CN1368549A

CN1368549A - 一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株及制备方法

Info

Publication number: CN1368549A
Application number: CN 02115580
Authority: CN
Inventors: 阎建平; 郑大胜; 袁志明; 罗绍彬; 王惠杰
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2002-09-11
Anticipated expiration: 2022-03-06
Also published as: CN1207381C

Abstract

本发明公开了一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株及制备方法,苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis Tm13－14,CCTCC NO:M202004。首先对虫尸经表皮消毒、研碎,置于营养培养液中,振荡培养一定时间;其次是将培养液稀释,涂布到分离培养基上,恒温箱中倒置培养;再是将单菌落纯化,接种于发酵培养基进行摇瓶发酵,至伴孢晶体脱落;第四是将发酵液稀释,进行靶标昆虫的生物测定。本发明具有杀虫谱广,杀虫活性较高,对小菜蛾、甜菜夜蛾、致倦库蚊、马铃薯瓢虫等昆虫均具有毒杀作用。

Description

一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株及制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensisTm13-14菌株，还涉及该苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称BT)是目前世界上应用最广泛、研究最深入的杀虫微生物，因其能在产芽孢的同时产生对某些害虫有特异毒杀性的伴孢晶体，而对人畜无毒、不伤害控制害虫群体的天敌，且不污染环境，一直是生物防治的重要组成部分，BT杀虫剂也是最广泛的生物杀虫剂。但是，不同的BT菌株对不同目的昆虫具有毒杀特异性，1901年发现苏云金芽孢杆菌以来，一直认为仅对鳞翅目昆虫有毒杀作用，直到1977年发现苏云金芽孢杆菌以色列变种(subsp.israelensis)，对双翅目蚊幼虫有特异性敏感性。打破了长期以来认为苏云金芽孢杆菌只对鳞翅目昆虫有效的固有观点，不仅把应用目标扩充到医学领域，还为研究不同毒力菌株的特异性提供了启迪。以此为契机，对几种鞘翅目幼虫有毒效，而对鳞翅目和双翅目无毒效的新菌株——拟步行甲亚种(subsp.tenebrionis)于1982年从联邦德国分离出来。但是一个菌株对鳞翅目、双翅目、鞘翅目同时具有毒杀作用的广谱杀虫BT菌种尚未见到报道。这一杀虫谱相对较窄的特性，在一定程度上制约BT杀虫剂广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，该菌株对鳞翅目、双翅目、鞘翅目具有毒杀作用，利用该菌株能开发出一种广谱、高效的BT杀虫剂。

本发明另一个目的在于提供一种制备苏云金芽孢杆菌菌株的方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

从黄粉虫(Tenebrio molitor)虫尸分离的一株苏云金芽孢杆菌。用发酵培养基进行发酵，培养至伴孢晶体脱落。对小菜蛾、甜菜夜蛾、致倦库蚊、马铃薯瓢虫进行生物测定，对上述供试昆虫均显示较强杀虫作用。对该菌株进行血清学、形态学、生理生化特征分析。其命名为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis Tm13-14。该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M202004。

其步骤是：

1.将虫尸经表皮消毒、研碎，置于装有5ml的营养培养液中，经75-80℃，水浴14-20分钟，振荡培养46-52小时。

2.将培养液稀释至10^-7-10^-8倍，涂布到分离培养基上，28-30℃恒温箱中倒置培养3-4天，挑选产生晶体、芽孢单菌落。

3.将单菌落纯化，接种于发酵培养基进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落。

4.将发酵液稀释，进行靶标昆虫的生物测定。

5.菌株的形态学描述。

6.血清学及生理生化特征分析。

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Tm13-14的性质：

根据上述实施方法，得到一株对鳞翅目、双翅目、鞘翅目同时具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株，命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensisTm13-14，该菌株于2002年1月31日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M202004。

1.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Tm13-14菌株的杀虫活性：该菌株在发酵培养基中培养至伴孢晶体脱落，发酵液稀释800-2000倍，对鳞翅目昆虫小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigue)、双翅目昆虫致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatces)和鞘翅目昆虫马铃薯瓢虫(Epilachnaniponica)，致死率为70-90％。显示出较强的毒杀作用。

2.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Tm13-14菌株的形态特征：营养细胞杆状，两端钝圆，周身鞭毛、芽孢囊不膨大，芽孢椭圆形，端生。伴孢晶体呈球形、不规则形、方形和棱形。

3.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Tm13-14菌株的血清学及生理生化特征：鞭毛抗原分析属H₁血清型。V.P反应+；卵磷脂酶+；精氨酸脱羧酶+；尿酶-；菌膜+；几丁质-；蛋白质水解酶+；淀粉水解酶++；水杨苷+；七叶灵+++；蔗糖+；甘露糖+。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：本发明选择了鳞翅目主要害虫(小菜蛾、甜菜夜蛾)，双翅目主要害虫(致倦库蚊)，鞘翅目主要害虫(马铃薯瓢虫)为靶标昆虫，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Tm13-14同时对上述3个目的主要害虫，均具有较强的毒杀作用。具有农业上的重要性，既有经济意义也有广泛的市场需求，有利于广谱BT杀虫剂产品的开发、生产及推广。目前市场上BT杀虫剂产品仅对单一目昆虫有效，即或者对鳞翅目、或者对双翅目、或者对鞘翅目昆虫有效，同时对3个目昆虫有效的BT杀虫剂产品尚未见报道。

具体实施方式

1.菌种分离、培养

将虫尸经表皮消毒、研碎，置于装有5ml的营养培养液中，经78℃，水浴15分钟，振菌培养48小时。将培养液稀释至10^-7-10^-8倍，涂布到分离培养基上，30℃恒温箱中倒置培养3天，镜检挑选产生伴孢晶体的单菌落。

营养培养液：蛋白胨1％牛肉膏0.3％ NaCl0.5％ PH7.5。

分离培养基：蛋白胨1％牛肉膏0.3％ NaCl0.5％琼脂2％ PH7.5。

2.菌种摇瓶发酵

将分离纯化菌株用发酵培养基进行摇瓶发酵，500ml的摇瓶装量80ml，摇床转速为230rpm，培养温度30℃，培养时间72小时。取样涂片显微镜观察，伴孢晶体脱落50％，无污染且菌株生长良好的发酵液用于生物测定。

发酵培养基：淀粉2％豆粕3％酵母粉0.3％ CaCO₃0.1％ PH8.5。

3.生物测定

将发酵液稀释至800-2000倍，放入一定量的靶标昆虫，置入26℃温箱中，72小时后计算供试昆虫死亡率。

Claims

1、一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征在于苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis Tm13-14，CCTCC NO：M202004。

2、一种实现权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，包括下列步骤：

A、将虫尸经表皮消毒、研碎，置于装有5ml的营养培养液中，经75-80℃，水浴14-20分钟，振荡培养46-52小时；

B、将培养液稀释至10^-7-10^-8倍，涂布到分离培养基上，28-30℃恒温箱中倒置培养3-4天，挑选产生伴孢晶体的单菌落；

C、将单菌落纯化，接种于发酵培养基进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落；

D、将发酵液稀释，进行靶标昆虫的生物测定。

3、根据权利要求2所述的一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于营养培养液为蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％、PH7.5。

4.根据权利要求2所述的一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于分离培养基为蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％、琼脂2％、PH7.5。

5、根据权利要求2所述的一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于发酵培养基为淀粉2％、豆粕3％、酵母粉0.3％、CaCO₃0.1％、PH8.5。

6、根据权利要求2所述的一种具有广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于将发酵液稀释至800-2000倍，放入靶标昆虫，置入26℃温箱中，72小时后计算昆虫死亡率。