WO2016068428A1 - 메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법 - Google Patents

메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법 Download PDF

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WO2016068428A1
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protein
gene
culture
methanol
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이상기
박은오
서훈
최광진
송건형
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순천향대학교 산학협력단
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing interleukin-2 protein using methanol magnetized yeast.
  • E. coli is the host cell most widely used to mass-produce such useful proteins, and research and development of many recombinant useful proteins have been carried out, ranging from hormones such as insulin and ⁇ -endorphin to immunomodulators such as interferon.
  • a host cell for producing recombinant protein for treatment various host systems such as microorganisms, plants, and animal cells have been developed and used.
  • glycoproteins have been used as host cells, mostly animal cells, which are higher eukaryotic cells.
  • the microorganisms are used as hosts for non-glycoproteins because of the disadvantage that the medium to be used is expensive, the protein production yield is low, and the culture is difficult.
  • Escherichia coli and yeast are mainly used as primary host cells for mass production of recombinant proteins.
  • These microbial expression systems have the advantages of lower production cost and simpler production process than higher eukaryotic expression systems, but they have glycoproteins or large and very complex structures that require post-translational modification such as glycosylation to have protein activity.
  • useful proteins when expressed in yeast, they do not form a complete folding and form an insoluble aggregate body in which the activity is lost by various mechanisms.
  • This insoluble protein may be obtained in a pure protein with high purity since the initial separation step is easy, but since it does not have activity as a protein, complex and expensive denaturation and refolding to obtain a soluble protein with biological activity from it. The process is necessary.
  • the production process is roughly divided into an upstream process for establishing a host cell line, a midstream process for producing a large amount of recombinant protein by culturing the cell line, a downstream process called a separation purification process, and a purified process. It is divided into a process of formulating a mixture of a drug substance and an excipient, and it is necessary to establish an optimal production process condition by establishing optimum conditions for key process parameters for each of these unit processes.
  • interleukin-2 is an interleukin composed of 153 amino acids and is mainly produced in T cells expressing surface antigen CD-4. Also, interleukin-2 is transformed T cells, B cells, lymphocyte cancer cells, LAK cells and NK cells. Secrete. Their production is induced by activation of T cells by mitogens or elegens, although several secondary stimuli are required for maximum production of interleukin-2, but resting cells are known to be unable to produce interleukin-2. . These interleukin-2 and its receptors have been reported to be associated with a number of diseases so far, but the study of their molecular characteristics has been very limited due to the limited amount obtainable.
  • the present invention provides a method for producing interleukin-2 comprising the following steps:
  • a a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; And cloning the yeast interleukin-2 expression construct comprising the interleukin-2 gene;
  • MOX methanol oxidase
  • step (b) transforming the expression construct prepared in step (a) into yeast host cells and culturing;
  • step (c) separating the expressed interleukin-2 from the transformed yeast cells cultured in step (b).
  • the present invention provides a method for producing interleukin-2 comprising the following steps:
  • step (b) separating the protein from the culture solution of step (a);
  • step (C) separating the interleukin-2 by treating tobacco isolated virus protease (Tobacco Etch Virus protease) to the separated protein of step (b).
  • tobacco isolated virus protease tobacco Etch Virus protease
  • the present inventors have expressed the expression level of interleukin-2 according to the culture conditions using methanol magnetization yeast transformed with recombinant vector comprising human serum albumin and interleukin-2 gene sequence.
  • the present invention was completed by having a mass production culture condition for interleukin-2 mass production.
  • the present invention provides a method for producing interleukin-2 comprising the following steps:
  • a a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; And cloning the yeast interleukin-2 expression construct comprising the interleukin-2 gene;
  • MOX methanol oxidase
  • step (b) transforming the expression construct prepared in step (a) into yeast host cells and culturing;
  • step (c) separating the expressed interleukin-2 from the transformed yeast cells cultured in step (b).
  • the method for producing interleukin-2 of the present invention comprises: (a) a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; And cloning the yeast interleukin-2 expression construct comprising the interleukin-2 gene.
  • MOX methanol oxidase
  • the yeast interleukin-2 expression construct of step (a) is an expression construct that is inductively expressed by a carbon source associated with methanol metabolism and can be used to produce large quantities of interleukin-2 at low cost.
  • the expression construct refers to a nucleic acid molecule containing only a minimum of elements (elemnet) for protein expression in the cell.
  • the expression construct of the present invention may be a recombinant vector.
  • a vector linking the methanol oxidase (MOX) promoter upstream of the human serum albumin gene full-length sequence or some fragment gene sequence thereof according to vector recombination methods known in the art and linking it upstream of the interleukin-2 gene can be.
  • MOX methanol oxidase
  • pYHSA13 that holds the HSA secreted gene expression by methanol inducible promoter of MOX promoter, E. coli screening cover the Ampicillin resistance gene, the MOX promoter and the marker gene for leu H. polymorpha For the H.
  • a fusion-expression recombinant vector can be prepared by cloning interleukin-2 in a recombinant vector (pUC18-HSA) recombined with the human serum albumin containing nucleotide sequence of the vector into pUC18, a high-copy vector for Escherichia coli. .
  • pUC18-HSA recombinant vector
  • FIG. 1 A schematic diagram of the pUC18-HSA recombinant vector is shown in FIG. 1.
  • the methanol oxidase (MOX) promoter is a promoter derived from genomic DNA of Hansenula polymorpha .
  • MOX promoter of the present invention can be used as a very effective promoter for expression of interleukin-2 because it is easy to regulate expression and is a powerful promoter that can be introduced into the chromosome multiple times and shows high stability of the introduced expression vector even in long-term culture using non-selective medium. do.
  • MOX promoter according to the present invention may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, has functionally equivalent properties and 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: Base sequences having%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology are also included in the scope of the present invention.
  • the human serum albumin gene or fragment thereof refers to a gene encoding a protein having a molecular weight of 65 kDa, consisting of 585 amino acids produced in the liver and secreted into the blood, or a fragment of a gene encoding human serum albumin.
  • Human serum albumin gene or fragment thereof of the present invention is a protein having a secretion signal sequence (signal sequence) is secreted well by itself without attaching a secretion system.
  • the protein since the protein has a large size or a complex structure, the expression of the protein is significantly increased when it is used as an interleukin-2 fusion protein for the expression of interleukin-2, which is a protein that is not secreted.
  • the human serum albumin gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and has a functionally equivalent property, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, Base sequences having 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology are also included in the scope of the present invention.
  • fragment genes of the human serum albumin gene are part of the human serum albumin gene which can be secreted by itself without a secretion system, and are 100, 200, 300, 400 from the N-terminus of the full-length amino acid sequence of human serum albumin. May comprise a gene sequence encoding a dog, 500 or more amino acid sequences.
  • the fragment gene of human serum albumin has the gene sequence of SEQ ID NO: 3.
  • interleukin-2 is an interleukin composed of 153 amino acids and is a protein mainly produced in T cells expressing surface antigen CD-4.
  • Interleukin-2 gene according to the present invention has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, has a functionally equivalent property and 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 Base sequences having%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology are also included in the scope of the present invention.
  • Expression constructs of the invention are used in yeast.
  • it is methanolized yeast, More preferably, Hansenula polymorpha , Pichia pastoris , Candia boidini , Pichia methanolica , or Oga Thea minuta ( Ogataea minuta ), even more preferably Hansenula polymorpha ( Hansenula polymorpha ).
  • the yeast interleukin-2 gene expression construct of the present invention is a protein for recovering only IL-2 sequences between human serum albumin and interleukin-2 gene sequences so that only interleukin-2 can be isolated after production of the fusion protein by the vector. It may include a sequence that can be cleaved by a protease.
  • Protease refers to an enzyme that cleaves peptide bonds of amino acids. Proteases can be, for example, serine proteases, threonine proteases, cysteine proteases, aspartate proteases, metalloproteases, glutamic acid proteases or combinations thereof.
  • the protease can also be, for example, a Tobacco Etch Virus (TEV) protease, trypsin, chymotrypsin, elastase, pepsin, enteropeptidase or combinations thereof.
  • TSV Tobacco Etch Virus
  • the region that can be cleaved by an enzyme may vary depending on the enzyme and may be known to those skilled in the art.
  • the sequence that can be cleaved by a protease preferably has the base sequence of SEQ ID NO: 5 to the Tobacco Etch Virus site.
  • the expression construct of the present invention further comprises a restriction enzyme recognition base sequence capable of cloning a foreign protein coding nucleotide sequence to be operably linked to the promoter sequence.
  • restriction enzyme of the restriction enzyme recognition base sequence included in the expression construct of the present invention is not limited to a specific one, for example, but is not limited to EcoRV, NheI, NotI, SphI, XbaI and the like. Preferably, it may include restriction enzyme recognition base sequences of EcoRV and NheI.
  • Expression constructs of the invention include transcription termination sequences.
  • transcription termination sequences include, but are not limited to, polyadenylation sequences, such as, for example, ectopic growth terminator, polyadenylation sequences derived from SV40, ⁇ -globin polyA, HSV TK polyA, or MOX terminators.
  • the expression construct of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as an optional marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneti Resistance genes for leucine (G418), neomycin or tetracycline.
  • an antibiotic resistance gene commonly used in the art as an optional marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneti Resistance genes for leucine (G418), neomycin or tetracycline.
  • the expression construct of the present invention may further comprise, in addition to the above components, functional linkages operably linked to nucleic acid expression control that can regulate transcription and / or translation of the nucleic acid sequence.
  • Preferred expression constructs according to the invention are Figure 3 (a) or (b), more preferably Figure 3 (a).
  • the expression construct has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
  • the cloning method in the present invention may use a method known in the art.
  • the interleukin-2 gene and the expression construct of the invention are treated with restriction enzymes and then stably inserted into the expression construct using a suitable enzyme, for example a ligase.
  • the method for producing interleukin-2 of the present invention includes (b) transforming the expression construct prepared in step (a) into yeast host cells and then culturing.
  • the yeast according to the present invention is as mentioned above, preferably as a transformed yeast is a transformant of Hansenula polymorpha , more preferably the transformed yeast is transgenic Hanse with accession number KCTC18329P Hansenula polymorpha .
  • the method of transforming the expression construct into yeast cells may use a method of transforming vectors into eukaryotic cells known in the art, for example, micro-injection, calcium phosphate precipitation, Electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, lithium acetate-lithium DMSO method and the like.
  • Culture of the transformed yeast in the present invention can be cultured according to conventional methods in the art, but shows excellent growth and protein production under the following culture conditions.
  • the culture medium is a medium containing methanol, for example, YPM (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), Methanol 3% (w / v)) medium, YPD (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), D-glucose 2% (w / v)), minimal medium YNBD (YNB without amino acids 0.67% (w) / v), amino acid mixture, D-glucose 2% (w / v)) and the like, preferably YPM medium.
  • YPM Bacto-peptone 2%
  • YPD Bacto-peptone 2% (w / v)
  • the culture carbon source is preferably methanol
  • the preferred concentration of methanol in the present invention is 1% (w / v) to 10% (w / v), preferably 2% (w / v) to 5% (w / v), more preferably 2% (w / v) to 4% (w / v).
  • the culture temperature is 25 to 45 ° C, preferably 30 to 40 ° C, more preferably 35 to 39 ° C.
  • the culture pH is 4.5 to 7.0, preferably 5.0 to 6.5, more preferably 5.7 to 6.3.
  • the culture agitation speed is 100 to 300 rpm, preferably 150 to 250 rpm, more preferably 180 to 220 rpm.
  • the method of producing interleukin-2 of the present invention comprises (c) isolating the expressed interleukin-2 from the transformed yeast cells cultured in step (b).
  • a spin column such as Milipore's Amicon ultra can be used to remove and recover proteins smaller than the molecular weight of the target protein.
  • a sequence between the human serum albumin and interleukin-2 gene sequences may further comprise a sequence that can be cleaved by a protease to recover only the IL-2 sequence.
  • the method may further include treating the protease before the separation step.
  • the protease is as mentioned above, and the protease treatment may be performed for 1 hour to 12 hours at 25 to 37 ° C., and preferably, if the TEV site is present, the TEV protease is treated for 4 to 8 hours at 28 to 32 ° C. for fusion. Proteins can be isolated.
  • the method for separating interleukin-2 expressed from the cultured transgenic yeast cells may be carried out by employing a separation and purification method commonly used in the art. For example, solubility fractionation using ammonium sulfate or PEG, ultrafiltration separation according to molecular weight, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Various methods may be used and are typically separated and purified using a combination of the above methods.
  • the present invention provides a method for producing interleukin-2 using Hansenula polymorpha comprising the following steps:
  • step (b) separating the protein from the culture solution of step (a);
  • step (c) treating Tobacco Etch Virus protease on the isolated protein of step (b) and isolating interleukin-2.
  • the method for producing interleukin-2 of the present invention comprises: (a) a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; Tobacco etching virus sites; And culturing the Hanshenula polymorpha transformed with the yeast interleukin-2 expression construct comprising the interleukin-2 gene.
  • MOX methanol oxidase
  • the present invention may be one wherein the above-mentioned yeast interleukin-2 expression construct is prepared by the above-mentioned method.
  • the transformed Hansenula polymorpha may be yeast transformed according to the above-mentioned method.
  • it is a transformed Hansenula polymorpha having accession number KCTC18329P.
  • the culture of the transformed Hansenula polymorpha shows excellent growth and protein production under the following culture conditions.
  • the culture medium is a medium containing methanol, for example, YPM (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), Methanol 3% (w / v)) medium, YPD (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), D-glucose 2% (w / v)), minimal medium YNBD (YNB without amino acids 0.67% (w) / v), amino acid mixture, D-glucose 2% (w / v)) and the like, preferably YPM medium.
  • YPM Bacto-peptone 2%
  • YPD Bacto-peptone 2% (w / v)
  • the culture carbon source is preferably methanol
  • the preferred concentration of methanol in the present invention is 1% (w / v) to 10% (w / v), preferably 2% (w / v) to 5% (w / v), more preferably 2% (w / v) to 4% (w / v).
  • the culture temperature is 25 to 45 °C, preferably 30 to 40 °C, beam is preferably 35 to 39 °C.
  • the culture pH is 4.5 to 7.0, preferably 5.0 to 6.5, more preferably 5.7 to 6.3.
  • the culture agitation speed is 100 to 300 rpm, preferably 150 to 250 rpm, more preferably 180 to 220 rpm.
  • the method of producing interleukin-2 of the present invention includes the step of (b) separating the protein from the culture medium of step (a).
  • the protein is concentrated according to a method known in the art, for example, Sodium deoxycholate (Na-DOC) and Trichloroacetic acid (TCA), and the like, and only the protein is extracted through centrifugation and sonication. can do.
  • Na-DOC Sodium deoxycholate
  • TCA Trichloroacetic acid
  • the method for producing interleukin-2 of the present invention comprises the steps of (c) treating tobacco isolated virus protease (Tobacco Etch Virus protease) to the isolated protein of step (b) and isolating interleukin-2.
  • tobacco isolated virus protease tobacco Etch Virus protease
  • TEV protease that cleaves the TEV site added between human serum albumin and interleukin-2 gene sequences can be treated.
  • Treatment of the TEV protease can be performed at 28 to 32 ° C. for 4 to 8 hours.
  • the method for separating interleukin-2 from a sample treated with TEV protease can be carried out by employing a separation and purification method commonly used in the art. For example, solubility fractionation using ammonium sulfate or PEG, ultrafiltration separation according to molecular weight, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Various methods may be used and are typically separated and purified using a combination of the above methods.
  • the interleukin-2 production method of the present invention exhibits high growth and protein synthesis rate according to the establishment of an optimal cell line, and mass-produces and purifies proteins containing interleukin-2 according to the establishment of optimal culture conditions using methanol, a low-cost carbon source. As a result of the process simplification, the production of high-purity interleukin-2 has a significant effect on the mass production of interleukin-2.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a pYHSA13 (T-1) vector and a pUC18-HSA vector.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a PUC-HSA-IL-2 vector comprising IL-2.
  • Figure 3 shows a vector schematic diagram including the specific configuration of the pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 vectors.
  • Figure 4 shows the results confirming the secretion expression of HSA-IL2 fusion protein and interleukin-2 in H. polymorpha transformed with pHSAft-5-IL-2 vector.
  • Figure 5 shows the results confirming the secretion expression of HSA-IL2 fusion protein and interleukin-2 in H. polymorpha transformed with pHSAft-1-IL-2 vector.
  • Figure 6 shows the results of confirming the cell growth and protein expression changes over time in the interleukin-2 production process using a fermentor.
  • Figure 7 shows the results of confirming the change in the expression level of human serum albumin and interleukin-2 fusion protein over time.
  • Figure 8 shows the results of confirming the change in the interleukin-2 expression amount of the TEV protease-treated culture supernatant over time.
  • HSA Human Serum Albumin
  • T-1 vector for H. polymorpha with His-tag on C-terminus of HSA gene and pUC18 vector (Invitrogen), a high-copy vector for E. coli were used.
  • the pYHSA13 (T-1) vector is HSA secreted and expressed by the MOX promoter, a methanol-inducible promoter of H. polymorpha , the Ampicillin resistance gene, a selection marker for E. coli, and the leu and MOX promoters, markers for H. polymorpha . It holds a gene.
  • the pYHSA13 (T-1) vector was digested with EcoRI and BamHI, resulting in a high-copy vector of 1.8 kb fragments containing the 5'-UTR to HSA and His-tag genes of the vector in three fragments.
  • PUC18-HSA vector was constructed by subcloning into the pUC18 vector.
  • a schematic diagram of the pYHSA13 (T-1) vector and the pUC18-HSA vector is shown in FIG. 1.
  • a fusion expression vector was constructed to efficiently express and secrete HSA and IL-2 fusion proteins.
  • HSA-His tag and IL-2- Strep tag binding sites were inserted to facilitate the secretion of the expressed and expressed fusion proteins, and between the HSA and IL-2 genes, a TEV site was collected to recover only IL-2 proteins after secretion. Attached.
  • the schematic diagram of the vector is shown in FIG.
  • HSA and IL-2 are expressed as a fusion protein by linking the entire sequence of the HSA gene and the upper 137aa sequence upstream of the IL-2 gene, respectively, to construct a fusion expression vector with HSA.
  • Vectors pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 engineered to be secreted were prepared, and specific configurations of the vectors are shown in FIGS. 3A and 3B, respectively.
  • HSA and IL-2 are expressed as a fusion protein by linking the entire sequence of the HSA gene and the upper 137aa sequence upstream of the IL-2 gene, respectively, to construct a fusion expression vector with HSA.
  • Vectors pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 engineered to be secreted were prepared, and specific configurations of the vectors are shown in FIGS. 3A and 3B, respectively.
  • the sequence information of these pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 is set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • HSA fusion tag domains When PCR was performed using a pUC18-HSA vector with a functional domain as a template, two kinds of HSA fusion tag domains of different sizes were prepared using different reverse primers.
  • the HSA cleavage site was determined based on the tertiary structure of the HSA, and the DNA fragment was obtained by cloning in front of the functional domain by PCR, and the tag was used to construct a tag expressing the fusion protein.
  • the primer sets used are shown in Table 2 below.
  • YPD Bacto-Yeast Extract 1% (w) / v), D-Glucose 2% (w / v)
  • H. polymorpha DL1-L precultured in liquid medium in 50 ml baffled flasks with initial OD 600 of 0.2 at 50 ml in a 30 ° C shake incubator. Incubated at rpm. After 6-7 hours, the cells were cultured until the OD 600 value was 1.0, and then centrifuged at 4 ° C. and 4000 rpm for 10 minutes.
  • LiAc / TE buffer solution (0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5) was added, suspended by pipetting, and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to obtain a precipitate.
  • competent cells were prepared by suspending in 500 ⁇ l of LiAc / TE buffer solution. Divided into 5 aliquots and divided into 5 aliquots.
  • the pHSAft vector is a vector in which HSA and IL-2 are secreted and expressed in the form of a fusion protein by attaching a protein secretion signal sequence of HSA to the top to efficiently increase the secretion of IL-2 protein.
  • the only difference between the pHSAft-1-IL-2 vector containing the 137aa region of HSA and the pHSAft-5-IL-2 vector containing the entire 608aa region of HSA is the difference in the length of the HSA, and both vectors can secrete the protein of IL-2. It was designed to be.
  • strains B1-8 and R1-8 were inoculated in YPM medium (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), Methanol 3% (w / v)), respectively. Seed inoculator 1%, shaker [SI-300R, Lab Companion] was incubated for 30 hours at 37 °C, 200rpm conditions.
  • Cell proliferation was measured at a wavelength of OD 600 with a spectrophotometer [UV1240, SHIMADZU]. When the measured value exceeded 1.0, the degree of incubation of each strain was confirmed by measuring the final OD value of the strain incubated for 30 hours. .
  • the culture solution was left to cool in ice, and then concentrated by adding 2% sodium deoxycholate (Na-DOC) to a final concentration of 0.02%.
  • 50% Trichloroacetic acid (TCA) was mixed at a final concentration of 7.5% and the sample was left on ice for 2 hours. After centrifugation at 4 ° C., 4,000 rpm (Centrifuge Combi-514R) for 30 minutes, the supernatant was removed and 2 mL Tetrahydrofuran (THF) was added to the precipitate.
  • TCA Trichloroacetic acid
  • the B8 strain As shown in Table 3, among the 8 strains (B1 to B8) of the H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) family containing only a part of the human serum albumin gene, the B8 strain was used for cell proliferation and total protein production. The highest OD values were 5.45 and 2.16 ⁇ g / mL, respectively.
  • the R4 strain was associated with cell proliferation and In total protein production, OD was 5.41 and 2.13 ⁇ g / ml, respectively.
  • the B8 strain of the H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) strain was finally selected and deposited as KCTC18329P at the Korea Biotechnology Research Institute on October 1, 2014.
  • the transformants were cultured in YPD liquid medium and transferred to E-tube as much as inoculated in YPM liquid medium by adjusting the OD 600 value to 0.1 and centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm. 1 ml of sterile distilled water was added to the precipitate, suspended by pipetting, and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to obtain a precipitate. Suspension was inoculated with YPM liquid medium previously dispensed and inoculated to induce protein expression.
  • Trichloroacetic acid 50% Trichloroacetic acid (TCA) was mixed at a final concentration of 7.5% and the sample was left on ice for 2 hours. After centrifugation at 4 ° C., 4,000 rpm (Centrifuge Combi-514R) for 30 minutes, the supernatant was removed and 2 mL Tetrahydrofuran (THF) was added to the precipitate. Subsequently, after centrifugation at 4 ° C. and 4,000 rpm for 30 minutes again, the supernatant was removed, and the precipitate added with Tetrahydrofuran (THF) was removed again by bath sonication (Powersonic 520, Hwashin Tech, Korea).
  • TCA Trichloroacetic acid
  • the prepared protein sample was subjected to SDS-PAGE, and then the gel was removed and the PVDF membrane (Bio-Rad) was raised thereon and assembled into a transfer caster, and 80 V was filled with a transfer buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris, 20% methanol). Was carried out for 1 hour.
  • PVDF membrane was added to blocking buffer [5% skim milk, TBST (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)] and shaken at room temperature for 1 hour to prevent nonspecific binding.
  • the primary antibody was added to the blocking buffer, shaken for 1 hour and 30 minutes at room temperature, and washed repeatedly for 10 minutes with TBST buffer.
  • the secondary antibody was added to the blocking buffer again, shaken for 1 hour, and washed three times with TBST buffer for 10 minutes.
  • Solution A and B of ECL (enhanced chemiluminescence) kit were mixed 1: 1 and poured into PVDF membrane to react for 1 minute to cause color reaction, and to detect signal by exposing to X-ray film in dark room.
  • Culture conditions optimization experiments were performed using the H. polymorpha (B8) strain finally selected as a recombinant interleukin-2 production excellent strain.
  • the seed inoculum was set to 1% in shaker [SI-300R, Lab Companion] using YP medium (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v)) as the base medium.
  • the experiment was performed to find the optimum culture conditions using the culture temperature, culture pH, and stirring speed (rpm) as variables.
  • Methanol concentration is 2% (w / v), 3% (w / v), 4% (w / v) or 5% (w / v) and the temperature is 30 ° C, 35 ° C, 37 ° C or 40 ° C.
  • pH was inoculated at pH 5.5, 6.0, 6.5 or 7.0
  • the experiment was carried out while changing the stirring speed to 150, 180, 200, 250 or 300rpm.
  • the final OD value and protein amount of the bacteria cultured in each condition for 30 hours were measured and confirmed by the aforementioned method.
  • H. polymorpha strains contain a powerful MOX promoter and are a yeast that can easily magnetize methanol, an inexpensive carbon source. Therefore, when methanol is used as a fermentation substrate, it is possible to reduce the cost of raw materials rather than to use glucose, which is very advantageous in the process.
  • H. polymorpha In order to examine the effect of H. polymorpha on cell proliferation and protein production according to the culture temperature, the cell proliferation and protein production at each temperature were checked by changing the culture temperature to 30, 35, 37 and 40 °C. As a result, as shown in Table 6, the H. polymorpha was cultured at a culture temperature of 37 ° C. Cell proliferation and protein production were confirmed to be the best.
  • H. polymorpha was adjusted to 5.5, 6.0. 6.5. Cell proliferation and protein production at each pH were confirmed by changing to 7.0. As a result, H. polymorpha in culture pH 6.0 as shown in Table 7 Cell proliferation and protein production were confirmed to be the best.
  • the optimal culture conditions for producing recombinant interleukin-2 using H. polymorpha were initial methanol concentration of 3% (w / v), incubation temperature of 37 ° C, pH 6.0, and agitation speed of 200 rpm.
  • the production of recombinant interleukin-2 was carried out using a 5 liter fermenter at an initial methanol concentration of 3% (w / v), a culture temperature of 37 ° C., pH 6.0, and a stirring speed of 200 rpm, which were the optimum culture conditions identified under the optimization conditions. It was.
  • HPLC analysis was confirmed by filtering the purified sample using a 0.45 ul syringe filter and a syringe and then injected into HPLC [SIMADZU, Prominence, Japan].
  • HPLC column was Vision HT C18 HL 5 ⁇ Length 250nm using a time of 60 minutes, flow rate 1.0ml / min, temperature was 30 °C, wavelength was 280nm, ratio range 10 samples were measured. The results are shown in FIG. In HPLC, green shows standard interferon-2, brown shows sample after 16 hours, black shows sample after 20 hours, and blue shows sample after 30 hours.
  • Table 9 shows the results of calculating fermentation kinetics in the production of recombinant interleukin-2 using H. polymorpha .
  • the cell growth rate is 10 mg / l / h
  • the methanol consumption rate is 0.67 g / l / h
  • the protein production rate is 2.17 mg / l. / h
  • cell growth yield was calculated as 15 mg / g
  • protein production yield (protein production yield) 3.25 ⁇ g / g
  • protein productivity 1.1 ⁇ g / g / h).

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Abstract

본 발명은 메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인터루킨-2 생산 방법은 최적의 세포주 확립에 따라 높은 성장 및 단백질 합성율을 보이며 저비용의 탄소원인 메탄올을 이용한 최적의 배양 조건 확립에 따라 인터루킨-2를 포함하는 단백질을 대량 생산하며 단백질 분리 정제과정 간소화에 따라 고순도의 인터루킨-2를 생산함으로써 인터루킨-2 대량 생산에 현저한 효과를 보인다.

Description

메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법
본 발명은 메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 단백질 생산 방법에 관한 것이다.
과거 자연 상태로부터 미량으로 얻을 수 밖에 없던 인간에게 유용한 의료용 단백질이나 산업용 효소 등은 재조합 DNA 기술의 발전에 의해 대량 생산이 가능하게 되었다. 예컨대 대장균은 이러한 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포로서 인슐린, β-엔도르핀과 같은 호르몬에서 인터페론과 같은 면역 조절제에 이르기까지 많은 재조합 유용 단백질에 대한 연구개발이 수행되고 있다.
재조합 단백질을 효율적으로 생산하기 위해서는 적절한 숙주세포를 선택하는 것이 매우 중요하다. 치료용 재조합 단백질 생산용 숙주세포로서 미생물, 식물, 동물세포 등 다양한 숙주 시스템이 개발되어 사용되고 있으며 특히 당단백질의 경우 대부분 고등 진핵세포인 동물세포가 숙주세포로 사용되고 있다. 그러나 동물세포의 경우 사용 배지가 고가인데다 단백질의 생산 수율이 낮고 배양이 까다롭다는 단점 때문에 비 당단백질의 경우 대부분 미생물이 숙주로 사용되고 있다.
여러 미생물 숙주 시스템들 중 대장균과 효모가 재조합 단백질 대량생산을 위한 일차적인 숙주세포로 주로 이용되고 있다. 이들 미생물 발현 시스템은 고등 진핵세포 발현시스템에 비해 생산단가가 저렴하며 생산 공정이 간단하다는 장점이 있으나, 단백질의 활성을 가지기 위해서 glycosylation과 같은 post-translational modification이 필요한 당단백질이나 크고 매우 복잡한 구조를 가지고 있는 단백질의 생산에는 한계가 있다. 또한 유용 단백질을 효모에서 발현시키는 경우 완전한 folding을 이루지 못하고 다양한 기작에 의해 활성을 잃은 상태의 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하게 된다. 이 불용성 단백질은 초기 분리단계가 용이하여 순도가 높은 순수 단백질을 얻을 수 있는 경우도 있지만 단백질로서의 활성을 가지지 못하므로 이로부터 생물학적 활성을 가진 soluble한 단백질을 얻기 위하여 복잡하고 비용이 많이 드는 denaturation, refolding 과정이 필요하다.
또한, 이러한 재조합 단백질 의약품 생산을 위한 세포주가 확립되더라도, 세포주에 대한 품질과 특성을 규명하기 위한 재조합 단백질 생산 공정에 대한 연구 및 scale-up 실시를 통한 생산공정 개발이 필요하다. 생산 공정은 크게 나누면 숙주세포주를 확립하기 위한 상류 공정 (upstream process)과 세포주를 배양하여 재조합 단백질을 다량 생산하는 중류 공정 (midstream process), 분리 정제 공정을 일컫는 하류 공정 (downstream process), 그리고 정제된 원료 (drug substance)와 부형제 등을 섞어 제제화 (formulation)하는 공정으로 나뉘는데, 이러한 각 단위 공정별로 핵심공정 변수 (parameter)에 대한 최적 조건을 확립하여, 최적의 생산 공정 조건을 설립할 필요가 있다.
한편, 인터루킨-2는 153개의 아미노산으로 구성된 인터루킨으로 표면항원 CD-4를 발현하는 T세포에서 주로 생산되며, 형질 전환된 T세포, B세포, 임파구암세포, LAK 세포 그리고 NK 세포 들도 인터루킨-2를 분비한다. 이들의 생산은 마이토젠 또는 엘레젠에 의한 T세포의 활성화에 의해 유도되며, 몇 종류의 2차 자극이 인터루킨-2의 최대 생산을 위해 요구되고 있으나 휴지기 세포는 인터루킨-2를 생산할 수 없다고 알려져 있다. 이러한 인터루킨-2 및 그 수용체는 지금까지 수 많은 질병들과 관련된다고 보고되어 왔으나, 얻을 수 있는 양의 한계로 그 분자적인 특징에 대한 연구는 매우 제한적이었다.
예컨대, 현재 기능성 있는 인터루킨-2 유전자의 투여에 의한 암에 대한 면역성을 증가시키기 위해 많은 방법들이 연구되고 있어, 인터루킨-2에 대한 연구와 치료제로서의 수요가 지속적으로 늘어나고 있으나, 이에 뒷받침되는 대량생산 기술이 뒷받침되지 못하는 실정이다.
이러한 배경 하에, 미생물 발현 시스템을 이용하여 인터루킨-2를 대량 생산 최적화 방안에 대한 연구가 필요하다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인터루킨-2를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 클로닝하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 발현 컨스트럭트를 효모 숙주 세포에 형질전환한 후 배양하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 배양된 형질전환 효모 세포로부터 발현된 인터루킨-2를 분리하는 단계.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인터루킨-2를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 담배 식각 바이러스 사이트; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 단백질을 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 분리된 단백질에 담배 식각 바이러스 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease)를 처리하여 인터루킨-2를 분리하는 단계.
상기한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 인간 혈청 알부민(Human serum albumin)과 인터루킨-2 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 메탄올 자화 효모를 이용하여 배양 조건에 따른 인터루킨-2의 발현량을 확인하고, 인터루킨-2 대량 생산을 위한 대량 생산 배양 조건을 갖춤으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인터루킨-2를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 클로닝하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 발현 컨스트럭트를 효모 숙주 세포에 형질전환한 후 배양하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 배양된 형질전환 효모 세포로부터 발현된 인터루킨-2를 분리하는 단계.
본 발명의 인터루킨-2를 생산하는 방법은 (a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 클로닝하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계의 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트는 메탄올 대사와 관련된 탄소원에 의하여 유도적으로 발현되며, 저비용으로 대량의 인터루킨-2를 생산하는데 사용가능한 발현 컨스트럭트이다.
본 발명에 있어서, 발현 컨스트럭트는 세포내에서 단백질 발현을 위한 최소의 엘리먼트(elemnet)만을 포함하는 핵산분자를 의미한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 재조합 벡터일 수 있다. 바람직하게, 당업계에 알려진 벡터 재조합 방법에 따라 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터를 인간 혈청 알부민 유전자 전장 서열 또는 이의 일부 단편 유전자 서열 상류에 연결하고, 이를 인터루킨-2 유전자 상류에 연결한 벡터일 수 있다. 예컨대, H. polymorpha의 메탄올 유도성 프로모터인 MOX 프로모터, E. coli용 선별표지인 Ampicillin 저항성 유전자, H. polymorpha 용 표지유전자인 leu 및 MOX 프로모터에 의해 분비 발현되는 HSA 유전자를 보유하고 있는 pYHSA13(T-1) 벡터의 절단된 서열 중 인간 혈청 알부민 포함 염기서열을 대장균용 High-copy 벡터인 pUC18에 재조합한 재조합 벡터(pUC18-HSA)에 인터루킨-2를 클로닝하여 융합 발현 재조합 벡터를 제조 할 수 있다. 상기 pUC18-HSA 재조합 벡터의 모식도는 도 1에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 메탄올 옥시다제(Methanol oxidase: MOX) 프로모터는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 genomic DNA로부터 유래된 프로모터이다. 본 발명의 MOX 프로모터는 발현 조절이 용이하면서 강력한 프로모터로써 염색체 상으로 다중 도입이 가능하여 비 선택 배지를 사용한 장기 배양에서도 도입된 발현 벡터의 높은 안정성을 보이기 때문에 인터루킨-2 발현에 매우 효과적인 프로모터로 사용된다. 본 발명에 따른 MOX 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있으며, 기능적으로 동등한 성질을 가지고 서열번호 1의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자는 간에서 생성되어 혈액에 분비되는 585개의 아미노산으로 이루어진 분자량 65kDa크기의 단백질을 암호화하는 유전자 또는 인간 혈청 알부민을 암호화하는 유전자의 일부 단편을 말한다. 본 발명의 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자는 분비 신호서열 (signal sequence)을 갖는 단백질로서 따로 분비시스템을 달아주지 않아도 자체적으로 분비가 잘 이루어진다. 특히, 단백질의 크기가 크거나 복잡한 구조를 가짐으로써 단백질의 분비발현이 원활하지 않은 단백질인 인터루킨-2의 발현을 위하여 인터루킨-2와 융합단백질로 사용되었을 때 분비발현을 현저히 증가시킨다. 본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 기능적으로 동등한 성질을 가지고 서열번호 2의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 인간 혈청 알부민 유전자의 단편 유전자는 분비시스템 없이도 자체적으로 분비가 이루어질 수 있는 인간 혈청 알부민 유전자의 일부로써, 인간 혈청 알부민의 전장 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 그 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 인간 혈청 알부민의 단편 유전자는 서열번호 3의 유전자 서열을 가진다.
본 발명에 있어서, 인터루킨-2는 153개의 아미노산으로 구성된 인터루킨으로 표면항원 CD-4를 발현하는 T세포에서 주로 생산되는 단백질이다. 본 발명에 따른 인터루킨-2 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 가지며, 기능적으로 동등한 성질을 가지고 서열번호 4의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 효모에서 이용된다. 바람직하게는 메탄올자화 효모이며, 보다 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candia boidini), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 또는 오가테아 미누타(Ogataea minuta)이며, 보다 더 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이다.
본 발명의 효모용 인터루킨-2 유전자 발현 컨스트럭트는 벡터에 의한 융합 단백질 생산 후 인터루킨-2만을 분리할 수 있도록 인간 혈청 알부민 및 인터루킨-2 유전자 서열 사이에 추가로 IL-2 서열만을 회수하기 위한 단백질 분해 효소(protease)에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 프로테아제는 아미노산의 펩티드 결합을 절단시키는 효소를 말한다. 프로테아제는 예를 들면, 세린 프로테아제, 트레오닌프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 그의 조합일 수 있다. 또한, 프로테아제는 예를 들면, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 펩신, 엔테로펩티다제 또는 그의 조합일 수 있다. 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역은 효소에 따라 달라질 수 있고, 당업자에게 알려진 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 단백질 분해 효소(protease)에 의해 절단될 수 있는 서열은 바람직하게 담배 식각 바이러스 위치(Tobacco Etch Virus site)로 서열번호 5의 염기 서열을 가진다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 추가적으로 상기 프로모터 서열에 작동적으로 연결되도록 외래 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝할 수 있는 제한효소 인식 염기 서열을 포함한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에 포함되는 제한효소 인식 염기 서열의 제한효소는 특정의 것으로 한정되지 않으며, 예를 들어 EcoRV, NheI, NotI, SphI, XbaI 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 EcoRV와 NheI의 제한 효소 인식 염기 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에는 전사 종결 서열을 포함한다. 예컨대, 폴리 아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터, SV40 유래 폴리 아데닐화 서열, β-글로빈 polyA, HSV TK polyA 또는 MOX 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 컨스트럭트는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신(G418), 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 상기 구성 요소에 추가적으로 핵산 서열의 전사 및/또는 트렌스레이션을 조절할 수 있는 핵산 발현 조절에 작동 가능하게 연결된 기능적 결합들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 발현 컨스트럭트는 도 3의 (a) 또는 (b)이며, 보다 바람직하게 도 3(a)이다. 본 발명의 일실시양태에 따르면 발현 컨스트럭트는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 염기 서열을 가진다.
본 발명에서 클로닝하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 인터루킨-2 유전자와 본 발명의 발현 컨스트럭트를 제한효소로 처리한 후, 적합한 효소, 예를 들어 리가아제(ligase)를 이용하여 발현 컨스트럭트에 안정하게 삽입한다.
본 발명의 인터루킨-2를 생산하는 방법은 (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 발현 컨스트럭트를 효모 숙주 세포에 형질전환한 후 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 효모는 상기 언급한 바와 같으며, 형질전환 효모로는 바람직하게 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 형질전환체이며, 보다 바람직하게 형질전환 효모는 기탁번호 KCTC18329P를 가지는 형질 전환 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 컨스트럭트를 효모 세포에 형질전환하는 방법은 당업계에 공지된 진핵 세포에 벡터를 형질전환하는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리 법, 유전자 밤바드먼트, 초산-리튬 DMSO법 등을 포함한다.
본 발명에서 형질전환 효모의 배양은 당업계의 통상의 방법에 따라 배양될 수 있으나, 하기 배양 조건에서 우수한 성장 및 단백질 생성을 보인다.
본 발명에서 배양 배지는 메탄올이 포함된 배지로 예컨대, YPM (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 배지, YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-glucose 2%(w/v)), 최소배지인 YNBD (YNB without amino acids 0.67%(w/v), amino acid mixture, D-glucose 2%(w/v)) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 YPM 배지이다.
본 발명에 있어서, 배양 탄소원은 메탄올이 바람직하며, 본 발명에서 바람직한 메탄올의 농도는 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 2%(w/v) 내지 5 %(w/v), 보다 바람직하게는 2 %(w/v) 내지 4 %(w/v)이다.
본 발명에 있어서, 배양 온도는 25 내지 45 ℃, 바람직하게 30 내지 40 ℃, 보다 바람직하게 35 내지 39 ℃이다.
본 발명에 있어서, 배양 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게 5.0 내지 6.5, 보다 바람직하게 5.7 내지 6.3이다.
본 발명에 있어서, 배양 교반 속도는 100 내지 300 rpm, 바람직하게 150 내지 250 rpm, 보다 바람직하게 180 내지 220 rpm이다.
본 발명의 인터루킨-2를 생산하는 방법은 (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 형질전환 효모 세포로부터 발현된 인터루킨-2를 분리하는 단계를 포함한다.
인터루킨-2의 분리를 위하여 당업계에 알려진 단백질을 농축하는 단계를 포함할 수 있으며, 예컨대, Sodium deoxycholate (Na-DOC) 및 Trichloroacetic acid (TCA) 등을 처리하고 원심 분리 및 초음파 처리 과정 등을 통해 단백질만을 회수하거나 Ammonium를 이용해 단백질을 침전 분리할 수 있다. 또한, Milipore사의 Amicon ultra와 같은 spin 컬럼을 이용해 타겟 단백질의 molecular weight보다 작은 단백질을 제거하여 단백질의 크기로 분리 회수하는 방법을 사용할 수 있다.
인터루킨-2 및 인간 혈청 알부민 융합 단백질의 분리를 위해서는 인간 혈청 알부민 및 인터루킨-2 유전자 서열 사이에 추가로 IL-2 서열만을 회수하기 위한 단백질 분해 효소(protease)에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있는바, 상기 분리 단계 전에 프로테아제를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 프로테아제는 상기 언급한 바와 같으며, 프로테아제 처리는 25 내지 37 ℃에서 1시간 내지 12시간 처리할 수 있으며, 바람직하게 TEV site가 존재하는 경우 TEV 프로테아제를 28 내지 32 ℃에서 4 내지 8시간 처리하여 융합단백질을 분리할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양된 형질전환 효모 세포로부터 발현된 인터루킨-2를 분리하는 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 분리 및 정제 방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기,전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 분리 및 정제하게 된다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 한세눌라 폴리모르파를 이용하여 인터루킨-2를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 담배 식각 바이러스 사이트; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 단백질을 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 분리된 단백질에 담배 식각 바이러스 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease)를 처리하고 인터루킨-2를 분리하는 단계.
본 발명의 인터루킨-2를 생산하는 방법은 (a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 담배 식각 바이러스 사이트; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기 언급된 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트가 상기 언급된 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
상기 형질전환된 한세눌라 폴리모르파는 상기 언급된 방법에 따라 형질전환된 효모일 수 있다. 바람직하게 기탁번호 KCTC18329P를 가지는 형질 전환 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이다.
상기 형질전환된 한세눌라 폴리모르파의 배양은 하기 배양 조건에서 우수한 성장 및 단백질 생성을 보인다.
본 발명에서 배양 배지는 메탄올이 포함된 배지로 예컨대, YPM (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 배지, YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-glucose 2%(w/v)), 최소배지인 YNBD (YNB without amino acids 0.67%(w/v), amino acid mixture, D-glucose 2%(w/v)) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 YPM 배지이다.
본 발명에 있어서, 배양 탄소원은 메탄올이 바람직하며, 본 발명에서 바람직한 메탄올의 농도는 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 2%(w/v) 내지 5 %(w/v), 보다 바람직하게는 2 %(w/v) 내지 4 %(w/v)이다.
본 발명에 있어서, 배양 온도는 25 내지 45 ℃, 바람직하게 30 내지 40 ℃, 보다 바람직하게 35 내지 39 ℃이다.
본 발명에 있어서, 배양 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게 5.0 내지 6.5, 보다 바람직하게 5.7 내지 6.3이다.
본 발명에 있어서, 배양 교반 속도는 100 내지 300 rpm, 바람직하게 150 내지 250 rpm, 보다 바람직하게 180 내지 220 rpm이다.
본 발명의 인터루킨-2를 생산하는 방법은 (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
배양액으로 단백질을 분리하기 위하여 당업계에 알려진 방법에 따라 단백질을 농축하고, 예컨대, Sodium deoxycholate (Na-DOC) 및 Trichloroacetic acid (TCA) 등을 처리하고 원심 분리 및 초음파 처리 과정 등을 통해 단백질만을 추출할 수 있다.
본 발명의 인터루킨-2를 생산하는 방법은 (c) 상기 (b) 단계의 분리된 단백질에 담배 식각 바이러스 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease)를 처리하고 인터루킨-2를 분리하는 단계를 포함한다.
인터루킨-2 및 인간 혈청 알부민 융합 단백질의 분리를 위해서는 인간 혈청 알부민 및 인터루킨-2 유전자 서열 사이에 추가된 TEV site를 절단하는 TEV 프로테아제를 처리할 수 있다. TEV 프로테아제의 처리는 28 내지 32 ℃에서 4 내지 8시간 수행될 수 있다.
TEV 프로테아제가 처리된 시료로부터 인터루킨-2를 분리하는 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 분리 및 정제 방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기,전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 분리 및 정제하게 된다.
본 발명의 인터루킨-2 생산 방법은 최적의 세포주 확립에 따라 높은 성장 및 단백질 합성율을 보이며 저비용의 탄소원인 메탄올을 이용한 최적의 배양 조건 확립에 따라 인터루킨-2를 포함하는 단백질을 대량 생산하며 단백질 분리 정제과정 간소화에 따라 고순도의 인터루킨-2를 생산함으로써 인터루킨-2 대량 생산에 현저한 효과를 보인다.
도 1은 pYHSA13(T-1) 벡터 및 pUC18-HSA 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 IL-2를 포함하는 PUC-HSA-IL-2 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2 벡터의 구체적인 구성을 포함한 벡터 모식도를 나타낸다.
도 4는 pHSAft-5-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha 에서 HSA-IL2 융합단백질 및 인터루킨-2의 분비 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 pHSAft-1-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha에서 HSA-IL2 융합단백질 및 인터루킨-2의 분비 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 발효조를 이용한 인터루킨-2 생산 과정에 있어서 시간에 따른 세포 성장 및 단백질 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 시간 경과에 따른 인간 혈청 알부민 및 인터루킨-2 융합 단백질의 발현량 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 TEV 프로테아제 처리된 배양 상층액의 시간 경과에 따른 인터루킨-2 발현량 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 시간 변화에 따른 인터루킨-2 생성량을 HPLC를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예 1] Human Serum Albumin 및 인터루킨-2 융합 발현 벡터 및 형질전환 균주의 제조
두 가지 크기의 Human Serum Albumin (HSA) 유전자 단편으로 HSA-IL-2 융합 단백질을 분비 발현 시킬 수 있는 Hansenula polymorpha 용 벡터 세트를 확보하기 위하여, HSA 유전자의 C-말단에 His-tag이 달린 H. polymorpha용 pYHSA13(T-1)벡터와 대장균용 high-copy 벡터인 pUC18벡터 (Invitrogen)를 사용하였다. 여기서, pYHSA13(T-1) 벡터는 H. polymorpha의 메탄올 유도성 프로모터인 MOX 프로모터, E. coli용 선별표지인 Ampicillin 저항성 유전자, H.polymorpha 용 표지유전자인 leu 및 MOX 프로모터에 의해 분비 발현되는 HSA 유전자를 보유하고 있다.
pYHSA13(T-1) 벡터는 EcoRI 및 BamHI으로 절단되었고, 그 결과 세 조각으로 나뉜 벡터의 조각 중 벡터의 5'-UTR부터 HSA, His-tag 유전자를 포함한 1.8 kb 단편을 대장균용 high-copy 벡터인 pUC18 벡터에 서브클로닝 하여 pUC18-HSA 벡터를 제작하였다. 상기 pYHSA13(T-1) 벡터 및 pUC18-HSA벡터의 모식도는 도 1에 나타내었다.
작용기 도메인을 도입하기 위한 일련의 유전공학적 조작을 수행하기 위하여 꼬리가 50-mer 이상인 긴 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 PCR에서 HpaI 꼬리가 달린 프라이머를 사용하여 작용기 도메인의 linker와 Strep-tag 서열을 제작하였고, 두 번째 PCR에서 NheI 꼬리가 달린 프라이머를 사용하여 멀티클로닝 사이트와 Tev 서열을 제작하고 첫 번째 프라이머 꼬리인 HpaI 서열을 제거하였다. 마지막으로 세 번째 PCR에서는 HSA 단편과 His-tag 서열 사이에 HpaI 인지 서열을 만들고 6xHis으로 연결, 제작하였다. PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
[표 1] 프라이머 서열
Figure PCTKR2015004788-appb-I000001
pUC18-HSA벡터에 IL-2 유전자를 클로닝하여 HSA와 IL-2 융합단백질이 효율적으로 발현, 분비될 수 있도록 융합 발현벡터를 제작하였다. 분비 발현된 융합단백질이 용이하게 분리할 수 있도록 HSA-His tag과 IL-2- Strep tag 결합 부위를 삽입하였고 HSA과 IL-2 유전자 사이에는 분비 발현 후 IL-2 단백질만을 회수하기 위한 TEV site를 부착하였다. 벡터의 모식도는 도 2에 나타내었다.
IL-2 단백질의 분비를 효율적으로 유도할 수 있도록 HSA와의 융합 발현 벡터 제작을 위해 HSA 유전자의 전체 서열과 상부 137aa 서열을 IL-2 유전자 상류에 각각 연결하여 HSA와 IL-2가 융합 단백질 형태로 분비 발현되도록 조작한 벡터 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2 를 제조하였으며, 벡터의 구체적 구성을 도 3의 (a) 및 (b)에 각각 나타내었다.
IL-2 단백질의 분비를 효율적으로 유도할 수 있도록 HSA와의 융합 발현 벡터 제작을 위해 HSA 유전자의 전체 서열과 상부 137aa 서열을 IL-2 유전자 상류에 각각 연결하여 HSA와 IL-2가 융합 단백질 형태로 분비 발현되도록 조작한 벡터 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2 를 제조하였으며, 벡터의 구체적 구성을 도 3의 (a) 및 (b)에 각각 나타내었다. 이들 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2의 서열 정보는 서열번호 6 및 서열번호 7에 기재하였다. 작용기 도메인이 도입된 pUC18-HSA 벡터를 주형으로 사용하여 PCR을 수행 할 때 reverse primer를 다르게 사용하여 각기 크기가 다른 HSA fusion tag domain 두 가지 종류를 제작하였다. HSA의 삼차 구조를 바탕으로 HSA 절단 부위를 결정하였고, PCR로 해당 부위 DNA 단편을 확보하여 작용기 도메인 앞에 클로닝 하는 작업을 수행하였고 이를 이용하여 융합단백질이 발현되는 tag을 구성하여 제작하였다. 사용한 프라이머 세트는 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] 프라이머 서열
Figure PCTKR2015004788-appb-I000002
상기 제조된 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2 벡터들을 이용하여 형질전환을 수행하기 위하여, YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-Glucose 2%(w/v)) 액체배지에서 전배양한 H. polymorpha DL1-L를 500㎖ baffled flask에 초기 OD 600 값을 0.2로 맞추어 50㎖을 30 ℃ 진탕 배양기에서 180 rpm으로 배양하였다. 6~7 시간 후 OD 600 값이 1.0이 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 4,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 상층액은 제거하고 LiAc/TE 완충용액 (0.01 M Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.1M LiAc, pH 7.5) 1㎖을 넣고 pipetting으로 현탁한 다음 13,000rpm으로 1분간 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 다시 LiAc/TE 완충 용액 500㎕에 현탁하여 competent cell을 제조하였다. 100㎕씩 5개로 나누어 분주하고 각 tube에 재조합벡터 2 ㎕, salmon sperm DNA 10 ㎕, PEG/LiAc 완충용액 (50% polyethylene glycol, 0.01 M Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.1M LiAc, pH 7.5) 600㎕를 혼합한 후, 3~4번 정도 조심스럽게 pipetting해주었다. 30℃에서 30분간 방치시킨 후 DMSO 70㎕를 첨가하여 살짝 pipetting 해준 후, 42℃에서 15 분간 열처리를 하였다. 얼음에서 3분간 방치한 후 13,000rpm으로 1분간 원심 분리하여 얻은 침전물을 멸균된 증류수로 현탁하고 선택배지인 SC-Leu(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids, Leu-dropout supplement, 2% glucose, 2% agar)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 형질전환체를 얻었다.
[실시예 2] 재조합 발효균주의 선별 (Screening of recombinant strains)
pHSAft 벡터는 IL-2 단백질의 분비를 효율적으로 증대시키기 위해 HSA의 단백질 분비 시그날 서열을 상부에 부착하여 HSA와 IL-2가 융합단백질 형태로 분비, 발현되도록 유도한 벡터이다. HSA의 137aa 부위를 포함한 pHSAft-1-IL-2 vector와 HSA의 전체 608aa 부위를 포함한 pHSAft-5-IL-2 vector 의 차이는 HSA의 길이 차이뿐이며 두 벡터 모두 IL-2의 단백질을 분비할 수 있도록 제작되었다.
상기 실시예 1에서 제조된 형질전환 균주 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2)와 H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2)를 사용하여 선별 실험을 진행하였다. 두 종류의 형질전환체를 각각 SC-Leu 선택배지(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids, Leu-dropout supplement, 2% glucose, 2% agar)에 도말하여 30시간 배양 한 후 자라난 colony 중 각 8개씩을 선별하고 각각 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) B1~8, H.polymorpha(pHSAft-5-IL-2) R1~8이라 명명하고 세포 증식과 단백질 생산이 가장 우수한 균주의 선별 실험을 진행하였다.
B1~8 및 R1~8 총 16균주를 각각 YPM medium(Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 에 접종하고 shaker[SI-300R, Lab Companion]에서 seed 접종량 1%, 37℃, 200rpm 의 조건으로 30시간 동안 배양하였다.
세포의 증식 측정은 분광광도계[UV1240, SHIMADZU]로 파장 OD600에서 행하였고, 측정값이 1.0이 넘어갈 경우 적절히 희석하여 30시간 배양한 균주의 최종OD값을 측정 함으로써 각 균주의 배양 정도를 확인하였다.
각 재조합 균주들이 생산한 단백질을 정량하기 위해 배양액을 얼음 속에 방치하여 냉각 한 후 2% Sodium deoxycholate (Na-DOC)를 이용하여 최종 농도 0.02%가 되도록 가하여 농축하였다. 50% Trichloroacetic acid (TCA)는 최종 농도 7.5%로 혼합한 후, 2시간 동안 sample을 얼음에 방치하였다. 4℃, 4,000rpm (Centrifuge Combi-514R)에서 30분 간 원심분리 후, 상층액을 제거하고 침전물에 2 ㎖ Tetrahydrofuran (THF)를 가하였다. 이어서 4℃, 4,000 rpm로 30분간 다시 원심분리 하고 상층액은 제거한 후에 Tetrahydrofuran (THF)를 가한 침전물은 bath sonication (Powersonic 520, Hwashin Tech, Korea)에서 다시 제거하였다. BSA 표준용액 50과 같은 부피의 샘플을 micro tube에 준비하고 Brilliant Blue G-250 950을 첨가한 뒤 상온에서 5분간 반응 시킨 후 595nm에서 OD를 측정하였다.
그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
[표 3] H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 균주의 생장 및 단백질 생산 (*Average Values)
Figure PCTKR2015004788-appb-I000003
[표 4] H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2) 균주의 생장 및 단백질 생산 (*Average Values)
Figure PCTKR2015004788-appb-I000004
표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 혈청 알부민 유전자의 일부만 포함하고 있는 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 계열의 8 개 균주 (B1~B8) 중에서는 B8 균주가 세포 증식과 총 단백질 생산량에서 각각 OD 5.45와 2.16 μg/㎖ 의 수치를 나타내어 가장 우수한 것으로 확인 되었다.
또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, 인간 혈청 알부민의 전체 유전자 배열을 포함하고 있는 H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2) 계열의 8개 균주 (R1~R8) 중에서는 R4 균주가 세포 증식과 총 단백질 생산량에서 각각 OD 5.41과 2.13 μg/㎖ 의 수치를 나타내어 가장 우수한 것으로 확인되었다.
전반적으로 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 계열 균주들의 세포 증식량과 총 단백질 생산량에서 H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2) 계열의 균주들 보다 높게 나타냄을 알 수 있었다.
재조합 인터루킨-2 생산 균주로서 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 계열 균주인 B8 균주를 최종 선별하고, 2014.10.01 자에 한국생명공학연구원에 KCTC18329P로 기탁하였다.
[실시예 3] 단백질 분비 발현 및 융합 단백질 분리 확인
형질전환체를 YPD 액체배지에서 배양한 균체를 OD600값 0.1로 맞추어 YPM 액체배지에 접종 할 양만큼 E-tube로 옮긴 후 13,000rpm으로 1분간 원심분리 하였다. 침전물에 멸균증류수 1㎖을 첨가하여 pipetting으로 현탁하고 13,000rpm으로 1분간 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 미리 분주해 놓은 YPM 액체배지로 현탁한 후 접종하여 단백질의 발현을 유도하였다.
분비 발현된 단백질을 농축하기 위해 2% Sodium deoxycholate (Na-DOC)에 최종 농도 0.02%를 가했다. 50% Trichloroacetic acid (TCA)는 최종 농도 7.5%로 혼합한 후, 2시간 동안 sample을 얼음에 방치하였다. 4℃, 4,000rpm (Centrifuge Combi-514R)에서 30분 간 원심분리 후, 상층액은 제거하고 침전물에 2 ㎖ Tetrahydrofuran (THF)를 가했다. 이어서 4℃, 4,000 rpm로 30분동안 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 후에 Tetrahydrofuran (THF)를 가한 침전물은 bath sonication (Powersonic 520, Hwashin Tech, Korea)에서 다시 제거하였다.
분비 발현된 융합단백질을 분리하기 위해 ProTEV Plus(Promega, USA)를 사용하여 components를 모은 후 sample을 30°C incubator에서 6시간 동안 방치하고 다시 -20℃에서 유지시켰다.
준비된 단백질 시료는 SDS-PAGE를 수행한 후 gel을 떼어내어 그 위에 PVDF membrane (Bio-Rad)을 올리고 transfer caster에 조립하여 transfer buffer (192mM glycine, 25mM Tris, 20% methanol)를 채운 상태에서 80 V로 1 시간 동안 수행하였다. 그 후 blocking buffer[5% skim milk, TBST (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)]에 PVDF 막을 넣고 상온에서 1시간 정도 흔들면서 비특이적인 결합을 방지하였다. Blocking buffer에 1차 항체를 넣고 상온에서 1시간 30분 정도 흔든 후 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 반복하여 세척하였다. 다시 blocking buffer에 2차 항체를 넣고 1시간 동안 흔든 후 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 반복하여 세척하였다. ECL (enhanced chemiluminescence) kit의 solution A와 B를 1:1로 섞어 PVDF 막에 부어 준 후 1 분간 반응시켜 발색반응을 일으키고 암실에서 X-ray필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, pHSAft-5-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha (strain R4)에서 HSA-IL2 융합단백질의 분비 발현이 확인된 시료 4개에 ProTEV를 처리했을 때 13.4kDa 밴드만 나오는 것을 확인하였으며(#1~#4), HSA와 융합 발현된 단백질을 47.3kDa(#5~#8)에서 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, pHSAft-1-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha (strain B8)에서 HSA-IL2 융합단백질의 분비 발현이 확인된 시료에서 28kDa 크기의 HSA-IL-2 융합 단백질의 분비 발현이 이루어졌음을 확인하였고(도 5 (a)), 이 융합 단백질을 ProTEV를 처리하였을 때, 14 kDa 정도의 인터루킨-2가 분리되는 것(도 5 (b))을 확인하였다.
[실시예 4] 형질 전환 메탄올 자화 효모를 이용한 인터루킨-2 생산 최적화
재조합 인터루킨-2생산 우수 균주로 최종 선별된 H. polymorpha (B8) 균주를 이용하여 배양 조건 최적화 실험을 수행하였다. YP 배지 (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v))를 기본배지로 하여 shaker[SI-300R, Lab Companion] 에서 seed 접종량을 1%로 하고 메탄올 농도, 배양 온도, 배양 pH, 교반속도(rpm)를 변수로 하여 최적 배양 조건을 찾는 실험을 진행하였다.
메탄올 농도는 2%(w/v), 3%(w/v), 4%(w/v) 또는 5%(w/v)로, 온도는 30℃, 35℃, 37℃ 또는 40℃로, pH는 접종 시 pH를 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0로, 교반속도는 150, 180, 200, 250 또는 300rpm으로 변화 시키면서 실험을 진행하였다. 각각의 조건에서 30시간 배양한 균의 최종 OD값과 단백질 양을 전술한 방법으로 각각 측정하여 확인하였다.
4-1. 메탄올농도의 최적화
H. polymorpha 균주는 강력한 MOX promoter를 보유하고 있어 저렴한 탄소원인 메탄올을 쉽게 자화할 수 있는 효모이다. 따라서 메탄올을 발효 기질로 사용할 경우 포도당을 사용하는 것 보다 원료에 대한 원가 절감이 가능하므로 공정상 매우 유리하다.
초기 메탄올 농도의 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 메탄올 농도를 2%(w/v)에서 5%(w/v)까지 변화시키면서 각 농도에서의 세포 증식과 단백질 생산량을 확인하였다. 그 결과 하기 표 5과 같이 초기 메탄올 농도 3%(w/v)에서 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산량이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
[표 5] 메탄올 농도에 따른 세포 성장 및 단백질 생성 (*Average Values)
Figure PCTKR2015004788-appb-I000005
4-2. 배양온도의 최적화
배양 온도에 따라 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양 온도를 30, 35, 37, 40℃로 변화시키면서 각 온도에서의 세포 증식과 단백질 생산량을 확인하였다. 그 결과 하기 표 6와 같이 배양 온도 37℃에서 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산량이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
[표 6] 온도에 따른 세포 성장 및 단백질 생성 (*Average Values)
Figure PCTKR2015004788-appb-I000006
4-3. 배양 pH의 최적화
배양 pH에 따라 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양 pH를 5.5, 6.0. 6.5. 7.0으로 변화시키면서 각 pH에서의 세포 증식과 단백질 생산량을 확인하였다. 그 결과 하기 표 7와 같이 배양 pH 6.0에서 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산량이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
[표 7] pH에 따른 세포 성장 및 단백질 생성 (*Average Values)
Figure PCTKR2015004788-appb-I000007
4-4. 교반속도의 최적화
교반 속도에 따라 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 교반 속도를 150, 180, 200, 250rpm으로 변화시키면서 각 교반 속도에서의 세포 증식과 단백질 생산량을 확인하였다. 그 결과 하기 표 8과 같이 교반 속도 200rpm에서 H. polymorpha의 세포 증식과 단백질 생산량이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
[표 8] 교반 속도에 따른 세포 성장 및 단백질 생성 (*Average Values)
Figure PCTKR2015004788-appb-I000008
이상의 최적화 실험을 통하여 H. polymorpha를 이용하여 재조합 인터루킨-2를 생산하기 위한 최적화 배양조건은 초기 메탄올 농도 3%(w/v), 배양온도 37℃, pH 6.0, 교반속도 200rpm임을 확인하였다.
[실시예 5] 발효조를 이용한 인터루킨-2의 생산
상기 최적화 조건 하에서 확인된 최적의 배양조건인 초기 메탄올 농도 3%(w/v), 배양온도 37℃, pH6.0, 교반속도 200rpm에서 5리터 발효조를 이용하여 재조합 인터루킨-2의 생산연구를 수행하였다.
YPD medium (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-Glucose 2%(w/v))에 접종되어 있는 최종 선별된 재조합 H. polymorpha 균주를 YPM 배지 (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v))에 접종하고 shaker[SI-300R, Lab Companion]에서 37℃, 200rpm 으로 30시간 동안 200 ㎖ 을 배양 하여 seed culture로 사용하였다. 5리터 발효조 [KoBioTech, KF-5L, Korea]에 가동 용적 (working volume)을 3.5 리터로 하여 YPM 배지 (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v))를 충진하고, 컴퓨터 자동조절 장치를 이용하여 pH는 5.90~ 6.05의 범위에서 조절될 수 있도록 2N HCl 과 2N NaOH로 조정하였으며, 온도는 36.5℃부터 37.5℃, RT 값은 300 으로 자동조절하고 총 30시간 배양하면서 2시간 간격으로 시료를 채취하여 전술한 방법으로 세포 증식과 단백질 정량을 실시하였다.
세포 성장 및 단백질 생성에 관한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 접종 후 24시간까지 지수기 (exponential growth phase)를 보이며 균주 성장이 일어났으나 24시간 이후에는 OD값이 감소하면서 더 이상의 증식이 일어나지 않는 것을 확인하였다. 한편 총 단백질 생산은 배양 초기 10시간 까지는 크게 증가하는 것이 보이지 않다가 배양 10시간 이후로 조금씩 증가하기 시작하여 배양 후 약 15시간이 경과한 이후부터 급격히 증가하기 시작하여 배양 30시간 이후까지 단백질 생산이 지속되는 양상을 확인하였다.
또한, 생산된 단백질이 HSA-IL-2의 융합단백질의 형태로 발현, 세포 배양액 내로 효율적으로 분비되었는지를 확인하기 위하여 상기 실시예 3의 방법과 동일하게 세포배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 TCA로 농축한 후 SDS-PAGE를 걸어 분리된 단백질의 band 크기로부터 융합 단백질의 존재를 확인하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 배양 시간이 경과함에 따라 약 28 kDa 크기의 단백질이 점점 다량 발현되는 것을 확인 할 수 있었고, 약 15시간 이 경과한 이후에는 단백질의 band가 점점 선명해 지면서 융합단백질이 과발현 (overexpression) 됨을 알 수 있었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 배양 시간 별로 ProTEV Plus로 처리한 단백질 샘플의 경우 배양 시간이 경과함에 따라 14kDa 크기의 단백질 band가 점차 선명하게 검출됨을 확인할 수 있었다.
또한, 단백질 용액을 ProTEV Plus로 처리하여 재조합 인터루킨-2가 분리되는지 여부를 확인하였고, 이를 다시 HPLC 분석을 통해 재확인하였다. HPLC 분석은 정제된 시료를 0.45 ul 실린지 필터와 주사기를 이용하여 여과한 후 이를 HPLC [SIMADZU, Prominence, Japan]에 주사하여 확인하였다. HPLC 컬럼은 Vision HT C18 HL 5μ Length 250nm를 사용하였고 시간은 60분, 유속은 1.0 ㎖/min, 온도는 30℃, 파장은 280nm, ratio range 10으로 시료들을 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9의 HPLC 상 녹색은 표준 인터페론-2, 갈색은 16 시간후 샘플, 검정색은 20시간 후 샘플, 파란색은 30시간 후 샘플을 나타낸다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 표준 인터루킨-2와 동일한 시간 대에서 재조합 인터루킨-2의 peak가 나타남을 확인할 수 있었고 시간이 경과함에 따라 peak의 넓이가 확장되는 것으로부터 재조합 인터루킨-2가 과량 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 형질전환 메탄올 자화 효모의 발효 역학(Fermentation kinetics)
H. polymorpha를 이용한 재조합 인터루킨-2의 생산에 있어서 fermentation kinetics를 계산한 결과를 표 9에 나타내었다.
표 9에 나타난 바와 같이, 세포증식률(cell growth rate) 은 10 mg/l/h, 메탄올 소모율(MeOH consumption rate)은 0.67 g/l/h, 단백질 생산률(protein production rate)은 2.17 mg/l/h, 세포증식 수율(cell growth yield)은 15 mg/g, 단백질 생산 수율(protein production yield)은 3.25 μg/g, 단백질 생산성(protein productivity)은 1.1 μg/g/h로 계산되었다.
[표 9] 형질전환 메탄올 자화 효모의 발효 역학
Figure PCTKR2015004788-appb-I000009
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC18329P
수탁일자 : 2014.10.01
Figure PCTKR2015004788-appb-I000010

Claims (11)

  1. 다음의 단계를 포함하는 인터루킨-2를 생산하는 방법:
    (a) 메탄올 옥시다제 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 클로닝하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 제조된 발현 컨스트럭트를 효모 숙주 세포에 형질전환한 후 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 배양된 형질전환 효모 세포로부터 발현된 인터루킨-2를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 발현 컨스트럭트는 담배 식각 바이러스 프로테아제 위치(Tobacco Etch Virus site)를 더 포함하는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 효모 숙주는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candia boidini), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica) 또는 오가테아 미누타(Ogataea minuta)로부터 선택되는 어느 하나인 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 배양은 YPM (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 배지에서 수행되는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 배양은 메탄올 농도가 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v); 배양 온도가 25 내지 45 ℃, 배양 pH가 4.5 내지 7.0 및 배양 교반 속도가 100 내지 300 rpm인 조건에서 수행되는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지며; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 가지며; 및 인터루킨-2 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  7. 다음의 단계를 포함하는 인터루킨-2를 생산하는 방법:
    (a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 담배 식각 바이러스 사이트; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 단백질을 분리하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 분리된 단백질에 담배 식각 바이러스 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease)를 처리하여 인터루킨-2를 분리하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 형질전환된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) KCTC18329P인 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 YPM (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 배지에서 수행되는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 메탄올 농도가 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v); 배양 온도가 25 내지 45 ℃, 배양 pH가 4.5 내지 7.0 및 배양 교반 속도가 100 내지 300 rpm인 조건에서 수행되는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 담배 식각 바이러스 프로테아제(Tobacco Etch Virus protease) 처리는 28 내지 32 ℃에서 4 내지 8시간동안 수행되는 인터루킨-2를 생산하는 방법.
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