WO2020204601A1 - Csq-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법 - Google Patents

Csq-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법 Download PDF

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WO2020204601A1
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csq
growth factor
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김성현
방진호
최미현
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Definitions

  • the present invention relates to a method for expressing, soluble and purifying a protein using a CSQ-tag (calsequestrin-tag), comprising a fusion protein comprising a CSQ-tag and a target protein, and a nucleotide sequence encoding the fusion protein
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid, an expression vector containing the nucleic acid, a cell transformed with the expression vector, and a method for expressing, watering and purifying a protein of interest using a CSQ tag.
  • the present invention is expected to reduce the cost of protein materials and drugs by improving expression and water solubility of proteins widely used in pharmaceuticals and cosmetics using the CSQ-tag and allowing them to be easily separated by calcium.
  • the protein of interest that people need can be produced by culturing cells transformed with a vector that expresses it to express the desired protein.
  • these proteins may be expressed in eukaryotic cells, prokaryotic cells, and the like, and in special cases, they may be expressed in transformed plants or transformed animals. For example, it is expressed in a transgenic animal that secretes milk, and a method such as obtaining a target protein through the milk of a transgenic animal has been attempted.
  • the desired protein can be separated and purified from cell culture or milk.
  • a process of extracting the protein from the inside of a storage organ or cell is first required. It is not easy to obtain a protein of interest from such transformed cells. Accordingly, in order to facilitate obtaining, a method of recombining a target protein into a form containing a tag other than a natural type has been widely used.
  • the method of using a tag for purification is one of the most highly efficient methods among various protein purification technologies, and the tags used at this time are largely divided into a peptide tag and a protein tag.
  • Peptide tags are composed of short amino acids and are typically histidine-tags, and in particular, hexahistidine tags (His6-tags) are frequently used. Since the histidine peptide has a specific chemical affinity with nickel, the fusion protein containing the tag can be purified with high purity by a column containing nickel.
  • a protein tag is a tag including a corresponding domain or the like in order to use the characteristics of a domain of a protein that binds to a specific component. Representatively, there is a GST-tag (Glutathione S-transferase-tag). The GST tag can be purified with high purity by a column using a glutathione immobilization medium, which is a substrate of GST.
  • the target protein can be easily expressed, hydrated, and purified. And completed the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the fusion protein and an expression vector comprising the nucleic acid.
  • a schematic diagram of the recombinant expression vector according to the present invention is shown in FIG. 1.
  • Another object of the present invention is to provide cells transformed with the expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for expressing and purifying a protein of interest using a CSQ tag.
  • An example of a method for expressing and purifying a target protein according to the present invention is shown in FIG. 2.
  • the present invention relates to a fusion protein comprising a CSQ tag and a protein of interest for improving the expression and solubility of the protein of interest.
  • the CSQ tag may be encoded with an amino acid consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the CSQ tag may be encoded with a nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4.
  • the CSQ tag and the target protein may be fused through a hydrolase-degrading peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • the target protein is characterized in that it is selected from the group consisting of high molecular proteins, glycoproteins, cytokines, growth factors, blood products, vaccines, hormones, enzymes and antibodies.
  • the protein of interest is Interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ - Interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth Fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor (EGF), insulin like growth factor factor, IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ , TGF- ⁇ , - ⁇ , brain-derived neutrophic factor (BDNF), platelet-derived growth factor (plateletderived) growth factor, PDGF), placental growth
  • the protein of interest may be encoded with an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 19.
  • the invention also relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the fusion protein.
  • the present invention also relates to an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the present invention also relates to cells transformed with the expression vector.
  • the cells are Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Salmonella typhimurium, Serratia marsessons, Pseudomonas species, yeast, insect cells, CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS- 7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK cell line, or a plant cell.
  • the present invention also comprises the steps of preparing an expression vector comprising a nucleic acid encoding the fusion protein;
  • E It relates to a method for expressing and purifying a target protein using a CSQ tag, comprising the step of separating the target protein from the fusion protein using a hydrolase.
  • solubility, and purification of a target protein using the CSQ tag of the present invention a protein that is not well expressed or aggregates well due to high expression and high water solubility of CSQ can be expressed in an aqueous solution. It is expected to be able to reduce the cost of protein materials and pharmaceuticals as it can be easily separated and purified into column-free after precipitation.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a recombinant expression vector according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a method for expressing and purifying a target protein according to the present invention.
  • EDB14 protein it is expressed using His-tag or GST-tag, but the target protein is not in the supernatant and is mostly aggregated and insolubilized as a precipitate, but EDB14, 21, 26 using CSQ-tag In the case of protein, a part of it aggregates as a precipitate, but it was confirmed that the target protein can be eluted because it is present in the supernatant (S) as a water-soluble protein of about 30-50% or more.
  • S supernatant
  • Example 5 shows the result of cutting the CSQ1TEV-EDB protein with TEV protease according to Example 1. After separating CSQ-tag and EDB protein with TEV protease, it was confirmed that EDB, the target protein, can be easily separated by sedimenting and removing the separated CSQ-tag by calcium treatment.
  • FIG. 6 shows the results of cloning the EGF target protein gene into the CSQ1TEV and CSQ1Thrombin vectors according to Example 2.
  • Example 7 shows the results of purification of CSQ1Thrombin-EGF and CSQ1TEV-EGF proteins according to Example 2. It is known that 100% of the EGF itself expressed in the original bacteria is aggregated and is present in the pellet, but using the CSQ tag indicates that 30-40% can be soluble.
  • Example 25 shows the results of purification of the CSQ2TEV-BMP2 and CSQ2Thrombin-BMP2 proteins according to Example 5.
  • 26 shows the results of cutting the CSQ2TEV-BMP2 or CSQ2Thrombin-BMP2 protein with TEV protease or Thrombin protease according to Example 5.
  • 35 shows the results of purification of the CSQ2-Ssp Dna-KGF1 protein according to Example 7.
  • CSQ calcium-binding protein of the sarcoplasmic reticulum. Even if the concentration of calcium is higher in the muscle vesicle than in the cytoplasm, it binds to calcium after muscle contraction and It allows the storage of calcium ions in the sisters of the endoplasmic reticulum. Because one calciquestrin molecule can bind several calcium (for example, each calciquestrin has 40-50 calcium binding sites), the calcium storage capacity is very good. When calcium is low, calciquestrin is present as a monomer, but when the amount of calcium increases, it becomes a multimer and increases in size.
  • target protein refers to any protein that needs to be obtained in high purity or in large quantities for a specific purpose, and includes, without limitation, a natural protein, a variant protein, or a new recombinant protein.
  • the target protein may be a protein that is required to be obtained in high purity or in large quantities for industrial, medical, academic reasons, etc., and preferably may be a recombinant protein for medicine or research, more preferably a high molecular protein, a glycoprotein, It may be one selected from the group consisting of cytokines, growth factors, blood products, vaccines, hormones, enzymes and antibodies. Even more preferably, the target protein may be all or part of the light or heavy chain of the antibody, and most preferably, the light chain variable region (VL) or the heavy chain variable region (VH) of the antibody.
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • hydrolase-degraded peptide as used herein may be included between the CSQ tag and the target protein, which is cleaved by the hydrolase to separate the CSQ tag and the target protein.
  • vector refers to an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and refers to a nucleic acid construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a nucleic acid insert.
  • Plasmids often used in the art include bacterial plasmids, phage, yeast plasmids, plant cell viruses, mammalian cell viruses, or other vectors, and plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106 , pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX series, pET series and pUC19, etc.), phage (e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 And M13, etc.) or a virus (e
  • transformation refers to DNA as a factor of chromosomes or by the completion of chromosomal integration by introducing DNA into a host, and artificially genetic changes by introducing external DNA into cells. It means a phenomenon that causes The transformation method is a CaCl2 precipitation method, a Hanahan method that improves efficiency by using a reducing material called dimethyl sulfoxide (DMSO) in the CaCl2 method, an electroporation method, a calcium phosphate precipitation method, a protoplast fusion method, and a silicon carbide fiber. Agitation method, Agrobacteria-mediated transformation method, transformation method using PEG, dextran sulfate, lipofectamine, and drying/inhibition mediated transformation method, etc., but are not limited thereto.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • host cell refers to a cell that supplies nutrition by parasiticizing other microorganisms or genes, and refers to a cell that exerts various genetic or molecular effects within the host cell by transforming the vector into the host cell. do.
  • any host cell known in the art may be used.
  • E. coli Rosetta E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • yeast Saccharomyce cerevisiae
  • insect cells e.g., human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7 , 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells, and the like can be used.
  • the present invention is to provide a fusion protein comprising a CSQ tag and a protein of interest.
  • the CSQ tag is characterized in that it comprises CSQ1 or CSQ2.
  • CSQ1 and CSQ2 are characterized in that they are encoded by amino acids consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the amino acid of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the amino acid of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the CSQ tag and the target protein are fused through a peptide degraded by a hydrolase consisting of an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • the protein of interest is characterized in that it is selected from the group consisting of a high molecular protein, a glycoprotein, a cytokine, a growth factor, a blood product, a vaccine, a hormone, an enzyme, and an antibody.
  • the protein of interest is Interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ - Interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth Fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor (EGF), insulin like growth factor factor, IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ , TGF- ⁇ , - ⁇ , brain-derived neutrophic factor (BDNF), platelet-derived growth factor (plateletderived) growth factor, PDGF), placental growth factor (PLGF), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2, keratinocytes Keratinocyte growth factor (KGF), gluca
  • the protein of interest is characterized in that it is encoded with an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 19.
  • the present invention is to provide a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a fusion protein comprising a CSQ tag and a protein of interest, and an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the CSQ tag is characterized in that it is encoded with an amino acid consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acid of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4. .
  • the CSQ tag and the target protein are fused through a peptide digested by a hydrolase consisting of amino acids selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • the target protein is characterized in that it is selected from the group consisting of a high molecular protein, a glycoprotein, a cytokine, a growth factor, a blood product, a vaccine, a hormone, an enzyme and an antibody.
  • the protein of interest is Interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ - Interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth Fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor (EGF), insulin like growth factor factor, IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ , TGF- ⁇ , - ⁇ , brain-derived neutrophic factor (BDNF), platelet-derived growth factor (plateletderived) growth factor, PDGF), placental growth factor (PLGF), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2, keratinocytes Keratinocyte growth factor (KGF), gluca
  • the protein of interest is characterized in that it is encoded with an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 19.
  • the present invention is to provide a cell transformed with an expression vector containing a fusion protein containing a CSQ tag and a protein of interest.
  • the CSQ tag is characterized in that it is encoded with an amino acid consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acid of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the CSQ tag and the target protein are fused through a peptide degraded by a hydrolase consisting of amino acids selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • the target protein is selected from the group consisting of high molecular protein, glycoprotein, cytokine, growth factor, blood product, vaccine, hormone, enzyme and antibody.
  • the protein of interest is Interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ - Interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth Fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor (EGF), insulin like growth factor factor, IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ , TGF- ⁇ , - ⁇ , brain-derived neutrophic factor (BDNF), platelet-derived growth factor (plateletderived) growth factor, PDGF), placental growth
  • BDNF brain-derived neutroph
  • the protein of interest is characterized in that it is encoded with an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 19.
  • the cells are Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Salmonella typhimurium, Serratia Marsessons, Pseudomonas species, yeast, insect cells, CHO cell lines ( Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK cell line, or plant cell.
  • the present invention is to provide a method for expressing and purifying a protein of interest using a CSQ tag, the method:
  • E It includes the step of separating the target protein from the fusion protein using a hydrolase.
  • the CSQ tag is characterized in that it is encoded with an amino acid consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acid of SEQ ID NO: 2 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the CSQ tag and the target protein are fused through a peptide degraded by a hydrolase consisting of amino acids selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 8. .
  • the protein of interest is characterized in that it is selected from the group consisting of a high molecular protein, a glycoprotein, a cytokine, a growth factor, a blood product, a vaccine, a hormone, an enzyme, and an antibody.
  • the protein of interest is Interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ - Interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth Fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor (EGF), insulin like growth factor factor, IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ , TGF- ⁇ , - ⁇ , brain-derived neutrophic factor (BDNF), platelet-derived growth factor (plateletderived) growth factor, PDGF), placental growth factor (PLGF), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2, keratinocytes Keratinocyte growth factor (KGF), gluca
  • the protein of interest is characterized in that it is encoded with an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 19.
  • EDB-F1 and EDB-B1 were synthesized (Bioneer, Daejeon, Korea). Meanwhile, as a comparative example, a fusion protein of a known His tag or GST tag and EDB was prepared.
  • EDB-F1 20 pmol of EDB-F1
  • 20 pmol of EDB-B1 4 ⁇ l of PCR PreMix (Elpisbio, Daejeon, Korea) and 10 ⁇ g of Template were mixed to prepare a mixture with distilled water to a total of 20 ⁇ l.
  • This mixture was subjected to PCR reaction (95°C for 5 minutes, 30 times: 95°C for 30 seconds, 42°C for 30 seconds, 72°C for 45 seconds and 72°C for 5 minutes), amplified, and purified (PCR Purification Kit , GeneAll, Seoul, Korea), EDB14 (SEQ ID NO: 9), EDB21 (SEQ ID NO: 10), EDB26 (SEQ ID NO: 11) genes were obtained.
  • the CSQ1TEV or CSQ1Thrombin vector and insert DNA were treated with restriction enzymes. About 1 ⁇ g of insert DNA was reacted with BamHI (New England Biolabs (NEB, Ipswich) and XhoI (NEB, Ipswich) for one day, and then purified DNA was obtained using a PCR purification kit.
  • CSQ1TEV or CSQ1Thrombin CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich) was added to the vector and reacted for 3 hours, followed by purification using a PCR purification kit.
  • the CSQ1Thrombin vector was connected for 3 hours at room temperature (FIG. 3).
  • DH5a a competent cell
  • DH5a a competent cell
  • a solution ligated to 100 ⁇ l of competent cells was reacted for 30 minutes.
  • heat shock was performed at 42°C for 1 minute
  • 200 ⁇ l of SOC media was added, and then incubated at 37°C for 30 minutes and smeared.
  • Six colonies from the smear were randomly taken and PCR was performed, and the insert was confirmed by DNA electrophoresis. Cloning colonies were confirmed by requesting sequencing from Bioneer.
  • the fusion protein of His tag or GST tag and EDB was cloned into pBT7-N-His and pBT7-N-GST vectors provided by Bioneer in the same manner as above.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 20 ml LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for one day while mixing at 37°C at 200 rpm, and then 400 ml LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred to and incubated until OD 0.7. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 18°C at a speed of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • His-EDB was expressed and purified in the following manner.
  • the cloned EDB14 into pBT7-N-His vector was transformed into BL21 cells, and then spread on agar medium containing ampicillin. After inoculating the colony grown on agar plate medium into 5 mL of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/mL), incubate for a day while mixing at 37°C at 220 rpm, and mix it with glycerol in a ratio of 1:1 to stock. 1 ml was made and stored in a -80°C deepfreezer.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 20 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a rate of 220 rpm at 37°C, and then 400 ml of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred to and incubated until OD 0.7. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 37°C at 220 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000xg at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • GST-EDB was expressed and purified in the following manner.
  • the cloned EDB14 into the pBT7-N-GST vector was transformed into BL21 cells, and then spread on agar medium containing ampicillin. After inoculating the colony grown on agar plate medium into 5 mL of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/mL), incubate for a day while mixing at 37°C at 220 rpm, and mix it with glycerol in a ratio of 1:1 to stock. 1 ml was made and stored in a -80°C deepfreezer.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 20 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a rate of 220 rpm at 37°C, and then 400 ml of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred to and incubated until OD 0.7. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 37°C at 220 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000xg at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • EDB14 protein cannot be expressed as a supernatant using His-tag or GST-tag, but it is soluble and can be expressed as a supernatant when using CSQ-tag.
  • TEV protease (Genscript. USA) was added and reacted at 30° C. for one day, and then confirmed by SDS-PAGE (FIG. 5). As a result, it was confirmed that the CSQ-tag and EDB fusion proteins were precipitated by calcium and then easily separated using TEV protease.
  • EGF-F1 and EGF-B1 were synthesized (Bioneer, Daejeon, Korea).
  • EGF-F1 20 pmol of EGF-F1
  • 20 pmol of EGF-B1 4 ⁇ l of PCR PreMix (Elpisbio, Daejeon, Korea) and 10 ⁇ g of Template were mixed to make a mixture containing distilled water to a total of 20 ⁇ l.
  • This mixture was subjected to PCR reaction (95°C for 5 minutes, 30 times: 95°C for 30 seconds, 42°C for 30 seconds, 72°C for 45 seconds and 72°C for 5 minutes), amplified, and purified (PCR Purification Kit , GeneAll, Seoul, Korea), EGF gene (SEQ ID NO: 12) was obtained.
  • the vector and insert DNA were treated with restriction enzymes. About 1 ⁇ g of insert DNA was reacted with BamHI (New England Biolabs (NEB, Ipswich) and XhoI (NEB, Ipswich) for one day, and then purified DNA was obtained using a PCR purification kit.
  • CSQ1TEV and CSQ1Thrombin CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich) was added to the vector and reacted for 3 hours, followed by purification using a PCR purification kit Insert DNA was vectored using T4 DNA ligase (Bioneer, Daejeon, Korea) And it was connected for 3 hours at room temperature (Fig. 6).
  • DH5a a competent cell
  • DH5a a competent cell
  • heat shock was performed at 42°C for 1 minute
  • 200 ⁇ l of SOC media was added, and then incubated at 37°C for 30 minutes and smeared.
  • Six colonies from the smear were randomly taken and PCR was performed, and the insert was confirmed by DNA electrophoresis. Cloning colonies were confirmed by requesting sequencing from Bioneer.
  • the DNA whose sequence was confirmed in Bioneer was transformed into BL21 cells, and then spread on agar medium containing ampicillin. After inoculating a colony grown on agar plate medium into 5 mL of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/mL), incubating for a day while mixing at 37°C at a speed of 200 rpm, mixed with glycerol in a ratio of 1:1 to stock 1 ml was made and stored in a -80°C deepfreezer.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 20 ml LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for one day while mixing at 37°C at 200 rpm, and then 400 ml LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred to and incubated until OD 0.7. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 18°C at a speed of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • Thrombin protease In order to separate only EGF from CSQ1 Thrombin-EGF protein, 5 ⁇ l of Thrombin protease was added and reacted at 22° C. for one day, and then confirmed by SDS-PAGE (FIG. 8). As a result, it was confirmed that CSQ-tag and EDB fusion proteins can be easily separated using Thrombin protease.
  • KGF1 (SEQ ID NO: 13), VEGF (SEQ ID NO: 14) and FGF2 (SEQ ID NO: 15) were synthesized in Bioneer, cloned into CSQ1TEV, transformed into BL21 cells, and plated on agar medium containing ampicillin. After inoculating a colony grown on agar plate medium into 5 mL of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/mL), incubating for a day while mixing at 37°C at a speed of 200 rpm, mixed with glycerol in a ratio of 1:1 to stock 1 ml was made and stored in a -80°C deepfreezer.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 30 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a speed of 200 rpm at 37° C., and then in 1 L of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred and incubated to OD 0.6. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 17°C at a rate of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • CSQ1TEV-VEGF and CSQ1TEV-FGF proteins also perform the same experiment as CSQ1TEV-KGF1 protein
  • 5 ⁇ l of TEV protease (Genscript. USA) was added and reacted at 30° C. for one day. And confirmed by SDS-PAGE (FIGS. 10, 12, and 14).
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • TEVCSQ1 or ThrombinCSQ1 vector and insert DNA were treated with restriction enzymes in order to insert the BMP2 gene (hereinafter, the same experiment as BMP2 was performed in the case of the TGF ⁇ gene) into TEVCSQ1 or ThrombinCSQ1 vector.
  • BMP2 was performed in the case of the TGF ⁇ gene
  • About 1 ⁇ g of insert DNA was reacted with BamHI (New England Biolabs (NEB, Ipswich) for one day, and then reacted with XhoI (NEB, Ipswich) for two days. Then, purified DNA was obtained using a PCR purification kit.
  • CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
  • Takara Japan
  • T4 DNA ligase Booneer, Daejeon, Korea
  • BMP2-TEVCSQ1 or BMP2-ThrombinCSQ1 Purification of BMP2-TEVCSQ1 or BMP2-ThrombinCSQ1, TGF ⁇ -TEVCSQ1 or TGF ⁇ -ThrombinCSQ1, HRP-TEVCSQ1 and GLP1-TEVCSQ1
  • BMP2-TEVCSQ1, BMP2-ThrombinCSQ1, TGF ⁇ -TEVCSQ1, TGF ⁇ -ThrombinCSQ1, HRP-TEVCSQ1, GLP-TEVCSQ1 vectors each of which the sequence was confirmed in Bioneer, was transformed into BL21 cells, and then plated on agar medium containing ampicillin. After inoculating a colony grown on agar plate medium into 5 mL of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/mL), incubating for a day while mixing at 37°C at a speed of 200 rpm, mixed with glycerol in a ratio of 1:1 to stock 1 ml was made and stored in a -80°C deepfreezer.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 30 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a speed of 200 rpm at 37° C., and then in 1 L of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred and incubated to OD 0.6. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 17°C at a rate of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • BMP2-TEVCSQ1 and BMP2-ThrombinCSQ1 proteins (FIGS. 16, 18, 20, and 22).
  • TGF ⁇ -TEVCSQ1 In order to separate BMP2 from BMP2-TEVCSQ1 protein (hereinafter, TGF ⁇ -TEVCSQ1, HRP-TEVCSQ1 and GLP1-TEVCSQ1 proteins are also subjected to the same experiment as BMP2-TEVCSQ1), 2 ⁇ l of TEV protease (Genscript. USA) was added to After reacting for one day at, it was confirmed by SDS-PAGE (FIGS. 17, 19, 21, and 23). As a result, it was confirmed that the CSQ-tag and BMP2 fusion proteins can be easily separated using TEV protease.
  • BMP2-ThrombinCSQ1 In order to separate BMP2 from BMP2-ThrombinCSQ1 protein (hereinafter, the same experiment as BMP2-TEVCSQ1 is also performed in the case of TGF ⁇ -TEVCSQ1 protein), 5 ⁇ l of Thrombin protease was added and reacted at 22° C. for one day, and then confirmed by SDS-PAGE ( 17, 19). As a result, it was confirmed that CSQ-tag and BMP2 fusion proteins can be easily separated using Thrombin protease.
  • This mixture was subjected to PCR reaction (95°C for 5 minutes, 30 times: 95°C for 30 seconds, 47°C for 30 seconds, 72°C for 45 seconds and 72°C for 5 minutes), amplified, and purified (PCR Purification Kit , GeneAll, Seoul, Korea), BMP2 (SEQ ID NO: 16) and KGF1 (SEQ ID NO: 13) genes were obtained.
  • BMP2 SEQ ID NO: 16
  • KGF1 SEQ ID NO: 13
  • CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
  • T4 DNA ligase Booneer, Daejeon, Korea
  • the DNA obtained by linking the CSQ2TEV or CSQ2Thrombin vector and the BMP2 insert was transformed.
  • DH5 ⁇ a competent cell
  • a solution ligated to 100 ⁇ l of competent cells was reacted for 30 minutes.
  • heat shock was performed at 42°C for 30 seconds
  • 200 ⁇ l of SOC media was added, and then incubated at 37°C for 40 minutes to smear.
  • the colonies produced by smearing were randomly taken, and the cloning colonies were confirmed by requesting sequencing from Bioneer.
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 30 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a speed of 200 rpm at 37° C., and then in 1 L of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred and incubated to OD 0.6. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 17°C at a rate of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 30 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a speed of 200 rpm at 37° C., and then in 1 L of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred and incubated to OD 0.6. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 17°C at a rate of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • EGF EGF
  • KGF1 SEQ ID NO: 13
  • Inoculate 100 ⁇ l of stock in 30 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for a day while mixing at a speed of 200 rpm at 37° C., and then in 1 L of LB media containing ampicillin (50 ⁇ g/ml). Transferred and incubated to OD 0.6. Then, 1mM isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside (IPTG) was added and incubated at 17°C at a rate of 200 rpm for one day. All the supernatant was removed by centrifugation at 4000 rpm at 4° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • EGF EGF
  • BMP2 SEQ ID NO: 16
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • E. coli was added. After dissolving E. coli using a sonicator, it was centrifuged at 4° C. at a speed of 13,000 rpm for 1 hour. CaCl 2 20mM was added to the supernatant and reacted at 4°C for 1 hour. Then, centrifugation was performed for 30 minutes at a speed of 5000 rpm. The supernatant was removed, EDTA was added to the precipitate, and suspended to obtain EGF-GyrA-CSQ1 and BMP2-GyrA-CSQ2 proteins (FIGS. 37 and 39).

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Abstract

본 발명은 CSQ-태그 (calsequestrin-tag)를 이용한 단백질의 발현, 수용화 및 정제 방법에 관한 것으로, CSQ-태그 및 목적 단백질을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 의약품 및 화장품에 많이 사용되고 있는 단백질을 CSQ-태그를 이용하여 발현을 증가시키고 칼슘에 의해 쉽게 분리될 수 있도록 함으로써, 단백질 소재 및 의약품 단가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CSQ-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법
본 발명은 CSQ-태그 (calsequestrin-tag)를 이용한 단백질의 발현, 수용화 그리고 정제 방법에 관한 것으로, CSQ-태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오디드 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포, 및 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현, 수용화 및 정제 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 의약품 및 화장품에 많이 사용되고 있는 단백질을 CSQ-태그를 이용하여 발현 및 수용화를 향상시키고 칼슘에 의해 쉽게 분리될 수 있도록 함으로써, 단백질 소재 및 의약품 단가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다.
최근 유전공학 및 생물학의 발전으로 특정 단백질을 대량으로 생산 또는 수득하여 각종 산업 및 질병의 치료 등에 사용하고자 하는 시도가 많이 있다. 이에 따라, 원하는 단백질을 수득하기 위한 단백질 조합 기술, 대량 생산 기술 및 정제 기술 등이 중점적으로 개발되고 있다. 종종 사람들이 필요로 하는 목적 단백질은 이를 발현하는 벡터로 형질전환된 세포를 배양하여 원하는 단백질을 발현시켜 생산될 수 있다. 경우에 따라서 이러한 단백질은 진핵세포, 원핵세포 등에서 발현될 수 있으며, 특별한 경우에는 형질전환된 식물이나 형질전환된 동물에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 젖을 분비하는 형질전환된 동물에서 발현되어, 형질전환 동물의 젖을 통하여 목적 단백질을 수득하는 등의 방법 등이 시도되고 있다. 이 경우, 세포 배양물 또는 젖으로부터 원하는 단백질을 분리 정제할 수 있다.
별도의 분비를 통한 목적 단백질 수득 방법이 없는 동·식물이나 미생물에서 단백질을 발현시키는 경우에는 우선 저장기관이나 세포 내부로부터 단백질을 추출하는 과정이 필요하게 된다. 이러한 형질전환 세포로부터 목적 단백질을 수득하는 작업은 용이하지 않다. 이에 따라, 수득을 용이하기 위하여 목적 단백질을 천연형이 아닌 태그(tag)를 포함하는 형태로 재조합하는 방법이 많이 사용되고 있다. 정제를 위하여 태그(tag)를 이용하는 방법은 다양한 단백질 정제 기술 중 굉장히 높은 효율성을 나타내는 방법 중 하나로, 이때 사용되는 태그는 크게 펩타이드 태그와 단백질 태그로 나뉜다. 펩타이드 태그는 짧은 아미노산으로 이루어진 것으로 대표적으로는 히스 태그(his-tag, histidine-tag)이 있으며, 특히 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag, His6-tag)이 많이 사용된다. 히스티딘 펩타이드는 니켈과 특이적인 화학적 친화력을 가지고 있어, 해당 태그를 포함하는 융합 단백질은 니켈을 포함하는 컬럼에 의해 높은 순도로 정제될 수 있다. 단백질 태그는 특정 성분에 결합하는 단백질의 도메인이 가진 특징 등을 이용하기 위하여 해당 도메인 등을 포함하는 태그이다. 대표적으로는 GST-태그(Glutathione S-transferase-tag)가 있다. GST 태그는 GST의 기질인 글루타치온 고정 매개체로 하는 컬럼에 의해 높은 순도로 정제될 수 있다.
이에 본 발명자들은 목적 단백질의 수득을 용이하게 하기 위한 신규한 태그를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, CSQ(calsequestrin) 태그를 목적 단백질에 융합시키는 경우 목적 단백질이 용이하게 발현 및 수용화 그리고 정제될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
[선행문헌]
대한민국 공개특허 제10-2014-0026781호
본 발명의 목적은 CSQ-태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법의 일 예를 도 2에 나타내었다.
본 발명은 목적 단백질의 발현 및 수용화 향상을 위한 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩될 수 있다.
상기 상기 CSQ 태그는 서열번호 4 또는 서열번호 4로 이루어진 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.
상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 가수분해효소 분해 펩타이드를 통해 융합될 수 있다.
상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 발현벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
상기 세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 또는 식물세포일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;
D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질를 침전시키는 단계; 및
E) 가수분해효소를 이용하여 융합 단백질로터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현, 수용화 및 정제 방법에 따르면, CSQ의 고발현 및 높은 수용성으로 인해 잘 발현이 안되거나 응집이 잘 되는 단백질을 수용액 상태에서 발현이 가능하며 칼슘에 의해 침전을 하여 무컬럼으로 쉽게 분리하여 정제할 수 있어서 단백질 소재 및 의약품 단가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법의 모식도를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에 따라 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터에 EDB 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따라 CSQ1TEV-EDB, CSQ1Thrombin-EDB 단백질의 정제 결과와 기존 상용화 되어 있는 태그인 His tag와 GST 융합단백질로 EDB를 정제한 결과를 비교한 것을 나타낸다. EDB14 단백질의 경우 His-tag이나 GST-tag을 이용해서 발현은 되지만 목적 단백질이 상층액(Supernatant)에 있지 않고 대부분 침전물(Pellet)로 응집되어 불용화되나, CSQ-tag를 이용한 EDB14, 21, 26 단백질의 경우 침전물로 일부가 응집 되지만 약 30~50% 이상 수용성 단백질로 상층액(S)에 존재해 목적 단백질이 용출 가능함이 확인되었다.
도 5은 실시예 1에 따라 CSQ1TEV-EDB 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다. TEV protease로 CSQ-tag과 EDB 단백질을 분리 후에 칼슘처리 하여 분리된 CSQ-tag을 침전시켜 제거하여 목적단백질인 EDB를 쉽게 분리 할 수 있음이 확인되었다.
도 6은 실시예 2에 따라 CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin 벡터에 EGF 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 7는 실시예 2에 따라 CSQ1Thrombin-EGF, CSQ1TEV-EGF 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다. 본래 박테리아에서 발현한 EGF 자체는 응집되어 100% 모두 침전물 (pellet)에 존재한다고 알려져 있는데, CSQ 태그를 이용하면 30~40%는 수용화될 수 있음을 나타낸다.
도 8은 실시예 2에 따라 CSQ1Thrombin-EGF 단백질을 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-KGF1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-KGF1 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 11은 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-VEGF 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-VEGF 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-FGF2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-FGF2 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 15는 실시예 4에 따라 TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터에 BMP2 및 TGFβ 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 16은 실시예 4에 따라 BMP2-TEVCSQ1, BMP2-ThrombinCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 17은 실시예 4에 따라 BMP2-TEVCSQ1 또는 BMP2-ThrombinCSQ1 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 18은 실시예 4에 따라 TGFβ-TEVCSQ1, TGFβ-ThrombinCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 19는 실시예 4에 따라 TGFβ-TEVCSQ1 또는 TGFβ-ThrombinCSQ1 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 20은 실시예 4에 따라 HRP-TEVCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 21은 실시예 4에 따라 HRP-TEVCSQ1 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 22는 실시예 4에 따라 GLP1-TEVCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 23은 실시예 4에 따라 GLP1-TEVCSQ1단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 24는 실시예 5에 따라 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터에 BMP2 및 KGF1 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 25는 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-BMP2와 CSQ2Thrombin-BMP2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 26은 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-BMP2 또는 CSQ2Thrombin-BMP2 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 27은 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-KGF1, CSQ2Thrombin-KGF1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 28은 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-KGF1 또는 CSQ2Thrombin-KGF1 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 29는 실시예 6에 따라 HRP-TEVCSQ2, HRP-ThrombinCSQ2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 30은 실시예 6에 따라 HRP-TEVCSQ2 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 31은 실시예 6에 따라 GLP1-TEVCSQ2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 32는 실시예 6에 따라 GLP1-TEVCSQ2 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 33은 실시예 7에 따라 CSQ1-Ssp Dna-EGF 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 34는 실시예 7에 따라 CSQ1-Ssp Dna-EGF 단백질을 Dithiothreitol(DTT)로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 35는 실시예 7에 따라 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 36은 실시예 7에 따라 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질을 Dithiothreitol(DTT)로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 37은 실시예 8에 따라 EGF-GyrA-CSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 38은 실시예 8에 따라 EGF-GyrA-CSQ1 단백질을 20mM Na-HEPES (pH 6.5) 버퍼를 이용하여 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 39는 실시예 8에 따라 BMP2-GyrA-CSQ2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 40은 실시예 8에 따라 20mM Na-HEPES (pH 6.5) 버퍼를 이용하여 잘라낸 결과를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "칼시퀘스트린(calsequestrin, CSQ)"은 근소포체(sarcoplasmic reticulum)의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근소포체에서 칼슘의 농도가 더 높을 지라도 근육 수축 후에 칼슘과 결합하여 근소포체의 시스터나에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 한다. 하나의 칼시퀘스트린 분자가 여러 칼슘(예를 들면, 칼시퀘스트린 한 분자당 40-50개의 칼슘 결합 부위를 가짐)과 결합할 수 있기 때문에 칼슘 저장 능력이 매우 우수하다. 칼시퀘스트린은 칼슘이 적을때는 단량체로 존재하다가 칼슘의 양이 증가하면 다량체로 변해 크기가 커지는 성질을 가지고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질”은 특정 목적에 의해서 높은 순도 또는 대량으로 수득할 필요가 있는 임의의 단백질을 말하며, 이에는 천연형 단백질, 변이체 단백질, 또는 신규 재조합 단백질 등이 제한 없이 포함된다. 목적 단백질은 산업적, 의료적, 학문적 이유 등으로 높은 순도로 또는 대량으로 수득이 요구되는 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 의약용 또는 연구용 재조합 단백질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 더욱더 바람직하게는 목적 단백질은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 가장 바람직하게는 항체의 경쇄 가변영역(VL) 또는 중쇄 가변영역(VH)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가수분해효소에 의한 분해 펩타이드 "는 CSQ 태그와 목적 단백질 사이에 포함할 수 있으며, 이는 가수분해효소에 의해 절단되어 CSQ 태그와 목적 단백질을 분리 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 포함하며, 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아-매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들면 E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모( Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예를 들면, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 CSQ 태그는 CSQ1 또는 CSQ2를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 CSQ1 및 CSQ2는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다. .
본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.
제3구현예에 따르면,
본 발명은 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 또는 식물세포인 것을 특징으로 한다.
제4구현예에 따르면,
본 발명은 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공하고자 하는 것으로, 상기 방법은:
A) CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;
D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질를 침전시키는 단계; 및
E) 가수분해효소를 이용하여 융합 단백질로터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: CSQ-태그를 이용한 EDB의 분리
1-1. CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin Vector에 EDB Cloning
CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin vector에 EDB를 cloning하기 위해서, 하기의 올리고뉴클레오티드 EDB-F1 및 EDB-B1 를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea). 한편, 비교예로서 공지 His tag 또는 GST tag와 EDB의 융합 단백질을 제조하였다.
5'-AATGGATCCGAGGTGCCCCAACTCACTGAC-3' (서열번호 20)
5'-ATTCTCGAGTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGG-3’ (서열번호 21)
증폭하기 위해서 EDB-F1 20pmol, EDB-B1 20pmol, PCR PreMix 4㎕ (Elpisbio, Daejeon, Korea) 및 Template 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 42℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), EDB14(서열번호 9), EDB21(서열번호 10), EDB26(서열번호 11) 유전자를 얻었다. EDB유전자를 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터에 삽입하기 위해서 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)및 XhoI (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 40㎍의 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 CSQTEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 3).
그 다음, CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 EDB 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5a를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 2㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 1분간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 6개 찍어 PCR하였고, DNA 전기영동하여 Insert를 확인 하였다. cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.
비교예로서 His tag 또는 GST tag와 EDB의 융합 단백질은 바이오니아에서 제공하는 pBT7-N-His와 pBT7-N-GST vector에 위와 같은 방법으로 클로닝하였다.
1-2. CSQ1TEV-EDB, CSQ1Thrombin-EDB, His-EDB, GST-EDB 정제
바이오니아에서 시퀀스가 확인 된 DNA 모두를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 18℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1TEV-EDB 와 CSQ1Thrombin-EDB 단백질을 얻었다 (도 4).
His-EDB는 다음과 같은 방법으로 발현 정제하였다. pBT7-N-His vector에 EDB14를 클로닝한 것을 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다.
소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 Ni-NTA 친화성 레진(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 20mM imidazole) 600㎖로 washing 후 일루션 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 250mM imidazole)을 이용하여 N-말단 His-tag EDB14 단백질을 용출시켜 획득하였다. (도 4).
GST-EDB는 다음과 같은 방법으로 발현 정제하였다. pBT7-N-GST vector에 EDB14를 클로닝한 것을 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl 및 0.05% NP-40)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다.
소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 GST·Bind Agarose Resin(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM Tris-Cl(pH 8.0), 150mM NaCl 및 0.1mM EDTA) 600㎖로 washing 후 일루션 버퍼(50mM Tris-Cl(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.1mM EDTA 및 10mM Reduced(Free) glutathione)을 이용하여 N-말단 GST-tag EDB14 단백질을 용출시켜 획득하였다. (도 4).
그 결과, EDB14 단백질의 경우 His-tag이나 GST-tag을 이용해서는 상등액(supernatant)으로 발현이 안되나 CSQ-tag을 이용하는 경우 수용화되어 상등액으로 발현 가능하다는 것이 확인되었다.
1-3. TEV protease를 이용한 EDB 분리
CSQ1TEV-EDB 단백질에서 EDB만 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 5㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 5). 그 결과, CSQ-tag 및 EDB 융합 단백질은 칼슘에 의해 침전된 후, TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 2: CSQ-태그를 이용한 EGF의 분리
2-1. CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin Vector에 EGF Cloning
CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin vector에 EGF를 cloning하기 위해서, 하기의 두 개의 올리고뉴클레오티드 EGF-F1 및 EGF-B1를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea).
5'-AATGGATCCAACTCTGATAGCGAATGCCCG-3' (서열번호 22)
5'-ATTCTCGAGTTA ACGCAGTTCCCACCATTT-3' (서열번호 23)
증폭하기 위해서 EGF-F1 20pmol, EGF-B1 20pmol, PCR PreMix 4㎕ (Elpisbio, Daejeon, Korea) 및 Template 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 42℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), EGF 유전자 (서열번호 12)를 얻었다. EGF유전자를 CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin 벡터에 삽입하기 위해서 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)및 XhoI (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 40㎍의 CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 6).
그 다음, CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 EGF 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5a를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 2㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 1분간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 6개 찍어 PCR하였고, DNA 전기영동하여 Insert를 확인 하였다. cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.
2-2. CSQ1Thrombin-EGF 또는 CSQ1TEV-EGF 정제
바이오니아에서 시퀀스가 확인 된 DNA를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 18℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1Thrombin-EGF와 CSQ1TEV-EGF 단백질을 얻었다 (도 7).
2-3. Thrombin protease를 이용한 EGF 분리
CSQ1Thrombin-EGF 단백질에서 EGF만 분리하기 위해서 Thrombin protease 5㎕를 첨가하여 22℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 8). 그 결과, CSQ-tag 및 EDB 융합 단백질은 Thrombin protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 3. CSQ-태그를 이용한 KGF1, VEGF 및 FGF2의 분리
3-1. CSQ1TEV-KGF1, CSQ1TEV-VEGF 및 CSQ1TEV-FGF2 정제
KGF1(서열번호 13), VEGF(서열번호 14) 및 FGF2(서열번호 15)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 CSQ1TEV에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1TEV-KGF1 와 CSQ1TEV-VEGF 및 CSQ1TEV-FGF2 단백질을 얻었다 (도 9, 도 11, 도 13).
3-2. TEV protease를 이용한 KGF1, VEGF 및 FGF2 분리
CSQ1TEV-KGF1 단백질(이하 CSQ1TEV-VEGF 및 CSQ1TEV-FGF 단백질의 경우에도 CSQ1TEV-KGF1과 동일한 실험을 수행함)에서 KGF1만 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 5㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 10, 도 12, 도 14). 그 결과, CSQ-tag 및 KGF1 융합 단백질, CSQ-tag 및 VEGF 단백질, 및 CSQ-tag 및 FGF 단백질은 모두 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 4. CSQ-태그를 이용한 BMP2, TGFβ, HRP 및 GLP1의 분리
4-1. TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 Vector에 BMP2 및 TGFβ Cloning
TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 vector에 BMP2 및 TGFβ를 cloning하기 위해서, 하기의 올리고뉴클레오티드 Amplify-F1 및 Amplify-B1 를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea).
5'-CAGCAAGACAGCGATGGATCC-3' (서열번호 24)
5'-CGACTTACAGGTGATCTCGAG-3’ (서열번호 25)
증폭하기 위해서 Amplify-F1 20pmol, Amplify-B1 20pmol, PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 및 Temp late 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 47℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), BMP2(서열번호 16) 및 TGFβ(서열번호 17) 유전자를 얻었다. BMP2유전자 (이하 TGFβ 유전자의 경우에도 BMP2와 동일한 실험을 수행함)를 TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터에 삽입하기 위해서 TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응 시킨 뒤, XhoI(NEB, Ipswich)으로 이틀 동안 반응시켰다. 그 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 3㎍의 TEVCSQ 또는 ThrombinCSQ 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (Takara, Japan)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 TEVCSQ 또는 ThrombinCSQ 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 15).
그 다음, TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터와 BMP2 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5α를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 5㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 30초간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 40분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 찍어 cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다. HRP(서열번호 18)와 GLP1(서열번호 19) 유전자도 바이오니아에서 합성한 후에 위와 같은 방법으로 TEVCSQ1에 클로닝하였다.
4-2. BMP2-TEVCSQ1 또는 BMP2-ThrombinCSQ1, TGFβ-TEVCSQ1 또는 TGFβ-ThrombinCSQ1, HRP-TEVCSQ1 및 GLP1-TEVCSQ1 정제
바이오니아에서 시퀀스가 확인된 BMP2-TEVCSQ1, BMP2-ThrombinCSQ1, TGFβ-TEVCSQ1, TGFβ-ThrombinCSQ1 , HRP-TEVCSQ1, GLP-TEVCSQ1 벡터 각각을 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 BMP2-TEVCSQ1 와 BMP2-ThrombinCSQ1 단백질을 얻었다 (도 16, 도 18, 도 20, 도 22).
4-3. TEV protease를 이용한 BMP2, TGFβ, HRP 및 GLP1 분리
BMP2-TEVCSQ1 단백질(이하 TGFβ-TEVCSQ1, HRP-TEVCSQ1 및 GLP1-TEVCSQ1 단백질의 경우에도 BMP2-TEVCSQ1과 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 2㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다(도 17, 도 19, 도 21, 도 23). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
4-4. Thrombin protease를 이용한 BMP2 및 TGFβ 분리
BMP2-ThrombinCSQ1 단백질(이하 TGFβ-TEVCSQ1 단백질의 경우에도 BMP2-TEVCSQ1과 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 Thrombin protease 5㎕를 첨가하여 22℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 17, 도 19). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 Thrombin protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 5. CSQ-캐그를 이용한 BMP2 및 KGF1의 분리
5-1. CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin Vector에 BMP2 및 KGF1 Cloning
CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin Vector에 BMP2 및 KGF1를 cloning하기 위해서, 합성한 올리고뉴클레오티드 Amplify-F1 및 Amplify-B1 를 사용하였다. (Bioneer, Daejeon, Korea). 증폭하기 위해서 Amplify-F1 20pmol, Amplify-B1 20pmol, PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 및 Temp late 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 47℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), BMP2(서열번호 16) 및 KGF1(서열번호 13) 유전자를 얻었다. BMP2유전자 (이하 KGF1 유전자의 경우에도 BMP2와 동일한 실험을 수행함)를 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터에 삽입하기 위해서 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응 시킨 뒤, XhoI(NEB, Ipswich)으로 이틀 동안 반응시켰다. 그 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 3㎍의 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (Takara, Japan)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 24).
그 다음, CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터와 BMP2 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5α를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 5㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 30초간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 40분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 찍어 cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.
5-2. CSQ2TEV-BMP2 또는 CSQ2Thrombin-BMP2 및 CSQ2TEV-KGF1 또는 CSQ2Thrombin-KGF1 정제
바이오니아에서 시퀀스가 확인 된 DNA 모두를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ2TEV-BMP2 와 CSQ2Thrombin-BMP2 단백질을 얻었다 (도 25, 도 27).
5-3. TEV Protease를 이용한 BMP2 및 KGF 분리
CSQ2TEV-BMP2 단백질(이하 CSQ2TEV-KGF1 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 2㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 26, 도 28). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
5-4. Thrombin Protease를 이용한 BMP2 및 KGF 분리
CSQ2Thrombin-BMP2 단백질(이하 CSQ2Thrombin-KGF1 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 Thrombin protease 5㎕를 첨가하여 22℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 26, 도 28). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 Thrombin protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 6. CSQ-태그를 이용한 HRP 및 GLP1의 분리
6-1. HRP-TEVCSQ2 또는 HRP-ThrombinCSQ2 및 GLP1-TEVCSQ2 정제
HRP(서열번호 18) 및 GLP1(서열번호 19)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 TEVCSQ2와 ThrombinCSQ2 벡터에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 HRP-TEVCSQ2 와 HRP-ThrombinCSQ2 및 GLP1-TEVCSQ2 단백질을 얻었다 (도 29, 도 31).
6-2. TEV Protease를 이용한 HRP 및 GLP1 분리
HRP-TEVCSQ2 단백질(이하 GLP1-TEVCSQ2 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 HRP를 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 2㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 30, 도 32). 그 결과, CSQ-tag 및 HRP 융합 단백질, 및 CSQ-tag 및 GLP1 유압 단백질은 모두 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 7. CSQ-태그를 이용한 EGF 및 KGF1의 분리
7-1. CSQ1-Ssp Dna-EGF 및 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 정제
EGF(서열번호 12), KGF1(서열번호 13)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 CSQ1-Ssp Dna와 CSQ2-Ssp Dna 벡터에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1-Ssp Dna-EGF 및 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질을 얻었다 (도 33, 도 35).
7-2. pH를 이용한 EGF 및 KGF1 분리
CSQ1-Ssp Dna-EGF 단백질(이하 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 EGF를 분리하기 위해서 20mM HEPES pH 6.5, 500mM NaCl 버퍼를 이용하여 상온에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 34, 도 36). 그 결과, CSQ-tag 및 EGF 융합 단백질은 pH를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
실시예 8. CSQ-태그를 이용한 EGF 및 BMP2의 분리
8-1. EGF-GyrA-CSQ1 및 BMP2-GyrA-CSQ2 정제
EGF(서열번호 12), BMP2(서열번호 16)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 GyrA-CSQ1와 GyrA-CSQ2 벡터에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다.
한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl 2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 EGF-GyrA-CSQ1 및 BMP2-GyrA-CSQ2 단백질을 얻었다 (도 37, 도 39).
8-2. Dithiothreitol(DTT)을 이용한 EGF 및 BMP2 분리
EGF-GyrA-CSQ1 단백질(이하 BMP2-GyrA-CSQ2 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 EGF를 분리하기 위해서 20mM HEPES pH 8.5, 500mM NaCl, 40mM DTT 버퍼를 이용하여 상온에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 38, 도 40). 그 결과, CSQ-tag 및 EGF 융합 단백질은 DTT를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 목적 단백질의 발현 및 수용화 향상을 위한 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 하는 것인, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 상기 CSQ 태그는 서열번호 4 또는 서열번호 4로 이루어진 뉴클레오티드 서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는 것인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 가수분해효소 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 하는 것인, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 것인, 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 하는 것인, 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  9. 제8항에 따른 핵산을 포함하는 발현벡터.
  10. 제9항에 따른 발현벡터로 형질전환된 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는 것인, 형질전환된 세포.
  12. A) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
    B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
    C) 상기 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;
    D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질를 침전시키는 단계; 및
    E) 가수분해효소를 이용하여 융합 단백질로터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법.
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