CN102154171A - 一株对蚊子幼虫高效的苏云金芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

一株杀孑孓的苏云金芽孢杆菌菌株及其应用，属于卫生害虫生物防治技术领域。本发明菌株为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WFS-97，菌株保藏号为CGMCC No.3946。进一步，本发明涉及一种对淡色库蚊和白纹伊蚊的幼虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株具有编码杀虫晶体蛋白基因cry30和cyt2，涉及对双翅目害虫高毒力的cry30基因全长核苷酸序列和cyt2基因全长核苷酸序列，以及分别由这两种基因编码的蛋白质氨基酸序列。利用这一菌株可生产杀蚊虫的生物农药，用于防治淡色库蚊和白纹伊蚊的幼虫，其杀虫基因也可用于构建杀蚊工程菌。

Description

一株对蚊子幼虫高效的苏云金芽孢杆菌

技术领域

本发明属卫生害虫的生物防治技术领域。本发明涉及一种对蚊子幼虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，涉及对编码杀蚊毒素的cry30基因全长核苷酸序列和cyt2基因全长核苷酸序列，以及分别由这两种基因编码的蛋白质氨基酸序列。

技术背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt，是一种分布极广的革兰氏阳性细菌，在稳定生长期Bt可形成伴孢晶体(parasporal crystal protein)，又称杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystal protein，ICP)，ICP对敏感昆虫有强烈的毒性，而对它们的天敌、人畜以及植物无害，被开发为生物农药广泛用于防治鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目等多种害虫(Schnepf E，Crickmore N，Van Rie，et al.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J].MicrobiolMol Biol Rev.，1998，62：775-806.)。

双翅目的蚊虫传播多种人类传染性疾病，如疟疾、乙型脑炎、丝虫病、黄热病、登革热等，对人类的健康造成了极大的危害(Masson L，Mazza A，Gringorten L，et al.Specificity domainlocalization of Bacillus thuringiensis insecticidal toxins is highly dependent on the bioassaysystem.Mol Mierobiol.1994，14：851-860.)据统计，由按蚊(Anopheles)传播的疟疾每年发病人数达3亿，并导致1亿人死亡；而每年亦有1.6亿人感染由库蚊传播的丝虫病、5千万人感染由白纹伊蚊传播的登革热(Budiansky S.Creatures of our own making.Science.2002，298：80-86.)。在过去的半个世纪中，大量地使用化学杀虫剂防治蚊虫，但带来了严重的弊端：蚊虫产生抗性，防治效果降低；破坏了生态平衡，也污染了环境，最终危害了人类的健康。人们逐渐认识到采取生物防治是包括蚊虫在内的害虫防治的必然趋势。Bt对白纹伊蚊属、库蚊属、按蚊属的多种蚊虫有很高的杀灭活性，其在蚊虫防治上的成功应用在一定程度上控制了虫媒病的传播。

1976年首次发现对蚊虫有很强杀虫活性的苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis subsp.israelensis，Bti)，目前已发现多种亚种或血清型具有灭蚊活性，如Canadensisi亚种、Morrisoni亚种、Darmstadiensis亚种、Thompsoni亚种和Jegathesan亚种等。同时也发现了多种杀蚊晶体蛋白，如Cry2、Cry4A、Cry4B、Cry10A、Cry11A、Cry11Bb、Cry19A、Cry19B、Cry20Aa、Cry27A、Cry30、Cry40和Cyt等，陆续还不断有新杀蚊蛋白的相关报道(赵新民，夏立秋，王发祥，等.杀蚊苏云金芽孢杆菌及其晶体蛋白研究进展[J].昆虫知识，2007，44(3)：336-342.)。Bti是研究时间较早、研究内容较深、应用范围较广的亚种，它作为生物杀蚊剂被广泛用于蚊虫的控制。野生Bt菌株WFS-97对白纹伊蚊幼虫的杀虫活性明显高于Bti，且杀虫基因不同，因此对于研究开发新的高效Bt杀蚊制剂具有非常重要的意义。

技术内容

本发明的目的是提供一种对蚊虫有高毒力的Bt菌株，以及两种新的cry30和cyt2基因序列，是一株生物杀蚊制剂候选菌株，也可以应用于构建工程菌。

本发明提供的Bt菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)WFS-97菌株。

上述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)WFS-97，已于2010年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC №.3946。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946的筛选方法为醋酸钠抗生素选择性筛选，用含有青霉素钠盐的醋酸钠选择性液体培养基培养土样(200r/min，30℃)4h，土壤悬液离心，取上清65℃热处理后涂LB固体平板，30℃培养3-4d，挑取单菌落涂片，用碱性复红染色，在油镜下观察晶体形状、大小以及芽胞和晶体的分离率。将胞晶混合物涂在盖玻片上，用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金，扫描电子显微镜下观察晶体的形状(见图1)。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946的基因型鉴定方法为用34对通用引物进行PCR扩增，确定其含有cry30和cyt2基因(见图2)。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946的cry30和cyt2基因全长序列克隆方法是，设计全长引物sun30-1/sun30-2和cyt2F/cyt2R分别扩增出PCR产物片段，切胶回收，克隆到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a感受态细胞，以蓝白斑筛选阳性转化子，重组质粒pUCm-T30、pUCm-T2经双酶切检测(见图3)后测序，其测序结果用DNAMAN和NCBI Blast软件进行序列分析。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946晶体蛋白的SDS-PAGE分析方法为，刮取已经胞晶分离的菌苔，用NaCl(1mol/L)、灭菌水交替洗两次，重悬灭菌水中，加入相同体积的2×上样缓冲液，混匀后，100℃煮沸5min，离心(4℃、12000r/min、1min)后取上清用于SDS-PAGE检测(见图4)。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946的生长曲线及pH值变化测定方法为，将苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946接种于LB液体培养基(200r/min，30℃)培养，每2h取样，测定菌液的OD600值和pH值，绘制生长曲线和pH值曲线(见图5)。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946菌的培养方法为，用接种针沾取斜面保存的BtWFS-97菌，在LB固体培养基平板上划线接种，然后放入30±1℃的生化培养箱中培养至胞晶分离，用灭菌水刮下菌苔，离心(4℃、12000r/min、5min)，弃上清，取沉淀用于杀虫活性的测定。

所述苏云金芽孢杆菌CGMCC №.3946的杀虫活性测定方法为，对棉铃虫、粘虫、玉米螟2龄幼虫用人工饲料混合饲喂法，每10g饲料加菌液1mL(湿重200mg/ml)，每个处理设置3个重复，每个重复24头试虫；对小菜蛾2龄幼虫采用浸叶法，选取等量鲜嫩一致的甘蓝叶片，在待测菌液(湿重200mg/ml)中浸泡均匀，自然晾干后放入生测盒，设置3个重复，每个重复15头试虫，28℃培养箱中培养72h后观察死虫数；对淡色库蚊2龄幼虫孑孓的生物测定方法是定量称取湿重Bt菌，配成一定浓度的菌悬液，每10ml菌悬液中15头试虫，设置3～4个重复，28±1℃生化培养箱中培养24h后，观察死虫数；该菌株对白纹伊蚊2龄幼虫孑孓的LC₅₀测定方法是，将菌液稀释成5个浓度梯度，24h后检查各处理死亡数，用杀虫剂毒力测定系统LC₅₀软件计算孑孓的LC₅₀值，并绘制LD-p直线图(见图6)。

附图说明：

图1：WFS-97菌株芽孢和晶体的扫描电镜图片

图2：WFS-97菌株cry30与cyt2基因的鉴定，其中：

M：DNA分子量标准(8kb，5kb，3kb，2kb，1kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb，0.1kb)

1：cry30基因PCR产物

2：cyt2基因PCR产物

图3：重组质粒pUCm-T30、pUCm-T2的酶切分析，其中：

M：DNA分子量标准(8kb，5kb，3kb，2kb，1kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb，0.1kb)

1：pUCm-T30/NcoI & XhoI

2：cry30全长PCR产物

3：pUCm-T

4：pUCm-T2/NcoI & XhoI

5：cyt2全长PCR产物

图4：WFS-97菌株晶体蛋白SDS-PAGE图谱

图5：WFS-97菌株的生长曲线及pH值变化

图6：WFS-97对白纹伊蚊2龄孑孓24h生测的LD-p直线图

具体实施方式

下列实例是进一步对本发明的说明，不应当成为对本发明的限制。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1、苏云金芽孢杆菌WFS-97菌株的分离与鉴定

本发明人自行从土壤中分离了Bt WFS-97菌株，土壤来源于河北省。

称取10g土样放入装有50mL醋酸钠液体培养基(蛋白胨0.5g，酵母粉0.25g，NaCl0.5g，醋酸钠1.8g，水50ml，调pH值7.2-7.4，121℃，高压灭菌30min)的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐使终浓度为400ug/mL，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10mL，加入无菌的离心管内300r/min离心15min，取上层浑浊液1.5mL于65℃水浴锅水浴15min，取热处理后的浑浊液0.2mL涂LB固体培养基(蛋白胨2g，酵母粉1g，NaCl2g，琼脂粉3.2g，水200ml，调pH值7.2-7.4，121℃，高压灭菌30min)平板，将平板置30℃培养箱中培养。3-4d从平板上挑取类似Bt的菌株涂片，用碱性复红染色，在油镜下观察晶体形状、大小以及芽胞和晶体的分离率，发现一株含有球形晶体的菌株，命名为WFS-97。

菌株WFS-97在LB固体培养基中30℃培养72h后，菌落呈乳白色，边缘产生折皱。将胞晶混合物涂在盖玻片上，用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金，扫描电子显微镜下观察晶体的形状(见图1)，可见营养体细胞呈杆状，大小为1.1～1.7μm×4.6～5.7μm，单个或成短链状，胞子囊未见膨大；芽胞椭圆形，大小为1.0～1.04μm×1.78～2.07μm；伴胞晶体呈球形，大小为0.57～0.84μm。

上述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)WFS-97，已于2010年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC №.3946。

实施例2、WFS-97菌株的基因型鉴定

WFS-97菌株总DNA与质粒DNA的提取参考Narva(Narva K，Payne J M，Schwab G E，Hickle L A，Galasan T and Sick A J.Novel Bacillus thuringiensis microbes active againstnematodes，and genes encoding novel nematodes-active toocin from Bacillus thuringiensisisolates(P).European Patent Office，EP0462721，1991.)方法。

以WFS-97菌株总DNA为模板，用31对通用引物进行PCR扩增，确定其含有cry30和cyt2类基因。根据cry30类基因保守区设计的一对通用引物为

S5un30：5-’aagattggctcaatatgtgtc-3’

S3un30：5-’gattatcaggatctacactag-3’

根据cyt2类基因保守区设计的一对通用引物为

cyt2-5：5-’attacaaattgcaaatggtattcc-3’

cyt2-3：5-’tttcaacatccacagtaatttcaaatgc-3’

用下列PCR反应体系(20μL)鉴定WFS-97

10×PCR buffer：2μL

25mM dNTP：     0.5μL

10μM5’引物：  0.4μL

10μM3’引物：  0.4μL

DNA模板：       1μL

Taq酶：         0.2μL

ddH₂O：         15.5μL

扩增循环：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环，72℃延伸10min。

结果(见附图2)显示菌株WFS-97含有cry30与cyt2类基因。

实施例3、cry30与cyt2基因的全长序列测定与分析

参照Gen-Bank发表的cry30和cyt2全长基因序列，利用DNAMAN软件设计了全长引物：

Sun30-1：5-’atgaagccgtatcaaagtgaaaatgaatatga-3’

Sun30-2：5-’ttagttcactggacaagcaaatgcat-3’

cyt2F：5-’atgtatactaaaaattttagtaattc-3’

cyt2R：5-’tcaattcgataaatttaaattttg-3’

用全长引物sun30-1/sun30-2和cyt2F/cyt2R分别扩增出PCR产物片段，切胶回收，回收产物连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，以蓝白斑筛选阳性转化子，得到阳性克隆pUCm-T30和pUCm-T2，检测后测序(双酶切结果见图3)，其测序结果用DNAMAN和NCBI Blast软件进行序列分析。分别得到基因序列SEQ ID NO l和SEQ ID NO 2。

序列SEQ ID NO 1长2064bp，编码688个氨基酸组成的蛋白(其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示)，推导的理论分子量为77.04kD，等电点8.01，为碱性蛋白，GC含量45.2％。同源分析表明该蛋白与Cry30-like protein蛋白具有很高的同源性，达到97％，与其它蛋白同源性比较见表1。

表1  Cry30蛋白同源性比较

进一步分析本发明所述菌株WFS-97的Cry30蛋白氨基酸组成，其中天冬氨酸、异亮氨酸相对含量较高，其它氨基酸含量见表2。

表2  Cry30蛋白的氨基酸组成

氨基酸	数目	百分比％	氨基酸	数目	百分比％
						Ala(A)	49	8.88	Ash(N)	66	9.75
Asx(B)	0	0.00	Pro(P)	43	5.54
						Cys(C)	7	0.95	Gln(Q)	38	6.21
Asp(D)	32	4.76	Arg(R)	26	5.07
						Glu(E)	21	3.46	Ser(S)	46	5.41
Phe(F)	29	5.36	Thr(T)	53	7.06
						Gly(G)	38	3.19	Val(V)	25	3.28
His(H)	7	1.21	Trp(W)	8	1.83
						Ile(I)	65	9.54	Unk(X)	0	0.00
Lys(K)	29	4.74	Tyr(Y)	38	7.70
						Leu(L)	55	8.07	Glx(Z)	0	0.00
Met(M)	12	2	Total	687

序列SEQ ID NO 2长780bp，编码260个氨基酸组成的蛋白(其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)，推导的理论分子量为29.23kD等电点6.9，为酸性蛋白，GC含量49.7％。

同源分析表明该蛋白与cytolytic delta-endotoxin蛋白(AAM09651)同源性最高，达到100％(表3)。

表3  Cyt2蛋白同源性比较

进一步分析本发明所述菌株WFS-97的Cyt2蛋白氨基酸组成，天冬酰胺含量最高，占所有氨基酸成分的11.31％，其它氨基酸组分均低于9％(表4)。

表4  Cyt2蛋白的氨基酸组成

氨基酸	数目	百分比％	氨基酸	数目	百分比％
						Ala(A)	18	4.73	Asn(N)	29	11.31
Asx(B)	0	0.00	Pro(P)	8	2.72
						Cys(C)	1	0.36	Gln(Q)	15	6.47
Asp(D)	9	3.54	Arg(R)	3	1.54
						Glu(E)	11	4.78	Ser(S)	21	6.51
Phe(F)	15	7.31	Thr(T)	14	4.92
						Gly(G)	7	1.55	Val(V)	23	7.95
His(H)	7	3.21	Trp(W)	3	1.81
						Ile(I)	23	8.90	Unk(X)	0	0.00
Lys(K)	15	6.47	Tyr(Y)	9	4.81

Leu(L)	23	8.90	Glx(Z)	0	0.00
						Met(M)	5	2.20	Total	259

实施例4、晶体蛋白的SDS-PAGE分析

在油镜下观察已经胞晶分离的菌落，刮取少量菌苔充分溶于100μL灭菌水中，振荡重悬，离心(4℃、12000r/min、5min)，弃上清，用200μL 1M NaCl重悬后，离心(4℃、12000r/min、5min)，弃上清，再用灭菌水重悬后，离心(4℃、12000r/min、5min)，弃上清，将沉淀重悬于20μL灭菌水中，加入相同体积的2×上样缓冲液，混匀后，100℃煮沸5min，离心(4℃、12000r/min、1min)，取上清用于SDS-PAGE检测，同时以标准菌株苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，Bti)作阳性对照，以同样的方法制作检测样品，结果见图4。

由图4可以看出，WFS-97菌株菌株含有147kDa、75kDa、56kDa、45kDa、30kDa等多个蛋白条带，仅有75kDa和30kDa与参比菌Bti菌株相同，其它条带差别很大。

实施例5、生长特性观察

将菌株WFS-97接种于LB液体培养基中活化过夜，按1％的接种量接菌与LB液体培养基中，振荡培养(28℃、230r/min)，每隔2h取样测定OD600，共测24h。同时测定培养液的pH值，观察其发酵过程中菌株的生长发育状况。

苏云金芽胞杆菌WFS-97在LB液体培养基中生长良好，在生长周期24h内，可正常产生芽胞和伴胞晶体。每隔2h取样测定培养液的OD600值和pH值绘制生长曲线与pH变化(图5)，并观察其发酵过程中菌株的发育状况。其中0～4h为潜伏期，pH值变化不大；4～14h为对数生长期，14h营养体开始出现内生芽胞，芽胞位于杆菌的中央，pH值呈先迅速下降，后缓慢回升的现象，在8h时达到最低点pH5.82；14～24h为稳定期，有大约80％的营养体出现芽胞，芽胞位于杆菌的中央，晶体蛋白位于杆菌的两端，但是没有发生胞晶分离，此阶段pH值呈缓慢上升，到24h时pH达7.15。

实施例6、对鳞翅目幼虫杀虫活性测定

对棉铃虫、粘虫等2龄幼虫的生物测定用人工饲料混合饲喂法，每10g饲料加菌液1mL(湿重200mg/ml)，每个处理设置3个重复，每个重复24头试虫，28±1℃培养箱中培养72h后调查死亡数；对小菜蛾2龄幼虫采用浸叶法，选取等量鲜嫩一致的甘蓝叶片，在待测菌液(湿重200mg/ml)中浸泡均匀，自然晾干后放入生测盒，设置3个重复，每个重复15头试虫，28℃培养箱中培养72h后观察死虫数。WFS-97菌株对几种鳞翅目昆虫的毒力测定结果发现，该菌株对鳞翅目重要害虫棉铃虫、小菜蛾、粘虫等2龄幼虫均无杀虫活性，

实施例7、对淡色库蚊幼虫的杀虫活性测定

对淡色库蚊的2龄幼虫孑孓的生物测定方法是用灭菌水将Bt WFS-97菌稀释成2mg/ml、0.2mg/ml和0.02mg/ml菌悬液(湿重)，每个处理10ml菌悬液，放入15头试虫，设置3个重复，以Bti作参照菌株，28±1℃培养箱中培养24h后调查死亡数，计算死亡率。生测结果表明Bt WFS-97菌株对淡色库蚊的幼虫有较强的杀虫活性，其24h杀虫活性分别达到98.3％、93.3％和23.3％。

实施例8、对白纹伊蚊幼虫的杀虫活性测定

该菌株对白纹伊蚊2龄孑孓的LC₅₀测定方法是，将Bt WFS-97菌稀释成5个浓度梯度，每个处理10ml菌悬液，放入15头试虫，设置3个重复，以Bti作参照菌株，28±1℃培养箱中培养24h后调查死亡数，用杀虫剂毒力测定系统LC₅₀软件分析。

对白纹伊蚊的毒力测定结果表明(见图6)，该菌株对白纹伊蚊2龄幼虫孑孓有很高的杀虫活性，对白纹伊蚊2龄幼虫的毒力曲线方程为y＝2.7132+1.6676x，LC₅₀为0.0235mg/mL(95％置信限：0.016670-0.033170)，其毒力明显高于标准菌株Bti(毒力曲线方程为y＝2.0045+1.6676x，LC₅₀为1.2835mg/mL，95％置信限：0.856255-1,923705)。

序列表

[0001] 附：核苷酸和氨基酸序列表

[0002] <110>王勤英 郭丽伟 宋萍 张冬冬

[0003] <120>一株对蚊子幼虫高效的苏云金芽孢杆菌

[0004] <140>201110006409.0

[0005] <141>2011-01-13

[0006] <160>4

[0007] <210>1

[0008] <211>2064

[0009] <212>DNA

[0010] <213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

[0011] <400>1

[0012] atgcgagccg tacaaagtga aaatgaatat gaaatattgg atgccttacc aaagtattcg     60

[0013] aacatcgtca atgtttattc aaggtatccg ttagcaaata atccacaagt tcctttacaa    120

[0014] aatacaagtt ataaagattg gcttaatatg tgtcaaacta ttactccact ttgtactcct    180

[0015] atagacattg atagtaaatt agtcgctacc gctataggga tactaggcgc tatattcaaa    240

[0016] gctatgcctg gtccaggatc agctgtagga ttatttttaa aaactttttc aacaataata    300

[0017] cctattcttt ggccaaatga caacacaccg atatggaaag agttcacaaa acaaggattg    360

[0018] caacttttta gaccggaatt aggcagagat gcaatagaaa ttataggcaa cgacgtacag    420

[0019] tccggcttca acgcgttaaa agaccacatg aacgactttg agactaagtt tgaaatctgg    480

[0020] gacaaagata gaactcaaac taatgcaaca tatctcataa ctgcatttgg cgttgttaac    540

[0021] ggtaaaatta tcgaccttaa aaatcaattc ttaataaacc ccgcaaatca acccgcattt    600

[0022] ctaaatctct atgcacaaac tgccaatatt gatttgattt tatatcaaag aggggccgta    660

[0023] tatggagata attgggcaaa agctataaat gatagttcca tatctccgtt taatagttcg    720

[0024] caaatttttt atgactcttt aaaagctaaa ataaaagagt atactaatta ttgtgcagaa    780

[0025] acatatagaa acagtttaac tatactcaaa aatcaaccca atatccaatg ggatatatat    840

[0026] aatagatatc gtagagaggc gactttaggt gcattagatt tagttgcatt attcccaaat    900

[0027] tacgatatat gtaaatatcc aatctcaaca aaaacagaac ttactagaaa agtttatatg    960

[0028] ccatcattct atttacaagc acttcaacat agtaacatag aagcattgga aaaccaactt   1020

[0029] acacatcccc catcattatt tacttggtta aacgaattaa acctttatac aatacgtgaa   1080

[0030] aatttcaatc cagctttaca ggtatcttca ttgtcaggtc ttcaagctaa atatcgttat   1140

[0031] acccaaaatt cgactatact tcctaatccg ccggctcaag gaatcacaaa tggcacacca   1200

[0032] ataccaataa tagggttaaa taacttgttt atttataaac tatcaatgtc acaatatcgt   1260

[0033] catccaaatg attgtgtacc aatagctgga atttccgata tgacctttta taaaagtgac   1320

[0034] tataatggca atgcttccgc aactcaaact tatcaagcag gtagaaactc caataatgtc   1380

[0035] atagatacat ttatgaatgg tccacaaaat gcatcaagct caaataatat ttctattaac   1440

[0036] caaacaaatc atatactatc tgatattaaa atgaattacg ctcgatctgg cggagtttat    1500

[0037] gattttggat attcatttgc ttggacacat actagtgtag atcctgataa tctaattgtt    1560

[0038] ccgaatagaa ttacacaaat tccagctgtt aaagctaact atttgtcttc accagctaga    1620

[0039] gtaattgcag ggcctggtca tacaggagga gatttagttg ctcttctaaa cggtggtact    1680

[0040] caagctggta gaatgcaaat ccaatgtaaa acaggtagct ttactggagc ttccagacgt    1740

[0041] tatggtatac gcatgcgtta tgctgcaaat aatgcattta cagtgagtcc atcatatact    1800

[0042] ttacagggtg gtaatacaat aagtacaaca tttattaccg aacgtacatt ttcaagacct    1860

[0043] aataatataa taccaacgga tttaaaatac gaggagttta aatataaaga atataatcaa    1920

[0044] attattacaa tgacttcacc tcaaaataca atagtaacta tagctattca acaactaaat    1980

[0045] ccgatcccaa atgatcaatt aattattgac agaatcgaat tttatccagt ggatcaaggt    2040

[0046] gcatttgctt gtccagtgaa ctaa                                           2064

[0047] <210>2

[0048] <211>780

[0049] <212>DNA

[0050] <213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

[0051] <400>2

[0052] atgtatacta aaaattttag taattccaga atggaagtaa aaggtaataa cgggtgttct     60

[0053] gcacctatta ttagaaaacc atttaaacat attgtattaa cggttccatc cagtgattta    120

[0054] gataatttta atacagtctt ttatgtacaa ccacaataca ttaatcaggc tcttcattta    180

[0055] gcaaatgctt ttcaaggggc tatagaccca cttaatttaa atttcaattt tgaaaaggca    240

[0056] ctccaaattg caaatggtat tcctaattct gcaattgtaa aaactcttaa tcaaagtgtt    300

[0057] atacagcaaa cagttgaaat ttcagttatg gttgagcaac ttaaaaagat tattcaagag    360

[0058] gttttaggac ttgttattaa cagtactagt ttttggaatt cggtagaagc tacaattaaa    420

[0059] ggcacattta caaatttaga cactcaaata gatgaagcat ggattttttg gcatagttta    480

[0060] tccgcccaca atacaagtta ttattataat attttatttt ctattcaaaa tgaagataca    540

[0061] ggtgcagtta tggcagtatt acctttagca tttgaggttt ctgtggatgt tgaaaaacaa    600

[0062] aaagtattat tctttacaat aaaagatagt gcacgatatg aagttaaaat gaaagctttg    660

[0063] actttagttc aagctctaca ttcctctaat gccccaattg tagatatatt taatgttaat    720

[0064] aactataatt tataccattc taatcataag attattcaaa atttaaattt atcgaattga    780

[0065] <210>3

[0066] <211>688

[0067] <212>PRT

[0068] <213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

[0069] <400>3

[0070] Met Arg Ala Val Gln Ser Glu Asn Glu Tyr Glu Ile Leu Asp Ala

[0071] 1               5                   10                   15

[0072] Leu Pro Lys Tyr Ser Asn Ile Val Asn Val Tyr Ser Arg Tyr Pro

[0073]                 20                 25                  30

[0074] Leu Ala Asn Asn Pro Gln Val Pro Leu Gln Asn Thr Ser Tyr Lys

[0075]                  35                  40                  45

[0076] Asp Trp Leu Asn Met Cys Gln Thr Ile Thr Pro Leu Cys Thr Pro

[0077]                  50                  55                  60

[0078] Ile Asp Ile Asp Ser Lys Leu Val Ala Thr Ala Ile Gly Ile Leu

[0079]                  65                  70                  75

[0080] Gly Ala Ile Phe Lys Ala Met Pro Gly Pro Gly Ser Ala Val Gly

[0081]                  80                  85                  90

[0082] Leu Phe Leu Lys Thr Phe Ser Thr Ile Ile Pro Ile Leu Trp Pro

[0083]                  95                 100                 105

[0084] Asn Asp Asn Thr Pro Ile Trp Lys Glu Phe Thr Lys Gln Gly Leu

[0085]                 110                 115                 120

[0086] Gln Leu Phe Arg Pro Glu Leu Gly Arg Asp Ala Ile Glu Ile Ile

[0087]                 125                 130                 135

[0088] Gly Asn Asp Val Gln Ser Gly Phe Asn Ala Leu Lys Asp His Met

[0089]                 140                 145                 150

[0090] Asn Asp Phe Glu Thr Lys Phe Glu Ile Trp Asp Lys Asp Arg Thr

[0091]                 155                 160                 165

[0092] Gln Thr Asn Ala Thr Tyr Leu Ile Thr Ala Phe Gly Val Val Asn

[0093]                 170                 175                 180

[0094] Gly Lys Ile Ile Asp Leu Lys Asn Gln Phe Leu Ile Asn Pro Ala

[0095]                 185                 190                 195

[0096] Asn Gln Pro Ala Phe Leu Asn Leu Tyr Ala Gln Thr Ala Asn Ile

[0097]                 200                 205                 210

[0098] Asp Leu Ile Leu Tyr Gln Arg Gly Ala Val Tyr Gly Asp Asn Trp

[0099]                 215                 220                 225

[0100] Ala Lys Ala Ile Asn Asp Ser Ser Ile Ser Pro Phe Asn Ser Ser

[0101]                 230                 235                 240

[0102] Gln Ile Phe Tyr Asp Ser Leu Lys Ala Lys Ile Lys Glu Tyr Thr

[0103]                 245                 250                 255

[0104] Asn Tyr Cys Ala Glu Thr Tyr Arg Asn Ser Leu Thr Ile Leu Lys

[0105]                 260                 265                 270

[0106] Asn Gln Pro Asn Ile Gln Trp Asp Ile Tyr Asn Arg Tyr Arg Arg

[0107]                 275                 280                 285

[0108] Glu Ala Thr Leu Gly Ala Leu Asp Leu Val Ala Leu Phe Pro Asn

[0109]                 290                 295                 300

[0110] Tyr Asp Ile Cys Lys Tyr Pro Ile Ser Thr Lys Thr Glu Leu Thr

[0111]                 305                 310                 315

[0112] Arg Lys Val Tyr Met Pro Ser Phe Tyr Leu Gln Ala Leu Gln His

[0113]                 320                 325                 330

[0114] Ser Asn Ile Glu Ala Leu Glu Asn Gln Leu Thr His Pro Pro Ser

[0115]                 335                 340                 345

[0116] Leu Phe Thr Trp Leu Asn Glu Leu Asn Leu Tyr Thr Ile Arg Glu

[0117]                 350                 355                 360

[0118] Asn Phe Asn Pro Ala Leu Gln Val Ser Ser Leu Ser Gly Leu Gln

[0119]                 365                 370                 375

[0120] Ala Lys Tyr Arg Tyr Thr Gln Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asn Pro

[0121]                 380                 385                 390

[0122] Pro Ala Gln Gly Ile Thr Asn Gly Thr Pro Ile Pro Ile Ile Gly

[0123]                 395                 400                 405

[0124] Leu Asn Asn Leu Phe Ile Tyr Lys Leu Ser Met Ser Gln Tyr Arg

[0125]                 410                 415                 420

[0126] His Pro Asn Asp Cys Val Pro Ile Ala Gly Ile Ser Asp Met Thr

[0127]                 425                 430                 435

[0128] Phe Tyr Lys Ser Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Ser Ala Thr Gln Thr

[0129]                 440                 445                 450

[0130] Tyr Gln Ala Gly Arg Asn Ser Asn Asn Val Ile Asp Thr Phe Met

[0131]                 455                 460                 465

[0132] Asn Gly Pro Gln Asn Ala Ser Ser Ser Asn Asn Ile Ser Ile Asn

[0133]                 470                 475                 480

[0134] Gln Thr Asn His Ile Leu Ser Asp Ile Lys Met Asn Tyr Ala Arg

[0135]                 485                 490                 495

[0136] Ser Gly Gly Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Ser Phe Ala Trp Thr His

[0137]                 500                 505                 510

[0138] Thr Ser Val Asp Pro Asp Asn Leu Ile Val Pro Asn Arg Ile Thr

[0139]                 515                 520                 525

[0140] Gln Ile Pro Ala Val Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Ser Pro Ala Arg

[0141]                 530                 535                 540

[0142] Val Ile Ala Gly Pro Gly His Thr Gly Gly Asp Leu Val Ala Leu

[0143]                 545                 550                 555

[0144] Leu Asn Gly Gly Thr Gln Ala Gly Arg Met Gln Ile Gln Cys Lys

[0145]                 560                 565                 570

[0146] Thr Gly Ser Phe Thr Gly Ala Ser Arg Arg Tyr Gly Ile Arg Met

[0147]                 575                 580                 585

[0148] Arg Tyr Ala Ala Asn Asn Ala Phe Thr Val Ser Pro Ser Tyr Thr

[0149]                 590                 595                 600

[0150] Leu Gln Gly Gly Asn Thr Ile Ser Thr Thr Phe Ile Thr Glu Arg

[0151]                 605                 610                 615

[0152] Thr Phe Ser Arg Pro Asn Asn Ile Ile Pro Thr Asp Leu Lys Tyr

[0153]                 620                 625                 630

[0154] Glu Glu Phe Lys Tyr Lys Glu Tyr Asn Gln Ile Ile Thr Met Thr

[0155]                 635                 640                 645

[0156] Ser Pro Gln Asn Thr Ile Val Thr Ile Ala Ile Gln Gln Leu Asn

[0157]                 650                 655                 660

[0158] Pro Ile Pro Asn Asp Gln Leu Ile Ile Asp Arg Ile Glu Phe Tyr

[0159]                 665                 670                 675

[0160] Pro Val Asp Gln Gly Ala Phe Ala Cys Pro Val Asn ***

[0161]                 680                 685

[0162] <210>4

[0163] <211>260

[0164] <212>PRT

[0165] <213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

[0166] <400>4

[0167] Met Tyr Thr Lys Asn Phe Ser Asn Ser Arg Met Glu Val Lys Gly

[0168] 1                5                  10                   15

[0169] Asn Asn Gly Cys Ser Ala Pro Ile Ile Arg Lys Pro Phe Lys His

[0170]                  20                  25                  30

[0171] Ile Val Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp Leu Asp Asn Phe Asn Thr

[0172]                 35                  40                  45

[0173] Val Phe Tyr Val Gln Pro Gln Tyr Ile Asn Gln Ala Leu His Leu

[0174]                 50                  55                  60

[0175] Ala Asn Ala Phe Gln Gly Ala Ile Asp Pro Leu Asn Leu Asn Phe

[0176]                 65                   70                  75

[0177] Asn Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Gly Ile Pro Asn Ser

[0178]                  80                  85                  90

[0179] Ala Ile Val Lys Thr Leu Asn Gln Ser Val Ile Gln Gln Thr Val

[0180]                  95                 100                 105

[0181] Glu Ile Ser Val Met Val Glu Gln Leu Lys Lys Ile Ile Gln Glu

[0182]                 110                 115                 120

[0183] Val Leu Gly Leu Val Ile Asn Ser Thr Ser Phe Trp Asn Ser Val

[0184]                 125                 130                 135

[0185] Glu Ala Thr Ile Lys Gly Thr Phe Thr Asn Leu Asp Thr Gln Ile

[0186]                 140                 145                 150

[0187] Asp Glu Ala Trp Ile Phe Trp His Ser Leu Ser Ala His Asn Thr

[0188]                 155                 160                 165

[0189] Ser Tyr Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ser Ile Gln Asn Glu Asp Thr

[0190]                 170                 175                 180

[0191] Gly Ala Val Met Ala Val Leu Pro Leu Ala Phe Glu Val Ser Val

[0192]                 185                 190                 195

[0193] Asp Val Glu Lys Gln Lys Val Leu Phe Phe Thr Ile Lys Asp Ser

[0194]                 200                 205                 210

[0195] Ala Arg Tyr Glu Val Lys Met Lys Ala Leu Thr Leu Val Gln Ala

[0196]                 215                 220                 225

[0197] Leu His Ser Ser Asn Ala Pro Ile Val Asp Ile Phe Asn Val Asn

[0198]                 230                 235                 240

[0199] Asn Tyr Asn Leu Tyr His Ser Asn His Lys Ile Ile Gln Asn Leu

[0200]                 245                 250                 255

[0201] Asn Leu Ser Asn ***

[0202]                 260

 

Claims (6)

1.一种苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC №.3946。

2.根据权利要求1所述的菌株在杀灭蚊子幼虫的应用。

3.根据权利要求1所述的菌株经鉴定含有的cry30基因，其特征是该基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的cry30基因编码的Cry30蛋白，且具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的菌株经鉴定含有的cyt2基因，其特征是该基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的cyt2基因编码的Cyt2蛋白，且具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。

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