KR101774354B1

KR101774354B1 - Z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질을 이용한 항체의 분리 및 정제 방법

Info

Publication number: KR101774354B1
Application number: KR1020150176634A
Authority: KR
Inventors: 김성현
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2017-09-04
Also published as: KR20170069452A

Abstract

본 발명은 항체의 분리 및 정제를 위한 Z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질, 및 상기 Z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질을 이용한 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 항체 정제에 일반적으로 사용되는 고가의 단백질 A 크로마토그래피 컬럼을 이용하지 않고 항체를 고순도 및 고품질로 정제할 수 있다.

Description

Z-도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질을 이용한 항체의 분리 및 정제 방법{Z DOMAIN-CALSEQUESTRIN FUSION PROTEIN FOR ANTIBODY ISOLATION AND PURIFICATION AND METHOD OF ISOLATING AND PURIFYING ANTIBODY USING THE SAME}

모노클로날 항체에 대한 정제 방법은 통상적으로 4개의 기본 단계를 포함한다. 이들 단계는 (1) 수거 - 발효 배양물로부터 숙주 세포의 분리; (2) 포획 - 정화된 수거물 중 대다수의 성분으로부터 항체의 분리; (3) 미세 정제 - 잔류 숙주 세포 오염물 및 응집물의 제거; 및 (4) 제형화 - 항체를 최대 안정성 및 저장 기간을 위해 적합한 담체에 배치하는 단계이다. 그러나 이들 단계들이 반드시 약제학적 상황에서 사용하기에 충분한 순도의 항체 조성물을 생성하는 것은 아니다. 따라서, 약제학적 사용에 적합할 정도의 불순물이 제거된 순수한 형태의 목적 항체를 생성 및 정제하는 방법이 무엇보다 중요하다.

단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography)는 단일 단계로 대개 IgG인 항체의 세포 배양 상층액으로부터 거의 완전한 정제를 가능케 하므로 공업적 항체 제조에 널리 사용되고 있다. 그러나, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼은 반복적인 사용에 의해 컬럼의 리간드가 어느 정도 누출될 수 밖에 없는 문제점을 가지고 있다. 이러한 단백질 A 또는 단백질 A 단편은 IgG에 대한 친화도를 가져, 항체와 복합체를 형성하여 항체를 오염시키며, 정제된 항체로부터 제거하는 것 또한 어렵다. 특히, 단백질 A는 박테리아성 단백질이므로, 원하지 않는 면역반응을 유도할 수 있어, 정제된 항체로부터 반드시 제거되어야 하는 필요성을 수반한다. 따라서 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제 공정은 잔량의 단백질 A를 공정 별로 모니터링하고 제거해야 하는 문제점을 가진다.

이에 본 발명자들은 항체 정제에 일반적으로 사용되는 고가의 단백질 A 크로마토그래피 컬럼을 이용하지 않고 항체를 고순도 및 고품질로 정제할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 칼시퀘스트린(calsequestrin)과 칼슘의 응집 반응을 이용하면 불편하고 시간과 비용이 많이 드는 컬럼 크로마토그래피 공정을 대체할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항체의 고속 분리 및 고순도 정제를 위한 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질(이하 "Z-칼시퀘스트린 단백질" 이라고 함)을 코딩하는 핵산을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 Z-칼시퀘스트린 단백질을 코딩하는 핵산을 이용하여 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면,

항체의 고속 분리 및 고순도 정제를 위한 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 개시된다. 본 발명에 따른 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질의 일 예를 도 1에 나타내었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Z 단백질"은 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A에서 얻어진 것으로, 이는 숙주세포 내에 존재하는 항체에 대한 방어 작용에 사용되는 단백질을 의미한다. 상기 Z 단백질은 숙주세포 내 항체의 Fc 부위와 결합하여 마크로파지(macrophage)에 의한 식균작용이 일어나지 못하게 하는 자기 방어 기작으로 사용된다. 단백질 A에서 항체와 결합하는 부위만을 조작하여 만든 탠덤 리피트 다이머(tandem repeat dimer)를 "Z 도메인"이라 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 부위"는 항체의 꼬리(tail) 부위로서 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 항체의 일 부위를 의미한다. 일반적으로, 파파인으로 전장 항체를 절단하면 Fab 부위와 Fc 부위 두 부위를 얻게 된다. 하나의 클래스에서 모든 항체의 Fc 부위는 거의 동일한 특성이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "칼시퀘스트린(calsequestrin)"은 근소포체(sarcoplasmic reticulum)의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근소포체에서 칼슘의 농도가 더 높을 지라도 근육 수축 후에 칼슘과 결합하여 근소포체의 시스터나에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 한다. 하나의 칼시퀘스트린 분자가 여러 칼슘(예를 들면, 칼시퀘스트린 한 분자당 40-50개의 칼슘 결합 부위를 가짐)과 결합할 수 있기 때문에 칼슘 저장 능력이 매우 우수하다.

본 발명의 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질에 있어서, 상기 Z 도메인은 Z 도메인이 반복된 형태인 Zn (상기 n은 1 이상의 정수이다)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 Z 도메인은 Z 도메인이 2개 반복된 형태인, Z 도메인일 수 있다. 또한, 상기 Z 도메인은 Z 도메인이 3개 반복된 형태인, ZZ 도메인일 수 있다. 일 예시적인 구현예에 따르면, 상기 Z 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZZ 도메인일 수 있다.

본 발명의 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질에 있어서, 상기 Z 도메인과 칼시퀘스트린은 링커(linker)를 통해 융합될 수 있다. 상기 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 링커는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질에 있어서, 상기 Z-칼시퀘스트린 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 Z-칼시퀘스트린 단백질은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질에 있어서, 상기 항체는 ZZ 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 Fc, 또는 이의 단편 또는 이의 유도체/유사체를 포함하는 항체, 항체의 단편, 유도체 또는 유사체일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 IgG일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면,

A) Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질("Z-칼시퀘스트린 단백질"_을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

B) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;

C) 상기 형질전환체로부터 Z-칼시퀘스트린 단백질을 발현시키는 단계; 및

D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 Z-칼시퀘스트린 단백질 결합된 항체를 분리하는 단계를 포함하는 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법이 개시된다. 본 발명에 따른 Z 도메인-칼시퀘스트린 융합 단백질을 이용한 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법의 일 예를 도 2에 나타내었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pACYC184 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면: λ-gt4, λB, λ-Charon, λ△z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 상기 형질전환 방법은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아-매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 락토바실러스와 엔테로코커스 등 유산균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 있어서, 상기 Z 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 ZZ 도메인일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 Z 도메인은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZZ 도메인일 수 있다.

본 발명의 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 있어서, 상기 Z 도메인과 칼시퀘스트린은 링커(linker)를 통해 융합될 수 있다. 상기 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 링커는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 있어서, 상기 Z-칼시퀘스트린 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 Z-칼시퀘스트린 단백질은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 있어서, 상기 항체는 ZZ 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 Fc, 또는 이의 단편 또는 이의 유도체/유사체를 포함하는 항체, 항체의 단편, 유도체 또는 유사체일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 IgG일 수 있다.

본 발명의 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법에 있어서, 상기 (D) 칼슘을 이용하여 Z-칼시퀘스트린 단백질 결합된 항체를 분리하는 단계는:

(d-1) 칼슘을 이용하여 Z-칼시퀘스트린 단백질에 결합된 항체를 침전시키는 단계; 및

(d-2) 원심분리 또는 여과를 통해 침전물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질은 칼슘에 따른 침전반응을 이용하여 항체를 쉽고 빠르게 분리 및 정제가능하며 기존 산업에서 많이 이용되고 있는 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 비해 많은 양의 항체를 초고속으로 분리가능하며, 이에 따라 정제 비용 감소와 항체 분해를 예방할 수 있다. 또한, 킬레이트를 이용하여 Z 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질의 재사용이 가능하므로 경제적이다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 Z 도메인-칼시퀘스트린 융합 단백질의 일 예를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다른 구현예에 따른 Z 도메인-칼시퀘스트린 융합 단백질을 이용한 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법의 일 예를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 칼시퀘스트린-Z 융합 단백질의 디자인을 나타낸다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않은 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 본 발명을 첨부된 도면을 참고하여 이하 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 칼시퀘스트린 - ZZ 융합 단백질의 제작

서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 ZZ-도메인을 N-말단에 배치하고 ZZ-도메인과 칼시퀘스트린의 기능적 방해를 위해 서열번호 5의 아미노산으로 이루어진 링커를 배치한 다음 마지막으로 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 인간 심근 칼시퀘스트린을 배치하여 칼시퀘스트린-ZZ 융합 단백질을 제작하였다(도 3).

실시예 2: 칼시퀘스트린 - ZZ 융합 단백질의 유전자 클로닝

상기 실시예 1에서 합성된 칼시퀘스트린-ZZ 융합 단백질의 유전자를 발현벡터인 pET28b로 클로닝하기 위해서 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용해 증폭하였다. 이를 위해 전방향 프라이머（AATAAAA CATATG GTAGACAACAAATTCAAC）와 역방향 프라이머 (ATT CTCGAG TTA ATCATCATCATCATCATCTTC)를 고안하였다(바이오니아). DNA 정제 키트(진올)를 이용하여 PCR 산물을 정제하고 NdeI 및 XhoI 제한 효소(상기 프라이머에 표시된 밑줄 부위, NEB)를 처리하였다. 또한 pET28b 벡터(Novagen)도 NdeI 및 XhoI 제한효소를 처리하였다. NdeI과 XhoI으로 잘린 DNA 단편과 pET28b 벡터을 라이게이즈(NEB)를 이용하여 16℃에서 12시간 동안 라이게이션시켰다. 라이게이션 된 것을 DH5a 대장균에 형질이입시켜 Kanamycin이 함유된 agar배지에서 하루 동안 배양한 후 성장된 콜로니에서 벡터를 추출하여 시퀀싱(바이오니아)을 진행하였다.

실시예 3: 칼시퀘스트린 - ZZ 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 제조된 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) 스트레인 BL21(DE3)(Novagen, Northumberland, UK)에 형질전환시켰다. 박테리아에 1 mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)(Sigma, St. Louis, MO)를 37℃에서 6시간 동안 처리하여 형질전환체를 유도하였다. 이후에 박테리아를 수득하여 용해 완충액(50 mM 소듐포스페이트, pH 8.0, 300 mM NaCl 및 5 mM imidazole)에 재현탁하고 초음파 분쇄(sonication)로 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 1시간 동안 1,550 g로 원심분리하였다. 용해 완충액(배양액 1 리터당 3 mL의 베드 용량)으로 전-평형된(pre-equilibrated) Ni-NTA 친화성 레진(Peptron, Daejeon, Korea)으로 팩킹된 중력-흐름 칼럼(gravity-flow column; BioRad, Hercules, CA)에 상등액을 로딩하였다. 칼럼 및 매트릭스를 비드 용량의 10배의 용해 완충액으로 세척한 후에 칼시퀘스트린을 용출하여 수득하였다. 인산완충용액(PBS, pH 7.4)으로 전-평형된 수퍼덱스 200 칼럼(Amersham PHarmacia, Bucks, UK)을 이용한 젤 여과방법으로 상기 단백질을 추가적으로 정제하였다. 도 4는 최종적으로 정제된 칼시퀘스트린-ZZ 융합 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과이다. 분석 결과 순도 90% 이상이 됨을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> Z DOMAIN-CALSEQUESTRIN FUSION PROTEIN FOR ANTIBODY ISOLATION AND PURIFICATION AND METHOD OF ISOLATING AND PURIFYING ANTIBODY USING THE SAME <130> 2015-PP-32202 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZZ DOMAIN <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys 115 <210> 2 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZZ DOMAIN <400> 2 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa 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285 Phe Glu Glu Ala Ala Glu His Phe Gln Pro Tyr Ile Lys Phe Phe Ala 290 295 300 Thr Phe Asp Lys Gly Val Ala Lys Lys Leu Ser Leu Lys Met Asn Glu 305 310 315 320 Val Asp Phe Tyr Glu Pro Phe Met Asp Glu Pro Ile Ala Ile Pro Asn 325 330 335 Lys Pro Tyr Thr Glu Glu Glu Leu Val Glu Phe Val Lys Glu His Gln 340 345 350 Arg Pro Thr Leu Arg Arg Leu Arg Pro Glu Glu Met Phe Glu Thr Trp 355 360 365 Glu Asp Asp Leu Asn Gly Ile His Ile Val Ala Phe Ala Glu Lys Ser 370 375 380 Asp Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Gln Val Ala Arg 385 390 395 400 Asp Asn Thr Asp Asn Pro Asp Leu Ser Ile Leu Trp Ile Asp Pro Asp 405 410 415 Asp Phe Pro Leu Leu Val Ala Tyr Trp Glu Lys Thr Phe Lys Ile Asp 420 425 430 Leu Phe Arg Pro Gln Ile Gly Val Val Asn Val Thr Asp Ala Asp Ser 435 440 445 Val Trp Met Glu Ile Pro Asp Asp Asp Asp Leu Pro Thr Ala Glu Glu 450 455 460 Leu Glu Asp Trp Ile Glu Asp Val Leu Ser Gly Lys Ile Asn Thr Glu 465 470 475 480 Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp 485 490 <210> 8 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZZ DOMAIN <400> 8 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagattct gcatctgccg 60 aacctgaacg aagaacagcg taacgcgttc attcagagcc tgaaagatga tccgagccag 120 tctgcgaacc tgctggcgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcccc gaaagtggat 180 aataagttta ataaggagca gcagaatgcc ttttacgaaa tccttcacct tccaaatctt 240 aatgaggagc agcgcaatgc ctttatccag agtcttaagg acgacccaag tcagagtgcc 300 aatcttcttg ccgaggccaa gaagcttaat gacgcccagg ctccaaaggg tggcggaggg 360 agcggtggag ggggtagtga agaggggctt aatttcccca catatgatgg gaaggaccga 420 gtggtaagtc tttccgagaa gaacttcaag caggttttaa agaaatatga cttgctttgc 480 ctctactacc atgagccggt gtcttcagat aaggtcacgc caaaacagtt ccaactgaaa 540 gaaatcgtgc ttgagcttgt ggcccaggtc cttgaacata aagctatagg ctttgtgatg 600 gtggatgcca agaaagaagc caagcttgcc aagaaactgg gttttgatga agaaggaagc 660 ctgtatattc ttaagggtga tcgcacaata gagtttgatg gcgagtttgc agctgatgtc 720 ttggtggagt tcctcttgga tctaattgaa gacccagtgg agatcatcag cagcaaactg 780 gaagtccaag ccttcgaacg 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Claims

항체의 고속 분리 및 고순도 정제를 위한 ZZ 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질을 코딩하는 핵산으로,
상기 ZZ 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 칼시퀘스트린은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것인, 핵산.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 ZZ 도메인과 칼시퀘스트린은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 링커(linker)를 통해 융합된 것인, 핵산.
제1항에 있어서,
상기 ZZ 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 핵산.
A) 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 ZZ 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질(“ZZ-칼시퀘스트린 단백질”)을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 ZZ-칼시퀘스트린 단백질을 발현시키는 단계; 및
D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 ZZ-칼시퀘스트린 단백질 결합된 항체를 분리하는 단계를 포함하고,
상기 ZZ 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 칼시퀘스트린은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 것인, 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법.
삭제
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제7항에 있어서,
상기 ZZ 도메인과 칼시퀘스트린은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 링커(linker)를 통해 융합된 것인, 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법.
제7항에 있어서,
상기 ZZ 도메인 및 칼시퀘스트린 융합 단백질은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인, 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법.
제7항에 있어서,
상기 (D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 ZZ-칼시퀘스트린 단백질 결합된 항체를 분리하는 단계는:
(d-1) 칼슘을 이용하여 ZZ-칼시퀘스트린 단백질에 결합된 항체를 침전시키는 단계; 및
(d-2) 원심분리 또는 여과를 통해 침전물을 제거하는 단계를 포함하는 것인, 항체의 고속 분리 및 고순도 정제 방법.