WO2016068427A1 - 인간 혈청 알부민을 이용한 인터루킨-2 발현 컨스트럭트 - Google Patents

인간 혈청 알부민을 이용한 인터루킨-2 발현 컨스트럭트 Download PDF

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WO2016068427A1
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interleukin
yeast
expression construct
gene
hsa
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PCT/KR2015/004787
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이상기
박은오
서훈
최광진
송건형
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순천향대학교 산학협력단
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    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to an interleukin-2 expression construct using human serum albumin and a transformed yeast comprising the same.
  • E. coli is the most widely used host cell for mass production of these useful proteins, and many recombinant useful proteins have been produced by Escherichia coli, ranging from hormones such as insulin and ⁇ -endorphin to immunomodulators such as interferon.
  • glycoproteins that require post-translational modifications such as glycosylation or proteins with large and very complex structures to have protein activity.
  • useful proteins when expressed in yeast, they do not achieve complete folding and form insoluble inclusion bodies in which the activity is lost by various mechanisms.
  • This insoluble protein may be obtained in a pure protein with high purity since the initial separation step is easy, but since it does not have activity as a protein, complex and expensive denaturation and refolding to obtain a soluble protein with biological activity from it. The process is necessary. Therefore, interest in mass production of the target protein in secret form is increasing.
  • interleukin-2 is an interleukin composed of 153 amino acids and is mainly produced in T cells expressing surface antigen CD-4. Also, interleukin-2 is transformed T cells, B cells, lymphocyte cancer cells, LAK cells and NK cells. Secrete. Their production is induced by activation of T cells by mitogens or elegens, although several secondary stimuli are required for maximum production of interleukin-2, but resting cells are known to be unable to produce interleukin-2. . These interleukin-2 and its receptors have been reported to be associated with a number of diseases so far, but the study of their molecular characteristics has been very limited due to the limited amount obtainable.
  • the present invention is a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; And an interleukin-2 expression construct for yeast comprising an interleukin-2 (IL-2) gene.
  • MOX methanol oxidase
  • IL-2 interleukin-2
  • the present invention provides a transformant comprising the expression construct.
  • the present invention provides an interleukin-2 production method using the recombinant transformant.
  • interleukin-2 interleukin-2
  • HSA human serum albumin
  • TMV Tobacco Etch Virus
  • the yeast interleukin-2 expression construct of the present invention and the yeast comprising the same can be cultured with methanol which is a cheap carbon source unlike the expression construct or expression system used in the conventionally known recombinant interleukin-2 production method, and It is a yeast interleukin-2 expression construct having a significant effect on the production of interleukin-2 in that it has a strong promoter induced and a yeast comprising the same.
  • the present invention is a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; And an interleukin-2 expression construct for yeast comprising an interleukin-2 gene.
  • the yeast interleukin-2 expression construct of the present invention can be inducibly expressed by a carbon source related to methanol metabolism in a transformant, thereby producing a large amount of interleukin-2 at low cost.
  • the expression construct refers to a nucleic acid molecule containing only a minimum of elements (elemnet) for protein expression in the cell.
  • the expression construct of the present invention comprises the aforementioned components as the minimum required components.
  • the expression construct of the present invention may be a recombinant vector.
  • a vector linking the methanol oxidase (MOX) promoter upstream of the human serum albumin gene full-length sequence or some fragment gene sequence thereof according to vector recombination methods known in the art and linking it upstream of the interleukin-2 gene can be.
  • MOX methanol oxidase
  • the MOX promoter, a methanol-inducible promoter of Hansenula polymorpha the Ampicillin resistance gene, a selection marker for E.
  • Recombinant vector recombining the nucleotide sequence containing human serum albumin among the truncated sequence of pYHSA13 (T-1) vector carrying the secreted and expressed human serum albumin (HSA) gene into pUC18, a high-copy vector for E. coli Fusion-expression recombinant vector can be prepared by cloning Interleukin-2 in -HSA).
  • FIG. 1 A schematic diagram of the pUC18-HSA recombinant vector is shown in FIG. 1.
  • the methanol oxidase (MOX) promoter is a promoter derived from genomic DNA of Hansenula polymorpha .
  • MOX promoter of the present invention is a powerful promoter that is easy to control expression and can be multiplely introduced into the chromosome, thus showing high stability of the introduced expression vector even in long-term culture using non-selective medium. do.
  • MOX promoter according to the present invention may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, has functionally equivalent properties and 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: Base sequences having%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology are also included in the scope of the present invention.
  • the human serum albumin gene or fragment fragment thereof refers to a gene encoding a protein having a molecular weight of 65 kDa consisting of 585 amino acids produced in the liver and secreted into the blood, or a fragment of a gene encoding human serum albumin.
  • Human serum albumin gene or fragment thereof of the present invention is a protein having a secretion signal sequence (signal sequence) is secreted well by itself without attaching a secretion system.
  • the protein since the protein has a large size or a complex structure, the expression of the protein is significantly increased when it is used as an interleukin-2 fusion protein for the expression of interleukin-2, which is a protein that is not secreted.
  • the human serum albumin gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and has a functionally equivalent property, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, Base sequences having 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology are also included in the scope of the present invention.
  • fragment genes of the human serum albumin gene are part of the human serum albumin gene which can be secreted by itself without a secretion system, and are 100, 200, 300, 400 from the N-terminus of the full-length amino acid sequence of human serum albumin. May comprise a gene sequence encoding a dog, 500 or more amino acid sequences.
  • the fragment gene of human serum albumin has the gene sequence of SEQ ID NO: 3.
  • interleukin-2 is an interleukin composed of 153 amino acids and is a protein mainly produced in T cells expressing surface antigen CD-4.
  • Interleukin-2 gene according to the present invention has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, has a functionally equivalent property and 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 Base sequences having%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology are also included in the scope of the present invention.
  • yeast is methanol magnetized yeast, more preferably Hansenula polymorpha , Pichia pastoris , Candia boidini , Pichia Pichia methanolica or Ogataea minuta , even more preferably Hansenula polymorpha .
  • the yeast interleukin-2 gene expression construct of the present invention recovers only IL-2 sequences additionally between human serum albumin and interleukin-2 gene sequences so that only interleukin-2 can be isolated after production of the fusion protein by the expression construct. It may include a sequence that can be cleaved by a protease (protease) to.
  • protease refers to an enzyme that cleaves peptide bonds of amino acids.
  • Proteases can be, for example, serine proteases, threonine proteases, cysteine proteases, aspartate proteases, metalloproteases, glutamic acid proteases or combinations thereof.
  • the protease can also be, for example, a Tobacco Etch Virus (TEV) protease, trypsin, chymotrypsin, elastase, pepsin, enteropeptidase or combinations thereof.
  • TSV Tobacco Etch Virus
  • the region that can be cleaved by an enzyme may vary depending on the enzyme and may be known to those skilled in the art.
  • the sequence that can be cleaved by a protease preferably has the base sequence of SEQ ID NO: 5 as a Tobacco Etch Virus site that can be cleaved by a tobacco etch virus protease. .
  • the expression construct of the present invention further comprises a restriction enzyme recognition base sequence capable of cloning a foreign protein coding nucleotide sequence to be operably linked to the promoter sequence.
  • restriction enzyme of the restriction enzyme recognition base sequence included in the expression construct of the present invention is not limited to a specific one, for example, but is not limited to EcoRV, NheI, NotI, SphI, XbaI and the like. Preferably, it may include restriction enzyme recognition base sequences of EcoRV and NheI.
  • Expression constructs of the invention include transcription termination sequences.
  • transcription termination sequences include, but are not limited to, polyadenylation sequences, such as, for example, ectopic growth terminator, polyadenylation sequences derived from SV40, ⁇ -globin polyA, HSV TK polyA, or MOX terminators.
  • the expression construct of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as an optional marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneti Resistance genes for leucine (G418), neomycin or tetracycline.
  • an antibiotic resistance gene commonly used in the art as an optional marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneti Resistance genes for leucine (G418), neomycin or tetracycline.
  • the expression construct of the present invention may further comprise, in addition to the above components, functional linkages operably linked to nucleic acid expression control that can regulate transcription and / or translation of the nucleic acid sequence.
  • Preferred expression constructs according to the invention are Figure 3 (a) or (b), more preferably Figure 3 (a).
  • the expression construct has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
  • the present invention also provides a transformed yeast comprising the yeast interleukin-2 expression construct.
  • Yeasts according to the invention are preferably transgenic yeasts which are methanol magnetizing yeasts, for example Hansenula polymorpha , Pichia pastoris , Candia boidini , Pichia metanolica ( Pichia methanolica ), or Ogataea minuta , a transgenic yeast.
  • the yeast according to the present invention is Hansenula polymorpha
  • most preferably the transformed yeast is a transformed Hansenula polymorpha DL1-L having accession number KCTC 18329P.
  • the method of transforming the expression construct into yeast cells may use a method of transforming vectors into eukaryotic cells known in the art, for example, micro-injection, calcium phosphate precipitation, Electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, lithium acetate-lithium DMSO method and the like.
  • the present invention also provides a method for producing interleukin-2 using yeast comprising the following steps:
  • a a methanol oxidase (MOX) promoter; Human serum albumin gene or fragment gene thereof; And cloning the yeast interleukin-2 expression construct comprising the interleukin-2 gene;
  • MOX methanol oxidase
  • step (b) transforming the expression construct prepared in step (a) into yeast host cells and culturing;
  • step (c) isolating the expressed interleukin-2 protein from the transformed yeast cells cultured in step (b).
  • the yeast interleukin-2 expression construct of the present invention obtains a fusion protein in a secreted and expressed form in human serum albumin (HSA) and a fusion protein at low cost, and can easily separate recombinant interleukin-2 from the bar, having high purity. This method can be useful for mass production of recombinant interleukin-2 protein.
  • HSA human serum albumin
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a pYHSA13 (T-1) vector and a pUC18-HSA vector.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a PUC-HSA-IL-2 vector comprising IL-2.
  • Figure 3 shows a vector schematic diagram including the specific configuration of the pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 vectors.
  • Figure 4 shows the results confirming the secretion expression of HSA-IL2 fusion protein and interleukin-2 in H. polymorpha transformed with pHSAft-5-IL-2 vector.
  • Figure 5 shows the results confirming the secretion expression of HSA-IL2 fusion protein and interleukin-2 in H. polymorpha transformed with pHSAft-1-IL-2 vector.
  • FIG. 6 shows the results of HPLC confirmed the interleukin-2 prepared in H. polymorpha transformed with pHSAft-1-IL-2 vector.
  • HSA human serum albumin
  • T-1 vector for H. polymorpha with His-tag at the C-terminus of HSA gene and pUC18 vector (Invitrogen), a high-copy vector for E. coli were used.
  • the pYHSA13 (T-1) vector is HSA secreted and expressed by the MOX promoter, a methanol-inducible promoter of H. polymorpha , the Ampicillin resistance gene, a selection marker for E. coli, and the leu and MOX promoters, markers for H. polymorpha . It holds a gene.
  • the pYHSA13 (T-1) vector was digested with EcoRI and BamHI, resulting in a high-copy vector of 1.8 kb fragments containing the 5'-UTR to HSA and His-tag genes of the vector in three fragments.
  • PUC18-HSA vector was constructed by subcloning into the pUC18 vector.
  • a schematic diagram of the pYHSA13 (T-1) vector and the pUC18-HSA vector is shown in FIG. 1.
  • a fusion expression vector was constructed to efficiently express and secrete HSA and IL-2 fusion proteins.
  • HSA-His tag and IL-2- Strep tag binding sites were inserted to facilitate the secretion of the expressed and expressed fusion proteins, and between the HSA and IL-2 genes, a TEV site was collected to recover only IL-2 proteins after secretion. Attached.
  • the schematic diagram of the vector is shown in FIG.
  • HSA and IL-2 are expressed as a fusion protein by linking the entire sequence of the HSA gene and the upper 137aa sequence upstream of the IL-2 gene, respectively, to construct a fusion expression vector with HSA.
  • Vectors pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 engineered to be secreted were prepared, and specific configurations of the vectors are shown in FIGS. 3A and 3B, respectively.
  • the sequence information of these pHSAft-5-IL-2 and pHSAft-1-IL-2 is set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • HSA fusion tag domains When PCR was performed using a pUC18-HSA vector with a functional domain as a template, two kinds of HSA fusion tag domains of different sizes were prepared using different reverse primers.
  • the HSA cleavage site was determined based on the tertiary structure of the HSA, and the DNA fragment was obtained by cloning in front of the functional domain by PCR, and the tag was used to construct a tag expressing the fusion protein.
  • the primer sets used are shown in Table 2 below.
  • YPD Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), D-Glucose 2% (w / v)
  • H. polymorpha DL1-L precultured in liquid medium was incubated at 180 rpm in a 30 ml shake incubator with an initial OD 600 of 0.2 in a 500 ml baffled flask. After 6-7 hours, the cells were cultured until the OD 600 value was 1.0, and then centrifuged at 4 ° C. and 4000 rpm for 10 minutes.
  • LiAc / TE buffer solution (0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5) was added, suspended by pipetting, and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to obtain a precipitate.
  • competent cells were prepared by suspending in 500 ⁇ l of LiAc / TE buffer solution. Divided into 5 aliquots and divided into 5 aliquots.
  • the pHSAft vector is a vector in which HSA and IL-2 are secreted and expressed in the form of a fusion protein by attaching a protein secretion signal sequence of HSA to the top to efficiently increase the secretion of IL-2 protein.
  • the only difference between the pHSAft-1-IL-2 vector containing the 137aa region of HSA and the pHSAft-5-IL-2 vector containing the entire 608aa region of HSA is the difference in the length of the HSA, and both vectors can secrete the protein of IL-2. It was designed to be.
  • H. polymorpha pHSAft-1-IL-2
  • H. polymorpha pHSAft-5-IL-2
  • SC-Leu selective medium 0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, Leu-dropout supplement, 2% glucose, 2% agar
  • H. polymorpha pHSAft-1-IL-2 B1-8
  • H.polymorpha pHSAft-5-IL-2) R1-8, respectively, for cell proliferation and protein production.
  • the screening experiment of this most excellent strain was carried out.
  • B1-8 and R1-8 16 strains of B1-8 and R1-8 were inoculated in YPM medium (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v) and Methanol 3% (w / v)), respectively. Seed inoculator 1%, shaker [SI-300R, Lab Companion] was incubated for 30 hours at 37 °C, 200rpm conditions.
  • Cell proliferation was measured at a wavelength of OD 600 with a spectrophotometer [UV1240, SHIMADZU], and when the measured value exceeded 1.0, the degree of culture of each strain was confirmed by measuring the final OD value of the strain incubated for 30 hours with proper dilution. .
  • the culture solution was left to cool in ice, and then concentrated by adding 2% sodium deoxycholate (Na-DOC) to a final concentration of 0.02%.
  • 50% Trichloroacetic acid (TCA) was mixed at a final concentration of 7.5% and the sample was left on ice for 2 hours. After centrifugation at 4 ° C., 4,000 rpm (Centrifuge Combi-514R) for 30 minutes, the supernatant was removed and 2 mL Tetrahydrofuran (THF) was added to the precipitate.
  • TCA Trichloroacetic acid
  • the R4 strain is the cell proliferation and total The protein production yielded the highest OD values of 5.41 and 2.13 ⁇ g / mL, respectively.
  • H. polymorpha (pHSAft-1-IL -2) appears in the cell increases food and total protein production of the line above the strain of H. polymorpha (pHSAft-5-IL -2) family of strains.
  • the B8 strain Hansenula polymorpha DL1-L
  • H. polymorpha pHSAft-1-IL-2
  • the deposit was given a microbial accession number KCTC18329P.
  • the transformants were cultured in YPD liquid medium and transferred to E-tube as much as inoculated in YPM liquid medium by adjusting the OD 600 value to 0.1 and centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm. 1 ml of sterile distilled water was added to the precipitate, suspended by pipetting, and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to obtain a precipitate. Protein expression was inoculated by suspending with pre- aliquoted YPM (Bacto-peptone 2% (w / v), Bacto-Yeast Extract 1% (w / v), Methanol 3% (w / v)) liquid medium and inoculating. Induced.
  • Trichloroacetic acid 50% Trichloroacetic acid (TCA) was mixed at a final concentration of 7.5% and the sample was left on ice for 2 hours. After centrifugation at 4 ° C., 4,000 rpm (Centrifuge Combi-514R) for 30 minutes, the supernatant was removed and 2 mL Tetrahydrofuran (THF) was added to the precipitate. Subsequently, after centrifugation at 4 ° C. and 4,000 rpm for 30 minutes again, the supernatant was removed, and the precipitate added with Tetrahydrofuran (THF) was removed again by bath sonication (Powersonic 520, Hwashin Tech, Korea).
  • TCA Trichloroacetic acid
  • the prepared protein sample was subjected to SDS-PAGE, and then the gel was removed and the PVDF membrane (Bio-Rad) was raised thereon and assembled into a transfer caster, and 80 V was filled with a transfer buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris, 20% methanol). Was carried out for 1 hour.
  • PVDF membrane was added to blocking buffer [5% skim milk, TBST (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)] and shaken at room temperature for 1 hour to prevent nonspecific binding.
  • the primary antibody was added to the blocking buffer, shaken for 1 hour and 30 minutes at room temperature, and washed repeatedly for 10 minutes with TBST buffer.
  • the secondary antibody was added to the blocking buffer again, shaken for 1 hour, and washed three times with TBST buffer for 10 minutes.
  • Solution A and B of ECL (enhanced chemiluminescence) kit were mixed 1: 1 and poured into PVDF membrane to react for 1 minute to cause color reaction, and to detect signal by exposing to X-ray film in dark room.
  • HSA and interleukin-2 fusion proteins produced from H. polymorpha (strain B8) strains transformed with a pHSAft-1-IL-2 vector were isolated and the isolated recombinant interleukin-2 protein was analyzed using HPLC.
  • the purified sample was filtered using a 0.45 ul syringe filter and a syringe, and then confirmed by injection into HPLC [SIMADZU, Prominence, Japan].
  • HPLC column was Vision HT C18 HL 5 ⁇ Length 250nm using a time of 60 minutes, flow rate 1.0ml / min, temperature was 30 °C, wavelength was 280nm, ratio range 10 samples were measured.
  • FIG. 6 As shown in FIG. 6, it was confirmed that the recombinant interleukin-2 (FIG. 6 (b)) was separated at the same position as the standard interleukin-2 (FIG. 6 (a)) after 30 minutes.

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Abstract

본 발명은 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase) 프로모터; 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트(expression construct) 및 이를 포함하는 효모에 관한 것이다. 본 발명의 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트는 저비용으로 인체혈청 알부민(HSA)과 융합단백질 형태로 분비 발현된 형태의 융합단백질을 얻고 이로부터 용이하게 재조합 인터루킨-2를 분리할 수 있는 바, 고순도로 재조합 인터루킨-2 단백질을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인간 혈청 알부민을 이용한 인터루킨-2 발현 컨스트럭트
본 발명은 인간 혈청 알부민을 이용한 인터루킨-2 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 형질전환 효모에 관한 것이다.
과거 자연 상태로부터 미량으로 얻을 수 밖에 없던 인간에게 유용한 의료용 단백질이나 산업용 효소 등은 재조합 DNA 기술의 발전에 의해 대량 생산이 가능하게 되었다. 예컨대 대장균은 이러한 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포로서 인슐린, β-엔도르핀과 같은 호르몬에서 인터페론과 같은 면역 조절제에 이르기까지 많은 재조합 유용 단백질이 대장균에 의해서 생산되어왔다.
하지만, 단백질의 활성을 가지기 위해서 글리코실화와 같은 번역 후 변형이 필요한 당단백질이나 크고 매우 복잡한 구조를 가지고 있는 단백질의 생산에는 한계가 있다. 또한 유용 단백질을 효모에서 발현시키는 경우 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 다양한 기작에 의해 활성을 잃은 상태의 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하게 된다. 이 불용성 단백질은 초기 분리단계가 용이하여 순도가 높은 순수 단백질을 얻을 수 있는 경우도 있지만 단백질로서의 활성을 가지지 못하므로 이로부터 생물학적 활성을 가진 soluble한 단백질을 얻기 위하여 복잡하고 비용이 많이 드는 denaturation, refolding 과정이 필요하다. 따라서 대상 단백질을 분비 형태로 대량 생산하는 방법에 관심이 높아지고 있다.
한편, 인터루킨-2는 153개의 아미노산으로 구성된 인터루킨으로 표면항원 CD-4를 발현하는 T세포에서 주로 생산되며, 형질 전환된 T세포, B세포, 임파구암세포, LAK 세포 그리고 NK 세포 들도 인터루킨-2를 분비한다. 이들의 생산은 마이토젠 또는 엘레젠에 의한 T세포의 활성화에 의해 유도되며, 몇 종류의 2차 자극이 인터루킨-2의 최대 생산을 위해 요구되고 있으나 휴지기 세포는 인터루킨-2를 생산할 수 없다고 알려져 있다. 이러한 인터루킨-2 및 그 수용체는 지금까지 수 많은 질병들과 관련된다고 보고되어 왔으나, 얻을 수 있는 양의 한계로 그 분자적인 특징에 대한 연구는 매우 제한적이었다.
예컨대, 현재 기능성 있는 인터루킨-2 유전자의 투여에 의한 암에 대한 면역성을 증가시키기 위해 많은 방법들이 연구되고 있어, 인터루킨-2에 대한 연구와 치료제로서의 수요가 지속적으로 늘어나고 있으나, 이에 뒷받침되는 대량생산 기술이 뒷받침되지 못하는 실정이다.
이러한 배경 하에, 다양한 발현 시스템을 이용하여 인터루킨-2를 대량생산하기 위한 유전자 발현 시스템에 대한 연구 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2(IL-2) 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트(expression construct)를 제공한다.
본 발명은 상기 발현 컨스트럭트를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 형질전환체를 이용한 인터루킨-2 생산 방법을 제공한다.
상기한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 효모 세포로부터 분비 발현이 용이한 인간 혈청 알부민(Human serum albumin, HSA)에 융합 가능한 적합한 단백질로 인터루킨-2(IL-2)를 찾고 이들의 융합 발현을 유도하고 분비된 인간 혈청 알부민과 인터루킨-2 융합 단백질에 Tobacco Etch Virus(TEV) protease를 처리하여 순수 목적 단백질인 인터루킨-2만을 회수함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 효모는 기존에 알려진 재조합 인터루킨-2 제조방법에서 사용되는 발현 컨스트럭트 내지 발현 시스템과 다르게 값싼 탄소원인 메탄올로 배양이 가능하며 메탄올에 유도되는 강력한 프로모터를 가지고 있다는 점에서 인터루킨-2 대량 생산에 현저한 효과를 가지는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 효모이다.
본 발명은 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트(expression construct)를 제공한다. 본 발명의 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트는 형질전환체에서 메탄올 대사와 관련된 탄소원에 의하여 유도적으로 발현될 수 있어 저비용으로 대량의 인터루킨-2을 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서, 발현 컨스트럭트는 세포 내에서 단백질 발현을 위한 최소의 엘리먼트(elemnet)만을 포함하는 핵산분자를 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 발현 컨스트럭트는 상기 언급된 구성요소들을 최소의 필수 구성요소로 포함한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 재조합 벡터일 수 있다. 바람직하게, 당업계에 알려진 벡터 재조합 방법에 따라 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터를 인간 혈청 알부민 유전자 전장 서열 또는 이의 일부 단편 유전자 서열 상류에 연결하고, 이를 인터루킨-2 유전자 상류에 연결한 벡터일 수 있다. 예컨대, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 메탄올 유도성 프로모터인 MOX 프로모터, E. coli용 선별표지인 Ampicillin 저항성 유전자, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)용 표지 유전자인 leu 및 MOX 프로모터에 의해 분비 발현되는 인간혈청알부민(HSA) 유전자를 보유하고 있는 pYHSA13(T-1) 벡터의 절단된 서열 중 인간 혈청 알부민을 포함하는 염기서열을 대장균용 High-copy 벡터인 pUC18에 재조합한 재조합 벡터(pUC18-HSA)에 인터루킨-2를 클로닝하여 융합 발현 재조합 벡터를 제조 할 수 있다. 상기 pUC18-HSA 재조합 벡터의 모식도는 도 1에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 메탄올 옥시다제(Methanol oxidase: MOX) 프로모터는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 genomic DNA로부터 유래된 프로모터이다. 본발명의 MOX 프로모터는 발현 조절이 용이하면서 강력한 프로모터로써 염색체 상으로 다중 도입이 가능하여 비 선택 배지를 사용한 장기 배양에서도 도입된 발현 벡터의 높은 안정성을 보이기 때문에 인터루킨-2 발현에 매우 효과적인 프로모터로 사용된다. 본 발명에 따른 MOX 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있으며, 기능적으로 동등한 성질을 가지고 서열번호 1의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자는 간에서 생성되어 혈액에 분비되는 585개의 아미노산으로 이루어진 분자량 65 kDa크기의 단백질을 암호화하는 유전자 또는 인간 혈청 알부민을 암호화하는 유전자의 일부 단편을 말한다. 본 발명의 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자는 분비 신호서열 (signal sequence)을 갖는 단백질로서 따로 분비시스템을 달아주지 않아도 자체적으로 분비가 잘 이루어진다. 특히, 단백질의 크기가 크거나 복잡한 구조를 가짐으로써 단백질의 분비발현이 원활하지 않은 단백질인 인터루킨-2의 발현을 위하여 인터루킨-2와 융합단백질로 사용되었을 때 분비발현을 현저히 증가시킨다. 본 발명에 있어서, 인간 혈청 알부민 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 기능적으로 동등한 성질을 가지고 서열번호 2의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 인간 혈청 알부민 유전자의 단편 유전자는 분비시스템 없이도 자체적으로 분비가 이루어질 수 있는 인간 혈청 알부민 유전자의 일부로써, 인간 혈청 알부민의 전장 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 그 이상의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 인간 혈청 알부민의 단편 유전자는 서열번호 3의 유전자 서열을 가진다.
본 발명에 있어서, 인터루킨-2는 153개의 아미노산으로 구성된 인터루킨으로 표면항원 CD-4를 발현하는 T세포에서 주로 생산되는 단백질이다. 본 발명에 따른 인터루킨-2 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 가지며, 기능적으로 동등한 성질을 가지고 서열번호 4의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 효모에서 이용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 효모는 메탄올자화 효모이고, 보다 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candia boidini), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica) 또는 오가테아 미누타(Ogataea minuta)이며, 보다 더 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이다.
본 발명의 효모용 인터루킨-2 유전자 발현 컨스트럭트는 발현 컨스트럭트에 의한 융합 단백질 생산 후 인터루킨-2만을 분리할 수 있도록 인간 혈청 알부민 및 인터루킨-2 유전자 서열 사이에 추가로 IL-2 서열만을 회수하기 위한 단백질 분해 효소(protease)에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 프로테아제는 아미노산의 펩티드 결합을 절단시키는 효소를 말한다. 프로테아제는 예를 들면, 세린 프로테아제, 트레오닌프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 그의 조합일 수 있다. 또한, 프로테아제는 예를 들면, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 펩신, 엔테로펩티다제 또는 그의 조합일 수 있다. 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역은 효소에 따라 달라질 수 있고, 당업자에게 알려진 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 단백질 분해 효소(protease)에 의해 절단될 수 있는 서열은 바람직하게 담배 식각 바이러스 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 담배 식각 바이러스 위치(Tobacco Etch Virus site)로 서열번호 5의 염기 서열을 가진다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 추가적으로 상기 프로모터 서열에 작동적으로 연결되도록 외래 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝할 수 있는 제한효소 인식 염기 서열을 포함한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에 포함되는 제한효소 인식 염기 서열의 제한효소는 특정의 것으로 한정되지 않으며, 예를 들어 EcoRV, NheI, NotI, SphI, XbaI 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 EcoRV와 NheI의 제한 효소 인식 염기 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에는 전사 종결 서열을 포함한다. 예컨대, 폴리 아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터, SV40 유래 폴리 아데닐화 서열, β-글로빈 polyA, HSV TK polyA 또는 MOX 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 컨스트럭트는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신(G418), 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함한다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 상기 구성 요소에 추가적으로 핵산 서열의 전사 및/또는 트렌스레이션을 조절할 수 있는 핵산 발현 조절에 작동 가능하게 연결된 기능적 결합들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 발현 컨스트럭트는 도 3의 (a) 또는 (b)이며, 보다 바람직하게 도 3(a)이다. 본 발명의 일실시양태에 따르면 발현 컨스트럭트는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 염기 서열을 가진다.
본 발명은 또한 상기 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 효모를 제공한다. 본 발명에 따른 효모는 바람직하게 메탄올 자화 효모인 형질전환 효모이며, 예컨대, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candia boidini), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 또는 오가테아 미누타(Ogataea minuta)인 형질전환 효모일 수 있다. 보다 더 바람직하게 본 발명에 따른 효모는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이며, 가장 바람직하게 형질전환 효모는 기탁번호 KCTC 18329P를 가지는 형질 전환 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha DL1-L)이다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 컨스트럭트를 효모 세포에 형질전환하는 방법은 당업계에 공지된 진핵 세포에 벡터를 형질전환하는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리 법, 유전자 밤바드먼트, 초산-리튬 DMSO법 등을 포함한다.
본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 효모를 이용하여 인터루킨-2를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase, MOX) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 클로닝하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 제조된 발현 컨스트럭트를 효모 숙주 세포에 형질전환한 후 배양하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 배양된 형질전환 효모 세포로부터 발현된 인터루킨-2 단백질을 분리하는 단계.
본 발명의 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트는 저비용으로 인체혈청 알부민(HSA)과 융합단백질 형태로 분비 발현된 형태의 융합단백질을 얻고 이로부터 용이하게 재조합 인터루킨-2를 분리할 수 있는 바, 고순도로 재조합 인터루킨-2 단백질을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pYHSA13(T-1) 벡터 및 pUC18-HSA 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 IL-2를 포함하는 PUC-HSA-IL-2 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2 벡터의 구체적인 구성을 포함한 벡터 모식도를 나타낸다.
도 4는 pHSAft-5-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha 에서 HSA-IL2 융합단백질 및 인터루킨-2의 분비 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 pHSAft-1-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha에서 HSA-IL2 융합단백질 및 인터루킨-2의 분비 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 pHSAft-1-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha에서 제조된 인터루킨-2를 HPLC로 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예 1] 인간 혈청 알부민 및 인터루킨-2 융합 발현 벡터의 제작
두 가지 크기의 인간 혈청 알부민 (Human Serum Albumin, HSA) 유전자 단편으로 HSA-IL-2 융합 단백질을 분비 발현 시킬 수 있는 Hansenula polymorpha용 벡터 세트를 확보하기 위하여, HSA 유전자의 C-말단에 His-tag이 달린 H. polymorpha용 pYHSA13(T-1)벡터와 대장균용 high-copy 벡터인 pUC18벡터 ( Invitrogen)를 사용하였다. 여기서, pYHSA13(T-1) 벡터는 H. polymorpha의 메탄올 유도성 프로모터인 MOX 프로모터, E. coli용 선별표지인 Ampicillin 저항성 유전자, H.polymorpha용 표지유전자인 leu 및 MOX 프로모터에 의해 분비 발현되는 HSA 유전자를 보유하고 있다.
pYHSA13(T-1) 벡터는 EcoRI 및 BamHI으로 절단되었고, 그 결과 세 조각으로 나뉜 벡터의 조각 중 벡터의 5'-UTR부터 HSA, His-tag 유전자를 포함한 1.8 kb 단편을 대장균용 high-copy 벡터인 pUC18 벡터에 서브클로닝 하여 pUC18-HSA 벡터를 제작하였다. 상기 pYHSA13(T-1) 벡터 및 pUC18-HSA벡터의 모식도는 도 1에 나타내었다.
작용기 도메인을 도입하기 위한 일련의 유전공학적 조작을 수행하기 위하여 꼬리가 50-mer 이상인 긴 프라이머를 사용하였다. 첫 번째 PCR에서 HpaI 꼬리가 달린 프라이머를 사용하여 작용기 도메인의 linker와 Strep-tag 서열을 제작하였고, 두 번째 PCR에서 NheI 꼬리가 달린 프라이머를 사용하여 멀티클로닝 사이트와 Tev 서열을 제작하고 첫 번째 프라이머 꼬리인 HpaI 서열을 제거하였다. 마지막으로 세 번째 PCR에서는 HSA 단편과 His-tag 서열 사이에 HpaI 인지 서열을 만들고 6xHis으로 연결, 제작하였다. PCR에 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
[표 1] 프라이머 서열
Figure PCTKR2015004787-appb-I000001
pUC18-HSA벡터에 IL-2 유전자를 클로닝하여 HSA와 IL-2 융합단백질이 효율적으로 발현, 분비될 수 있도록 융합 발현벡터를 제작하였다. 분비 발현된 융합단백질이 용이하게 분리할 수 있도록 HSA-His tag과 IL-2- Strep tag 결합 부위를 삽입하였고 HSA과 IL-2 유전자 사이에는 분비 발현 후 IL-2 단백질만을 회수하기 위한 TEV site를 부착하였다. 벡터의 모식도는 도 2에 나타내었다.
IL-2 단백질의 분비를 효율적으로 유도할 수 있도록 HSA와의 융합 발현 벡터 제작을 위해 HSA 유전자의 전체 서열과 상부 137aa 서열을 IL-2 유전자 상류에 각각 연결하여 HSA와 IL-2가 융합 단백질 형태로 분비 발현되도록 조작한 벡터 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2 를 제조하였으며, 벡터의 구체적 구성을 도 3의 (a) 및 (b)에 각각 나타내었다. 이들 pHSAft-5-IL-2 및 pHSAft-1-IL-2의 서열 정보는 서열번호 6 및 서열번호 7에 기재하였다. 작용기 도메인이 도입된 pUC18-HSA 벡터를 주형으로 사용하여 PCR을 수행 할 때 reverse primer를 다르게 사용하여 각기 크기가 다른 HSA fusion tag domain 두 가지 종류를 제작하였다. HSA의 삼차 구조를 바탕으로 HSA 절단 부위를 결정하였고, PCR로 해당 부위 DNA 단편을 확보하여 작용기 도메인 앞에 클로닝 하는 작업을 수행하였고 이를 이용하여 융합단백질이 발현되는 tag을 구성하여 제작하였다. 사용한 프라이머 세트는 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] 프라이머 서열
Figure PCTKR2015004787-appb-I000002
[실시예 2] 형질 전환체의 제조
상기 제조된 벡터들을 이용하여 형질전환을 수행하기 위하여, YPD(Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-Glucose 2%(w/v)) 액체배지에서 전배양한 H. polymorpha DL1-L를 500㎖ baffled flask에 초기 OD 600 값을 0.2로 맞추어 50㎖을 30 ℃ 진탕 배양기에서 180 rpm으로 배양하였다. 6~7 시간 후 OD 600 값이 1.0이 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 4,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 상층액은 제거하고 LiAc/TE 완충용액 (0.01 M Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.1M LiAc, pH 7.5) 1㎖을 넣고 pipetting으로 현탁한 다음 13,000rpm으로 1분간 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 다시 LiAc/TE 완충 용액 500㎕에 현탁하여 competent cell을 제조하였다. 100㎕씩 5개로 나누어 분주하고 각 tube에 재조합벡터 2 ㎕, salmon sperm DNA 10 ㎕, PEG/LiAc 완충용액 (50% polyethylene glycol, 0.01 M Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.1M LiAc, pH 7.5) 600㎕를 혼합한 후, 3~4번 정도 조심스럽게 pipetting해주었다. 30℃에서 30분간 방치시킨 후 DMSO 70㎕를 첨가하여 살짝 pipetting 해준 후, 42℃에서 15 분간 열처리를 하였다. 얼음에서 3분간 방치한 후 13,000rpm으로 1분간 원심 분리하여 얻은 침전물을 멸균된 증류수로 현탁하고 선택배지인 SC-Leu(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids, Leu-dropout supplement, 2% glucose, 2% agar)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 형질전환체를 얻었다.
[실시예 3] 재조합 발효균주의 선별 (Screening of recombinant strains)
pHSAft 벡터는 IL-2 단백질의 분비를 효율적으로 증대시키기 위해 HSA의 단백질 분비 시그날 서열을 상부에 부착하여 HSA와 IL-2가 융합단백질 형태로 분비, 발현되도록 유도한 벡터이다. HSA의 137aa 부위를 포함한 pHSAft-1-IL-2 vector와 HSA의 전체 608aa 부위를 포함한 pHSAft-5-IL-2 vector 의 차이는 HSA의 길이 차이뿐이며 두 벡터 모두 IL-2의 단백질을 분비할 수 있도록 제작되었다.
형질전환 균주 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2)와 H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2)를 사용하여 선별 실험을 진행하였다. 두 종류의 형질전환체를 각각 SC-Leu 선택배지(0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids, Leu-dropout supplement, 2% glucose, 2% agar)에 도말하여 30시간 배양 한 후 자라난 colony 중 각 8개씩을 선별하고 각각 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) B1~8, H.polymorpha (pHSAft-5-IL-2) R1~8이라 명명하고 세포 증식과 단백질 생산이 가장 우수한 균주의 선별 실험을 진행하였다. B1~8 및 R1~8 총 16균주를 각각 YPM medium(Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v))에 접종하고 shaker[SI-300R, Lab Companion]에서 seed 접종량 1%, 37℃, 200rpm 의 조건으로 30시간 동안 배양하였다.
세포의 증식 측정은 분광광도계[UV1240, SHIMADZU]로 파장 OD600에서 행하였고, 측정값이 1.0이 넘어갈 경우 적절히 희석하여 30시간 배양한 균주의 최종 OD값을 측정함으로써 각 균주의 배양 정도를 확인하였다.
각 재조합 균주들이 생산한 단백질을 정량하기 위해 배양액을 얼음 속에 방치하여 냉각한 후 2% Sodium deoxycholate (Na-DOC)를 이용하여 최종 농도 0.02%가 되도록 가하여 농축하였다. 50% Trichloroacetic acid (TCA)는 최종 농도 7.5%로 혼합한 후, 2시간 동안 sample을 얼음에 방치하였다. 4℃, 4,000rpm (Centrifuge Combi-514R)에서 30분 간 원심분리 후, 상층액을 제거하고 침전물에 2 ㎖ Tetrahydrofuran (THF)를 가하였다. 이어서 4℃, 4,000 rpm로 30분간 다시 원심분리 하고 상층액은 제거한 후에 Tetrahydrofuran (THF)를 가한 침전물은 bath sonication (Powersonic 520, Hwashin Tech, Korea)에서 다시 제거하였다. BSA 표준용액 50와 같은 부피의 샘플을 micro tube에 준비하고 Brilliant Blue G-250 950을 첨가한 뒤 상온에서 5분간 반응 시킨 후 595nm에서 OD를 측정하였다.
그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
[표 3] H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 균주의 생장 및 단백질 생산 (* 평균값)
Figure PCTKR2015004787-appb-I000003
[표 4] H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2) 균주의 생장 및 단백질 생산(* 평균값)
Figure PCTKR2015004787-appb-I000004
표 3에서 확인되는 바와 같이, HSA 유전자의 일부만 포함하고 있는 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 계열의 8 개 균주 (B1~B8) 중에서는 B8 균주가 세포 증식과 총 단백질 생산량에서 각각 OD 5.45와 2.16 μg/㎖ 의 수치를 나타내어 가장 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 표 4에서 확인되는 바와 같이, HSA의 전체 유전자 배열을 포함하고 있는 H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2) 계열의 8개 균주 (R1~R8) 중에서는 R4 균주가 세포 증식과 총 단백질 생산량에서 각각 OD 5.41과 2.13 μg/㎖ 의 수치를 나타내어 가장 우수한 것으로 확인되었다.
전반적으로 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 계열 균주들의 세포 증식량과 총 단백질 생산량에서 H. polymorpha (pHSAft-5-IL-2) 계열의 균주들 보다 높게 나타남을 확인하였다.
재조합 인터루킨-2 생산 균주로서 H. polymorpha (pHSAft-1-IL-2) 계열 균주인 B8 균주 (미생물의 명칭: Hansenula polymorpha DL1-L)를 최종 선별하고, 2014.10.01 자에 한국생명공학연구원에 기탁하여 미생물 기탁번호 KCTC18329P를 부여받았다.
[실시예 4] 단백질 분비 발현 및 융합 단백질 분리 확인
형질전환체를 YPD 액체배지에서 배양한 균체를 OD600값 0.1로 맞추어 YPM 액체배지에 접종 할 양만큼 E-tube로 옮긴 후 13,000rpm으로 1분간 원심분리 하였다. 침전물에 멸균증류수 1㎖을 첨가하여 pipetting으로 현탁하고 13,000rpm으로 1분간 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 미리 분주해 놓은 YPM (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 액체배지로 현탁한 후 접종하여 단백질의 발현을 유도하였다.
분비 발현된 단백질을 농축하기 위해 2% Sodium deoxycholate (Na-DOC)에 최종 농도 0.02%를 가했다. 50% Trichloroacetic acid (TCA)는 최종 농도 7.5%로 혼합한 후, 2시간 동안 sample을 얼음에 방치하였다. 4℃, 4,000rpm (Centrifuge Combi-514R)에서 30분 간 원심분리 후, 상층액은 제거하고 침전물에 2 ㎖ Tetrahydrofuran (THF)를 가했다. 이어서 4℃, 4,000 rpm로 30분동안 다시 원심분리하고 상층액을 제거한 후에 Tetrahydrofuran (THF)를 가한 침전물은 bath sonication (Powersonic 520, Hwashin Tech, Korea)에서 다시 제거하였다.
분비발현된 융합단백질을 분리하기 위해 ProTEV Plus(Promega, USA)를 사용하여 components를 모은 후 sample을 30°C incubator에서 6시간 동안 방치하고 다시 -20℃에서 유지시켰다.
준비된 단백질 시료는 SDS-PAGE를 수행한 후 gel을 떼어내어 그 위에 PVDF membrane (Bio-Rad)을 올리고 transfer caster에 조립하여 transfer buffer (192mM glycine, 25mM Tris, 20% methanol)를 채운 상태에서 80 V로 1 시간 동안 수행하였다. 그 후 blocking buffer[5% skim milk, TBST (20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)]에 PVDF 막을 넣고 상온에서 1시간 정도 흔들면서 비특이적인 결합을 방지하였다. Blocking buffer에 1차 항체를 넣고 상온에서 1시간 30분 정도 흔든 후 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 반복하여 세척하였다. 다시 blocking buffer에 2차 항체를 넣고 1시간 동안 흔든 후 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 반복하여 세척하였다. ECL (enhanced chemiluminescence) kit의 solution A와 B를 1:1로 섞어 PVDF 막에 부어 준 후 1 분간 반응시켜 발색반응을 일으키고 암실에서 X-ray필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.
그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, pHSAft-5-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha (strain R4)에서 HSA-IL2 융합단백질의 분비 발현이 확인된 시료 4개에 ProTEV를 처리했을 때 13.4kDa 밴드만 나오는 것을 확인하였으며(#1~#4), HSA와 융합 발현된 단백질을 47.3kDa(#5~#8)에서 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, pHSAft-1-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha (strain B8)에서 HSA-IL2 융합단백질의 분비 발현이 확인된 시료에서 28kDa 크기의 HSA-IL-2 융합 단백질의 분비 발현이 이루어졌음을 확인하였고(도 5 (a)), 이 융합 단백질을 ProTEV를 처리하였을 때, 14 kDa 정도의 인터루킨-2가 분리되는 것(도 5 (b))을 확인하였다.
[실시예 5] 단백질 분비 발현 및 융합 단백질 분리 확인
pHSAft-1-IL-2 벡터로 형질전환된 H. polymorpha (strain B8) 균주로부터 생산된 HSA와 인터루킨-2 융합단백질을 분리하고 분리된 재조합 인터루킨-2단백질을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 정제된 시료를 0.45 ul 실린지 필터와 주사기를 이용하여 여과한 후 이를 HPLC [SIMADZU, Prominence, Japan]에 주사하여 확인하였다. HPLC 컬럼은 Vision HT C18 HL 5μ Length 250nm를 사용하였고 시간은 60분, 유속은 1.0 ㎖/min, 온도는 30℃, 파장은 280nm, ratio range 10으로 시료들을 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, HPLC를 이용하여 확인한 결과 30분 경과 후 표준 인터루킨-2(도 6(a))와 같은 위치에서 재조합 인터루킨-2(도 6 (b))가 분리되는 것을 확인하였다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC 18329P
수탁일자 : 2014.10.01
Figure PCTKR2015004787-appb-I000005

Claims (10)

  1. 메탄올 옥시다제 (Methanol oxidase) 프로모터; 인간 혈청 알부민 유전자 또는 이의 단편 유전자; 및 인터루킨-2 유전자를 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트(expression construct).
  2. 제1항에 있어서, 담배 식각 바이러스 위치(Tobacco Etch Virus site)를 더 포함하는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 메탄올 옥시다제 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨-2 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트.
  6. 제2항에 있어서, 담배 식각 바이러스 프로테아제 위치(Tobacco Etch Virus protease site)는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트.
  7. 제1항 내지 제6항에 따른 효모용 인터루킨-2 발현 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 효모.
  8. 제7항에 따른 효모는 메탄올 자화 효모인 형질전환 효모.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 메탄올 자화 효모는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candia boidini), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica) 또는 오가테아 미누타(Ogataea minuta) 중 선택된 어느 하나인 형질전환 효모.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환 효모는 KCTC 18329P 인 형질전환 효모.
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