ткр Уа) Аво Тбт вхо 330 335

Тук Меє дек Ріе Заг Азропец бі Авао Аїз ї1їе ї1іє Дко Рко Ро нів зча з45 зва цей обвпе бій ТЕ Бей Акч дз Пей ТНК ЇІтТе Нія ТВ оБіУ Ака Тук Аео

За5 зпо З65 ей уві діу слу дів йту рРБе її біб б5іу Тер о Уаі сіу Ків бек Ма та ЗУ зво

Тк дво оТвВж Аку їш біуУу Авлобйех ТБ уаї РОе ТВкобБеє Ав оТук СЩ1у ї У ї ві зх 390 ЗБ 8009

Бах цей ВЕБ БКо Акч Ре біт Уві Ре Аза РНе ТЕ Зп о ббе ляр Уві 495 419 415 тТук уп їі деп ТВ Ака АтТа Авр о чех Тк сіУу Тв орйе Аку біе РЕо во В 430 біу рве Аін чаї тик Ак Аля біп вне Ті вхо бі Б1у Тс о Тух Бех

Скде 440 445 таї Алта нів йо вро бко пі Ав оСу5 Сів біп вар оТух Дяробек ТІЄ 350 455 155 бій сбій пе) Ркб бе бео АероРіх двропіч бка ї1іе АвпоАКа бек тує 455 та 475 480

Бек Ні АкЯ бо бет Ніз Уві тТвЖ їей Тує Був Тук ЇВр о йей беж да 455 1950 355

Ти Авротук Ку Маї Гів Дві: ТУЮ ТК одер отТукт Сіу беж Мей с рко Аїзв 505 ЗІ тук УВІ Тв ТИк онія да Авроуаї Аве оїей ТмпкоАвВа ЛМпж Ті ТНЕ Аха 515 А БІ дародкч тла Те біт рев Бо Бе Уві БуУзЗ дія Беї так їм ргОо діа 53О 5 зас йішжотнЕ ТвгоМаії Уві пух б19 РЕб сСіу Ре стлу Бі Б1іу Алр її Пец 335 за 5ва 560

Ак Ах ТЕ ТНК два о біУ ТНг о рве бі ТБЕ ге) я Маї Ага Уві Авл зо та 578 ат Буо рел отТйк іп Сів тує Акад іє) дгу Уві Аса Бпе Аза бек тв

ВО ВЕ 835

Сі дв Ре бек Її Ак о Уаї Пец АгаЯа біу Біу ТБ бек Те б1у Авр

Зах 500 505

Міа Ака Ре Ку беї ТБЖ Меє Аа Ажа сту бій с1із Бей Те тех І

Біо 515 ве стер РМа Уді Тк дк бій РНе Те отТее ТВ обпьу Бко Бпе йво Бко РКО 625 30 35 54)

Ене Тих ВБе ть бів тв бБя біс її Бе ТАЄ Узі деп Аїв біз су ва вв КО

Уві Зак ТВж Сіу пі іч Тук Ту ї1е Ар бек їїе бій їі Уді Брго во 555 БУВ чаї Ах обко Твж Аку йМа Ада ПІ: бій двройей Бі Аза Аза Був Буд вт бо 685 т ел і що дощ Й р ть Дж пт ник дос раї кт т т й тт і р

Ва чаї Аза Беж бевш Рйє Тк оАха Те о Ака Авробіу ценз біп Уві дек

Бог 535 ТО

Чаї Твк Авр отут біп Уві АвросбСіп Аїа Діа Ди бе Узі бек сСу5 Мей 05 ТО 715 тий бек дво обід Ба Туг б1уУ Ні Авробує був Меї Ппей Без біб діз Уві 730 735

Ахка дія дів БУ Ако сви Бег АкУ ія Ака два Беб) бе бів дев го я зав пп

Авв Ре Авп о ТНІ 11е Аво 5ек Тс біз біз Ава бу тр ву віз бек 755 тво зва

Авап біу худі Твх 1Їе дек бід бі 5Біу РКО Рпце Тук уз бішж вка Аіїв 178 15 то їеза йій Сер» Аза ее Аса Втеча охо да бук о БкОо ТП о Тухю Кі тує бів. їв5 7959 та вО00 пу увазі дай ді его біз цей о цув бро Тук ТТН Ак Тує Акч о Бев Ар поз 8160 815 шіу вне узі Бу бек Беж бів АзроПен бій ї1е Двробеб ї2е лів ІБ

Нів був узі Нів цез Уві цу дво Уві Бго Авр Авпоїей Маї бек АБр во пай тмк тех Беї Алср ЗіуУ век о Сув бег Зіу Меб Авп Ага був су бі БЦ во вах Бо біт має уді Ак дія бій їн іш ТЕ сло Нів нів Ніж реко МеЄ Ав ней 870 вх ВО з па х яд Мр її еще. А я дб дк Уві у З А т

Сув Су бід Аїа дія сів ТЕ Яхаз біз Ббе бек Бек Тух їТе Ап Трг еН-вя я ва

Стіу ввропей Ап обек бес Уві АввоБів фу їі Тв Улі УМ їв був

Зо вав я

Уа Ака ТЕ ОТАК Авробіу Тух Аїа ТВЕЖ беп о бБІіуУ АБ Тем пі: їж Уа зо зи сів Уа о сіУу Вкбо Цей цех пу січ обек ем о бім Ак білі бій вхо АВ

З з35 40

Лог ож Жов жк (Жив Ток с НШ У юю Бра а не то з т «Чи

Ави Аїа був Тко Бах Аїз Січ Сеча Бі АкЯ Бу Ако Віа біз Тих Дер

За зва зах З6О

Ажха Чаї тує бів АвзроАза пу біл о Вех 112 Ава БІ рез о ББбе о Укі Ав 965 зо Зх

Тук біт Ар сів бій ей Авпорко бій Ті бьу Мет йіа дво Хе ТІ зви 85 З

АБ Аза бій Ав ей Уаї Лів бек щі бак АБротві Тує дек АвролІв аз 1596 1905

Чаї пещй 3 ї11е Его сту їїе Ав Тук бів Бі Ту ТК обі ей 1010 Ої5 їкио

ЗегоАєть дтп бец сіб біп о діа Бех Тук Бей тує тако баг о Аку дво 1230 1035 діа Ууаі бій Авп обБіУ Аво Ра дБ беб СТУ Та Ав бек Тур Авп пок ик ттущах

Кв ен 1045 іще

Вів тих біу біУ Аза Тр маї бій бів двю СіУу Авп о Тих Кт впе 1055 1050 1055 іїєсц Уві Пе) бек Пів Тгтр Ав» Аїа біб Уаії Бех бів бів рле Аху 17 1075 1.85

Чаї іп о ро АвпосСув Був Тує Уві їх Ака Уві ТЕ Аїда и був то85 1055 055 уві біу пі сту Авр бу Тук чаї ТНЕ Ї12 Агу Авро б1іу Ата НІВ май ї123 13110 нів ТВ йіз Був цем ТБ вне Аз Аза Суя ДвроТук о АвроТ1з дал 15 1129 1195 сту Твж о Тук Чаї Тих АвроАни ТБ Ту пес ТВ Був біб: Уаї Уві 50 4535 1149

ЕМе Тр о Бех Ні ТВкК ші Ні Меб оТеко Уві біз Узї бЗежф бій ТЕ ї145 1150 1155 сто бу ві РБе Ні ІТ дер Бек ї11іе біб пе Маї біб Тк бів 1160 Т65 ВЕУ ву «2105 6 «2115 1135 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005» 6

Меє дво тує Пув АвротУую бев йуя Меї Зег Авр о біу Авротує Уві Авр

Ії 5 їз З пет тТук Тіє Аза Рхс біу зей бек Ті б1іУу Арч во Авроуді ТВж Бей тТбкобіу укк 51іу ті Уа) Аза Теи 0(е уві біу ТВх Бей біу шу Ко

З 33 З чаї біт слу туя Уді Тих 5І1У беб сіє Зевс яек Тева без Бу еп рей а БО

Тхе5 ро бес дами Авройегп двроуві Тр біз йіз РЕ Ме Аза Св ої1е 65 7о 75 яо бій січ без о ї1їе бі: бін Ак Ті1е Аїв Авробій Уа1і Уаї Аква Взпол1іа 85 а 5 ївцпойар Ап оїеви тах сбьу Без оАку ЯвБротТук Тук два бів тує йеш пей то 105 115 діа бецобій біз Тк піп Бі Аха рРхо Авб оАТа УЗі Ага беє Тахо Пец 115 1759 1275

Чаї Ра Ап Ако Бе біс Тк їв Ні Беж Нів Бпе Уві ТВ сек Меє 133 135 145 рЕб бек рве осіУу бек піу ко 01у вії бій дру ТУкК АтТа Уві зій Цей 145 150 155 тко їеа ТтеЕ о таї теє вій бів Аа АТ Авпобен Ні цем ГеЗ бей Бе АЕЗ тав то а

Ав о Аіа Аврої3іе Тут ОС1У Аїа Аг ТеБ біУу во Ахе сій бек обі Тща і Ій5 1939

Аво цен тує РН Ав бів Пец біп АапоАКо Тих Ако АввотТук ТВкКОоАВа 195 -(Ю 20 нів Суз чаї ТЕ Аіа Тук дай Авпобіу ев зЗто бів тіе Ак С1Уу ТЕ

Їй 25 229

Зех ро Аза бег Тв Пец Ага Тук нів о Сбі0 РБе Аг Ака шій тах тТВхЕ

Я 239 235 740

Пес гіе діа рез АБО Пес Уві Аа бів Ре го Ту Тут Авп Уві дев 245 250 Б бі тую Бко Ті6 біу Маї Азп о Бго Біб Бей Тс Ак о АввоУві Ту Тв аб ге об

Аврорго ті 51іу чаї ТБг вне Аке Ахо бі: АВо ТЕв о бія Тв бій уйі о Кк ета піз Сув Ака рес Те оУві Дяв ТВ Рг ТУк Мебє Зег рРее Беї дер це

За жчВ 0 біз дев діа Тїє ї)іе йга ко ргро Нів рев Рре бід ТВх Ге) АгЯ Веа 355 319 ЗІЗ не т. пні: в По ік. я Ми хм Мт лу хат У 1 ді аья тк

Їж тих їТе снів Те Су ре ту йзподей Уві Бу слу ліа сли ве зда 330 335

Іїе біз сСіу Тер оУві О1у Ні Беж уаї ТЕ Ав ТВеоЛсЯ бем Бу Ав 310 345 350 зею твЕ уві Ре тк бек дал о тук бі БЕК ви рБОо РКО Аха впа зів 355 360 385 "Ві РБе Аво Рне ТвКодевп Ре дер уві Тук ба Її дп Твс о дка Аа

Зо ЗІ зо дво бек Те біу ТВ Ре АкЯ Тіз Бо бБіу Рпе Аза Уві Тих Аку Аза 35 390 зав 490 бЕя Ве їїе Бко біУу бу Тв Ту бек Уві Аза Вів Ас Авр обро 01У 35 16 415

Аіїа Сув Бій їв Авр оТух АвробБах ї1іе Бі 5іо пец Рго бек ЦПевбв Вер 420 485 430 виб ДЕ ОМ вк сів Ав о Аха Зевс Тут бек КЕвВ Ака цеш обеє Ні ух 43 445 145

ТЕ Себ Бук Був ТУК ТАК ей 5ву Аво Тпх дер Тук сіу Уаї ІБ Ав я 455 169

Туж Тих йвр о Тук біу беє Меї РКО Віа Тух Уві Тор ТЕ Нів Ахо Авр 165 а7О 475 аа

Уві Авр оцец їй АвпотТйє ї1е6 Твк дід АвроАку Т1в Твж біп обец рка «85 а ах іви чаї Гуз Аїа Зек ТЕ Сео Кко Аза біу Тв ТБ уві Уві му С1у

Зоо БУ То рРжОо Біу Ре Тит ту ПіУ Авр оті їеФб Ак Ас ТЕ Ту Ава обі Тох

ЗА зей ЕВ не йжту ТЕ цей оНів Маї дгЯ УЗ Аво бек Ркбо їеввотТек бів біпотухє зо 5 54 йжа пес дея Уві Ако ВБе дія Бек ТВ о 03у Ав обБе бек 116 Люкд Чаї а5 БО 555 бо рез дія піу біу тн бе Ті сіу Вр о Аіа Акту ББе оту Бек ТЕ Має

ТО ЖІ дна Аа сту біп сь Цей ТвЕ тТук об5іб Зеб БМе Маі їй Аго бі рпе

ЗО АВ З

Тик о ТвВи Тв шіу Вк Рпе двп оРро Вко Бпе ТЕ о Бйе Так бай Тбх сій мед вОо 505

ОР тів без Тв Уаї Авй АтТа біл бі чаї Бех Те БрУ ЗУ Бі тує

БІО БІБ 52О

Тук її йвор бех ІТ Бій тів Уві ко Уві Авв Рко ТвкЕ Ак біз Аїа й що 3 5ЧО іа Бін Авробец сь АтТа йта був пух Лія маї Аїа зву Без вве Та ва 5 555 дж Лв Ак АБробіу пев сбіп таз два ай Ти о Авроїек біп щу Авр ва 63 510

СФіп АтТа Аїв о Авп Пец ча1ї Звк о Сув бен бе Авзрвобібє Сів Тух Б1Уу Нів 575 58о 55

Авропу сжя Мей їеч опе Зі йзхя Уві АЛюд Аха Аїе обу Ака беб чес 58) 635 тов

Ака Біб; Акч Ав Пейп бе» біт Ав о РКО АввоОБпе АвпотТьс Ті Ав о5ех то 718 ЗІ тей

Тпж біч біс Ав оЗ3і5 ТкроБуя Дія ех Азпосіу Маї тв Ії век сти 7525 730 73

Сіу бі Бхв вве Тс Був пу Ака АтТа шо біб рев віа вт Аїа Ак 749 145 759 пін Ана о Тую Рхо Тк Ту ї112е Тук біп був Уві Авт Аза бет біз гец 955 тей тБ5 цув вко Ту ТБ Аха ТУ Ату єп Авробіу Бе уаї бу дек Хек С1вВ 70 Т5 тво ддо паж зі іє АБр пемй ІТе Нів Ніз їв Був Уаї нНіб Бей уві БМВ.

ТЕЗ то 795 ОО двй уаї реб дар о Авб опец Узі бот Азвротнк тує ех Авр о біу зех Сух во 810 15

Беї біу МесодАвп да Сув Бій біб б5іп бій Меє Уві Авбв о Ата бій Бей 825 п25 Зо бпіш о твк бій Нів Ні нів о бкго Меб АвроСув Сув Сів Ара Дів піп о твК чо 555

Віх біб Не вк Бек Тук ЇТе Аза ТвкЕос1іуУ Авроїво Авп о век ек Уві щі сук. рих 855 во

Авробійх сту Ті ткроуді Маї їжи Бувотаї Аку ТВ Тл Ав сту Тук 855 то 875 во діва Хв Бен бі Аві» рей бім беб Уаї біз Маї біу Рко Бец овєк полу 885 820 8

Січ Бек Бей біо дтб біз іп Ага АвБроАвп ові Був ТІр бек діа бі адо 15 310 пез Біу ва БУВ АкЯ Лів бій Танго АвВо Акя Уві Тух їй лЛяро АТ був 5 З2г9 За5

Сіл бек її: АБО Ні То ба оуаї Ар оТує піз дер бій ій цей Ав зо а35 жа

Ртв бій теє СІ1Уу Мес діє АЗе 1їе І11е Аве Абе бі Авт обео Уаї Аїз зЯ5 55 З85 За: звк іє Бек двр о Маі Ту бек АБр Аїа Чаї Брев йпій Тіе Ркє Ззіу Те

Зе5 зо 5

Ав ТУЮ СТО ТТ Тек Тв обіч є беж о Ава АкФф мяч бів січ АТа бе зво зних ча

Тук Іза Тує ТІ пек оАко Ат о АКа уві біз Ав обі Авро Ве Азв Бе зах 1009 Т005

СЕУ бе двробБеж Тер Аза Аїа тТВЕ Біб біу Авіа Тако Уві біп бул та МН 1095

АвроБіу Аяий Же Ну Пе ей о таї Бей бек Ні Тр о Ар о Аїа сів 10и5 то 5

А

Чаї бек бій біп вве Дефо ав іп реЕб Ав був Був о тує Уаї Гео

Нею 1045 їО50 да уаї тв дія пів рув маї 0іУу сіу йіу двроБіу Тухк мах тТБЕ їх 1065 1965

Та Ак Авробіу дів Ніж нів Так обід Ббуз бе ТВхІ Рпе Ап АІа тала 1075 їз8о

Сув Авро Тую Аво о 115 Авпобіу тах Ту Уаї Тв о Авро дае ТОК тТУЄ

ТО 590 1395 пен отнк був біс Уаї Чаї Рпйе тує бвк Між Тк Ся НівоМеб тер 1100 Та 1119 чаї ві: Уві бат обі тах обіц бі Аза Бе нія Це Азв о Век тів в 1155 3155 бі: Рпе Уаї біо ТвВхобБіч був 1135 1155 «2105 7 «2115 1127 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005» 7

Меї беє Аво сіу Ав оТук чаї Ар обеж Тух Ії Ап обо спіу Сей бе 5 5 що І5 ї1е бі Ак ка АвроУай Тк оївеи Таж 01у хат бТУ їїе Уа АтТа гей ев) 25 аб її мМаї вІіу твж пер сіу ГУ Ргосхмаї 5Біу ту те Уві тер ошіу Бех го 45 тіе Зек Чдехж Пер пец бкгу чез Їжу Тре РКО бег деп одяр АвпоАяв узі 5 З БО їхв біл Атза Ре о Мех Ата СБ ті біо за пво 116 біз сіп Ага 11 760 то 50 віз Авр шій Уві Уві кт Ап Атя їец АзроАво бем Тих Сіу ев Де йо зу 95 дввотук Тук о Авпосій Тук о їенв о бей Аза бей біз бла Тер обіп ІМЯ Ак ре ем НКИ їшо 05 119 ко давав дія Уві АКу бек Т7рк Мей Узі Рпе Азв о Ахоа бле біз ТЕ (ей як Ат тек 115 125 155

Нів дат Нів Ррє Уа тв беж Меє Бо Бех Бе біу Зак бік ко 61 130 ї155 14

Чет біч Акч тує Аїв Уві біп озЗзез Бей ТБ чаї Тух Ма біб Аза А1а 155 Іо 155 150 дя Пец Нів ЦО Гей беб без Ата Авр о Аїа АБО її тує сі1Уу Аа Аха

ІБ То ї75

Тер ої; цес Ака біб пек бів сів АхроМцев Тую Ре Ав осіб пем обі то хІ85 19а

Ап Аку Тих ойко АвротТух ТВБх АвпоНів Су Узі Тпж о Аза тує дл АБ ї95 20О Р сіУу бе зі бРа Тіє Ак 51У ТП бек Ро АтТа бек Тв цем Ава Тук іо 5 шко із бів Рне Ах йжа озіз Тих їж о бецд ТІє Азів їецз о Авроїєй Уді Аїа яких вч Й у я -. уз 30 5 пд їде рве Ро тУук Ту в Уві Дюка біо ТбУую Рг ї3З3е сі Уві Ажо го ші «5 Віко іп бев тк оАгу двр ові Тук Тк ойвровКо Ті біу Уаї ТВ Ре Агу 250 га ато хха са йвр отв обуи Тв бу Уві Бі Сув Аке Бхо Тер о Ма3 Ав ТАг

ТВ но 255

Рко Тух Меї бек Бе бек о Авробви біз Або оАта ї1іе Ще Асо Бко рев

ВО 235 390

Нів ід спе біб тТБЕ Бей Або Ап ої ТНК їхе Ні ОТЛЕ біУ АкКо тух

Зах За 35 БВ,

АзЗзп оце) У ЗІ й1У А1в йтя БВе тів сів біб Ткросбаії іу нів дв

ЕН ЗО 35 чаі Тнпх Аво ТВ Аго бей обіу Авпобдех Тс Уаї ББе тТнеЕ дек дев Ту

3460 345 350 б1іу Бак цен бко БжО Аку пе бій Уві рве дей Рце ТЕ Ава Ре Ар 355 Зоо з та тук Біп лів деп Тк о дгу Аза дво беж ТВКобіУ ТВК ББе Аку іє 37 375 30

Бо біу Бе дів Уаї Тв ока дів бів пе Тіз Рро бі біу Тв тує зва 390 395 100

Зако Узі дів Нів йкч дер Бо БУ Ата Су біз бів ДвротТує АБ даю і05 чо 415 їЇїе сій біс Пец РО бек бев ДВБ БІ Ав о сіб БЕєЄ зї1е АБО о дгу век 420 їі25 450

Тут бек Ні Дсу бен бек нів Уаії Ти бер; Ту був тую ТК оцец хек 435 че 45

АзротвЕ дв тує Сіу ав тів Ав Тух Тих АБО Тук піу бек Мах рРко 55 455 450

Аза Ту узі ТЕв ТВ нНіз Ак дз о Уві др Гео Таж АБИ Тах Ме те ї х рі Е Е 465 то 475 ана

Аїа двр АК лів Твробів сей орто бей чаї Був АЗа бет Тк їв БКО 85 35 435

Аіз іу Тис Твх Чаї Узі Бу Пі БКе бу не Тк бі сту АБО ТІ

ВО ОЗ БІВ па вка Ак тТНЕ ТЕ Авп обіу Тих ре біу ТБх Бе ні Маї Ахб Уві

ВО 5

Авпобву ркос рен Тс оіп бів Тук Ага Бей Агу Уаї Ахо РНе Аза дак

Зо З вай

ТНЕ пу дЗпобНпе бек їв АК Уаії Се) АБЯ біє ЗіУу ТВО бет ТТ 1у «45 59 555 50

Ав оАїа Аку РБе осіуУ бек МК Ме Аа Ак зу Сів с ока фе тТвеОотух

Ох ве тля зіш ет Ре Уаї ТЕ Ака б Ра тТасе твЕж ТК бі ко Ре: Ави ехо

ЗНО 5вУ За

А ру: зие тв рче Тит сій Тв обів бр: їТіе Бей Тв о Уаї АвпоАта бій 55 е0о 55 сьу чаї бек ТвВх біу п0іу Зі Тух Тух Ме Ар овек Тїе сбЯш іЗе Уві вій Бі ве

Бе Уві Взи ко Тв Ака бли ліз вів ста Авроївео щи Аза Ат був вив 3 3 4 пуш Ма Маї Аїз ек без вве Тахо ду РАК Ак Ав обіУу зей біз Зах 545 65 БАЗ

Авв таї Пес АвротУкК іп Ма1 Авроськ Аза Аїв Авб бе Уді Зедк Сув

Бо БЕ ета іїви Бах Авв бід бів тує гу Ні Ач Був Ппув Ме Мей Бей бід ва 478 БНО 85 ві Аку діа діа ЦПув дж Без ех дк фіб Ах деп Бев Гей бій Дер 60 ва 700 га йвр Бе ди Тйгоїів два бе ТЕ біб бій Ав біуУу ТЕб Пух ДІВ тах то 715 тей зех АдвпобЗіу чаї Тбж Її бек біч біу ту Бко Ре Тух Був Біч вка

Те та 735

Аіїа Це о біт Се) йів бек пів Аа ЗІ ап оТтУх Ре ТвВе о ТУую її тую 740 745 тва пуп озув чаї Авпа! вів йекобьш Га був вк Бук ТВК Аа ТУ Ада бен тА 765 765

Аво сіу Бе Узі Пув о Зех бех сід Авроцем Січ Гі Авробни 11а пів та В тво ев Ні Пуж Уа) Ні Те Уаї був Авпоуві Рго АвроАзд осей Уві бе

ТВА т ТЯ водо

АвроїВу Тугс бЗех дар сру бе Су бвк обі Меє дя) дра Сув 05 бів яп5 чі ЕТ бій біб Мек баз Авв Абе бі ей 314 Те бів Ніж Вів о Нія бко Мех во виЗ 930

Аве Су Сус бій Аза діз бій ТАх Нів біо Ре бех Бек Ту зе Ай я. п4в ЕЕ тах сіу дяр ву до Зет бек Уві Аяробів спіу іє Тур Уві Узі Мей 85 бо іїлия УІ Ато Твх ТвВс двр обі Ток Ата Те без сосбіу Авпопей бій Бей вах вто 75 во

Ууаї ЗІ У«) фу ко Гей Бек біУу бїм Бек пе) Баш вка БМ бій Ага 885 за 855 двр два АтТа Був Тур Беж Аїа біс без піу Ака Був Аа вів БМВ Ото 8005. Зо. ЗО

Авройро Маї Тук біп о Авродіа Був біп бек о ї1єе АвапоНівз Гей рве Уві 915 Фо йе,

Азр тую іп Аво бів біп пай дви рКо бій їїе 51 МебЄ Ліз Ар о Іїе азо 55 но тів Аво Ата бій Ав опе Ма1ї ліва бйех Ії Зах АврочЗаї ТУух бе Аво

ЗА5 | 50 955 ЗЕ

Ата Уві їеч бів Тв РКО спіУ Ті Авй Тує 515 116 Тук Те СІВ ге зе в ат

Щек Ави Ач іє) бій бів Аді век Тухк й тую ТК бак Ака Ази діа о: 85 чав чав піп йва Б1іУу Аще Бе дет овек біУ пе) Ав бек о То Доп о АтТа Те з95 їопо 1555 мзаімосоіУ вза ЖЕ Ма1і Бів вій Аввойтїу Ав о тТвЕ Нів рпе оБбец Уві 1910 пане НИ 02 зей леї нів ТжхвБ Авр АЗів бій Узі Бек віп сій рле Ах ії ся 1225 ї05о 1035

БЕо Ач був о буш Тек Уві Перо йгу УВІ ТнЕ Дів о біяа був Уві Бі» 1049 1045 1450 сту су Аве ошіУу Туюк Уві ТВБт ї1їз Ар АДвробіу Атїа нів Ні Те т1а55 105Бо ї565 сій був о мец о стпж вве Ап діа був Або Тух Аво 116 дялпоБіу ТНЕ

ТЕ 07. та тк Укі Лв бвБр деп Тв о Тук ге) ТВ був біз Уві Уві ре Тує 105 1585 1095

Бех із тр спр) нів Меб Торо УМаїз біз Уві бек ЗЇї Те с1а біу 1195 1105 тро

Аза Бе Ві 11а Ав о бех Тіє пів Без Уді б)іб трк о сіб Був 15 155 1325 «-2105 8 «2115 673 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «400» 8

Мет АВ Агу дя ав сіб біУ Біз тук Їй 112 Гіе Дер Ії бек тТпе 1 З -10 ЇВ су ЗіУу Суд Бек обех АЮ АвроУаї ві бів тує Ргз ви АТЗ Ака Авр го а Зо

Кко Ава йіа лій вве сій АвпоМеє Авй Тут бух Ар о Тук бри Був МЕ пек о АвВроОіМ Ав» оТук Чаї Аво бе ТУк Ї16 Ачп РКО сау пе о бет Ї1е па в БО с1у йгч Аха АвроувЬ Тпсоїеа тве біб Уві бпіу тЗіе УК АТла Тец Їїе о 75 чо чаї біу тих цей біу біу Рго уві біу зу їїе Уві Твк о біу во її 55 Зо 95 зак йежт рей Тец бі їбей Гей Тер орто Бек Авп о АвроАвп Азов о Заї Тер 162 135 ва іа дів Бпе Мес Аа ба ї1е бій бій Тем Ті піз біб Ага ІТ1е Аа 115 159 125

Аше біпо уві Чаї Ако АвпоАвВа рез АБродви ви Тс с1іу пев Ат Авр

І30 135 140 тТух тТуг Ав б) Тук цво Пец Аішж Бев Бій біз Ткб бій Сів дкй ро 14 а і55 тей

Ап ді Уві Аг Чет Тк реа таб ре Ди Аква рРае Сль Тих пей нія ї65 170 178 бЗзеж Ніз гне Маї Тк Бех Ме Рхо Ба пе щу беє Бі Бо біу пек ї5а їй 155 пів АЕВ Тух Аза чаї бів Бей рем ту уаї Тук Дів сій Аза Ат АВ 135 200 жо

Без Нів цем) Бер гемо Гео Ако йяроАіа АДврої1іе Тує біу Ада Аке Тур

ЩО 2. еВ

Сіу їжа Аку бій дев Сі Ііє Авроцев о Тук Ре Ай сот їні бі Авт

Ява 23 235 ша

Ака тТВх Ак АвроТує ТНК АвБоНів Суг Маї ТБбг о Аїа Тух дав Авп обогу 255 250 5

Гейозім БІО Ліе Аа Оїу Тип чек ро Аза бех Тв ви Ася Тут НЕ 2650 55 10 бі пе Аку Аа 010 Те Тк дев» Ті Дів ец Ар бен Уві АТЗ Те 215 280 25 гре боб Тут Тух Азп Уві Ака бій Тук о Бро Тїє БКУ Маї Авт букс оди чо 25 ЗО

Ме Тв Ак Авроуві Туг ТВ Ар орто Їрае біу Узі ТВк Ре Ага Ака

ЗО 315 120

Січ Яшр о Теробім ТВ біу Ма! бо Сув Ака Рро Ткр оУді Ав Тих вхо

З 30 335 тує Меї бек ББе бек дар Пец 013 Ап Х1іа 118 Ті Ако Рке Бко мів 3 335 З5О цем пе стій Тс бе) Ахц Ап о йем ТП 118 нів Тпгобіу Ак Тк Авіа або 5 їжа уаї біу пі Аа Асу Бе І1е біш біу Хжвр Чаї С1у Ні Чек Уді 47о Зк зно

Тву Аби оте о дко їжи бТу ді Бек ТНІ Уаї Впє ТЬгобЗеє Ави тує 1У 485 ї850 за5 400 пек осей рро гко Акч Ре о біп Уа РБе Ав Рре ТБт Авпо Ра Ав Уа «5 418 аа

Тук бій Тіє АвпотТкК Ака Аів Авробек ТАК обі Таж о вНе Ага тів ргО

Бе! 155 435 їУу впесдіа Узі тк Аго Аза Бій Рпе ї1і5 Бо Бу СІУ Тих ТХую Бех я аа 445

Уаї Аїв Віз Ага Аве руб Бі Аза Сух іп бій с Аво Тук Авродев ЛІ 450 155 БО січ З без Вко бех Бей Дар Бка Аво бів Рга ї116 АепоАка бе Туб 4655 47а 75 Іво пек Нівз ДкЗ Гекі век Мів Мі Тв бемя Тек Був Тує Таж Пец век Авр 485 490 5

ТпЕ дв отТує лу Уа Це дви ТУ ТЕ о Аво о тує бі Бек Ме оре Аїд -0З Зоб 5ТО тТук Уа Тв Те НІ АхЗ АвбБ Уві Аве о їео Те Авв Та їїіе їх дід п 525 ВІ 5

Авв о Ака Те тах піп без Ро цей Уаі Муз Аза бек ТЕ цЦев; Рез Аіа 53 538; 540 піу ТпгоТївк Узі Уд1і Гуз бі» Рко б1у вБе ТБгобіу Сі Авр оті (ви зах ЗВО зпВ зво

Вхо дже ТьЕ Тв оАхв Сім ТВ о Бпе бі Тв оревч Ні 5) Ак уді Дал 5ез 57 БВ бек Ре Пез Ту см СІ ТуУкоАга Бец дку Чаї Дга Рпе Ата Зах Тег

ЗО 585 АВ пі Вей оБпе Бех іі БуЯ о Зві Тео оАко Су 01у Ліїє дес їїв бі Дер

Кіа КЕчЧ о Рце сСтуу зас ТЕ Меб Авп о Аха б1іуУу бія бі: рей Тк Лек Бл 510 55 о

Жек ББе ак ть Ат бід ве отве ТЕ тах біу реа Ре Дяп руш Бо жах 53 535 па бе тТвБж Вйє Тк бів їВБк Осій бхш тІе Бей ТЕ отУав Ази Аів бі БІу ба 5 ши 555

Чаї Бак Тр о бБУ сіб сі ТУє ТУук 112 двр бек І16 бій тіє Майї ко 5650 56553 пло

Уві «210595 «2115» 634 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005» 9

Мес двп тую був дзротТУкК йейп Був Меб Бе лавр біУу Авр о Тук Ущді Авр 1 З 18 й: дек тТук їїе аво ро щ1У Бей бек ІтТе Сіу АкЯ АкчЧ о Авроуві тик Пец 2 25 же тТвЕ Сі уві біб їі Уві Аїв рез дів Уві бі ТБ бен б1у б1уУ рей

Б3й чо 45

Ущш БІ йпіу ее уаї тТве о біу рем їіє бБеб беж ес Гей ЗУ Її ев тТтр о Рке бек Авп о Аво олЛап Аво Уаї Тср обі)» Дів Брпе Меї діва ів ІІ сіб бій ї-и Іі бій бій дра 116 А1їа Азробіп уві Уві Ак дзп Аїа 5 зо 95 ев АзроАнгп без тах бі їєц Або Аво Тук Тут йвп бій Тут Бей гей «ва дв зїй шко Уго ВАМ

АтТа їй сто Бій те бів січ Аку реко АБ оАівз Уаї Аху бек ТВх о йец

Тї5 15) То 7аї Бе Авп о Аг рНе біз; Твж о цев Ні век НіЗ рр ул тТвЕ БЕ Мех 135 35 Мас

Бо бер Рі СІУу бек пі Рко сіу ех б10 АхЯ Тух Ава о уаї біо беш 145 15 зу 155 пер тн Уві ТуксАта бій Дія дів веб; Пей Нів без; ей їей цей Дей 165 175 175

Аши Азта двр о ї1е Тух з1у Аїз ха Тер біу їз Ак біб Звке о біп Іїв: 150 185 159

Авр Пец Тух ре дви осі еп бій Авп Аг ТНх о дк двроТук ТВХ Аво 195 20о 05 ньш осСув Уаї тп Аза тТук АБаи АВО обі без бі біс ТТе Аку зу ле -о 7515 жо

Саву Ехо Дів Ба Тгр о Мей Асо Тук ПжВ бій Рбе Ася Ага біз тТБЕ Тих

КЕ 2-38 238 255 їз Ге Аїа без Авроїєю Ууаї АРа ї1е Ре Рго Тук Тух АвпоУаї Ага 245 280 55 бій Тую Бо їіє бі Чаї Авробко Піп без ТВг о Ако дврочаї Тухк ТЕ 26 65 210

Авр о Бко І1е бі Уві Тис Рре Аку АкЯ біз Ар ото бій Тих біу Уві 875 28о тя5 сь Сув аз Рус тер Уві Аве ТВЕ РКО ТУЮ МеЄ дет вме Зет др о Пев као а 309

ІЧ АвпоАТа ї18е Бі Аха Бго Река Ні бе) Ре піч тТНг без втЯ Ав 05 За 315 ЗВО

Ба тв тї6 Ні Те ойіу Ака тут Ав Ббеч уаї 51» піУ Ата Аку Ра

Зи5 330 33 ще сти БІ ТО У«і с1у Ньш бек ЧУаї ТНжЕ АБО Твх АКа пи бі Ав

Зо 345 350 йеж тТпк оУуаї вн тик обее АвпоТук біу беж ївиа Ро Бго Аа рр ОІВ 355 зво 365

Узі пе Авповне Так Ав орре АвроУуві Тух бій її АБ ту Аа дія

ВИКО 315 зво

Авробет твжт бі ТБЕ Бк Веб тів Рхо бі ББае діа уві тТне вка лі 385 З 395 ОО бі овае бфіе Рго б5іУ біу Трт Тур бех Уві АЇш нів йко Авт Ро біу 05 410 зи дів був піп опів Азротук Авро обех Ті біз бьш Гею Бус бет Ген Авр 45 123 430

Рко двр обі Ре їїє Авп ко бек Тут бек Пів Ав меш век бів Уві 455 440 145

ТвЕ о бви Тує Був Тує ТЕ цей бек двротТвЕ Аво Тує бі Уаї Т1ї6 Ал

БО 455 150

Тук Тне Ар о тук шіуУ беж Меб Рко Аїа Тух Уві Ткр.Тах нів ага Авр 455 470 т 489 чаї Вар і Ту дяюв ТВБх (іа Трпк Аза дар ойко с1е ТВкросій бек орго 485 Зо 395 їви Узі пух Аза бек ТІ Бевш Ро діа бі Тл Тахо Узі Уві цу сіу зоба ОВ БІ

Рко біу Рає тих біу СіУу Азрої1іє Пец дк Ага Та оТйс АвпоОЇУу Тих 515 З БЕ

Бнпе сту Те їла Нів о Уві Ака Уві дяп Бек Ре їшо тТвх бі база тує

ЗО 535 а

Ага Себ.одко уа1ї Ака Ре Аза бек ТНК б1У АВ Рпе бек ї1і8в Ака Уді1 545 550 555 Зо

Без Аа пу Оу ТВ век г1іЄє йбьУ Авв Аза лез Бра опблу век ТвЕ Ме:

ЗБ 579 575

ЗЕ Ага БіУу бів 015 реа та оТух бі Бех Бе Уа1ї ТВ Ага 530 рре 58 585 БІ

Тв ответ Зіу ро Бе Авпорко Вко рпе Тк Бе Тл бій ТвВк оси 595 ба БОБ біз їТіе Ббеш Тік Уаї дап Аїв бів Бі» Уві бек Те о біу біє бі Тук

Ту Тіє Ав- беж Щіе бій тіе Уві ро Уві

БаЗ 53 «210510 «2115» 626 «212» БІЛОК «213» Васійн5 ІПигіпдієпвів «4005 10 х то ожя жа. щу сте я ск ех Пе Кт кова Си

Ме бек дво Су Аво тТук уаї Авробек Тує 112 Ап о БКо біу пем век

З нж о) 15 ох з чи Мпруя трлн яю КАЛ ж мае о з. діа з сів пі Ара дб Аярочаї Тйк цев тс бБіу Уаї Сі 116 таї Ата Пец о й 30

Ї щі Її ФІ Сх і ма їх 2 та У; ту ГУ, гу її Уаї йіУу ТВ Геза б1Уу Бі РЕО УМаф пі» сту їі Мі Твже шіу Сем пт ; й 35 40 ст 1 т. і; 0 Ж ут Фе -щ Де тої Тушки м ії сек дах ей цем обіу ей Пед Ткро бує бек дев Ар о Авп о АЮ Уа з ее СИ 95 БО

Ткр біз дів Ріє Меб дія сій І11іе бій 0150 Гви їіе бів біб Дка Ті кр бала Аа Ре» мес ож ЗМ ще шли що зонам кв ль а ці ке ух оз пе 15 5 х її й ви з чі пд т тпреро зт йхтї Док дів АвБр осів Уві Уві Ага Ап Авфа Без Де оАВп рев ТвЖж бБіу Цей АкЕЯ я. З 55 ; : до ух стук тре ща СТОР Барі ТЛА ЛЯ сну тло де

Аво тТУукК тую дев бів тую Ццвоа пер оАтТа Без бій їхр ва біз вка 159 105 150

К ох - В Мо ящИ Я Бали Мо я 2 - г ех жк

Бгто Авпо Аза Уаї лЛЕсС ЗК ТБЕ Пец Узі РПЄє дви Ахка Ре бо ту Сез : зі ще : КЛЕ 115 12 125 ні : її Ууді тТЕк пью жовкоОУу щах бив щі бек ру ко щі

Ніз бек Ні Бре Ууді ТБх бас Меб рРко Бех. РП сіу век пі вхо пу 135 155 150 й і нед па ту ИН ух. на Ще А ля дз бах ІМ Акт Тук АТЗ Уаї біз Сбебс оцен тре Узі Тут АТ1а іп Атв о А1а 7 М 7 тя. ТО 7 : шк й ій ще Кк ей 145 1590 155 ї65 їх ще фло: : ще Ка пк хуя що бю и РИ зо Лк

Ав Сем нів Пей цей цес; оГед вка Ар о Ала Аве Де ТУкК Обі Аїе Лу

І тож ом, зве 5 їли 175 4 ; ку к жан з . 2 Журрдро буті ств же ле

ТЕЖ Іо цем Ах бів бек змі гів сАо Без Тук Бе Ав обіч. Бей ПБЕМ

Е З о ; ЗЕ ми їв Ін 19

Ї З з Че у Е сода щи -- у пвх жі що за демо джу дЕМ Ат Твпг вка Ав оТую тТпх ле ні Суб Маї ТЕ о ліа Тук АВ дев

ЗЕ пе око А о йога і 5 ТО «Ма

М з - і - а трхоує иа Тех М ау Фе тонер ую СПдоююо

ЗіУ ем шіб біц ї16 Ак о біу ТЕ беж Рко дід век ТЕр Без АхЯ тує гул рощ ол є ї 1 ЕНН, шок ми - сх -еЕ А соди ск дещо стю т ки пи жу бокю чаї А

Нів бів БНе Агро Аху бі ТвАЕ ТБк пев їзе Аїа Пе Ар Бей свя, йтіа 5 тя Аг 225. 230 235 24 їії-е с бре Бко тТУж Тух двп Узі Аква бій Тук РО 116 біу Уві АВп о вює

А 255 ява

Зі Пей ТвЕ Ака Ав оУзі Тук ТК о АвювоРгО ЇЇ Сі Уві ТК Рпе Аку 250 ее 275 ко сій дв оТевВ осі) ТвВе ЗіМ Уві зізб Сук Ака рео Тер оуаі Авий отТну та 5 ва ко туж Меє бек Бе бек лЛюр Бей бБіч Ав Аїа 16 І16є Ак РКО рко

КО 285 350

Ні цей Ре сСьц тнє пем дко дви їей Тс її Нів ТНЕ біу Ак Тук

ЗМУ зі зі5 ЗО

Аби є Уві зі Б1уУу Аїа Аку Ре ї1е бі бі ТЕр уаї біу нія бех

Зо 335

Уві Тв о Ахп тах одка Бей піу АБп бек Тк Уві РБе Тве о бет АБа Тує 34а зЗ45 50 су Зек ме) ршх бко Вр бе по уві бе Аа бе сте АБа РЕ Аво 355 З з55

Уві тую сьй її Адез Те дка вія Дяр о бек ТК бІіУ ТВЕ Рпе Ах тів

З 378 зво жо Сіу ВНа вів Уві Тк дк дія Бій РН їІТтТе Без біу ШЕУ ТК тек же Му ПЕ Бод Уа ак: вже мА Залі пе зб шко зх І хпПиОТуХ

З55 за за зо

Бек Уа Афіа ніш Акуч АвроБте біуУу АТа Сув ЗІіп бів АвротТую Авро бек 4 а 410 115

ІКе Сто іч Цей Рес бек їеи АвроБуо Авробіш БкКо Ї116 Ав Ако йек 7 425 13

Тук звх Пів АгЧ бер одеж Ні Уаї Тих Гео Тук Гув Тух ТвРЕ ої Бех кЗ5 440 445

АБ ТБІ АзротуУух оту аз ї16 да тує Ту дДаротук піу Бек Меб рко 4 ади

Ала тую Чаї Тжр Тк нів гу два Уві Авобобед Тк АвБотТве Ті о твЕ 455 о 75 488

Аїа др Аа їі тих біз рей ко Бе Уаї Бу Аза беж Тс о Їеи вКО ваза піу Тв ТНЕ Уа уві Був сі рко сІуУ БВе Те оЗ1уУ біу Авв о Т3е ів; дк Аха ТвВг Тих дЕв о сСі1у ТВх Епе біу ТБх Пец Пів Ма1 До Уві 515 ЗРО Вау даповек о рео Бева ТВЕ бів сій Тує Акч Без КЗ Уві де Ре дів о жхеу

БАО Аа іо тиж осіу дао рве Бек їїе Аку Уаї рем Ася біу бБіу тих Беж сте щ1у 45 БИ я БО

Кер Вів Зкоа Бце біу бек ТБЕ Мебс Авп Ага біу біп біс Тем Тих Тук

ЗО УТ В

Сій бек Бре Уві Трг Ак біз Ре Ту Тв Тек обі рРео Ре Депо рЕго

БО 55 295 хо вва тТвк ве Твж бій тп бів біз тіе Пе) так Узі Ав дія бі 5пй БОБ

ЯМУ Уа бек ТНК діу 21У бі) Тук Ту жфе Ар Ву Ії Біо І18 Уві 1 БУ Бе рто Ма їз -2105 11 «2115 336 5 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005 11

Мес Авп Ббуш Був Уаї ТВгоБцув ТВ Маї Бей бот Уді Уві Меє б1у її 1 З 15 15

Бех Ма1ї іа» Аїя Бек Ркс Тем Аїа ді Аза Діз Муз Тк бів АВ АВ

Був ШЖМ Уа біп мак о їїе ТК бій Ре дай сім дк бі й бує Бе іа аз ла

Бко Авро узі СІМ сІіп оіУ їі сів Тер без дес бьйп ввЕє Тут яру Був в я бо

Зех цей Бує дез Ден сіу Бі ЗДУ Тук бек ев бьіу Ав о АвроУві Ме ве я 75 по

Зес Тут Ме ПЦецй б5їо Чаї був Авп Бек Тук ОІу СІЙ без Аїз їі 15 85 о За

Ро біт уУаії тіе бБет ТЕ ТБ Реб Бей ТКр о Аїа біу біп дек Ар Бу 100 125 110 51ч Аво оАтТа Тих Аво о Нів біз піл о тТБЕ о їеп йвп бек Те обіч Ра був їхо 125

Пуз Твх Тук Бек Ар ТК о тТаЄ ТОє ТБ бек Так біз Ап біу Бе мес 136 о 139

Ії зі бів бі тах бій біу уз маї біу тв го Бе уві Аїа 515 145 150 535 150 ку був чаї Тк їфе Був Тлх іл Жук депо вне Ап он ТЕ Ап сЖу 165 17 15

Тує бій ТвЕ беж бОім бек УавБ бів ТуУух її Аза Ро Бек бів беж Те 155 185 195

Був Маї Ро РКО Бі ТОЖ ІМе о Аїа АкаЯа Уаї ТЕ АтТа дей рей Авроуву 155 ОО 25 ув йуБ Ті ув бо1у пу Ме пів облі ТУукК БВЖж ОС я ре сі у Гей Дяі 210 215 ЕО

ПУ о АвроТук ось Тук Ашо Меб Заї Бо Ббев аз Тук пух Тук біу ЯТУ як 30 2-5 ай

Бо Ре бує Тух Уві Тнг без бі стТвс Бей Ту да зії Сіу Тух Був ав що 25 біз Аха біп Геш Азо Тує Бег два Ме ЗіУу Авт Уві Тіе Рко сл БІТИ

БИ б 270

Іїв Сі Жвж Маї бек Був бек АВ АБ Рко два Нія пем без о йАіа бек я йо ВВ зі пев сту Тіє Ве бій Веб ПР Тує Біб беж Ууді РН Дай Узі пув 2За Расін за

Уві іа Тже 18 айви Т1і6є цу Тпго Був Пув Ііе Зіз Бе ТБ 15 Ава 3п5 Зо 315 Зо це твж ї1іе бій Бжо Тв ЇІГе Уві Ро Чаї біз був Те дай отвж ГУ 328 3390 Зх «-2105 12 «2115 323 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005 12

Мес БіУ її бек чаї Гео; дів бек БкКо Бей Лія УдьЮ ща Аза пух Тк 1 5 Іо 15 біш дл АБ Був бі біп сій уші Тф6 Твх біл РБе дя бів Аке оси 28 30

АвпоМцує пе Ехо Ав Уві СІМ Зіп о біу її 5313 Тер оцей обех Бал опе

ТУух лу уз Бек Цей Ппув АБИ Ав обіу бів СтТу Тук Бек Гец о біу Аяй 5 55 о

Авр омаії мес Бек тує Бле беш бій Уді цу Ак век Тук СІУ бій гей

Б 7о 75 55 вія Те бій рух бій Маї її Бет о Тк тТвкК о Рко без ТЕр Аїа Ту бій 85 ВО Зв пеж дво Бен біз Авп діа Тако Авевоків бро шій Тит ївеб Аа Бек Тех

КИ Ко її іш рве пух рув Твх ТуУух бек Ай ТБЕ ТЕ о ТнЕ Тпж бек Тис бій дВб ті5 15о 125

Стіу вне мех І1їе Сьу СІЯ бій тТнеЕ обі ВРУ був чаї СЕУ Те РКО Рне 130 135 за

Уві Аза біс оту пу уді Тв їж Бу Тр ОСТа ТУук АВ ОРНЄ Авгп. НЕз 145 150 У 150 тн оаво бі Тук бІ10 ТВ беє бів Зех Таї біз тує іє дів Его Зее 165 170 ть ціп бех Тіє пу оМваі Бо Бо іа ТК отТіє Аза йхшо уві Тр Аїх пев

То ї8У 150

Мей др чаї Був орув ї1е (уз пі бує Меб нія їєв Тук бек біч Ті16

Т95 а ОБ

Оіу бен Ап Був дз тує ту ТУК АвромМеЄє Маї Рего Бей УК ТУ Пух 2ї0 215 ей тую бБіУ біу ро РИ Бує Тук чаї ТК бер пі Так їби тук Авкш обі й о Ме ай під отеою їхся біп ді пів бец дав ПШЧет Ав Мав біу дет Уві ї1Фв - и їук Був зЗіп ямїа ЗіБ зем дер гук зе ав че Бу БТ ча

З ЗО 255 вко 01 іш ІТїе бій Твт Уві Бек обуд бек Ап Ава Бго Азп ОБ бен 2. 263 ред їши дія бек Шіу Бевз йіу їїж- Бое бій бег обі) Тут Ббіу беж Уа) ВББе 28 255

АвпоуУваі Грує Уві біш тує Гі Авй їЗіє уз ТІ сбув Му Ще Бій БУВ що 235 З00 тв пі Аво Пец ТЕ ттТ6 сі во ТВЕ Ті Уві Ріс Маї бі був Тв за5 БИ 313 ЗО

АБИ ТИХ Був «2105 13 «2115 310 5 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005 13

Меє Був ТВеЄ Оля дви о дни Був 010 пів сій Узі їїе Так бів Бйє деп

З Е 10 15 біц Ак бів Аза Буз Ве Рго Аве оУаії щіу Бі бу Ті6є сл ТЕЮ Пец ха що ЗУ веж 516 Ре Тук (ТУ зу о век Пец о Туз Ав Авй о зіуУ вів БіУ Тух ЗБЕ

Ме: обіу АБ Абр о Уді Мебє бек ТтТук РЕЄє Без» іч Узі Бу Аво Зеж ТУЮ со бі біб ей Ата Тіє ім о Вко біз ча) Те беж Тих ТВ Его ем Тер

БЕ то 15 Бо

Аіз спі» сів Зек Ар обеи піз Або о Аіа Тих АвроНія З3ш бій Тк опе 85 зи ЗВ дви век їТБЕ Зі вве Був Був Тк тТУг бех Авп ТИХ ТИЖ Тих Тих 5ех

Що щО05 110 твх Зі Авпобі впе Меє ті 5іу пт ста тв бів сіу був Уві сі 115 120 125

Її Рко Рає Уві Аза сІо біу Пух Уа1ї Тих ТІ бук ТЕ обі Тул Авг 139 135 ії

БНе АвпоНів Тих дви бі Тук бім ТЕ Бех біс бек Уві сіб тує Т1е 145 191 155 160

Аїа кб дет Яіп бек тів пуз Уаї РЕ Руо нія ТП ІТ Аїа Агсо Уві 165 175 175

Тв Два рем опе: йяр Уаї Ппуя Гуз Ії був СІіу Був МежЕ Ні Пеюм Тук 189 185 130 бекосім їте біу їва Аа бух АвроТук о йіу Тух Авор Межє Заї Бко бен. 195 20 о

Хай Туює був Тур бу шу БО рре Пуз Туг Уді Тк Пеб БбіУу ТЕ Бенц е1о -15 гей

Тут Ашр ців З1у Ту Буш бів Аза бів рез; Ав Тух бех АвпоМеє бі 2» кет 238 фай

АвпоМаї Те во ств Зіл те бю Те Маї бек Буя Бек оАвте Аді ВГ жа. 25 а

Вей оМів Бе: Піх Аїта баб Сіу бен обіу Бів Ра бій дек біб тує Шіу 253 265 27 как Маї ВБе АБпоУзЗі Бу Маї бій ТуЄ 18 Ап тіє ПУв Тв Був пу 215 28о 285 їїв шій Був Твх обід Дей Бей татів бі бо Так ІТ Уві Ртє Мді туби студе: зла

АК 255 Зоо бів БВує Таж Авап Тв дув 305 310 «2105 14

«2115 257 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «400» 14

Мек Бек Тує ЕБе йцеч сій Чаї Ппув Авп Бек тує Бу бій Неш Аїа їТе 1 5 о 15 біз Бко бів Уві Ге бех ТТН ТВІ Бо Гей Ткродів 01у біб Зех Ар 8 25 зи

Бен осіш вепоА1ів Твсе АврвоНів сі бів ТВ Бео дввоБехє Твк біб бе 35 40 45

Туз був Тйє Тук бек дяп Тит Тах ТвВг ТНя беж ТЕ бій Авй ББу рне 5О 55 бо

Мет їІтїе бу бів сі) Тв обТш біу Був Чаї б1у тів во Ра уві Аїя 70 75 во 5 сій Біу буя Уаї Тк її8 був ТВПРОбЛІ тут Авц о рне АвпонІВ Так одЕВ 85 за з б5іу Тук пі тв бек бій бех уві бі. тує 116 дДіз Рхо Бех біл ве іп ці 119 їїе був Уві Рко Рус ків ТБ Із Азів Аку Ма3 ТВ АТ бер Гей Аве 115 ІН 125

Хбаї рбуз Був ІІ Був Сіу бух Меє Пів Бе: Туг бву біш Ї1їе біш Бех 155 ІЗ5 155 бзпобув Авр Тук б1у Тук Азр Меї Уді Рус йо Ууаї Тук Пуз Тук Біу 145 150 155 1505 бі Вко РБе Був Тук уд! Так Кеш біу Так іван Тух двр 010 біу Тук 165 170 175 зув іп Аїв бій бен Аве Ту бегоАзв Мет 519 Ази Уві Ге кб бів 155 185 т8б ст 16 51: Тих Уді Бег Був Бек дип Ав БО Ай Нів ес бео Від бо

155 200 505

Шех БіУ Пен СТУ 11е Реве біз бех біч тТук Бу век Уві Роє двпочУді аа ше вай ув УВІ піч тую Ії дви ї16 пу ТВх був був тів бів гу ТВ ОСІ 225 ЗО 3 а два їжи ТВ тіє б3імн вхо Тк їз Уаї то Уаї біб бує по дви Тпе

Ай 25 25

ГУ

«210515 «2115 341 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005 15

Мес дк ій Буг Авр оре АвпоГув бує уаї Тк пу Аза Уа) Бер пек 1 5 15 15

Мек т1е Уаї йіу Ге бБвет Уві Пес Аіа бек РЕ Ге Аїв чаї Аза Аха 2 25 30

Був їнг бій два о Авлал обу 5із 016 піп оУаї їТїе Тк Віж ве дай 1

За 40 45 вхо о ши Бу гра рко вв УВІ сту сів Му Те оЇп Ткр о їж ех 5 За що

Сів ве Тує птіу Ммув Зак Гей був деп о дяй ОКУ піч БІУ Ту Бех Гев бе т Т5 ВО і бів две уаї Ме Акоа Ту ББе Гей біо Узі був дви бек Тух бію

ЩЕ т

Сів Без вра Мет озіц Бко бів У«і ТЗе дев ЖНю Тахо Бко цей ТЕр діа и 105 1Т19 сту ів дет Ав Без біб Ап ові Тк о Аво Вів Сім біб ТБ Цепо Авт їг5 120 ї2 8.

Бак оТню СТ Бе Був Був Таг ТуУк беб йвп ТВХ ТБ тв ТЯ 5ет Те 5 135 140

Зі: дп піу Ре МеЖ ї1є бі біз 15 ТВк біб сіу був Уві БІУу 11 145 1 158 159

Рга бле чаї Аза біз шіу Бу Мні Твх Тіє Бу ТКЖ біб Тух дяповне

Її655 Мо 175

АвпонНів ТЕ Авап обі Ту озій ТВ Бех біб беж Маї шьш тТук Ті АтТа

НО ї55 ЇїЗО

Рго Бек ІБ Бек І16 Пув Уаї РКО Рго нів Три сіє віз ДКЗ Ула ТЕ 195 2па 205

Ма їм цеб Авроуазі пуз був ЇЇе Гує Сіу пуз Меб Нів Без Тук цех 510 28 о бів ге у во Ди Був с Аво ту біу ЛУК Авр Меб Уві Рко Пей Узі та 230 аа 245

Тук Мув ТУує біу Сіу рхе ВНе Був Тух Маї Тк їм Су ТЕ ПеО тТуУк 243 За 255 дЕвояі зі тує Був ЗІіп оАів бій Мед ар оТує Ре Ав о Меб су Ав 260 285 270 чаї Ттїєе ко біз 51: їі сі ТБ Уді Бек був Зех Ач АвпорКо Ав

ЕТ «ВО га

Кі їв ГесоАін бек бі Уві Ту їіе Ре бйліи бек Бі тТУкК сіу бек ча1і Бпе Дей Укі Був Уві СьЬ0 Тух її Ав» ТТ Авзп оте Був бух її 05 31 ЗІБ 328 із був тТвт о сп1Я Ав Бем ТтВк о їїе пі Ро ТБт Ті уаї Ро Уві Гув 325 з50 335 бій ТЕ дай лпх був тка їх І 349 «2105 16 «2115 325 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005 16

Мек тіє ві бі» її БеБ Маї Ппей Віа Бек Рто Ге Аза Узі Аїа діа і З о 15 буз Ту обіч Ав о дзпобув біз біб бій Уві 118 Так Вів рРпе Авт бій 28 25 30

Ах 1 Аяа гпув ЗВ Бко Авроуві біу бів 5ТУу Ії ЗІЗ ТКробез беж

З 35 4 бЗіп о вне тТуУук сіу Му Зах Бей муз Ав АБП бу бій с офу тут бек Гей о 5 БО

Сі бБіп Авооуаі Меб Ака Тук Бле Бей бра Уа Був Авопобет тую оту а 7 75 во ій йо АвВа Меб 15 Бо ств Уаїі їїе Бе ТЕ Тпх ово пе) Тер Аїа 85 зо а5 сіу бій бек Ав ойео бій Ап Аза Тех Аво Вів біз біб Тс ей Аеп 1по 195 110

ЗЕ Тс Бі) вБпе був Бу Тк Тук йек Аза Тс тах ТО ТБЕг Бек Так тї5 | та та

Зі вапосіу Бе Меї тів біу бій Біб ТБ 5І1ч Б1Уу бувоуав озіу Тв

Її 35 іо то Ва тат Аза пі 51Уу пу Уві Тв ттїе ев ТВ Зі ТУух ва ВЕ 155 159 ї55 їв двап ові Тк одва бі тує Бі Твк бе біз вк Уаї СІ Тує ТІіе дід 165 ТТ 175 рЕЗ ВВЕ бів бек 1 пу Узі Руб ВЕБ нів ТВвх Те Аза Ажа Уа те

ЇВ 195 ї95

Ада бер пбиа БВ Уві цу Пув 16 ув бБ1У Був МеЄ нія рез Тук Зх 155 ад В сі її гу Пец; Ай Був Аво ТУуї 51» Тук Ар о Мет Уа то бе; Ууді 210 215 ей

Тух пух Ту б1у піу Рго Бе бує Тк Ууаі Те бец біу Трек Бей тур 23 2 й а

АввоБіч біУу Тук Був о бів Аба бів рец АвротТухю Ре вв о Меф біу дДед баії Ті Рко Сі 5То її біз ТБ оУкі бек був Бек Ав авО го Ав 259 255 й

Ні ей цей Ат дек біу Уві 51У її Бе ЗВ» Зевк біб Тук С1Уу Бех 315 2788 285 чтУаї Бвме Азйп Ууаї Ду Чаї бро Ту ті Авп оті Авп ТВ пу Пув 18 «ЗО 283 зо

Сіш Пуз Тйк біз вйвп Бей ТВ І1іе бі: Бгто ТВ Це уві хо УВГ Був

ЗБ Зі 315 БРАВ, сі тик Авп ТНЖ бує

За «210517 «2115 315 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005 17

Ме бею Аза Мі АТа іа був тТБЕ обі дв» о Ази Був ім бій сІіпроуді ін ів) 18 15 їїє Тпе Ні Ре дав біз де б93д Бва пу Бе Рко Ашро Уві пі біп 2О 25 ЗО біУу Ті піп оТтТго Пецш дек бів Ре Тут бту Був бек Го Був ву деп

ЗУ БІ зіУ тТух бек во бу сіл бво Уві Меб АхЯ Тух Бле Тена и

ЩЕ 55 во чаї су Ава Ват ТУЮ БЕ бів Тез Аза Ме бій бо пі Уяі Їїів Бек во то. ту що

Тв ЛЬх ВгОо пез Тр оАтіа сіу бів БЕК йвроцеи ЗО дво Аіа ТНт дар

Б за з5

Нів БЗБо осбіп тТйх ей бе овек ТвВк бів Ре Був був ТЕ ТуУує Беж Ави ї05 155 ї1о

ТВЕ Тне Тих Твж дек ТБ обі; Аво біу ре Межє тів піу біп ів тнЕ іш біу був узі бі» 116 Рсо пе уві Ата бі біу був о Уяі ТВ Те 130 155 140.

Був твж бін тує Аят бе дян Ніа Тв ДяпосСіу Тує Біо Тк Бес Сг. 145 155 155 БИ бвх Уві іс Тух Т1е Дів о рко Шет біл обек 112 був Узі Рео Ре нів 1655 170 175

Твк отіє Аїз Аг Уаї Тв Аів пем Бей Авромаї Був пу Т1іє Кух БЕуУ що За 190

Пув Меї Нія ей Тує бек піз бі біу дей дво пу АвроТує Ту Тук 195 290 205

АвроМеє Уві Ро ба Уаї Ту був Тук Б1Уу 01ТуУ го Рв був Ту Уві 10 Ії 0

Так тей біу Тбт Вей тує Дер шій біу Тук Був біз дій біп'оіїєй дво йг5 30 ий 24

Ту ВВе дво Меї о біу Авй Уві її Рко біз біб зв бій тре уа1ї пек 248 ву ВЕ

Муз Бех Авп одяп РЕО Авип о Нів бес Пед Аїа пет бІту Узі біу Т1їе Ре 260 255 27 бій бег бі) Туг біу Беж Уді рве Аяп Уд)і Гуз Уві бій Тук їТе Ап та во 5

Її Вп Трек о Ббуз Був оїїє біч Був Тк бі Авпоївцч ТВ осів бід обро

Тих Іїє аг о рко Узі Ппуз бій тТвЕ дяв Те був

ЗОВ Зо 35 «2105 18 «2115 257 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005 18

Мех дк Тує Ре Гец Сів Увю Був Авп о бек Тугк біу біп уви Аїа Мех і 5 10 15 вже бів Уві їіі1їє Чек Тпє ТпжЕ оБко Мн) Тїхв Аза БіУ іа йцег дяр 2 5 о ви біз Ап діа їпК дю Нів ій біл о Твх Цей лави бек Тк обі Бе зв чо 45 ув був ТІ Тук вас АБ Тс ТнжЖ ТвЕ ТП Бак о Тйх біб аАЗп бу РНа 5 ва

Мас тіе бфу бій бів Тс бів біу був Узі біУ Тіве Рус пе Уві Аза 65 73 їх 89 5313 Єзїу Гув уві Тв їі Бу Ти» зіб; ТУк Двоорне Аа Нів Тк Авт 5 за З бу Тух зі ТпЖж бек зі) Бех УМаї ЗБ. Тук Щ16є Ата бо беж Стій Бек хо яна ен: її мує Уаї Рко ріс Нів ТБу Хі Аза Акб Уві ТЕ Ала без їхні Ар 115 170 1855 чаї Був був Ті Ку сСьу Бу Меб Ні Пец тТук бах бів Ті бі Пбви

Ва е ї38 140 двй пух ЗвротТУукК пу тТУкК о В5Зв Ме тав Ре Бец Уві тує Муз ТуЖ гу 145 Іо 155 Б ту Еге вве Ту Тук Уаї ТИЖ цер шпЬУу Тахо Чей ТУЮЄ АввозЗіч бу ТУ 165 ї17о У

Ппув зіп о Аїз біп їй Авзо о Тує БНе Ази Мес бу депо Уві Те ек бі їв 185 зе) сли їіє 510 ТБ Мал Бех КБув бек Ази Ап обхо Ай Ніа їй без оАїв

Ес 200 вай так осіу Уд! сім Ті БРВ о с3ц бек бій Тек шШку бає Маї РВе Ай Уа 21 -5 220 їув чаї вів Тут Ше дви Тіз оАва Тв був уз Ті БТо Бу тн о ви 230 235 240

Авяшть сей ТВк о 1тТіє бій бкб5 Тато тів таії ро Уві БУ БІ Тв Ав) те

З 5 255

Був «2105 19 5 «2115 242 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005» 19 й сет ск - . р к. У рокя- м щ Ку ит х. ськ ен зт

Меї пій вко Бі Уаї Її6Є Єву Тк так Во бе) ТуроАза йіу біпошеє 1 5 10 З вою ся я іа зе ах Іі фія ха роя 5 з т

Авд Без Фо Авп Ара Тв Аво Нів бій біп ТВ Без Аво Бех Те 51 й я - ле а 25 30

Ух ї в Є пок стю т й А кю си ПТ ськ От У

Біе Був Буг ТЬж Тух Зег два ТНЕ тп ТБ ТвЕ Бек Трх Би Ав 5І1У з жк 45 35 40 45

РИ МЕ її б1у біз ПТО твж сі сі був баї біу Ії8е ркО Рпє Уві ій бін б1у Був Уаї ТБЖж лів бух тп обі) тТук дап Ро Ав ній ТЕЖ то 5 о

З ук, 5 і: а сет косу ї З пи о наше Ше т х д чеку нки КТ

Авт обіу Тур бій Тх бе облм Бек чаї бо тую Ті Аіа Ркоовех іл

ВЕ аа 5

ЯШеж Тіє Був Уші Бко Рко чів ТБ ої1їе Аіз Ак Уді ТК Аїд Тим Пед що 195 То

Ар о Уаї бух був її Був БіуУ Пух Меє Ніз Бей Ту бЗег СІ її 51Уу

Й рух по зт 115 їхо їх5 їй Ав о Муз дер оту пау Тук Аво Меб Узі Бго без чаї Тух Му о тук о їЗ5 ї52 зі біУу ро рпе пух тує Уві їв ви біу ТЕ Сей тує Аво бій Бу 150 ї155 їво тТУук був піп Аа бій пев дер тує РОБ Ав о Мес сту АБ Уа їде с Вко ї65 17 475

Ба и Се зо тв Маї бек Був вк Аг Дех БЕЗ Ав о нія без соуевй 15о 185 т90 аіа зЗшх бі Уві піт ТТ Бе біо бетє віз Тук піУ Бек Уві Вле дай 195 НВ) 205 ві Був чаї саги Тк 116 Авпої1е Ап оТвЕ Був Гу Ті піз Бу тег яка г пек: а а ж А ІЗ й М . ля здо дк и о Яр -о ра су ува - ші отак дах пів дя ва Тв їі пів» Ро Тв Її Уаї Рг Уяі Був ЗапоОтТИЕ Авп зл о Р що 225 я

ТЕ МуВ.

-2105» 20 «2115 343 «212» БІЛОК «213» Васіїйнзв ІПигіпдієпвів «400» 20

Меб Агу бій пу двр Ме Аво Був Був їіїє тво Буз Аіїа Аза Без бах - х ря ї 5 ї З) з

Меб їі Мей 01» Ії Щек Ма) Ісц бек бек Бко їжа АЛіа Уа1 Аїв діа ра 25 З

Був ТВЕ біз деп АБп був Чіч б) Віз Ууді ї16є тТас бів Бе дз бій 35 40 45 дура а Ап Гу Бе Бо Аврозаї щу Шів бі 16 біл. Тер їй Бек 5 це по сів оВце тує бі Був заг бен о цув Авий дви осьу біо зі ту ес Бе

КБ 79 75 во піу ім дво Узі Ме Бей Тук Ріє Кеш сіб Майї ув Аве йеготую бі у | неТе а пап о їеО Аза Мет сі Бко біп Уві ї16 Бек Тйх тТпх Рко Гео сткр о дАІа 100: 05 11о пту бій бек А їз біч АБи Аїа с Аве КівБ ТЗ Ми тп Бей АБО

ІЗ ї20 23 вах тих сій Бе цув Мо тих Тук беж АБи отих тп ТЕ ТЕ Бах тв

Кия 140 дім оАвп сбіу Ве Мебє 116 бІіУ бів З1ій тн біз сіу пуб узі біУу ів 145 Та 455 ї65О

Ркео Рбе о Уаї Аза піс біу бух Маї Тве бів Був ТВ бів Тує Авповра веб 176 175 дз нів тик ден біу Тує бій ТБ бек бій бек Уві бів Тух Ге д18

Іо і85 155 то бек бів Бек їїе Був Уві Вхо Рко Нія ТВ їТіє Ліз дк Уві то ї95 га 05

Ага ре ев АввоМві Бу Був 116 Був буу Був Мас Нів Те) тую цех 218 пане: го бій її б1у це) оАВвпб бу вер Ту біу Тук Явр оМеє Уаї рко Бази Уві ее 235 2 24

ТУ Був Тук біу Ту Рхо Бпсе Буз Тук Уаї Типи Пемл б1іу ТЕ бец тую 245 5 258

Аве обіч пі Жук був біп діа біп Те; одер оТуг Бе Аве Меб біу Ав зва КО ато бавлвв шк Січ ма ті пІіб ту Уа шек гує 5 дай дявп Ве АВ та жк вро віч -и зе ек бпх чаї ек ЖЕ ше ВВП де КЕО В мае ВО вх нів Бес; їва Афа Зек бі Уаї піу їТ16 РБе бій дес Сл тує сьу бег кеВ 255 Зо

Уді Ре Ди Ууаї пуя чаї біч Ту Ше Ап оІт1Ме Ав ТйКЕ Бе Гув ІїТе

ЗЕ Зі 315 32

Січ Був тТве ді Ат ви ТВ ї1е Біб вхо Те Тіт Уві Веб ма Був йо З 335 буп Ту деп ТУ Два Те пух 34 «-2105 21 «2115 338 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «4005» 21

Мес дер Був Був Т1іє ТВк пуб АТ Аїа пед Бек Меб їівз Ме слу її 1 5 18 ІБ вес зві пе; о бег бек бко еп о Аїа Уваї вів Аїа був Тк сі дев Ав 29 в Зо

Був сво бів Нав Уа тіж Тк бій ие Авп сій Аву Сі. АБ цув вВе

35 40 43 вто двр уві бу БІБ біу 114 бій Ткробем Зек сій Ре тТух стр Був 50 55 що чек цеш цу дао ДЕЙ оСіу біз б1іУу бує Бех без біу Сіп Аво Укі МЕ

БВ та 75 ви пет тую Бе Бер бін Уві Був Ап обек Тухобіу біп оїев Аба Мей 51 за 25

Ро біб Уаї її беж тв ТВх Яжо беб Тер Аїв сту іп о5еє Авр зей

М їо5 1та

Сів Авий Ата ТвВу дб НІЖ січ бій тн Пес Ав бек ТП обІіЗ ве був 129 125

Буз Тнх Тех Бест два Те тк о ТвЕж Твж бех ТНкЕ 5 Аби б1у РНе Має 135 138 180

Іїв біу біп біб Те 16 сіу був Уві бТ1у 11 Рсо Рре Уві Аза 0 145 159 355 169 бу пу уві Тпх ІїБГе ПЦув ТагосСіс Тук ойзо Бе Ап НЕ Тит Авпоску

Т165 175 175

ТУ сао Тпк бек 5 Зес Ма1ї ств ТУук віз Афа реко беї біп обех Тів то: івх 150

Ту уві Вко Руб Ньв ТВі Тіє Аза дк Уа ТНЕ діа цеи ем дароуві 155 200 208 ув цуз тЛе був біу був Меб Ні Пеп оТух Бек бій їі 01у їес дав 250 215 ий ув во Тук пі1у Тує АБО оМеб заї Еко цей узі Тук Гуз Тук БІ бу ви ЗО а 249

Бутко рве Гув о тух Уаї ЖПж оТні ЗІУ ТВ рез ТУуК двр біа бтТу Бук Мув

ТА | 25 з5В

СІя Аів бів Бей Ар о Тух РНе о Аві Мей Су АвпоУуаї ї1і8е Рус ств пи ше гей о ман у хр І-І. «ему Мч т; нт ш- хх - ст Кн тях їі Бій Тнж Уві бек Гу Бех Ап ой Рг Аза нів ви цео діа бе вів 2 285 бі хаї1 сСіу Їїє Реє біц чес бів Туг бі бек Увї Бе Аа УЗІ Бу 290 295 0

Ууаї бі Тур Ті Аяп о Т1є Авп ТВЕ Пув Був ІТє бів бух тТпх бій Авп 305 з1б 315 зЗао

Без ТВ Іїе сії) ВУЄ ТЕ ї16 Уві Рко Малі цув біт так о Аяп Тл Ав 325 330 433

ТЕ Гу «2105 22 «2115 327 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005» 22

Месб їіе Ме б1іу її Ваг о Уаї ей Бех бек Бгто Цей Аа Уаї дів діє ї 5 хо 15

Був їТвк біз Авл Ав їм о сій бів ' нів баї КТ ТБ Сів ББе АБ ол о. ре зо ду бій Авпобує Рпе Рко Ар оМаї бі» бій Зіу Те буп Тр оцви Бек

Ба «о 45 бів вМе Ту БІУ був бек рей був да дви б1у Біб Біу Тує чех ев

Зо 5 50 сі сів Ар уві Ме дек ТУє Ре Бей біо Уяо пу дво бас тТук о бію 5 то В по біп рей діа Мебє біз Рко іп Мах 36 бек тн Тк рто Беб Тер Аза й 29 З5 віУ бів бек Авроцем Зіс Ав Аза ТЕ Азро нія Бо пів ТБу їй Ав 150 ВИ о

Бех тпж йілорне уз Був ТВх Тук веб Ава о тТве тТнЕ ТВ твкК оВех ТНЕ

Т1х 1250 125 щ-а АвпобіуУ Бе Мас 112 ббу щіл с1із ТБ Зі біуУу Був Уві йпіУу ТА3в нка; тзЕ а ї30 135 140

Зко Бе удаі діа Щіза біу Туз уві ТЕ тіє був ТЕ ба тТуК АвпорНе

АвпоНів Твк деп обі Ту бів тн бек бій бек туш) бій тую тів Аха 185 1 175

Рута в бів бек її мує уаї ро РК Вів Те 119 АТа дко Уві ТЕ

ТІК 185. 190 два пес ів Авроуаі Сув Буз Ті Су 5іУ Гук Мек Нів дей Тук бах 155 200 ОО

Чі тів бі бев Ав Був АзротТук бІУу Тук АвроМеко уві Бкб цей Уві 2 215 хо

ТУуж Був ТУукК сіу ШУ Бкб ре Бух Тук Маф Твж бен ску Тахо Бей Тук

Тих | аа дай 240 дюр обід пТу ТУх цуз Стп о Аїіа бій; бео Аве тує Ре Веб Ме біу дви х ї ї З . ії я їх Не ї 245 230 Ва

Уві Ті Бо біз бів тТе брс ТигоУві бек бе шек АБ АбЗпоБкоО вет 2650 265 ТО

Ні їао бен о Аів Зав сві Заї бі (Пе ре бі бек біо тує бБ1у Бе ай Б З

Уа. спе АвопоУаї Був Уаї 5іЧп лук їз Аа Лі Ал Так пу цувк 118

ЗО 295 Зоо біз був ТлкЕ Сі Аа цев ТВЕ о їіе бі» Его Трх ї112 Уа) Роз Уві Гуз

Зх 319 315 За біз Тк два ТЕ два Тв Був зв «2105 23 «2115 325 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «400» 23

Меї б3уУ їі бек Уві еп обер Бек Рео Гей АрБТа Уві Аза діа гу Тлг зі АвооАвВо був зла сів Ні Уяї 11 Твх біб РБЄ два біт Ава 01 29 25 За дзп обу Ба Рго азв Уві біу бів ойіу Їїе Пі Тер о бем бек бій Бле 35 45 де од: чи же й ях зх и

Тух ці Був бег їеч Муз дяв Авпобіу піч біу Жує ек їм ТУ О)8 як. -к ій нят а За ба

Ж ц . з - и ра - Жид Б: яко Кк о г 1 Т.І

АвБ оУаї Меб бер Тук вде їв біз Ущі Був деп осеє Тук зіу бів шви хо -ч Е ще ге: о 75 во , г то мч Ти х клин ж таз Пи ПУТ я я дів Меї Зі Рго бій Уа1їі Її Бек ТБх ТнНх обо Сец Тео віза бі біп що 5 : «7 - я ся с ска «з я жо мчч яшове т зе бЗех Азр Без бід Авв о Аза Те Аз Ньв бі би ТБе Гей Авт Бетг ЖЕ

ОО 155 1

ЕІ ж й Н й зу ст точи х зх - кт - «учи ож - -х по деут піп бе уз ув ТВ Тук дах Аза о ТВЕ ТвгоТвВу ТНК оЗех ТВ ба ДеЕп 115 1275 185 с: Я и й і вт Й у з 4 ре з хх кни, т" біУу Рпе Має Ііїе ої біз біз Тв біц біу був Уаї сьу ТІ рто Рре 135 135 15 ак Ата біз бію був Маї ТБ о їїє Му ТВр обіч Тукодвп Бе АБ нів тво 150 155 158

ТЕ о Аво бБіу Ттук Бін Та ех біз век Уа сти тую їіє Аза оре Бе 165 ІТФ 175

Сіпозек (Та дув ай Бжо Бо сНія Тс ї1ї6 Аїд Ас Уві ТЕ Аза оцей

Іо ІЗ топ

Без Авв о Уві буз уз Ге пух біу Був Ме Був їй Тук Зах бів тів 195 жо й

Оіу ел Авп Буз АвроїТую БіУ Тут Авр Мер ув) Вуо їн УМа| тек Був хуя жу я хуя

А 215 о

Тук спі Біу Вко Бе Був тую Маї Твх Гез біу Твпж ої тує дар піц їв 240

Сіу Тук був біт Аїз бій іей Аво Ту Бе сАвпоМес біу ДяпоУві (іє

У Оту ; юогу еВ йо са ко 10 Із ІБ бі тп Уч Бех цув век дви Ав Рує Ав нія Пед 25 ев 270 їжб діа дер о сіу Уаї біу т1іє Рбаєе біо» бег січ Тук біу Бе ві пе 215 ВО 85. вкп уві був Уаї біз Тук ї1е Авпоїзе Авп о ТВгогув був 116 5 був аа 295 Зо твнк бів дз Бей тяж їі 0315 бко Тв обзе туаї Бко Уві Був віп отТКуе

ЗОВ аво 315 ЗО ази Таж део Тпж пух

З я «2105» 24 «2115 259 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «400» 24

Мес дес Тук Бе Пец сво Уві ГБух Ази дек Тух біу біп Бей Аіа Мес 1 5 10 15 база Во сій Уаї Ттє Бек Таж Таж Рко їеч То Ма БіУу бів бек Ар 29 о ЗО їви бі АВ Атба ТБЕ АБО оНів зі бій ТК обей Ал ек тах бій рве 49 45

Пух БУ ТИХ Тук Бех Ап ТвкотТвЕК Тв твс дек Тс Зі вп ОВУ Ре 5 | Бе 50

Ме л1іе 01у бій сів Тс осі біУу буя узі йіу її ркз Бне Уві дід 65 то 5 в піч сіу Був Уві Ту Ііє Був ТНх біс Тук Ав Бе АвиоМів ТК дяв 85 50 за

Сіу Тух ба Тек дек біс Бех Уві сво Тут ТВ Аза Рто Вес пли Бак 100 105 іо

Ії був уаї реє Ро Ні Тлх 11е АТв Ака Уві Тк Аба па цем Авб

І5 12 їй чаї ГСжя Бувотіе Був Б1у Куз Мет пзя цей стук Бет па її ту Бей 135 138 145

Ази озув АвротТує БІ1У Тух АвроМеє Маї Ро Без уві Тує руд тТжЕ гу ся і155 155 1 сіу Рео Рбе Був Тук Уві Тс обец о біу Тв рей тук дею спі біу тує цу сій діа сійп ей двр о тує рРне Авп Меб Сту Авп о уві П1є Рге біо

ТО і85 їі дій діє біб тв Уві Яєег ру бас АввоАвп Рго Ап Нів без обез Аїв 155 29 що

Зег біу Уаї с01устіє Ріє біс бек біз тує Оїу бек Уа РИ Аяп о Уаї 810 215 255

Був маї «1 Тук 18 деп ост Авв о Тв ПУ уз ТІ БМ бу тп опій ва5 230 235 Ка)

Авб о пацй отнеЕ їз спи РКО тиж тів уві Ре Уаї Був ів ТМ Ада ОотТНЕ

АБ З! еп дей Так ОоцЦУвВ «2105 25 «2115 244 «212» БІЛОК «213» ВасіПйиз5 (пигіпдієпвів «4005» 25

Меєс бій Бре бів Уаї І1їе Бек ТНЕ ТВх Ркз їц Тер о Авба біу бігобех 1 5 ке ї5 4вробен осіб Ав» Ага ТЕ Ав Ні бів бій ТВробед) двт бек Тобі о В ЗО вБе уз бух ТК Тук Бех Ави Тпр отих ТВ тн бек ТВж бів Дзвоблу чо Ще вна соМеє тт щі бів два тв піл бі їли Мді щі Її ке ке Уді пе оМеє же: Срру а о щ зі ОУу цу Уа ЗМУу ГІЇ БгОо Бе Уді 5О 55 6.

Мід біс ву ру УІ1 ТЕ ів Пув ТВЕ бій тує Дав оре дви Він ТВ 5 та 7 во

Авпошіу Тук о бім ТВе бу біб бек уві 515 тух Те дів веб бек одій 85 по зе бек їі цув Уві бхо ко Ні тих 116 Атїа Аго Чаї їТве вів Гей ви 100. 105 її дер уві бух був їі уз б1уУу був МебЄ Ніз Без Тук Зек бій ів біу 115 ї2а 1575

Бач дао буз АвроТук біу Тук бр Меє Уаї Рхб Бе УТ Тук Бу Ту 150 135 340 сіу біу ко ЕКе Гуз Тух уаї тве бец сту Тк їеш Тух Авробіш оту 145 156 158 160 тТух о пух піп Дів іп Бе дзроТуєк ББе АзроМеї біу АвпоУві їів Рко 155 170 ії75 піж бім т1іє біб ТвЕ о Маї дет Був беж Авп АБп о рко Ана Нів їм Пез 150 Т85 ЗО

Аїз Зек БіУу УВБ Бі5 ІтТе ве біо беж біз тую біУу Звк Уаї РК Авв таб 250 205

Уах пу уві ві туш Тіїе о Ава Їїє Азпотах БУВ Зуб бів пів Бу тре іо о хи са дет зей Тк отїіе бішп РКО ТВжх ІЗ Узі Бгто Уві Бу бід ТЕ Ап й 3 235 ВАД тТпж АБО Тк о Гув «-2105» 26 «2115 312 «212» БІЛОК «213» Васійнв5 ІПигіпдієпвів «400» 26

Меб Гу Твх о б5іа два ВЕп їв бі: бій Нів Маі Ті ТВкК біт Ре Авл 1 5 10 15 сага 10 Ава Пуг Ре Рко йвр уві біу бів СТу Ше б15 Тр Бер о 25 36

Бек бій пе тую о біу Був Бек йеч Був Ап Аза б1у 1 С1у Ту бек

Зк 40 45 цер ці сів АБроуУві Мех бет ТУук РНБО їз сто уаї був Авпобеє Тут еВ са во реж ся. жк - є г. я х У яд т Фікрає дужче Товар Ля сіу біп ївеу Аза Меї бів ро бів Уаї т1іе Бек ТЕ ТрЕ га їец ІВ 55 7 15 що

Аїа біу бій бах Азробей біз АБО Аїа ТИЄ Азо о нів біз біп Тк о цев їх; за Зо дай Чек ТЕЖ біз РБе фув був Трж о Тує беж Авип ТИЖ ТВЕ ТИХ Тбгобек 196 ї25 ТЕ

В ще ща дріт ян теж я яеря ситу мк юри стро

Тас бів А5а піу Рре Меє їїе БіУ сів Св ЖИих пів біу був УВЕ ЗУ хх ж лад ї2о 123

Іі вхо рРйе Уві Аїа сіл бі Пув Уал ТБЕ їі Був ТЕ Сл тую Ай

ВЗ 135 149 ве Авп Нів Таж Ап осьу Тухє СТО ТвЖ Бех ім Бек Уві бів Ту Лів 145 ав 155 150 вра жо чек Сіп пет її Бу Уаї Рго бКОо Ні ТП Те Аза Ага Уві 155 ою 175

ТнНЕ Аїз цезч Геб АвроУлі Бу Буш 116 Пуї бі Був Ме нів Гей тТук 150 155 190

Бек біс їі пі Бей Авп о був АвротТук піу Тує Аве Меб удії рко Тез

ЗУ 209 а

Чаї Тук Пух ТУух О1У Сі» Еко Рів Був Тук Уві тре Тем облу ТВж о їев 1 215 2

Тук др б10 Сіу Тре був бів Аіз бій без АвроТує рРпє дз Ме СІ ге 239 235 гай

Ап очах ї3зле БРко бій бій їле 51 ТВ о У«і бек о їм5 бер Авп деп овБКо 245 285 55 деп Ні бе без Аза бек БІіу Уаі біу тіє Ре бі бек Б1и Тк бТУу гай 255. ято

Чек Уаїх Бне АвпоУаб пуз Уаї бів Тух їіє Авпоїїє Аяп о ТВу Був Був т 28 285

Тіє Ба мух ТИХ біц Ай бец Тахо Ті бі; го тТвкоїіе а) Бко Уві 8 283 зо0о

Був піп Вс Ав Таж Два ТВЕ Був я 319 «2105» 27 «21154 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Пептид, націлений на ендоплазматичний ретикулум «400» 27

ПУБ о Авро Бій Бе

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, що має пестицидну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної під ЗЕО ІЮ МО:3; Юр) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність під будь-яким ЗЕО ІЮ МО:15-19; с) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким 5ЕО ІЮ МО:15-

19.

2. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, де зазначена нуклеотидна послідовність є синтетичною послідовністю, яка була сконструйована для експресії у рослині.

З. Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1, де зазначена нуклеотидна послідовність функціонально пов'язана з промотором, здатним керувати експресією зазначеної нуклеотидної послідовності у клітині рослини.

4. Вектор, що містить молекулу рекомбінантної нуклеїнової кислоти за п. 1.

5. Вектор за п. 4, що додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний поліпептид. Зо 6. Клітина-хазяїн, що містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту за п. 1.

1. Клітина-хазяїн за п. 6, яка є бактеріальною клітиною-хазяїна.

8. Клітина-хазяїн за п. 6, яка є клітиною рослини.

9. Трансгенна рослина, що містить клітину-хазяїна за п. 8.

10. Трансгенна рослина за п. 9, де зазначена рослина вибрана з групи, яка складається з маїсу, сорго, пшениці, капусти, соняшника, томата, хрестоцвітих, різновидів перцю, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряка, цукрової тростини, тютюну, ячменю та олійного ріпаку.

11. Трансгенна насінина, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.

12. Рекомбінантний поліпептид з пестицидною активністю, вибраний з групи, що складається з: а) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність під будь-яким ЗЕО ІЮ МО:15-19; та Юр) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким ЗЕО ІЮ МО:15-19.

13. Поліпептид за п. 12, що додатково містить гетерологічні амінокислотні послідовності.

14. Композиція, що містить поліпептид за п. 12.

15. Композиція за п. 14, де зазначена композиція вибрана з групи, яка складається з порошку, дусту, пелети, гранули, спрею, емульсії, колоїду та розчину.

16. Композиція за п. 14, де зазначена композиція отримана за допомогою сушіння, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, осадження або концентрування культури бактеріальних клітин.

17. Композиція за п. 14, що містить від приблизно 1 95 до приблизно 99 95 за масою зазначеного поліпептиду.

18. Спосіб контролю популяції лускокрилого, напівтвердокрилого, твердокрилого шкідника, нематоди-шкідника або двокрилого шкідника, що включає приведення зазначеної популяції у контакт з пестицидно-ефективною кількістю поліпептиду за п. 12.

19. Спосіб знищення лускокрилого, напівтвердокрилого, твердокрилого шкідника, нематоди- шкідника або двокрилого шкідника, що включає приведення зазначеного шкідника у контакт з пестицидно-ефективною кількістю поліпептиду за п. 12 або її згодовування зазначеному шкідникові.

20. Спосіб одержання поліпептиду з пестицидною активністю, що включає культивування клітини-хазяїна за п.

6 в умовах, за яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид.

21. Рослина або клітина рослини зі стабільно вбудованою в її геном ДНК-конструкцією, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок з пестицидною активністю, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної під 5ЕО ІЮ МО:3; БЮ) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність під будь-яким ЗЕО ІЮ МО:15-19; та с) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким 5ЕО ІЮ МО:15-

19.

22. Спосіб захисту рослини від шкідника, який включає експресію в рослині або її клітині нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний поліпептид, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної під ЗЕО ІЮ МО:3; БЮ) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність під будь-яким ЗЕО ІЮ МО:15-19; та с) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким 5ЕО ІЮ МО:15-

19.

23. Спосіб за п. 22, де зазначена рослина продукує пестицидний поліпептид, який має пестицидну активність щодо лускокрилого, напівтвердокрилого, твердокрилого шкідника, нематоди-шкідника або двокрилого шкідника.

24. Спосіб підвищення врожайності рослини, що включає вирощування у полі рослини або її насінини зі стабільно вбудованою у її геном ДНК-конструкцією, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок із пестицидною активністю, де зазначена нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з: а) нуклеотидної послідовності, викладеної під ЗЕО ІЮ МО:3; Юр) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність під будь-яким ЗЕО ІЮ МО:15-19; та с) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності під будь-яким 5ЕО ІЮ МО:15- 19; при цьому зазначене поле заражене шкідником, щодо якого зазначений поліпептид проявляє пестицидну активність.