JP2514793B2 - 生物学的殺虫剤の細胞カプセル化 - Google Patents

生物学的殺虫剤の細胞カプセル化

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Description

【発明の詳細な説明】 従来の技術と問題点 農業生産性の驚異的な向上は、農業関連の諸方法につ
いて理解が著しく深まったことや、設備改良、肥料の入
手、殺虫剤（本明細書では有害生物撲滅剤前般をさす）
の改良など多くの要因の結果である。最後に挙げた殺虫
剤については、環境へのマイナス効果のため有害な面が
ないわけではなかった。従って、環境上受け入れられる
効果的な殺虫剤の開発は、現実的な関心事である。
生態学的に受け入れられる殺虫剤の中に、バチルスチ
ューリンゲンシスのような種々の微生物によって作られ
る蛋白質毒素がある。しかも、B.チューリンゲンシスの
溶菌液や胞子を殺虫剤として使うのは、著しい欠点があ
った。殺虫剤の寿命が環境中で比較的短く、適当に保護
するには複合的な施用を必要とする。そのため、これら
の殺虫剤は長期の残留活性をもつ従来の化学製品に比べ
て経済的ではない。田畑での長期効力を改良すること
は、生物学的又は蛋白質性の毒素に基づく殺虫剤の応用
を拡大するのに大きな助けになるのであろう。
上に示したように、殺虫剤には特定の施用に関連して
多くの必要条件がある。例えば、多くの場合、環境に蓄
積せずに田畑で長い残留活性をもつ殺虫剤が望ましい。
更に経済的配慮からは、適度に広い範囲の生物活性をも
つ殺虫剤は好ましい。また殺虫剤は、環境上受け入れら
れる分解生成物まで分解していくものでなければならな
い。他の考慮すべき点としては、処方の容易さ、殺虫剤
活性、光・水・生物等の環境的影響に対する安定性及び
環境中の有益生物や無害な生物への影響がある。
ウエスト（West）、Soil Biol Biochem.（1984年）16
巻357−360頁は土壌中におけるB.t.毒素の持続性に関す
る研究結果について報告している。またウエストら、J.
of Invertebrate Pathology（1984年）43巻150−155頁
も参照のこと。合衆国特許第4,265,880号は、コアセル
ベートのマウクロビーズ中に生きた殺虫剤病原体を埋め
混むことを記述している。日本特許第51−5047号は毒性
を保持しながらB.チューリンゲンシス胞子を殺す物理化
学的方法を記述している。
問題解決手段 農作物と農業製品を害虫から保護する方法及び組成物
が明らかにされている。本発明のある面で毒素（殺虫
剤）生産性物の細胞全体、すなわち溶菌していないも
の、又は細胞壁が破壊されていないもの（以下「無傷の
細胞」と述べる）を、目標害虫環境への細胞施用時に細
胞内につくられる毒素の活性が持続するような試薬又は
物理的手段又はこれらの組合せで処理している。本発明
のもう一つの面で、細胞宿主へ異種遺伝子を導入するこ
とによって殺虫剤がつくられる。異種遺伝子の発現の結
果、直接的又は間接的に殺虫剤が細胞内で生産され保持
される。上記のように目標害虫環境への細胞施用時につ
くられる毒素の活性を持続させるような条件下に、これ
らの細胞を処理する。生ずる生成物は毒素の毒性を保持
している。次に目標害虫のいる環境、例えば土壌、水及
び植物の葉に施用するための慣用技術に従って、天然に
カプセル化されたこれらの殺虫剤を処方できる。
このように本発明は本質的に無傷の任意の細胞を毒素
を包み込むカプセルとして使用する殺虫剤に於て、その
細胞を安定化処理することによって殺虫活性を持続させ
た殺虫剤に関するものである。
本発明は従って、天然に生ずる殺虫剤生産微生物、又
は宿主中に発現できる異種遺伝子を担った殺虫剤生産微
生物で、発現の結果、直接間接に殺虫剤を生産するもの
を変更することによって、他の利点の中でも特に長期の
残留寿命をもつ改良された殺虫剤が提供されている。本
発明は目標害虫環境への細胞施用時に、細胞内につくら
れる毒素の活性を持続させるように試薬又は物理的手段
又はこれらの組合せで生物を処理することを含む。生ず
る生成物は毒素の毒性を保持している。
細胞内で、特に細菌等の原核生物や、カビ、例えばア
カパンカビ（Neurospora）とコウジカビ（Aspergillu
s）のような酵母と糸状菌を例とする真核生物、又はア
メーバ、原生動物、藻類のような原生生物などの単細胞
微生物中で生産できることを特徴とする広範囲の殺虫剤
が生産できる。
これらの殺虫剤は微生物でつくられる任意の毒素であ
りうる。例えば殺虫剤は鞘翅目、鱗翅目、双翅目、半翅
目、革翅目、及び直翅目等の昆虫、又はクモ形綱、膜足
類、又は線虫やへん平動物等の蠕虫のような真核性の多
細胞害虫に対して毒性のもつポリペブチドでありうる。
感受性のある種々の昆虫はカブトムシ、ガ、ハエ、バッ
タ、シラミ及びハサミムシを包含する。
宿主細胞中でつくられる殺虫剤は、活性型でつくられ
るポリペブチドか、又はB.チューリンゲンシス・バラエ
ティ・クルスタキの結晶毒素の場合と同様、害虫などに
よる毒素活性の処理をなおも必要とする前駆型である。
このため、遺伝子は殺虫剤組成物をつくるために代謝物
を変更するような酵素を暗素を暗号化できる。
細胞本来の遺伝子によって製造される毒素には、鱗翅
目に対して活性のあるB.チューリンゲンシス・バラエテ
ィ・クルスタキ、蚊に対して活性のあるB.t.バラエティ
・イスラエンシス、鞘翅目に対して活性のあるB.t.M−
７、スポドプテラ（Spodoptera）に対して活性のあるB.
チューリンゲンシス・バラエティ・アイザワイ及び蚊の
幼虫に活性のあるB.スファエリクスがある。他の毒素は
ボーバリア・バッシアナ（Beauve−ria bassiana）のボ
ーバリンやメタリジウム（Me−tarhizium）sppのデスト
ラキシンのような昆虫病原性のカビのもの、又はストレ
プトミセス・アバーミチルス（Streptomyces avermitil
us）のアバーメクチン類のような広範囲の殺虫化合物を
包含している。上の例となる培養基は次の通りである。
バチルスチューリンゲンシス・バラエティ・クルスタ
キHD−１（NRRL B−3792、合衆国特許第4,448,885
号）、 B.チューリンゲンシス・バラエティ・イスラエレンシ
ス（ATCC 35646）、 B.チューリンゲンシスＭ−７（NRRL B−15939）、 B.チューリンゲンシス・バラエティ・テネブリオニス
（DSM 2803）。
以下のB.チューリンゲンシス培養基は、テキサス州ブ
ラウンスビルの合衆国農務省（USDA）から入手できる。
請求は、78520合衆国テキサス州ブラウンスビル、私書
箱1033号、農務省農業研究局、綿昆虫研究部、ジョー・
ガルシア宛て。
B.チューリンゲンシス・バラエティHD2 B.チューリンゲンシス・バラエティ・フェニティムス
HD3 B.チューリンゲンシス・バラエティ・アレスティHD4 B.チューリンゲンシス・バラエティ・クルスタキHD73 B.チューリンゲンシス・バラエティ・ソット−HD770 B.チューリンゲンシス・バラエティ・デンドロリムス
HD7 B.チューリンゲンシス・バラエティ・ケニヤHD5 B.チューリンゲンシス・バラエティ・ガレリアエHD29 B.チューリンゲンシス・バラエティ・カナデンシスHD
224 B.チューリンゲンシス・バラエティ・エントモシダス
HD9 B.チューリンゲンシス・バラエティ・スブトキシクス
HD109 B.チューリンゲンシス・バラエティ・アイザワイHD11 B.チューリンゲンシス・バラエティ・モリソニHD12 B.チューリンゲンシス・バラエティ・オストリニアエ
HD501 B.チューリンゲンシス・バラエティ・トルウォルシHD
537 B.チューリンゲンシス・バラエティ・ダルムシュタデ
ィエンシスHD146 B.チューリンゲンシス・バラエティ・トマノフィHD20
1 B.チューリンゲンシス・バラエティ・キュウシュウエ
ンシスHD541 B.チューリンゲンシス・バラエティ・トンプソニHD54
2 B.チューリンゲンシス・バラエティ・パキスタニHD39
5 B.チューリンゲンシス・バラエティ・イスラエレンシ
スHD567 B.チューリンゲンシス・バラエティ・インディアナHD
521 B.チューリンゲンシス・バラエティ・ダコタ B.チューリンゲンシス・バラエティ・トーホクエンシ
スHD866 B.チューリンゲンシス・バラエティ・クマモトエンシ
スHD867 B.チューリンゲンシス・バラエティ・トチギエンシス
HD868 B.チューリンゲンシス・バラエティ・コルメリHD847 B.チューリンゲンシス・バラエティ・ウハネンシスHD
525 バルチス・セレウス,ATCC21281 バルチス・モリタイ,ATCC21282 バルチス・ポピリアエ,ATCC14706 バルチス・レンチモルブス,ATCC14707 バルチス・スファエリクス,ATCC33203 ボーベリア・バッシアナ,ATCC9835 メタリジウム・アニソプリアエ（M.anisopliae） ATCC24398 メタリジウム・フラボビリデ（M.flavoviride） ATCC32969 ストレプトミセス・アバーミチルス,ATCC31267 毒素は細胞本来の遺伝子によって製造される毒素と同
じである必要はない。ポリペプチド毒素は細胞本来の遺
伝子によって製造される毒素の断片でもよく、又アミノ
酸の２％以下を変更した欠失、塩基転換又は塩基転位な
どの突然変異の発現生成物、又は意図された害虫宿主に
よる加工処理の可能な繰り返し配列のものでありうる。
更に例えば毒素の蛋白質分解を減少させるためにＮ−末
端に１個、５個又はそれ以上のアミノ酸が提供されてい
る融合生成物をつくることができる。ある場合には、複
数の同じ又は異なる毒素を暗号化し発現させ、その場合
にポリトキシンの各毒素部分の間に処理位置を導入でき
る。
宿主細胞の例は、哺乳類のような高等生物に有毒な物
質をつくらない細胞に通常限定された原核生物又は真核
生物を包含している。しかし、高等生物に有毒な物質を
つくる生物でも、毒素が不安定であるか、又は使用水準
が哺乳類宿主に有毒と成る可能性を避けるほど十分低い
場合は使用できる。宿主として特に興味あるものは、原
核生物とカビのような下等な真核生物である。グラム陰
性及びグラフ陽性の原核生物の例は、エシュリヒア（Es
cherichia）属、エルビニア菌（Erwinia）属、シゲラ
（Shigella）属、サルモネラ（Salmonel−la）属、及び
プロテウス（Proteus）属のような腸内細菌科；バルチ
ス科；リゾビウムなどのリゾビウム科；発光細菌、ザイ
モモナス（Zymomonas）属、セラチア（Serratia）属、
アエロモナス（Aeromonas）属、ビブリオ（Vibrio）
属、デスルホビブリオ（De−sulfovibrio）属、スピリ
ルム（Spirillum）属のようならせん科；乳酸杆菌科；
シュードモナス属とアセトバクター（Acetobacter）属
のようなシュードモナス科；アセトバクター科及びニト
ロバクター科を包含する。真核生物には藻菌類と子のう
菌類のようなカビ類があり、これらはサッカロミセス
（Saccharomyces）属とスキゾサッカロミセス（Schizos
accharomyces）属のような酵母、及びロドトルラ（Rhod
otorula）属、アウレオバシジウム（Aureobasidium）
属、スポロボロミセス（Sporo−horomyces）属等のよう
な担子菌類酵母を包含している。
生産の目的で宿主細胞を選択する上で特に興味ある特
性は、異種遺伝子を宿主へ導入するのが簡便なこと、発
現系が入手しやすいこと、発現の能率、宿主中での殺虫
剤の安定性、及び補助的な遺伝子可能性の存在を包含す
る。殺虫剤のマイクロカプセルルとして使うための興味
ある特性としては、厚い細胞壁や色素、細胞内包み込み
又は封入体の形成のような殺虫剤保護性、葉の親和性、
哺乳類毒素の欠如、毒素に被害を与えずに細胞細菌・固
定しやすいこと等がある。他の考慮する点は処方と取扱
いの容易さ、経済性、貯蔵安定性等を包含している。
特に興味ある宿主生物は、ロドトルラ種、アウレオバ
シジウム種、サッカロミセス種及びスポロボロミセス種
等の酵母；シュードモナス種、エルビニア種及びフラボ
バクテリウム種のようなフィロプレーン（phylloplan
e）生物；又はエシェリヒア、乳酸杆菌種、バシラス種
等の他の生物を包含する。特定的な生物は緑膿菌（Pseu
domonas aeru−ginosa）、シュードモナス・フルオレッ
センス、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
ce−revisiae）、バチルスチューリンゲンシス、大腸菌
（E.coli）、枯草菌（B.sub）等を包含する。
細胞は通常無傷のものであり、殺菌時には胞子型より
は実質的に増殖型にあるが、場合によっては胞子も使用
できる。
細胞は種々の方法で増殖を抑制できるが、但しその手
法が殺虫剤性状の悪影響せず、殺虫剤を保護する細胞能
力を打ち消すものであってはならない。手法としては物
理的処理、化学的処理、細胞の物理的性質を変えるも
の、又は細胞の物理的性質を実質的にそのままに保つも
のなどがある。
宿主細胞を不活性化する種々の技術は加熱（通常50℃
ないし70℃）、冷凍、紫外線照射、凍結乾燥、毒素、例
えば抗生物質、フェノール、アニリド類、例えばカーバ
ニリドとサリチルアニリド、ヒドロキシユリア、第四級
塩類、アルコール、抗菌染料、EDTA及びアミジン類、ハ
ロゲン化剤例えば塩素化剤、臭素化剤又は沃素化剤のよ
うな非特異的な有機・無機化学薬品、アルデヒド類、例
えばグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒド、オゾン
類及びエチレンオキシドのような有毒ガス、過酸化物、
プソラレン類、乾燥剤等を包含し、これらを個々に、又
は組み合わせて使用する。薬剤の選択は特定殺虫剤、宿
主細胞の性質、架橋剤で細胞壁を固定し保存するなど細
胞構造の変更の性質に依存するのであろう。
細胞は一般に強化された構造安定性をもち、畑での環
境分解に対して抵抗力が高くなっている。殺虫剤が前駆
型の場合は、目標病原体によって前駆型が成熟型の殺虫
剤に加工処理されるのを抑制しないように不活性化方法
を選択すべきである。例えば、ホルムアルデヒドは蛋白
質を架橋し、ポリペプチド殺虫剤の前駆型の処理を抑制
することがある。不活性化又は殺菌の方法は、毒素の生
物学的利用率又は生物活性の少なくとも実質的な部分を
保持する。
異種遺伝子は染色体外で維持されるか、又は宿主ゲノ
ムに組み込まれるが、いずれにしても任意慣用の方法で
宿主に導入される、（異種とは遺伝子が導入先の宿主に
ないものか、又はその遺伝子がそのような宿主中に通常
見い出されないものであることを意図している。すなわ
ち、宿主生物と異種遺伝子が情報交換するとしても、異
種遺伝子は自然界の野生型宿主細胞中に通常見当らな
い。普通、異種という用語は宿主及び遺伝子源として異
なる属の種について使われる。） プラスミド、ウイルス又は動原体からの複製系を安定
維持用の自律複製分節（autonomous repli−cating seg
ment,ars）と組み合わせた種々の構造体を使用できる。
組込みのみを望んでいる場合には、構造体は複製を提供
するもので、トランスポゾンであるか、又はトランポゾ
ン様の挿入活性をもつものか、又は宿主ゲムノとの相同
を提供するものを使用できる。宿主染色体又はプラスミ
ドのゲムノ中の配列と相同な配列間に異種遺伝子をもつ
DNA配列が、しばしば使用される。異種遺伝子が複数コ
ピーで存在するのが望ましい。例として合衆国特許第4,
399,216号を参照。こうして、異種遺伝子の導入には形
質導入、トランスフェクション及び形質転換を使用でき
る。
ベクター類は、ColE1、Ｐ−１非和合性プラスミド
類、例えばpRK290、酵母2mμプラスミド、ラムダ等のよ
うな真核生物及び原核生物の複製系に依存する多数のも
のが、現在入手できる。
染色体外の要素を使用する場合は、DNA構造体が標識
遺伝子を含み、構造体を含有する宿主細胞の選定ができ
るようにするのが望ましい。標識は生物を殺す物質に対
する耐性、例えば抗生物質耐性や重金属耐性、また栄養
要求宿主に基本栄養性を与える相補正などを提供するも
のが一般的である。複製系は、ランナウェイ複製のよう
な特別な性状を与えるもの、cos細胞に関係するもの、
又他の特徴をもつものでありうる。
異種遺伝子は、宿主細胞によって認識される転写及び
翻訳の開始終了についての調節信号をもっているが、異
種遺伝子と連携してこれらの調節特徴を使うとうまくい
くことが多い。しかし、例えばリーダー配列を除くか、
殺虫剤の成熟型を暗号化した配列を提供するなどのよう
に、異種遺伝子を変更する場合や、遺伝子全体を前駆物
質に対して暗号化する場合には、天然のものとは異なる
転写開始の調節配列が提供されるようにDNA配列を操作
する必要がしばしば起る。
広範囲の宿主に対して広範囲の転写開始配列が存在す
る。配列は殺虫剤の構成表現又は調節表現を提供でき、
その場合調節は代謝物質など化学物質や、温度、調節可
能なリプレッサーによって誘導できる。例として合衆国
特許第4,374,927号を参照のこと。プロモーターの特定
的な選択は、プロモーターの強さ、細胞生存度に対する
プロモーターの干渉、細胞に内在する調節機構のプロモ
ーターに対する影響など、多くの因子に左右されよう。
多数のプロモーターが商業的なものを含めた種々の給源
から入手できる。
異種殺虫剤遺伝子を含有する細胞宿主は、任意慣用の
栄養培地で生育できる。培地中でDNA構造体は選択的な
利点を提供し、全部又は実質的に全部の細胞が異種遺伝
子を保持するように選択培地を生じさせる。次の、これ
らの細胞は慣用の方法で収穫され、上記のように種々の
方法で変更できる。その代わりに、細胞を取り入れる前
に固定できる。
毒素を含んだ宿主生物を処理する方法は、多くの役割
を果たすことができる。第一に、構造の一体性を強める
ことができる。第二に、蛋白質性分解に対する感受性を
低下させるように毒素を変更することによって、また細
胞内に天然に存在するプロテアーゼの蛋白質性分解活性
を減少させることによって、毒素の蛋白質分解安定性が
強化される。無傷の段階で、毒素蛋白質の実質的な蓄積
があった時に細胞を変更するのが好ましい。これらの変
更は広いスペクトラムの化学的安定性をもつ化学試薬を
使用するなど、種々の方法で達成できる。無傷の細胞を
かきまぜなが、又はかきまぜないで、約−10ないし60℃
の範囲の温度で、化学試薬を含有する液体試薬培地と一
緒にすることができる。反応時間は経験的に決定でき、
試薬と反応条件により広範囲にわたる。細胞濃度はml当
り約10E2ないし10E10の範囲にある。
化学試薬として特に興味あるものはハロゲン化剤、特
に原子番号17−80のハロゲン類である。更に詳しくは、
望んでいる結果を達成するのに十分な時間の間、温和な
条件下に沃素を使用できる。他の適当な手法はホルムア
ルデヒドとタルアルデヒドのようなアルデヒド類、ゼフ
ィランクロライドとセチルピリジニウムクロライドのよ
うな坑感染薬、イソプロピルとエタノールのようなアル
コール類、ブアン（Bouin）固定剤とヘリー（He−lly）
固定剤のような種々の病理学固定剤［フマソン、グレッ
チェン・Ｌ、『動物組織技法』（Ani−mal Tissue Tech
niques）（W.H.フリーマン社、1967年）を参照］での処
理や、目標害虫環境への細胞施用時に細胞中につくられ
る毒素の活性を持続させるような物理的処理（熱）と化
学剤との組合せを包含する。
沃素でのハロゲン化では、温度が概して約０ないし50
℃の範囲であるが、反応を室温で行なうのが好都合であ
る。沃素化は、酸性の水性媒体、特に約0.5−5Mの範囲
のカルボン酸水溶液における0.5ないし５％の三沃化物
又は沃素を使用して、都合よく実施できる。酢酸を使う
のが好都合であるが、概して約１−４個の炭素原子の他
のカルボン酸類も使用できる。反応時間は一般に１分未
満から約24時間、普通には約１ないし６時間の範囲にあ
る。任意の残留沃素は、ジチオナイト、チオ硫酸ナトリ
ウムのような還元剤、又は畑での最終的使用で両立でき
る他の還元剤、との反応によって除去できる。更に、変
更された細胞は、反応媒体の全部を除くための洗浄や、
乾燥型での単離、及び当業者に周知のように農業用の一
般に利用される典型的な粘着剤、展着剤、助剤との処方
などの処理にかけることができる。
特に興味あるものは、細胞壁を架橋できる試薬であ
る。この目的には幾つかの試薬が知られている。この処
理で殺虫剤の安定性が強まるものでなければならない。
すなわち、畑の条件下に殺虫剤の持続性又は残留活性が
強化されるべきである。従って、未処理細胞の殺虫剤活
性が削減する条件下で、処理細胞の活性は１−３倍長い
期間の間、持続する。細胞は種々の方法で処方できる。
無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）
又は植物材料（トウモロコシ穂軸の粉末、米のもみ殻、
クルミの殻等）のような種々の不活性材料と混合するこ
とによって、水和剤、粒剤又は粉剤としてこれらを使用
できる。処方剤は展着・粘着助剤、安定剤、他の殺虫添
加物、又は表面活性剤を包含できる。液体処方剤は水性
基盤が非水性のもので、フォーム、ゲル、懸濁液、乳剤
等として施用できる。成分には流動剤、表面活性剤、乳
化剤、分散剤又は重合体を包含できる。
殺虫剤濃度は特定処方剤の性質、特にそれが濃縮液か
直接使用されるかにより、大幅に変わる。殺虫剤は少な
くとも１重量％の量で存在し、100重量％も可能であ
る。乾燥処方剤は約１−95重量％の殺虫剤をもつが、液
体処方剤は概して液体相に約１−60重量％の固体があ
る。処方剤は一般にmg当り約10E2ないし約10E4の細胞を
もつ。これらの処方剤は、ヘクタール当り約２オンス
（液体又は乾燥）ないし２ポンド以上で施用されよう。
処方剤は害虫環境に、例えば植物、土壌又は水に、噴
霧、散布、散水等によって施用される。
以上の実施例は例示のために提供されており、限定の
ためではない。
実施例１ （自家溶菌の前に）胞子を含有する無傷のB.チューリ
ンゲンシス細胞を以下に述べるように、ルゴール（lugo
l）沃素で処理してから、細胞を殺すが、これらはトリ
コプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の幼虫に対する毒
性を保持している。
無傷のB.チューリンゲンシス（HD−１）胞子形成細胞
を、その自家溶菌直前に遠心分離により収穫し、細胞ペ
レットを脱イオン水に懸濁して、60×10E9細胞/mlの濃
度とする。細胞懸濁液のアリコートを1.5×10E8細胞/ml
に希釈し、１％ルゴール沃素に室温で４時間当てた（１
％ルゴール液はリットル当たり沃化カリウム1.0g、沃素
0.5g及び氷酢酸1.0mlを含有）。処理細胞を洗い、無菌
の脱イオン水に再懸濁して60×10E9の細胞濃度とした。
４時間の沃素処理後、栄養寒天培地上でのプレート計数
により生存可能な細胞を検出しなかった。一方ルゴール
沃素で処理をしない未処理対照細胞を準備した。次にル
ゴールの処理及び未処理対照細胞をT.二幼虫に対する毒
性について生物検定にかけた。
本発明の細胞は天然に生ずる細胞であるから、本発明
の利点を実現するためにこれらの処理を殺菌条件下で行
う必要はない。このため、当業者は目標害虫環境下に毒
素（殺虫剤）活性の高水準の持続を達成するために、本
明細書に記述されたとおりの細胞処理を最適化できる。
生物検定手順 ルゴールの細菌細胞又は未処理の生きたHD−１細胞の
希釈液を、一定量の幼虫飼料カップに混合した。次に生
後５日のＴ、二幼虫を１匹ずつ各カップに加えた。希釈
当たり18匹の幼虫を試験した。幼虫を６日後に検査し、
死亡した幼虫の総数を記録した。結果を第１表に示す。
これらは幼虫の死亡率で示してある。
実施例２ 安定性試験 B.t.HD−１の胞子を含有する無傷の細胞を１％ルゴー
ル液で、室温で４時間処理し、脱イオン水で洗い、冷蔵
庫に52日間貯蔵した。この期間後、細胞は完全な状態に
あり、溶菌（胞子と結晶の放出）の証拠はなかった。
胞子を含有するB.t.HD−１の無傷の細胞を遠心分離に
よって取り入れ、生ずるペレットを無菌の脱イオン水に
懸濁し（10E10細胞/ml）、70℃に30分加熱し、冷蔵庫に
９日間貯蔵した。この期間後、実際上全部の細胞が溶菌
し、胞子と結晶を放出した。
実施例３ 土壌実験手順 B.t.HD−１の調整： 胞子を含有するB.t.HD−１の無傷の培養基を、遠心力
分離によって取り入れ、細胞ペレットを１％ルゴール沃
素液400mlに懸濁した（４×10E8細胞/ml）。沃素／細胞
懸濁液を室温で３時間かきまぜ、３回洗い、無菌の0.1M
燐酸ナトリウム緩衝液（ph 6.9）400mlに再懸濁した。
沃素処理後、栄養寒天培地（10E−１）上で生きたB.t.H
D−１細胞は検出されず、顕微鏡検査は、全細胞が無傷
（未溶菌）であることを明らかにした。
ダイペル調整： B.t.HD−１細胞を含有するダイペル（0.1g、アボット
・ラボラトリーズ、効力16,000国際単位/mgリストNo.51
88）を0.1M燐酸ナトリウム無菌緩衝液400mlに計り入れ
た。
実験設計： １）無菌でない土壌の調整。土壌40gを無菌の500mlフラ
スコに入れ、試験液200mlを加えた。
２）無菌土壌の調整：土壌40gを無菌の500mlフラスコに
入れ、試験液200mlを加える前に１時間オートクレーブ
処理した。土壌懸濁液を入れたフラスコを回転振蕩機
（200rpm）上で培養した。各土壌懸濁液の試料（30−40
ml）を４×のチーズ布に通してと過し、レタス苗木の葉
に噴霧し、その後Ｔ−の幼虫い対する毒性を測定した。
葉抑制検定での摂取抑制によるB.t.毒素の測定： ロメイン・レタス苗の葉に、新しく調整された標準濃
度（１×0.19g/100ml,1/10×,1/20×及び1/100×）のダ
イペルと試験液を施用の24時間前に噴霧した。
標準液と試験液で処理された葉を植物から除いて葉ご
とに計量し、個々のペトリ皿に入れた。生後７日の絶食
させたT.二幼虫10匹を各葉に添わせて、25℃で約24時
間、葉を食べさせた。給餌期間に終わりに葉を再び計量
し、各処理に対して平均重量損失を測定した。
上記の条件下に、葉の重量損失は、0.19mg/mlないし
0.019mg/mlのダイペル（mg当り16.000国際単位の効力）
に等しい毒素濃度にわたり、毒素濃度の対数を一次関数
である。このため、新しく調整したダイペルをレタス苗
に噴霧し各検定を行なった時の濃度は、標準としての役
目を果しており、試験液を噴霧した葉の毒素濃度と等式
化できる。第２表のデータは、元の毒性（第１日）に対
して、培養後種々の時の土壌中に残留し葉抑制検定でそ
の後検定された残留毒性比率を示す。レタス苗以外の葉
をB.t.毒性効力の検定に使用できる。
土壌中のB.t.HD−１の蛋白質結晶の不活性化は、土壌
微生物の活性によることが示された（ウエスト、1984
年）。第２表の結果は、ダイペル及びルゴール沃素処理
された溶菌前のB.t.HD−１調整剤を同様な条件下に培養
した時、ダイペル（胞子−結晶）製剤の毒性は急速に劣
化したが、ルゴール沃素処理の細胞の毒性は木質的に未
変化のままであったことを示している。
上の結果から、無傷の微生物細胞の化学的処理は、細
胞を貯蔵条件に安定にさせながら、ポリペプチド毒素の
活性を保持するような形で実施できるのが明らかであ
る。これにより、畑の条件下に毒素の残留活性が高くな
る。
実施例４ 非相同遺伝子の構築と適当な宿主への形質転
換 構築は北部研究所から入手できる緑膿菌（NRRLB−121
27）のクローンで始まるが、これは広い宿主範囲のシャ
トル・プラスミドpRO1614を含んでいる。（J.Bact.［19
82年］150巻60頁、合衆国特許第4,374,200号）。このプ
ラスミドは、特異なHindIII、BamHI、SaII及びPvuIIの
制限位置や、PstI挿入部をもっていて、これはカルベニ
シリン耐性遺伝子と緑膿菌複製系を包含しており、ここ
でHindIII.BamHI及びSaII制限位置はテトラサイクリン
耐性遺伝子の中にある。残りのプラスミドはpBR322から
誘導される。第二のプラスミドpSM1−17は大腸菌（NRRL
B−15976）のクローンとして寄託された。この寄託は6
1604合衆国イリノイ州ピオリア、合衆国農務省北部研究
所の永久保存施設にされたものである。プラスミドpSM1
−17はアンピリシン耐性を大腸菌に与え、B.チューリン
ゲンシスHD73の50mdプラスミドからのδ−エンドトキシ
ン遺伝子を含んだ6.8KbpのHindIIIDNA断片を含有する。
無傷の細胞をキャベツ・シャクトリムシに有毒にさせる
のに十分な毒素が、大腸菌のこの遺伝子から発現され
る。毒素の発現を評価し、代わりの宿主のシュードモナ
ス・フルオレッセンス中での毒素発現を達成するため、
DNA断片を更に変更する。望んでいないDNAを6.8Kbpの断
片から除くために、pSM1−17をBamHIで消化させて、毒
素遺伝子の５′端末に最も近い位置で環状プラスミドに
開裂させ、またエキソヌクレアーゼBaI31で処理して6.8
KbpのHindII挿入物を約2.9Kbpに減らした。DNAの遊離末
端をクレノフ・ポリメラーゼでふさぎ、BamHIリンカー
スを加えて、線状DNAを連結し、環状プラスミドを再形
成させた。生ずるベクターのpFG270をXhoIで消化させる
と、環状プラスミドが毒素遺伝子の３′末端に最も近い
位置で開破した。SaIIリンカースを加え、プラスミドを
環状に連結させ、生ずるベクターのpFG10.6を大腸菌で
増殖させた。pFG10.6をSaIIとBamHIで完全に消化させ、
生ずる毒素遺伝子を含有する2.1Kbp断片をゲル電気泳動
によって精製し、プラスミドpRO1614のBamHIとSaII位置
に連結した。生ずるプラスミドpCH2.1を大腸菌で増殖さ
せ、シュードモナス・フルオレッセンスをカルベニシリ
ン耐性及びδ−エンドトキシン合成能に形質転換するの
に使用した。シュードモナス・フルオレッセンス（pCH
2.1）をNRRLに寄託し呼出し番号NRRL B−15977を与えら
れた。プラスミドpSM1−17は、1985年７月２日に同施設
に寄託された。
以下の例示的な実験でP.フルオレッセンス（pCH2.1）
を形質転換していない細胞の対照群と連携して使用し
た。
大腸菌（pSM1−17）−NRRL B−15976とP.フルオレッ
センス（pCH2.1）−NRRL B−15977の培養基寄託は、NRR
L受託機関の永久保存施設になされたもので、少なくと
も30年間保存される。これらの寄託物はそれらを明らか
にした特許の公布により一般に入手できる。また本出願
の対応特許ないしその後継特許の出願された国における
外国特許法の要求に応じても入手できる。しかし、寄託
物の入手が、政府措置によって許可された特許権を侵害
してまで本発明の実施権を構成するものではないこと
は、理解すべきである。
実施例５ 異種遺伝子を取込んだ微生物の処理と試験 シュードモナス菌を、１％ルゴール沃素（無菌蒸溜水
１リットル中のKI 100g、I. 50g、氷酢酸100ml）で、
又は２％ホルマリン溶液処理により、いずれも周囲温度
で殺菌した。
B.t.毒素を加えた、又は加えないP.フルオレッセンス
のブロス培養基２リットルからの細胞ペレットを半分に
分けた。細胞の半分を１％ルゴール沃素で４時間処理
し、他の半分を氷上に保持した。洗ったルゴール処理細
胞と未処理細胞を無菌の脱イオン水10ml中で再ペレット
化した。この懸濁液（10E8−10E12細胞/ml）9mlを若い
レタス苗３本に噴霧した。噴霧済みの苗３本を閉じた一
室に入れ、トリコプルシア・二の幼虫50−70匹を苗に付
けた。観察期間中に葉に目に見える損失がなければ、苗
は保護されたと考えられる。
次の研究では、新しくふ化させたキャベツ・シャクト
リムシを、生物検定しようとする材料の水滴の入ったペ
トリ皿に入れる。幼虫が液を吸い込んでから、取り出し
て幼虫の餌が入っている小さなカップに入れる。７日後
に幼虫を検査して、総死亡数を記録する。次の第４表は
その結果を示す。
次の研究では、細胞の鹸化安定性に対する効果を測定
するため、異なる方法を用いて細胞を殺した。P.フルオ
レッセンス菌株33は、B.t.毒素を含有しない未形質転換
の細胞であるが、菌株pCHは2.1kbの毒素遺伝子を含んで
いる。第一の研究では、菌株33と菌株pCHの静止相培養
基を遠心分離によって取り入れ、細胞ペレットを無菌の
脱イオン水に、それぞれ10E10及び10E9の濃度で懸濁し
た。細胞のアリコートを種々の長さに時間に70℃の温浴
にかけ、キングＢ寒天上でのプレート計数によって細胞
の生育可能性を測定した［キング・イー・オー（King.
E.O）ら（1954年）、J.Lab.＆Clin.Med.44巻304頁を参
照のこと。培地は次の成分をもつ。プロテオース・ペプ
トン３号2.0％、バクト寒天1.5％、グリセロールC.P.1.
0％．K2HPO4（無水）0.15％、MgSO4、7H2O0.15％、pH7.2
に調整］。菌株33は５分以内に実質的に完全に死滅した
が、菌株pCHは10分以内に生育可能な細胞を実質的に示
されなかった。
菌株33の細胞（未処理、70℃加熱処理又はルゴール処
理［１％ルゴール沃素、２時間、室温］）を、10mlの脱
イオン水に懸濁して、約10E9/mlの細胞濃度とした。次
に細胞懸濁液をブロンソン200鹸化機（マイクロプロー
ブ出力10、デューティサイクル50％、パルス・モード使
用）にかけた。細胞懸濁液の光学濃度（575nm）を鹸化
処理の前後に測定した。光学濃度の減少は細胞の破壊を
示している。次の第５、６表はその結果を記載してい
る。
菌株pCH（５×10E10/ml）を70℃の温浴中で加熱処理
し、Ｉ二（ni）幼虫に対する毒性の検定を行なった。生
物検定手順は新たにふ化させたキャベツ・シャクトリム
シを使用し、生物検定しようとする材料の水滴を含んだ
ペトリ皿に入れた。幼虫に液を吸わせてから、幼虫の餌
を入れた小さなカップに移動した。幼虫を６日後に検査
し、動物の死亡総数を記録した。
P.フルオレッセンス−B.t.毒素（菌株pCH）のルゴー
ル処理細胞の持続性を次のように室温で分析した。
（１）ロメイン種レタスの葉に殺虫剤細胞を噴霧した。
（２）処理ずみ植物を19日間まで温室環境に置いた（温
室を紫外線透過屋根で覆った）。（３）葉抑制検定によ
り、葉に残留するキャベツ・シャクトリムシ殺虫剤活性
を検定した。給餌抑制によるB.t.毒素の測定は、既述の
とおりであり、植物に噴霧する方法は実施例５に記述さ
れている。この実験で、1.0の毒素活性水準は、噴霧液1
00ml当りダイペル0.19gを植物当り約10ml（すなわち流
出寸前）の率で施用して得られる殺虫剤活性と同等であ
る。
第７表に示すように、11日後、シュードモナス調製剤
はまだ十分に活性があったが、ダイペルの例は初期活性
の2/3以上を失った。固定されたシュードモナス細胞
が、何らかの方法で葉表面での不活性化から殺虫剤毒素
を保護しているものと、我々はこのデータから解釈して
いる。
上の結果から、毒素を含有する殺菌された殺菌は生菌
の殺虫剤活性の全部又は実質的に全部の割合を保持しな
がら多くの利点を提供することが明らかである。貯蔵、
輸送及び施用のため死菌を保持するほうが、生菌を使用
するより都合がよく、経済的である。それと同時に、長
期間にわたり毒素の生物活性を維持するように、菌は毒
素のカプセル化による保護を提供する。更に、プロテア
ーゼの変性がポリペプチド殺虫剤の蛋白質分解性の解体
を防ぐ。菌体構造を破壊したり蛋白質殺虫剤を変性した
りせずに殺菌するために種々の手段を使用して、処方と
植物及び植物製品への応用に都合のよい殺虫剤組成物を
提供しながら、望んでいる殺虫剤活性を得ることができ
る。
本発明は明快な理解を目的として説明と実施例によっ
てかなり詳しく記述されたが、添付の特許請求の範囲内
で、ある変化・変更を行なえることは明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン ジー．カミングス アメリカ合衆国 08008 ニユージヤー ジー州 ビーチ ハブン ビーチ アベ ニユー 12214 (56)参考文献 特開 昭47−39521（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−145915（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−66489（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−125022（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−156382（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細菌細胞が本来有している遺伝子に従って
    製造されたポリペプチドであるか、細菌細胞内での異種
    遺伝子の発現の結果製造されたポリペプチドであるかを
    問わず、細胞内ポリペプチド殺虫剤を含有している実質
    的に細胞壁が破壊されていない細菌からなる殺虫剤の製
    造方法に於て、目標害虫の環境に適用される時に持続的
    な殺虫剤活性を与えるために、ハロゲン化剤、アルデヒ
    ド類、抗感染薬又は抗菌染料、アルコール類、病理学固
    定剤、フェノール、アニリド類、ヒドロキシユリア、第
    四級塩類、EDTA又はアミジン類、有毒ガス、過酸化物、
    プソラレン類、抗生物質等の毒素、及び乾燥剤及びこれ
    らの二以上の組合せからなる群から選ばれる化学剤、又
    は加熱、凍結、紫外線照射、及び凍結乾燥及びこれらの
    二以上の組合せからなる群から選ばれる物理的手段、又
    は上記化学剤と物理的手段との組合せで、細胞壁が無傷
    でかつ毒素蛋白質の実質的な蓄積のある細菌を殺虫剤活
    性を保持しながら、プロテアーゼ不活性化又は細胞壁強
    化条件下に殺菌して安定化処理することを特徴とする実
    質的に細胞壁が破壊されていない細菌からなる殺虫剤の
    製造方法。
  2. 【請求項２】細菌が腸内細菌科、バチルス科、リゾビウ
    ム科、らせん菌科、乳酸杆菌科、シュードモナス科、ア
    ゾトバクター科、及びニトロバクター科からなる群から
    選ばれる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】細菌がバチルス・チューリンゲンシス（Ba
    cillus thringiensis）Ｍ−７、B.チューリンゲンシス
    ・バラエティ・クルスタキ（var.Kurstaki）HD1、B.チ
    ューリンゲンシスHD2、B.チューリンゲンシス・バラエ
    ティ・フィニティムス（var.finitimus）HD3、B.チュー
    リンゲンシス・バラエティ・アレスティ（var・aleste
    i）HD4、B.チューリンゲンシス・バラエティ・クルスタ
    キHD73、B.チューリンゲンシス・バラエティ・ソットー
    （var.sotto）HD770、B.チューリンゲンシス・バラエテ
    ィ・デンドロニムス（var.dendrolimus）HD7、B.チュー
    リンゲンシス・バラエティ・ケニヤエ（var.kenyae）HD
    5、B.チューリンゲンシス・バラエティ・ガレリアエ（v
    ar.galleriae）HD29、B.チューリンゲンシス・バラエテ
    ィ・カナデンシス（var.canadensis）HD224、B.チュー
    リンゲンシス・バラエティ・エントモシダス（var.ento
    mocidus）HD9、B.チューリンゲンシス・バラエティ・ス
    ブトキシカス（var.subtoxicus）HD109、B.チューリン
    ゲンシス・バラエティ・アイザワイ（Var.aizawi）HD1
    1、B.チューリンゲンシス・バラエティ・モリソニ（va
    r.morrisoni）HD12、B.チューリンゲンシス・バラエテ
    ィ・オストリニアエ（var.ostriniae）HD501、B.チュー
    リンゲンシス・バラエティ・トルウォルシ（var.tolwar
    thi）HD537、B.チューリンゲンシス・バラエティ・ダル
    ムシュタジエンシス（var.darmstadiensis）HD146、B.
    チューリンゲンシス・バラエティ・ツマノフィ（var・t
    oumanffi）HD201、B.チューリンゲンシス・バラエティ
    ・キュウシュエンシス（var.kyushuensis）HD541、B.チ
    ューリンゲンシス・バラエティ・トンブソニ（var・tho
    mpsoni）HD542、B.チューリンゲンシス・バラエティ・
    パキスタニ（var.pakistani）HD395、B.チューリンゲン
    シス・バラエティ・イスラエレンシス（var.israelensi
    s）HD567、B.チューリンゲンシス・バラエティ・インデ
    ィアナ（var.indiana）HD521、B.チューリンゲンシス・
    バラエティ・ダコタ（var.dakota）、B.チューリンゲン
    シス・バラエティ・トーホクエンシス（var.tohokuensi
    s）HD866,B.チューリンゲンシス・バラエティー・クマ
    モトエンシス（var.kumamotoensis）HD867、B.チューリ
    ンゲンシス・バラエティ・トチギエンシス（var.tochig
    iensis）HD868、B.チューリンゲンシス・バラエティ・
    コルメリ（var.colmeri）HD847、B.チューリンゲンシス
    ・バラエティ・ウハネンシス（var.wuhanensis）HD52
    5、B.チューリンゲンシス・バラエティ・テネブリオニ
    ス（var.tenebrionis）からなるバチルスチューリンゲ
    ンシスの殺虫剤生産菌株から選ばれるバチルス種、及び
    B.セレウス（cereus）、B.モリタイ（moritai）、B.ポ
    ピリアエ（popilliae）、B.レンチモルブス（lentimorb
    us）及びB.スファエリクス（sphaericus）から選ばれる
    他のバチル種である、特許請求の範囲第２項に記載の製
    法。
  4. 【請求項４】毒素がポリペプチド毒素を暗号化した異種
    遺伝子の発現結果である特許請求の範囲第１項に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】細胞が微生物、シュードモナスであり、毒
    素がB.チューリンゲンシスに由来する、特許請求の範囲
    第４項に記載の方法。
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