CN112342159A

CN112342159A - 一种芽孢杆菌新菌株hsy204及其杀虫基因和应用

Info

Publication number: CN112342159A
Application number: CN202011240491.9A
Authority: CN
Inventors: 张文飞; 吴江玉; 贾璐羽; 何佳利; 范子钰; 蔡雨辰; 张旭东; 王锐萍
Original assignee: Haikou Haisenyuan Biotechnology Co ltd; Hainan Normal University
Current assignee: Haikou Haisenyuan Biotechnology Co ltd; Hainan Normal University
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: WO2022095295A1; CN112342159B

Abstract

本发明提供一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用，芽孢杆菌新菌株HSY204的分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204，其包括3个新型杀虫基因；经过生物活性测定表明菌株HSY204及其杀虫基因对埃及伊蚊幼虫具有很高的毒性，对蚊子的生长具有明显影响，可应用防控蚊虫，有效降低蚊媒疾病大规模传播的风险。

Description

一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域和分子生物学技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用。

背景技术

蚊虫是我们熟悉的一种害虫，它的种类繁多，已知全世界有3200多种，其中我国已知蚊类达18个属48个亚属和371种或亚种。蚊虫不仅严重影响我们的生活，更重要的是它是传播多种疾病的媒介。目前在我国吸血并能传播疾病的蚊种有10多种。以蚊子为媒介传播的病在预防医学中占有重要地位，因为蚊类传播的转播力强、发病率高、危害性大。其传播的疾病主要有疟疾、登革热、丝虫病、流行性乙型脑炎和寨卡等，严重地危害着人民群众的身体健康。

近年来我国一些老的以蚊子为媒介传播的疾病不断复发，并且新的以蚊子为媒介传播不时出现，因此对蚊子的防治受到广泛关注。蚊子防控的主要策略有环境防治、化学防治和生物防治等。环境防治效率较低；化学防治效率高、见效快但污染环境，短时间内会导致抗性产生、高残，甚至直接导致人畜中毒。而生物防治既是用一种生物控制另一种生物或者利用生物本身的特点来控制，其最大的优点是比环境比较友好、成本低。

目前随着对杀蚊活性的菌株中晶体蛋白结构和有关分子作用机理的不断广泛而深入研究，并通过利用现代生物技术手段提高杀蚊效果。无疑，研究高效的菌株生物杀虫剂，对控制蚊虫具有非常重要的现实意义。研究杀蚊作用机理的关键是受体。Pootanakit等已从埃及伊蚊(Aedes aegypti)中肠中鉴定出两种晶体蛋白作用受体——氨肽酶N异构体。Charles等发现以色列亚种晶体蛋白作用于伊蚊的肠道上皮细胞导致其组织病理学变化与鳞翅目昆虫中的情况相似。芽孢杆菌是一类兼性厌氧或好氧，革兰氏阳性杆菌的总称，产芽孢，生理特征丰富多样，分布极其广泛，是植物体表、根际和土壤、空气的重要微生物种群。芽孢杆菌是一类产生大量的不同化学结构的多肽抗菌物质的物种。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是环境中常见的食源性致病菌之一，兼性好氧。生长温度范围20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境，但目前对于蜡样芽孢杆菌在杀虫剂方面中的应用未见报导。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204是海森元生物科技有限公司从海南热带雨林分离一株菌。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204进行生物测定结果表明该菌对蚊子具有高毒力，明显对蚊子的生长具有影响，预示着该菌在防治蚊虫方面有着良好的应用前景。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种芽孢杆菌新菌株HSY204，其分类命名为蜡样芽孢杆菌 (Bacilluscereus)HSY204，于2020年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO.M2020523。保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

进一步说明，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204包括3个新型杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877；其中，orf5878、orf5055和orf5877的DNA序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步说明，所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

进一步说明，所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的克隆方法为：以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204的基因组为模板，采用PCR扩增方法，分别获得orf5878、orf5055和orf5877的完整杀虫基因片段。

进一步说明，所述PCR扩增的引物序列与限制性内切酶包括：

orf5878引物F：taagaaggagatatacatatgaaaataatgggggaatatatat，R： gtggtggtggtggtgctcgagccaccaaactccctcttttac，限制性内切酶为Nde Ⅰ和Xho Ⅰ；

orf5055引物F：taagaaggagatatacatatgaattcaaatattcaaaattcta，R： gtggtggtggtggtgctcgagccggtaaggtaccaattcaat，限制性内切酶为Nde Ⅰ和Xho Ⅰ；

Orf5877引物F：taagaaggagatatacatatggttactacaaaaatgatacctag，R： gtggtggtggtggtgctcgagaatttgatccgattcgtataact，限制性内切酶为Nde Ⅰ和Xho Ⅰ；

一种芽孢杆菌新菌株HSY204的应用为，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204在杀伊蚊方面中的应用。

进一步说明，所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204在制备杀蚊剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对蜡样芽孢杆菌 (Bacilluscereus)HSY204进行筛选、鉴定、营养期杀虫蛋白的杀虫活性以及其基因的克隆表达等实验，经过生物活性测定表明，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204菌株及其杀虫蛋白对埃及伊蚊幼虫具有很高的毒性，对蚊子的生长具有明显影响，对小菜蛾和棉铃虫的生长没有影响，可以应用防控蚊虫，有效降低蚊媒疾病大规模传播的风险。

附图说明

图1为本发明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204不同视野倍数下的光学显微镜图；

图2为本发明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204培养到芽孢期时的不同视野倍数下的扫描电镜图；

图3为本发明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204的SDS-PAGE分析，图中，1：HSY204；2：Bti(Bacillus thuringiensis israelensis)

图4为本发明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204杀虫基因PCR扩增产物琼脂糖电泳分析图，图中，A为5877基因；B为5878基因；C为5055基因；

图5为本发明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204杀虫基因5055、5877、 5878蛋白的SDS-PAGE分析图，图中，A为5877蛋白；B为5878蛋白；C为 5055蛋白。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的酶,试剂盒及其他试剂均购自上海生物工程有限公司。

以下实施例中所用引物由上海生物工程有限公司代为合成。

实施例1-菌株HSY204的筛选与鉴定

(1)土壤样品采集：采样地点选择在海南省热带雨林，为了增加获取新菌株的概率，采样点选择植被保护完整、生态环境没有人为干预少、土壤腐殖质丰富的地方；

(2)菌株HSY204筛选：采用醋酸钠-温度筛选法，称取5g左右土壤放入 20ml BPA培养基中，充分振荡，30℃摇床培养4-5h，75℃水浴15min，取1ml 上清稀释至10^-3、10^-4和10^-5，各吸取200μL NB平板，30℃倒置培养3d，挑取形态各异的单菌落划平板。

(3)芽孢杆菌培养3-5天形成芽孢后，进一步利用石炭酸复红染色和光学显微镜分离株的是否含有伴胞晶体蛋白，光学显微镜下观察到无色芽孢为芽孢杆菌，产生伴胞晶体的芽孢杆菌，命名为蜡样芽孢杆菌HSY204，然后进一步用电子显微镜观察芽孢的形状，如图1和图2所示，可以出菌和晶体的具体形状。为了明确筛选得到野生菌株的杀虫活性，以埃及伊蚊作为靶标昆虫进行生物测定，筛选一株菌株HSY204对伊蚊表现出很好的杀虫效果，命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204。为了进一步鉴定该菌株是否为新型芽孢菌株，通过 SDS-PAGE电泳分析其伴胞晶体带型，发现菌株HSY204与标准菌株有类似的带，如图3所示。

实施例2-菌株HSY204的DNA提取及杀虫基因鉴定

通过利用MiSeq Illumina下一代测序和PacBio技术对菌株HSY204的基因组序列进行分子和生物信息学分析。

1.菌株HSY204基因组DNA提取

(1)HSY204单菌落接种于2-5mL左右的LB液体培养基中，28℃，220rpm 培养过夜活化；

(2)第二天按1％量转接到新鲜的LB液体培养基中，28℃，220rpm继续培养4～6小时至OD600＝2.0左右；

(3)以8000rpm离心2min收集1-3mL菌体；

(4)1mL J Buffer(0.1M Tris HCl(pH 8.0)、0.1M EDTA(pH 8.0)、0.15M Nacl)洗涤沉淀，8000rpm离心2min，弃上清；

(5)移液枪吹打将沉淀重新悬浮于500μL J Buffer(J Buffer使用前预先加入溶菌酶至20mg/mL)中，37℃温育30min，期间振荡3-5次；

(6)加入15μLRNase(10mg/mL)，50℃作用15min；

(7)再加入80μL SDS(10％)，70℃处理20min，室温冷却至室温；

(8)等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)氯仿：异戊醇(24：1)各抽提一次(上下剧烈倒置10-30次，12,000rpm离心10min，小心吸取上清)；

(9)加入等体积的异丙醇混匀，12,000rpm离心10min，倾去上清；

(10)加入500μL的70％乙醇(勿剧烈震荡)，12,000rpm离心2min；

(11)风干后溶50μL TE Buffer中，取5μL DNA溶液在1.0％的胶电泳检测。

2.菌株HSY204杀虫基因鉴定

用菌株HSY204的基因组DNA片段构建了Illumina pair-end文库和SMRT bell文库，分别用于Illumina Hiseq和PacBio RSII进行全基因组测序。PacBio 的原始测序数据用Canu软件进行组装，软件Pilon用Illumina的原始测序数据对Canu的组装结果进行了较正，最终得到了HSY204全基因组长度为 6,035,572bp，0个gap，由一个染色体和四个质粒组成。使用Glimmer软件进行基因预测，得到HSY204包含6102个CDS。将这些基因在六个数据库(NR, Swiss-Prot,Pfam,EggNOG,GO and KEGG)中进行了注释，以进一步发掘出潜在功能。

rRNA和tRNA分别用软件RNAmmer-1.2和tRNAscan-SE进行预测。

实施例3-菌株HSY204杀虫基因克隆表达

通过采用碱裂解的方法提取菌株HSY204的基因组DNA，根据基因orf5878、orf5055、和orf5877的编码序列设计引物，并采用无缝克隆的技术手段将基因插入表达载体pET-30a，构建成功的重组子转入BL(DE3)，进行诱导表达。

无缝克隆(SeamLess cloning)技术具体为：

A.采用双酶切法者PCR扩增方法将载体线性化

(1)酶切后线性载体进行胶回收，平末端和粘性末端均可；

(2)PCR扩增获得线性载体，如果是单一带，PCR产物直接纯化，否则进行胶回收纯化。

B.使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；

表1：HSY204菌中的三个基因引物序列信息表

(1)引物不能磷酸化；

(2)扩增产物为平末端的高保真DNA聚合酶；

(3)电泳检测扩增产物的完整性，有杂带，凝胶回收目的片段；

(4)克隆引物包括目的片段特异引物序列(22nt)和载体重叠序列(15-25nt；对于3个以上片段的重组，将同源区域增加至30nt)；

(5)对酶切位点有严格要求，选择合适的酶切位点，正向和反向引物增加缺少碱基恢复原有的酶切位点；

(6)按照线性载体末端结构5`突出、3`突出、平末端引物设计。

C.克隆反应体系

(1)将目的DNA片段和线性化载体加入量为0.01-0.25pmol(估算1kb 20ng、 1.5kb30ng)，最佳摩尔比为2:1，加到离心管混匀；

(2)50℃反应15min进行重组反应，反应结束置于冰上冷却数秒(对于3个以上片段的重组，反应时间延长至60min)；

(3)重组产物保存-20℃或直接用于转化。

重组产物通过快速或传统方法转化E.coli感受态细胞

(4)将感受态细胞从-70℃冰箱取出后，置于冰浴中融化；

(5)在50μL感受态细胞中加入5μL重组产物，轻轻弹动离心管壁混匀(禁止涡旋)后，在冰上放置30min，期间不要振动离心管；

(6)将离心管置于42℃恒温水浴热激30-90sec，取出管后立即置于冰浴中静置2～3min；

(7)向离心管中加入500μL 37℃预热的SOC或LB培养基(不含抗生素)， 200rpm、37℃振荡培养1h；

(8)将离心管中的菌液轻弹或吸吹混匀，吸取200μL加到含相应抗生素的 LB固体培养基(最好提前37℃预热)过夜培养。

阳性克隆鉴定

(9)菌落PCR或提取重组质粒PCR验证；

(10)重组质粒酶切验证；

(11)测序鉴定，初步鉴定后，将所有新构建的载体选取1～2个阳性克隆进行测序鉴定。

实施例4-制备毒素蛋白

通过IPTG诱导蛋白表达，小量表达，超声波破碎，利用SDS-PAGE电泳分析表达蛋白。大量表达采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和Ni-NTA 纯化介质把螯合剂(氮川三乙酸或NTA)共价偶联到琼脂糖介质(4％交联)上，然后再螯合Ni²⁺制备而成。NTA能够通过四个位点牢固的螯合Ni²⁺，从而减少纯化过程中Ni²⁺泄露到蛋白样品中。

菌株HSY204杀虫基因在大肠杆菌中表达方法具体如下：

(1)构建好表达工程菌株接种到2-5mL含有对应的抗生素的LB培养基(Amp 100Kan30μg/mL)中过夜活化表达菌株；

(2)第二天按1％量转接到含相对应抗生素的新鲜LB培养基中培养2h至 OD600为0.6左右，加入2-8μl IPTG(500mM)至终浓度为0.1-0.5mM培养8-20h (其中，空载用IPTG诱导作对照；表达菌株转接2份，一份加入IPTG，另为一份作为阴性对照不加IPTG)；

(3)以不同的温度、IPTG溶度和表达时间，优化表达体系，实现可溶性表达；

(4)8000rpm离心，5min收集菌体，用0.5M NaCl或ddH2O或PBS缓冲液洗涤1-3次；

(5)加入800μl适量PBS缓冲液，超声波破碎处理5-20min，至液体澄清 (SonicsVCX750S参数：小探头功率20％，工作10s，间隔10s)；

(6)10000rpm离心5min，分别收集上清，沉淀用1mL PBS缓冲液洗涤1-2 次，然后用50μl PBS缓冲液吹打悬浮；

(7)表达菌株和参照菌株蛋白产物上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示。

实施例5-HSY204蛋白生物活性测定

将制备获得的HSY204蛋白用于生物活性测定，Bio-Rad光密度扫描法对表达蛋白进行定量分析，蛋白样品做梯度稀释，准备2-3龄靶标昆虫，设置空白对照，进行生物测定，观察死虫的数量，利用SPSS13.0软件进行概率回归分析，获得LC50值和95％置信区间值，明确杀虫活性。

1.棉铃虫、斜纹夜蛾人工生物测定

(1)称取10g人工饲料置一灭菌培养皿中，加入1000μl待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发；

(2)分装于经消毒的24孔细胞培养板中，用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每孔一头，每处理重复3次，严格密封，防止幼虫逃逸；

(3)放置于光照培养箱(25℃，湿度为65％，光周期为12h∶12h)中培养，第4天或6天分别调查死活虫数，计算死亡率和LC50。

2.埃及伊蚊饲养及蚊子的生物测定

(1)蚊幼虫采集于夏季静止小溪流；

(2)在人工室内环境，温度为26度，相对空气湿度为80％和光照周期为14 小时的条件下饲养；

(3)蚊的生长周期为4个阶段：卵、幼虫、涌和成虫；幼虫生长在去氯自来水中，不断加入人工饲料(面粉9：酵母粉1)喂食；

(4)成虫放置在玻璃虫笼中，放入10％蔗糖溶液(或者蜂蜜溶液)的脱脂棉球喂食成虫，放入小老鼠让蚊吸血后进入繁殖阶段；

(5)因雌性蚊要将虫卵产在静止的水中，在成虫笼中放入一个盛水的开放容器收集虫卵；

(6)3-4龄的幼虫用于生物测定实验，每天观察，记录其死亡数，计算死亡率和LC50；

(7)用于蛋白毒力测定的蚊虫为实验室人工饲养的敏感品系，标定好浓度蛋白溶液由去氯自来水稀释成一定的浓度，分别置于消毒透明饮水塑料杯里；

(8)每个塑料杯盛10ml蛋白溶液，用pasteur pipette移入10头3龄的蚊幼虫；

(9)不加入任何蛋白的去氯自来水作为阴性对照，每个蛋白浓度设置3个重复。

3.菌株HSY204杀虫蛋白的生物活性测定结果如下表：

表2 HSY204杀虫蛋白的生物活性测定

(其中，ND:未检测到。>300：300μg/g时无致死作用和体重抑制。) 由上表可以看出，HSY204杀虫蛋白对蚊子的生长具有明显影响，对小菜蛾和棉铃虫的生长没有影响。

4.菌株HSY204中杀虫基因的蛋白对埃及伊蚊杀虫活性测定结果如下表：

表3 HSY204杀虫基因对埃及伊蚊杀虫活性测定

杀虫基因蛋白	杀虫蛋白分子量	杀虫蛋白溶度	埃及伊蚊致死率
				orf5055	76KDa	≥200mg/mL	67％
orf5878	45KDa	≥200mg/mL	100％
				orf5877	94KDa	≥200mg/mL	33.33％

由上表可以看出杀虫基因orf5055、orf5878和0rf5877对埃及伊蚊具有较高的致死率，其中，基因orf5878的蛋白对埃及伊蚊的致死率可达100％。

5.HSY204杀虫基因蛋白5878不同浓度下对伊蚊杀虫活性测试结果如下表：

表4 HSY204杀虫基因5878不同蛋白浓度下对伊蚊杀虫活性测试

由上表可知，随着杀虫基因5878的蛋白浓度的增加，其对伊蚊的致死率增加，当杀虫基因5878蛋白的浓度为22.845μg/mL时，其对伊蚊的致死率可达到40％；经SPSS计算得出杀虫基因5878对库蚊的LC50为27.115μg/m (19.381-61.199μg/mL)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南师范大学

海口海森元生物科技有限公司

<120> 一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaataa tgggggaata tataatgtct atagtagaac aaacttttta tgatttttta 60

ggagcatcaa atgaaccatt tttgaaggtt acatttgtcg cattttggga taaaaataat 120

cctgaagaat ataagaagat agaaccgata ttaaaagaac tttctgaaga ggtacaagat 180

attacattta cacagataag ttttgaaaga caagaggaaa ttggaaaggt tacattgctt 240

agagatatgg atatccgaac agaaatgtat ggatcaaaat atatctataa taatgaacag 300

gatttgaaaa ataatgatcc actaattctt aggatttatt taaatagaaa tataataaac 360

gaaaaaattg gtatttgttc taaagaagaa ttgttggagt ttctgggtga atctcaaaga 420

aataaacatg atatattaga actaacaact caaaactttg aggaaaaagt aatccaagca 480

aagggttctg ttttagtagc atttatagat aaaaatttac cagcggtagg caaggtttta 540

gagccaatac tagaaaagtt atcggaggaa atacaaggtg tcacatttgc aaaatttgaa 600

tttaatcgca atgacgctga tgctgatgat tttcaagaga aatatgtata ctacacagat 660

gaatttatgc tcttcagaaa tggaaattat aaagctagtc aaagttattg tacgaaagat 720

gaaatacctg aatttcttga aagaaatagc ttagacaccc tccatgttct aatggacatt 780

aaatttatta atgagggaga cgaaagcttc aatgatgcag gtatgccaag gccttatgga 840

gagatttata tagaaaaaaa taatgagctg ggtatttatg gaaatatatt agtatggcaa 900

gaaaaatata ataggcacca cacatcaata cttactcata gatttagaac cgttatggta 960

tgtacaaatt ctgaaataaa ctctttaact ttctatggtg atgtgaaaga atacgatgaa 1020

tacagtgccg atgatatttt agcttatcca gaaaataaag tatctggttc tccaaatcaa 1080

accattaaac ttccaggtga agatgataag agttatgtaa caattacata tacggtaaaa 1140

gagggagttt ggtggtaa 1158

<210> 2

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaattcaa atattcaaaa ttctattcaa caattagaaa acattgctaa atttcctcta 60

tcatttgacc caattaggca tttatcgggt atgaattata aagattgctt agctaataat 120

ggattagatt taataaaacc tagtgaagcg tcagctctta acgccactac agccattctg 180

gggtcctcag ctgctgttct ttctctttta ctagcaccgc caattactgt aggaggagta 240

atcgtggcag cgttctctac tctttctgtt agtgctccct ttttttggcc cgtatcaggt 300

gaaaataata tgaatgagct ggtttatgca acagaagatc ttctcgaaca aagaataact 360

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ctttcagggt atgaagagtt actgctacca ctctatgcac aagcagcatt tcaacattta 600

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gtatcgggta gcagttcata tgtattaggg atagaaaatc gatataactt aggaggtgga 1080

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cagagaaggg attcttttgg taactatcaa tataaagacc tatacagact aattcttggt 1200

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aattatcatg cattacgaga tttgccgcca ttggaagaca ctcaacttcc tcatttacat 1380

cattcacatg atctatcgga tgtaattatt gctaaaacta accctgataa tactcaggcg 1440

tactcaatcg cttggacaca taaagaactt gactggagaa attatataac tgatactcaa 1500

atattgaccg atgagacgac tggtagccaa ttgcaaatac ctctaataac acaaatccca 1560

gcgactaatg cctataatat aagcaaaaca gggcaaatag cacaacaata tgcaaatatt 1620

tcagttacag atgctgtaaa attcacagga ggaaacttag ttttatgtga acttgatata 1680

ccagcaaatg atcaaaatac gtttataaca tattttgata ttgattttgg atgtgtaata 1740

ggatatataa gaaataactc gtttcgtata cgaattcgtt acgcgtctaa tattgattgt 1800

aacgcaagtt ttattgggtc tcctggttat gctactgtag cattaaaaaa tacttttaat 1860

agtgttacag atattagtag attaaacttc ggaaatttcg cttttgtgga atctactgga 1920

acttttggag tatctcaaca tatgaatctc tcaatagata tatcgaatcc aaccgtaaga 1980

ggtaagaatg ttaaaatatt gattgataaa attgaattgg taccttaccg gtag 2034

<210> 3

<211> 2832

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggttacta caaaaatgat acctagacta aaagctcttc cagactttat tgatgatttt 60

aatggtgtat acgggtttat gaataacatt tctgatctga taggcacaat ttttggaatt 120

aatactggtg attcatctct tgatgctgta ttagagaatc aagagttatt acaacaaatg 180

atgggtcaaa tgaatactat acagagcaca ttggatgaca ttatggaaaa tcaaagtatc 240

tccgaagacg tactactaca gcttcgaagt ttagcgggtg agcaattgga gctctcaaag 300

tccattaata cagaacttgt aaaaattgaa ggtattctaa atacgtattt acctgcaatt 360

agctctatgg taaataaagt atatagtcaa acatctatga ttaaccaaaa agtagataaa 420

ctattacaat tgatggcatt tgctttgcaa gaacttgatt acctaaaaga taatgtggta 480

ctgaattcga gtattataga aatcacaccc catgttcaaa agttagttta tgtgaatagc 540

aagtttcttg ctctatcaag aaattatatg caaggaaaag gaatgagtat tgatagaatg 600

caagaactta ttcaatgggc aaaatcaatt gttgatacag atatgaatag ctttgaattt 660

tcagtggata cattacacag tgttataatg ggggacaatc tatataaaaa atccgcgtta 720

gcaacctttg ccgatgtttt attggatgat actagtcaat atggagattt cggtacacca 780

gtagcaaaat tttatacatt ttactcatcg ttagcaacgt tacaaataaa tgcttatctt 840

tgtttaactt ttgcaagaaa ggttttaggg cttactcaaa ttgaatatca aatcacgatg 900

caagagcgca ttagaaacca aaatcaattg tttataaact taattgaaga taagaatgtt 960

tcctcctatc ttgaagtcaa aggaattgct gatcagctac cggttgcaaa agagataaaa 1020

tcttttgacc tacaagctaa aggtggatat gcgtttatcg gcttagaatt tattttagat 1080

ggtgacgaat ataaagcaaa agcctatcaa gctaaggtgg ataagaactt ttcagtacat 1140

gcggaaacag tagaagaaat cattagcgat aatttaatgg aagtgttcac atattactat 1200

ttggacccag gaatgaagta tgttaaattt cctttatcag gaaaattgac tggtgcaact 1260

aatactttaa ttactcggat tggctttggt tgtaaaaata atcaaagcca agatcctaag 1320

gtatatgcct atatagatgc tgatttttct ccgtataatc catacactgg agagataatg 1380

aaagagggca cacaaacaat ttcattagat ggaagcgagg atacggttaa cgcttatggg 1440

atatggccta tgggtttatt gggtgatctt tacatggcac ctttaaaatc tttattttta 1500

agtgtggatg ctgataatgc ttcgtatgtt gatgccactg acgcagtact taattttggt 1560

ggtgaatctt atcttcctac aatcttatct aaagaatatg atgctaactt tatcatgtat 1620

tctcacatca agaacactga tcaaatggat atgaatatgc ttatgaatgg agatttcgaa 1680

aaaggggtgg acaattggtc acttatagaa cctatggatc ttgcagaagg agaaggtgtg 1740

aatggttcaa atgctttaaa aggtcatcta ggtgcaagta atggtaaagc tgcacaatcc 1800

gtctacttag aaccaaatac aacatataaa ctaaaagcat atgggaaagt agatgctgat 1860

ggctcaaaag gggaaattgg aatacaagat atatacggcc ccttttggaa atatcaggag 1920

ttctcatcat tacaatacac tccagttgaa ttagaattta aaacaagcga tgacacttta 1980

aatctatgta tatattatca aagtcgtaat ggtactagtt ggatagataa ctttgaattg 2040

tttgatctca cattagaaaa aggaaatcta atagcgaatc cgagttttat attcggaggg 2100

atttcgcatt ggatagccga tgagggagta actgttgtag aagggaaagg gatgtttaat 2160

tcgaatgcag cacaaattaa gggaaaagat cgaattagtc agcaagtatc aatgaaaccg 2220

aacactcact accaattgga agcatatgtg aaagtagaca atgccaatac tactgcgcaa 2280

attggatatg gacaaaacta tgtaacatgt aattcaactt ctttcacacc aatcactgta 2340

aaatttagca ctggtgatag ccctcttaat acagaagatt ctgtgtactg tgcaaatact 2400

agtaatcagg gtacggtttg ggcagataac tttgtattac atgaggctcc taatttaatt 2460

gtaaatggtg attttaaaca gttaaatcct gttgcatctt ggacactctc tccctctgaa 2520

aatggtgaca tttcaatagt acctaaaggg attggtatat taaataaagg tcaaattagt 2580

caaaaagtaa aattaaagtc gaatacaaaa tatacattga cagcatatat agcagtatat 2640

ggtggtgttg caaagcttgg atatggagat actaataaaa catgtacttc aaaggatttt 2700

acacaagtga gtgtcgattt tgtcactagt tctaatccta ataacgatag cgtatatttg 2760

tctaatgaaa atgacggtaa ttgttctgtt attgggaaca aatttgagtt atacgaatcg 2820

gatcaaattt aa 2832

<210> 4

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Ile Met Gly Glu Tyr Ile Met Ser Ile Val Glu Gln Thr Phe

1 5 10 15

Tyr Asp Phe Leu Gly Ala Ser Asn Glu Pro Phe Leu Lys Val Thr Phe

20 25 30

Val Ala Phe Trp Asp Lys Asn Asn Pro Glu Glu Tyr Lys Lys Ile Glu

35 40 45

Pro Ile Leu Lys Glu Leu Ser Glu Glu Val Gln Asp Ile Thr Phe Thr

50 55 60

Gln Ile Ser Phe Glu Arg Gln Glu Glu Ile Gly Lys Val Thr Leu Leu

65 70 75 80

Arg Asp Met Asp Ile Arg Thr Glu Met Tyr Gly Ser Lys Tyr Ile Tyr

85 90 95

Asn Asn Glu Gln Asp Leu Lys Asn Asn Asp Pro Leu Ile Leu Arg Ile

100 105 110

Tyr Leu Asn Arg Asn Ile Ile Asn Glu Lys Ile Gly Ile Cys Ser Lys

115 120 125

Glu Glu Leu Leu Glu Phe Leu Gly Glu Ser Gln Arg Asn Lys His Asp

130 135 140

Ile Leu Glu Leu Thr Thr Gln Asn Phe Glu Glu Lys Val Ile Gln Ala

145 150 155 160

Lys Gly Ser Val Leu Val Ala Phe Ile Asp Lys Asn Leu Pro Ala Val

165 170 175

Gly Lys Val Leu Glu Pro Ile Leu Glu Lys Leu Ser Glu Glu Ile Gln

180 185 190

Gly Val Thr Phe Ala Lys Phe Glu Phe Asn Arg Asn Asp Ala Asp Ala

195 200 205

Asp Asp Phe Gln Glu Lys Tyr Val Tyr Tyr Thr Asp Glu Phe Met Leu

210 215 220

Phe Arg Asn Gly Asn Tyr Lys Ala Ser Gln Ser Tyr Cys Thr Lys Asp

225 230 235 240

Glu Ile Pro Glu Phe Leu Glu Arg Asn Ser Leu Asp Thr Leu His Val

245 250 255

Leu Met Asp Ile Lys Phe Ile Asn Glu Gly Asp Glu Ser Phe Asn Asp

260 265 270

Ala Gly Met Pro Arg Pro Tyr Gly Glu Ile Tyr Ile Glu Lys Asn Asn

275 280 285

Glu Leu Gly Ile Tyr Gly Asn Ile Leu Val Trp Gln Glu Lys Tyr Asn

290 295 300

Arg His His Thr Ser Ile Leu Thr His Arg Phe Arg Thr Val Met Val

305 310 315 320

Cys Thr Asn Ser Glu Ile Asn Ser Leu Thr Phe Tyr Gly Asp Val Lys

325 330 335

Glu Tyr Asp Glu Tyr Ser Ala Asp Asp Ile Leu Ala Tyr Pro Glu Asn

340 345 350

Lys Val Ser Gly Ser Pro Asn Gln Thr Ile Lys Leu Pro Gly Glu Asp

355 360 365

Asp Lys Ser Tyr Val Thr Ile Thr Tyr Thr Val Lys Glu Gly Val Trp

370 375 380

Trp

385

<210> 5

<211> 677

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Asn Ser Asn Ile Gln Asn Ser Ile Gln Gln Leu Glu Asn Ile Ala

1 5 10 15

Lys Phe Pro Leu Ser Phe Asp Pro Ile Arg His Leu Ser Gly Met Asn

20 25 30

Tyr Lys Asp Cys Leu Ala Asn Asn Gly Leu Asp Leu Ile Lys Pro Ser

35 40 45

Glu Ala Ser Ala Leu Asn Ala Thr Thr Ala Ile Leu Gly Ser Ser Ala

50 55 60

Ala Val Leu Ser Leu Leu Leu Ala Pro Pro Ile Thr Val Gly Gly Val

65 70 75 80

Ile Val Ala Ala Phe Ser Thr Leu Ser Val Ser Ala Pro Phe Phe Trp

85 90 95

Pro Val Ser Gly Glu Asn Asn Met Asn Glu Leu Val Tyr Ala Thr Glu

100 105 110

Asp Leu Leu Glu Gln Arg Ile Thr Glu Thr Ile Arg Thr Ile Ala Leu

115 120 125

Gly Val Met Asn Gly Phe His Asn Ser Ile Thr Tyr Tyr Asn Ala Ala

130 135 140

Phe Ser Phe Trp Val Arg Tyr Pro Thr Ser Asp Thr Pro Arg Leu Glu

145 150 155 160

Val Leu Asn Arg Phe Gln Arg Leu His Gly Asp Tyr Val Met Ser Met

165 170 175

Ser Met Leu Ala Leu Ser Gly Tyr Glu Glu Leu Leu Leu Pro Leu Tyr

180 185 190

Ala Gln Ala Ala Phe Gln His Leu Gln Val Leu Ser Asp Gly Ile Arg

195 200 205

Tyr Ala Asp Lys Trp Lys Leu Ala Lys Asp Asp Tyr Asn Tyr Gly Asp

210 215 220

Leu His Tyr Ala Glu Phe Gln His Tyr Met Glu Val Tyr Thr Asn His

225 230 235 240

Cys Asn Leu Trp Tyr Arg Asn Gly Leu Ile Arg Ser Asn Ser Thr Ser

245 250 255

Lys Asn Trp Ala Glu Gln Asn Glu Tyr Ile Arg Tyr Met Thr Leu Trp

260 265 270

Val Leu Asp Thr Val Ala Leu Phe Gln Asn Leu Asn Pro Arg Leu Tyr

275 280 285

Pro Asn Ala Val Lys Thr Gln Thr Leu Ser Arg Lys Ile Tyr Ser Pro

290 295 300

Pro Ile Asn Phe Val Pro Ala Asp Lys Thr Ser Asp Thr Leu Asn Phe

305 310 315 320

Thr Thr Lys Pro Asp Leu Tyr Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asn Ile Tyr

325 330 335

Ser Asn Ser Pro Val Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Val Leu Gly Ile Glu

340 345 350

Asn Arg Tyr Asn Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Ile Ser Lys Leu Phe

355 360 365

Gly Gln Ser Thr Asn Phe Pro Gln Leu Val Asp Phe Gln Arg Arg Asp

370 375 380

Ser Phe Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Leu Gly

385 390 395 400

Phe Asn Ser Gln Thr Ala Gly Arg Asn Leu Gln Asn Leu Cys Lys Met

405 410 415

Glu Phe Tyr Gly Val Gly Pro Asp Val Ser Ala Ile Asn Pro Thr Phe

420 425 430

Glu Tyr Lys Thr Gly Met Pro Ala Asn Tyr His Ala Leu Arg Asp Leu

435 440 445

Pro Pro Leu Glu Asp Thr Gln Leu Pro His Leu His His Ser His Asp

450 455 460

Leu Ser Asp Val Ile Ile Ala Lys Thr Asn Pro Asp Asn Thr Gln Ala

465 470 475 480

Tyr Ser Ile Ala Trp Thr His Lys Glu Leu Asp Trp Arg Asn Tyr Ile

485 490 495

Thr Asp Thr Gln Ile Leu Thr Asp Glu Thr Thr Gly Ser Gln Leu Gln

500 505 510

Ile Pro Leu Ile Thr Gln Ile Pro Ala Thr Asn Ala Tyr Asn Ile Ser

515 520 525

Lys Thr Gly Gln Ile Ala Gln Gln Tyr Ala Asn Ile Ser Val Thr Asp

530 535 540

Ala Val Lys Phe Thr Gly Gly Asn Leu Val Leu Cys Glu Leu Asp Ile

545 550 555 560

Pro Ala Asn Asp Gln Asn Thr Phe Ile Thr Tyr Phe Asp Ile Asp Phe

565 570 575

Gly Cys Val Ile Gly Tyr Ile Arg Asn Asn Ser Phe Arg Ile Arg Ile

580 585 590

Arg Tyr Ala Ser Asn Ile Asp Cys Asn Ala Ser Phe Ile Gly Ser Pro

595 600 605

Gly Tyr Ala Thr Val Ala Leu Lys Asn Thr Phe Asn Ser Val Thr Asp

610 615 620

Ile Ser Arg Leu Asn Phe Gly Asn Phe Ala Phe Val Glu Ser Thr Gly

625 630 635 640

Thr Phe Gly Val Ser Gln His Met Asn Leu Ser Ile Asp Ile Ser Asn

645 650 655

Pro Thr Val Arg Gly Lys Asn Val Lys Ile Leu Ile Asp Lys Ile Glu

660 665 670

Leu Val Pro Tyr Arg

675

<210> 6

<211> 943

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Val Thr Thr Lys Met Ile Pro Arg Leu Lys Ala Leu Pro Asp Phe

1 5 10 15

Ile Asp Asp Phe Asn Gly Val Tyr Gly Phe Met Asn Asn Ile Ser Asp

20 25 30

Leu Ile Gly Thr Ile Phe Gly Ile Asn Thr Gly Asp Ser Ser Leu Asp

35 40 45

Ala Val Leu Glu Asn Gln Glu Leu Leu Gln Gln Met Met Gly Gln Met

50 55 60

Asn Thr Ile Gln Ser Thr Leu Asp Asp Ile Met Glu Asn Gln Ser Ile

65 70 75 80

Ser Glu Asp Val Leu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Ala Gly Glu Gln Leu

85 90 95

Glu Leu Ser Lys Ser Ile Asn Thr Glu Leu Val Lys Ile Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Asn Thr Tyr Leu Pro Ala Ile Ser Ser Met Val Asn Lys Val Tyr

115 120 125

Ser Gln Thr Ser Met Ile Asn Gln Lys Val Asp Lys Leu Leu Gln Leu

130 135 140

Met Ala Phe Ala Leu Gln Glu Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Asn Val Val

145 150 155 160

Leu Asn Ser Ser Ile Ile Glu Ile Thr Pro His Val Gln Lys Leu Val

165 170 175

Tyr Val Asn Ser Lys Phe Leu Ala Leu Ser Arg Asn Tyr Met Gln Gly

180 185 190

Lys Gly Met Ser Ile Asp Arg Met Gln Glu Leu Ile Gln Trp Ala Lys

195 200 205

Ser Ile Val Asp Thr Asp Met Asn Ser Phe Glu Phe Ser Val Asp Thr

210 215 220

Leu His Ser Val Ile Met Gly Asp Asn Leu Tyr Lys Lys Ser Ala Leu

225 230 235 240

Ala Thr Phe Ala Asp Val Leu Leu Asp Asp Thr Ser Gln Tyr Gly Asp

245 250 255

Phe Gly Thr Pro Val Ala Lys Phe Tyr Thr Phe Tyr Ser Ser Leu Ala

260 265 270

Thr Leu Gln Ile Asn Ala Tyr Leu Cys Leu Thr Phe Ala Arg Lys Val

275 280 285

Leu Gly Leu Thr Gln Ile Glu Tyr Gln Ile Thr Met Gln Glu Arg Ile

290 295 300

Arg Asn Gln Asn Gln Leu Phe Ile Asn Leu Ile Glu Asp Lys Asn Val

305 310 315 320

Ser Ser Tyr Leu Glu Val Lys Gly Ile Ala Asp Gln Leu Pro Val Ala

325 330 335

Lys Glu Ile Lys Ser Phe Asp Leu Gln Ala Lys Gly Gly Tyr Ala Phe

340 345 350

Ile Gly Leu Glu Phe Ile Leu Asp Gly Asp Glu Tyr Lys Ala Lys Ala

355 360 365

Tyr Gln Ala Lys Val Asp Lys Asn Phe Ser Val His Ala Glu Thr Val

370 375 380

Glu Glu Ile Ile Ser Asp Asn Leu Met Glu Val Phe Thr Tyr Tyr Tyr

385 390 395 400

Leu Asp Pro Gly Met Lys Tyr Val Lys Phe Pro Leu Ser Gly Lys Leu

405 410 415

Thr Gly Ala Thr Asn Thr Leu Ile Thr Arg Ile Gly Phe Gly Cys Lys

420 425 430

Asn Asn Gln Ser Gln Asp Pro Lys Val Tyr Ala Tyr Ile Asp Ala Asp

435 440 445

Phe Ser Pro Tyr Asn Pro Tyr Thr Gly Glu Ile Met Lys Glu Gly Thr

450 455 460

Gln Thr Ile Ser Leu Asp Gly Ser Glu Asp Thr Val Asn Ala Tyr Gly

465 470 475 480

Ile Trp Pro Met Gly Leu Leu Gly Asp Leu Tyr Met Ala Pro Leu Lys

485 490 495

Ser Leu Phe Leu Ser Val Asp Ala Asp Asn Ala Ser Tyr Val Asp Ala

500 505 510

Thr Asp Ala Val Leu Asn Phe Gly Gly Glu Ser Tyr Leu Pro Thr Ile

515 520 525

Leu Ser Lys Glu Tyr Asp Ala Asn Phe Ile Met Tyr Ser His Ile Lys

530 535 540

Asn Thr Asp Gln Met Asp Met Asn Met Leu Met Asn Gly Asp Phe Glu

545 550 555 560

Lys Gly Val Asp Asn Trp Ser Leu Ile Glu Pro Met Asp Leu Ala Glu

565 570 575

Gly Glu Gly Val Asn Gly Ser Asn Ala Leu Lys Gly His Leu Gly Ala

580 585 590

Ser Asn Gly Lys Ala Ala Gln Ser Val Tyr Leu Glu Pro Asn Thr Thr

595 600 605

Tyr Lys Leu Lys Ala Tyr Gly Lys Val Asp Ala Asp Gly Ser Lys Gly

610 615 620

Glu Ile Gly Ile Gln Asp Ile Tyr Gly Pro Phe Trp Lys Tyr Gln Glu

625 630 635 640

Phe Ser Ser Leu Gln Tyr Thr Pro Val Glu Leu Glu Phe Lys Thr Ser

645 650 655

Asp Asp Thr Leu Asn Leu Cys Ile Tyr Tyr Gln Ser Arg Asn Gly Thr

660 665 670

Ser Trp Ile Asp Asn Phe Glu Leu Phe Asp Leu Thr Leu Glu Lys Gly

675 680 685

Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Phe Ile Phe Gly Gly Ile Ser His Trp

690 695 700

Ile Ala Asp Glu Gly Val Thr Val Val Glu Gly Lys Gly Met Phe Asn

705 710 715 720

Ser Asn Ala Ala Gln Ile Lys Gly Lys Asp Arg Ile Ser Gln Gln Val

725 730 735

Ser Met Lys Pro Asn Thr His Tyr Gln Leu Glu Ala Tyr Val Lys Val

740 745 750

Asp Asn Ala Asn Thr Thr Ala Gln Ile Gly Tyr Gly Gln Asn Tyr Val

755 760 765

Thr Cys Asn Ser Thr Ser Phe Thr Pro Ile Thr Val Lys Phe Ser Thr

770 775 780

Gly Asp Ser Pro Leu Asn Thr Glu Asp Ser Val Tyr Cys Ala Asn Thr

785 790 795 800

Ser Asn Gln Gly Thr Val Trp Ala Asp Asn Phe Val Leu His Glu Ala

805 810 815

Pro Asn Leu Ile Val Asn Gly Asp Phe Lys Gln Leu Asn Pro Val Ala

820 825 830

Ser Trp Thr Leu Ser Pro Ser Glu Asn Gly Asp Ile Ser Ile Val Pro

835 840 845

Lys Gly Ile Gly Ile Leu Asn Lys Gly Gln Ile Ser Gln Lys Val Lys

850 855 860

Leu Lys Ser Asn Thr Lys Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr Ile Ala Val Tyr

865 870 875 880

Gly Gly Val Ala Lys Leu Gly Tyr Gly Asp Thr Asn Lys Thr Cys Thr

885 890 895

Ser Lys Asp Phe Thr Gln Val Ser Val Asp Phe Val Thr Ser Ser Asn

900 905 910

Pro Asn Asn Asp Ser Val Tyr Leu Ser Asn Glu Asn Asp Gly Asn Cys

915 920 925

Ser Val Ile Gly Asn Lys Phe Glu Leu Tyr Glu Ser Asp Gln Ile

930 935 940

<210> 7

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taagaaggag atatacatat gaaaataatg ggggaatata tat 43

<210> 8

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtggtggtgg tggtgctcga gccaccaaac tccctctttt ac 42

<210> 9

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taagaaggag atatacatat gaattcaaat attcaaaatt cta 43

<210> 10

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggtggtgg tggtgctcga gccggtaagg taccaattca at 42

<210> 11

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taagaaggag atatacatat ggttactaca aaaatgatac ctag 44

<210> 12

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtggtggtgg tggtgctcga gaatttgatc cgattcgtat aact 44

Claims

1.一种芽孢杆菌新菌株HSY204，其特征在于：其分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)HSY204，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO.M2020523。

2.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204包括3个新型杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877；其中，orf5878、orf5055和orf5877的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的克隆方法为：以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204的基因组为模板，采用PCR扩增方法，分别获得orf5878、orf5055和orf5877的完整杀虫基因片段。

5.如权利要求4所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：所述PCR扩增的引物序列与限制性内切酶包括：

orf5878引物F：taagaaggagatatacatatgaaaataatgggggaatatatat，R：gtggtggtggtggtgctcgagccaccaaactccctcttttac，限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ；

orf5055引物F：taagaaggagatatacatatgaattcaaatattcaaaattcta，R：gtggtggtggtggtgctcgagccggtaaggtaccaattcaat，限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ；

Orf5877引物F：taagaaggagatatacatatggttactacaaaaatgatacctag，R：gtggtggtggtggtgctcgagaatttgatccgattcgtataact，限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ。

6.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的应用，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204在杀伊蚊方面中的应用。

7.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株的应用，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204在制备杀蚊剂中的应用。