CN112457391B

CN112457391B - 猪干扰素α、β、λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法及其应用

Info

Publication number: CN112457391B
Application number: CN202011204523.XA
Authority: CN
Inventors: 黄金海; 施靓轩; 郭艳余; 张丽琳
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-11-02
Also published as: CN112457391A

Abstract

本发明公开了一种猪干扰素α、β、λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法及其应用，其包含IFN‑α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN‑β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN‑λ1蛋白的20位至192位氨基酸，优选除原始信号肽以外的完整功能域。将体外构建猪干扰素α、β、λ1蛋白的截断体完整转录单位GPD‑(IFN‑α)‑TU、GPD‑(IFN‑β)‑TU、GPD‑(IFN‑λ1)‑TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用酿酒酵母α因子信号肽将猪IFN‑α、IFN‑β、IFN‑λ1蛋白分泌至发酵液上清，获得猪IFN‑α、IFN‑β、IFN‑λ1蛋白分泌表达型的重组酵母菌株JDY52‑(IFN‑λ1+IFN‑β[IV]/IFN‑α[XVI])，并利用所得菌株发酵液上清制备重组干扰素。本发明的分泌型重组酵母成本低廉、生产使用安全、操作简便、安全有效，具有I、III型IFN生物活性，且下游抗病毒蛋白功能良好，为猪广谱抗病毒防控以及猪重组干扰素制备提供选择。

Description

猪干扰素α、β、λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种猪干扰素α、β、λ1的表达方法，特别是指一种在酿酒酵母菌表达系统中共同表达猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1的方法及其应用。

背景技术

近年来，我国的养猪业迅速发展，养猪模式也从传统养殖向规模化、集约化模式转变，猪的疾病，尤其是病毒性疾病严重危害着我国畜牧业发展，部分人畜共患病毒病直接危害着人类的健康。对于蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等疾病，由于免疫程序、疫苗本身、生长环境和不同动物个体等原因，使疫苗免疫效果往往不理想，加之病毒不断变异，接种预防作用越来越不明显，目前还没有高效疫苗来预防病毒的蔓延。另一方面疫苗预防也存在干扰素基因常处于静止状态，在病毒等因素的诱导下才能表达，且表达量极微，难以直接提取纯化，天然干扰素难以大量制备。注射普通干扰素半减期很短，在血药浓度的低谷期正值病毒复制恢复期，易产生抗药性。并且注射用长效IFN会产生高额生产及人力成本，同时很多地区存在抗生素滥用的现象，造成一些抗药菌株的产生，给疾病预防和人类健康造成极大危险。因此，一种可兼顾普通干扰素的低成本与长效干扰素的循环时间长、长期积累至稳定浓度，极少出现抗药性的且对环境无污染的生物制剂对于预防和治疗猪病毒病迫在眉睫。干扰素具有广谱的抗病毒活性，可以有效抑制病毒的复制，经典高效的IFN-α配合IFN-β与IFN-λ联用在生产应用方面前景广阔。

干扰素(interferon，IFN)是一组具有抗病毒、影响细胞生长、分化和调节免疫功能活性的蛋白质。因为最初发现病毒能诱导一些细胞产生具有“干扰”病毒复制作用的蛋白质，所以将这一类蛋白质称为干扰素^[1]。干扰素是最早发现、研究最多、第一个被克隆、第一个用于临床疾病治疗的细胞因子。

IFNs目前可分为三类：I型、II型和III型，I型IFN包括所有IFN-αs,IFN-β,IFN-ε,IFN-κ,IFN-ω和IFN-τ，其中IFN-α主要由白细胞产生，IFN-β主要来自成纤维细胞，它们具有相似的生物学活性，结合同样的细胞受体。III型IFN包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，并被证明与白细胞介素-10(IL-10)结构相似^[2,3]。第四种III型IFN,IFN-λ4，于2013年被发现，与丙型肝炎病毒(HCV)感染清除能力受损有关^[4]。第二类IFN类只有一个成员：IFN-γ，主要由T细胞和NK细胞产生且生物学活性与I、III型干扰素明显不同。符合经典的一个配体与一个受体的模型，本发明将只集中在I型和III型干扰素。

每类IFN-I型、II型和III型-信号通过不同的异二聚体受体，并通过Janus激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)信号通路诱导下游基因表达：(1)I型干扰素与IFNAR受体复合物(由IFNAR1和IFNAR2组成)结合、III型干扰素与IFNLR受体复合物结合(包括IIFNLR1和IL-10Rβ)。(2)干扰素与任何一种受体复合物的结合都会导致JAK1和TYK2在受体亚基的胞质结构域上交叉磷酸化。磷酸化后触发STAT1和STAT2的磷酸化。(3)随后这些STAT形成各种复合物转移进入细胞核，它们在ISG启动子上结合IFN刺激的反应元件(ISREs)或γ激活序列(GASs)，与这些启动子元件的结合导致数百个参与抗病毒反应的基因的转录，其中包括ISGs、IFNs、IRFs和STATs^[5-10]。

I型干扰素表现出广泛的生物活性:抗病毒、抗增殖、刺激对多种免疫系统细胞的细胞毒活性，在养猪业，干扰素α被用于治疗猪的病毒性疾病，起初主要用作猪瘟的治疗。近年被大量用于其他的疾病，包括流行性腹泻，传染性胃肠炎，轮状病毒病和蓝耳病等。但只以I型干扰素中的IFN-α为主，并没有筛选协同效应的抗病毒谱及干扰素配伍组方，时空效果更为单一。

III型干扰素的作用已在一些病毒感染过程中得到评估，作为局部粘膜免疫的主力军，但大部分研究仅限于人类与小鼠，且应用不广。在黏膜免疫中，I型和III型干扰素的冗余和独特作用也得到了研究。病毒趋向性是每种IFN类型相对作用的主要决定因素。肠上皮细胞更偏向对III型IFN^[11]产生初始应答，III型干扰素限制肠道上皮细胞的初始复制，减少病毒通过粪便的排出，但I型IFN系统对于预防全身感染是必不可少的。因此，两种IFN系统都以非冗余方式控制呼肠孤病毒感染^[12]。同样，在诺如病毒感染中，I型IFN限制病毒的全身传播，但只有在III型IFN信号传导存在的情况下，病毒才能在胃肠道中得到控制^[13]，但I型和III型IFN在肺部的分工则不像在肠道中那样严格，但也遵循了类似的模式，其反应可能以III型IFN为主。然而，一旦免疫细胞开始产生IFN，反应可能会转向由I型IFN驱动^[14]。因此I型和III型IFN的协同联用很有必要且前景广阔，且近年来并无同时表达I型和III型IFN的菌株构建，所以高效且能共同表达I型和III型IFN的酵母菌株在工业生产中可兼顾成本、保存、产品活性、配比等一系列要求。

酵母作为工程受体菌近年来发展迅速，相对于大肠杆菌而言，酵母具有更完善的基因表达调控机制和翻译后加工修饰能力和分泌能力，且不产生内毒素，是良好的真核基因受体菌。酵母具有基因操作相对简单，外源蛋白加工与修饰正确、表达量高、易于纯化、适于大量发酵培养等优点。且根据原核生物蛋白进行产物特异性设计，靶DNA与真核基因调控基因无同源性，因此不存在基因的非特异性影响，能够严格控制基因的表达，而人为地调控基因的表达情况以高效的诱导基因表达也是其他系统所不及之处。巴斯德毕赤酵母是常用的重组蛋白表达的宿主菌之一。用于转化毕赤酵母的重组质粒为穿梭质粒，含有大肠杆菌的复制起始点，但是这类质粒无法在毕赤酵母中复制并稳定存在，只有将重组表达载体整合入酵母基因后才能稳定存在。因此对于外源基因的转入、转入的染色体不同、内源蛋白酶活性、宿主菌的种类和状态等因素都能影响外源蛋白在酵母中的表达效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种可高效共表达猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1的猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法，该方法是构建含有猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1酵母表达元件载体，将构建的重组表达元件片段以同源重组形式整合至酿酒酵母不同染色体上(IFN-β、IFN-λ1位于IV号染色体，IFN-α位于XVI号染色体)，获得重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因得到表达。

一种表达猪干扰素α、β、λ1蛋白的重组酵母，JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])，其包含IFN-α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN-β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN-λ1蛋白的20位至192位氨基酸。

一种猪干扰素α、β、λ1蛋白的截断体，优选为IFN-α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN-β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN-λ1蛋白的20位至192位氨基酸，序列特征为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3，为包含除原始信号肽以外的完整功能域。

表达所述蛋白截断体的基因，其特征在于，包含酿酒酵母α-Factor片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.4以及猪干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白的除原始信号肽以外的完整结构域，即IFN-α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN-β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN-λ1蛋白的20位至192位氨基酸，即IFN-α蛋白的70位至570位碱基、IFN-β蛋白的64位至561位氨基酸、IFN-λ1蛋白的58位至576位氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7。

构建所述分泌型酿酒酵母的转录元件所在重组质粒命名为GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU，由权利要求3所述基因片段和POT-RFP、GPD、ADH1片段组成。

制备表达猪干扰素α、β、λ1蛋白的重组酵母的方法，其特征在于，将体外构建的猪干扰素α、β、λ1蛋白的截断体完整转录单位GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用酿酒酵母α因子信号肽将猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌至发酵液上清，获得猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌表达型的重组酵母菌株JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])，并利用所得菌株发酵液上清制备重组干扰素。

得到一种共表达猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白的重组酿酒酵母，JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])

具体包括以下步骤：

(1)猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因的PCR扩增：参考参考猪IFN基因序列NM_214393.1、NM_001003923.1、FJ853390.1设计扩增引物，后续连接至PET28a原核表达载体，序列特征为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7；以PET28a原核表达载体质粒为模板，设计引物扩增IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因(IFN-α)、(IFN-β)、(IFN-λ1)用于酵母载体连接；

(2)包含完整转录单位的重组质粒构建：酿酒酵母α-Factor基因与IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因(IFN-α)、(IFN-β)、(IFN-λ1)拼接:，overlap方法所用引物序列特征为IFN-α(A1：SEQ ID No.8、A2：SEQ ID No.9、B1：SEQ ID No.10、B2：SEQ ID No.11)、IFN-β(A1：SEQ ID No.8、A2：SEQ ID No.12、B1：SEQ ID No.13、B2：SEQ ID No.14)、IFN-λ1(A1：SEQ ID No.8、A2：SEQ ID No.15、B1：SEQ ID No.16、B2：SEQ ID No.17)；通过BsmBI单酶切线性化POT-RFP、GPD、ADH1载体，T4DNALigase拼接IFN-α、IFN-β、IFN-λ1各自基因片段和线性化POT-RFP、GPD、ADH1片段成分泌表达载体。获得重组质粒GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU。重组质粒转化至E.coli DH5a中，用IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(3)猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌表达型的重组酵母菌株的构建：以POT1-F/R为引物(序列特征为POT1-F：SEQ ID No.18、POT1-R：SEQ ID No.19)，POT-GPD-(IFN-λ1)-TU为模板，扩增IFN-λ1的转录单位，以POT2-F/R为引物(序列特征为POT2-F：SEQ ID No.20、POT2-R：SEQ ID No.21)，POT-GPD-(IFN-β)-TU为模板，扩增IFN-β的转录单位，不同的引物在转录单位的两端按加入不同的前后缀序列，使片段进行顺次连接，IFN-λ1在前，IFN-β在后。将IFN-λ1+IFN-β串联转录单位与同源臂质粒(URR1和URR2)和筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，将POT-GPD-(IFN-α)-TU与同源臂质粒(SUR-TU和SUR-TD)和筛选标签Trp编码序列进行酶切拼接，获得完整的分别包含IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot进行蛋白表达水平验证。

共表达猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白的重组酿酒酵母在制备用于抗猪病毒性疾病制剂中的应用。

本发明中将体外构建的猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1完整转录单位GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU，通过醋酸锂转化法同源重组共同整合于酵母基因组，选择原用于毕赤酵母分泌表达的Ppic9k载体中编码α因子信号序列的255bp，使目的蛋白分泌表达，目的蛋白的多肽直接存在于发酵液的上清中，不必破碎细胞，大大简化了分离纯化的工序，降低生产成本。再者，酿酒酵母为安全菌株，其表达产物易于达到各类应用所需的安全要求，可广泛应用于食品、医药、动物营养及美容保健等领域。

本发明中所述的共分泌表达猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白的重组酿酒酵母在国内属首次报道，高效多蛋白共分泌菌株构建具有一定的创新性，为猪病毒性疾病使用干扰素防控提供了新思路。

附图说明

图1：猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因PCR扩增结果；A图泳道3-4为IFN-α；B图泳道1为IFN-λ1，泳道5为IFN-β；

图2：目的基因IFN-α、IFN-β、IFN-λ1与酿酒酵母信号肽α-Factor拼接结果；A图泳道3-6分别为α-Factor、IFN-α、α-Factor+IFN-α，泳道7-10分别为α-Factor、IFN-β、α-Factor+IFN-β；B图泳道3-6分别为α-Factor、IFN-λ1、α-Factor+IFN-λ1；

图3：GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU完整转录单位拼接模式图；

图4：构建GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU质粒转化大肠杆菌后的转化子检测；1-9泳道分别代表IFN-α、IFN-β、IFN-λ1不同的大肠杆菌转化子菌落PCR检测结果，13-15泳道是以猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因PCR产物为模板的扩增，10-12泳道为ddH2O对照；

图5：GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU完成共转酵母转化后在SD-leu-trp培养基中的生长情况；A为酵母转化后生长情况；B为9号、15号菌落划线纯化后生长情况；

图6：JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])重组酵母的基因型验证；测序正确的转化子进行酵母转化后验证三种基因型；泳道1-18分别为18个不同的酵母转化子；挑选9号、15号重组酵母菌株保存；

图7：JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])酵母菌株的Western blot验证；泳道10为图6中9号酵母转化子JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])共表达酵母菌株36h时的蛋白表达情况；

图8：JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])重组酵母的生长曲线及其与蛋白表达趋势的关系；A图为9号菌体的生长曲线，以JDY52为对照，表达蛋白的菌株生长趋势与对照组一致；B图为9号、15号菌株不同培养时间点的蛋白表达情况分析；

图9：重组蛋白的生物活性检测及诱导受体能力检测；A图为重组蛋白对下游抗病毒蛋白mRNA水平的调控情况；B图为重组蛋白对I、III型干扰素受体mRNA水平的调控情况；C图为单重组蛋白、复合重组蛋白对I、III型干扰素受体mRNA水平的对比调控情况；

图10：重组蛋白抑制VSV、PRRSV复制的能力；A图为复合重重组蛋白抑制VSV、PRRSV复制的情况；B图为单重组蛋白、复合重组蛋白抑制PRRSV复制的情况；C图为单重组蛋白、复合重组蛋白抑制VSV复制的情况；

图11：信号肽与目的基因Overlap方法示意图。

具体实施方式

以下结合实例进一步阐述本发明，其中的内容不应理解为限定该发明的范围。实施例中所述试剂除特别说明，均为商业化试剂。

实施例1.GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU载体的构建

(1)猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因的扩增

在NCBI上找到猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因序列，参考猪IFN基因序列NM_214393.1、NM_001003923.1、FJ853390.1设计扩增引物，扩增后连接至PET28a原核表达载体

PCR扩增体系为：

使用以下PCR程序进行扩增：

PCR反应程序

95℃ 5min；

95℃ 30S，58℃30S，72℃60S，运行35个循环；

72℃ 10min；

PCR产物大小分别为IFN-α：570bp、IFN-β：561bp、IFN-λ1：576bp

PCR结果如图1所示，图1A的3、4号泳道为IFN-α，图1B的1号泳道为IFN-λ1，5号泳道为IFN-β。

(2)GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU载体的构建

①目的基因IFNs与信号肽连接

本发明构建可以将IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌表达的酵母菌株，因此需要在IFN基因的前端连接信号肽，使蛋白可以分泌到酵母细胞外。我们选择酿酒酵母信号肽α-Factor作为IFN蛋白的信号肽，使用overlap的方法将信号肽和IFN基因连接。首先设计overlap的引物IFNs-A1/B1/A2/B2并通过B1引物删除IFNs的N端天然信号肽，通过B2引物在IFNs基因的C端加上His标签，然后利用PCR将两部分连接到一起，连接示意如图11；overlap方法所用引物序列特征为IFN-α(A1：SEQ ID No.8、A2：SEQ ID No.9、B1：SEQ ID No.10、B2：SEQ ID No.11)、IFN-β(A1：SEQ ID No.8、A2：SEQ ID No.12、B1：SEQ ID No.13、B2：SEQ IDNo.14)、IFN-λ1(A1：SEQ ID No.8、A2：SEQ ID No.15、B1：SEQ ID No.16、B2：SEQ ID No.17)

首先利用IFNs-A1/B1和IFNs-A2/B2分别扩增信号肽α-Factor和IFNs基因，PCR体系如下

使用以下PCR程序进行扩增：

PCR反应程序

95℃ 5min；

95℃ 30S，58℃30S，72℃1min，运行35个循环；

72℃ 10min；

运行结束后取PCR扩增后的产物，进行PCR，体系如下。

体系混匀后运行以下PCR程序：

95℃ 5min；

95℃ 30S，57℃60S，72℃60S运行10个循环；

72℃ 10min。

程序运行完后将反应管取出，加入1μL的IFNs-A1和IFNs-B2，接着运行上述程序25个循环，产物用1％的琼脂糖凝胶检测，如图2A的3、4、5、6号泳道分别为a-Factor、IFN-λ1和二者的拼接片段；7、8、9、10号泳道为a-Factor、IFN-β和二者的拼接片段；图2B的3、4、5、6号泳道分别为a-Factor、IFN-α和二者的拼接片段；使用TSINGKE的DNA凝胶回收试剂盒回收连接好的片段，回收产物保存于-20℃，用于后续实验。

②转录单位的构建

利用Yeast Fab Assembly的方法在体外构建IFN-α、IFN-β、IFN-λ1的完整转录单位。构建转录单位所需要的元件分为三类：启动子(PRO)，开放阅读框(ORF)，终止子(TER)。这三个部分分别承载于各自的载体上，载体来源于质粒pSMART-HCKan。为了能够使不同元件顺次连接，不同元件的前后具有4个碱基的特异序列，BsmBI单酶切后会出现4个碱基的粘性末端。元件顺次连接后会与POT-RFP载体连接，替换载体上的RFP单位，使载体转化后的菌落由红色变为白色(如图3)，提高筛选效率。

转化E.coli DH5α。大肠杆菌转化子经Amp抗性平板筛选，并用IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因检测引物IFNs-A1和IFN-α-B2、IFN-β-B2、IFN-λ1-B2进行PCR验证及测序。

结果如图4所示，PCR扩增产物大小为IFN-α：774bp、IFN-β：771bp、IFN-λ1：792bp，阳性转化子为No.1-9号，选择其中2号，5号和9号测序，与预期结果一致，表明POT-GPD-(IFN-α)-TU、POT-GPD-(IFN-β)-TU、POT-GPD-(IFN-λ1)-TU质粒构建成功，质粒图谱如图3。

实施例2.猪干扰素酵母重组菌株JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])的构建及检测

(1)酵母转化片段的构建

①串联IFN-λ1+IFN-β转录单位

利用Yeast Fab Assembly的连接方法，设计引物POT1-F/R(序列特征为POT1-F：SEQ ID No.18、POT1-R：SEQ ID No.19)和POT2-F/R(序列特征为POT2-F：SEQ ID No.20、POT2-R：SEQ ID No.21)，分别PCR扩增IFN-λ1和IFN-β的转录单位，酶切连接，酵母转化。

以POT1-F/R为引物，POT-GPD-(IFN-λ1)-TU为模板，扩增IFN-λ1的转录单位，以POT2-F/R为引物，POT-GPD-(IFN-β)-TU为模板，扩增IFN-β的转录单位，不同的引物在转录单位的两端按加入不同的前后缀序列，使片段进行顺次连接，IFN-λ1在前，IFN-β在后。

PCR扩增体系如下

体系混匀后运行以下程序：

95℃ 5min；

95℃ 30S，58℃30S，72℃2min，运行35×循环；

72℃ 10min；

运行完后用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后用TSINGKE的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收，用于后续的酶切连接。

②IFN-λ1+IFN-β串联转录单位与IFN-α共酵母转化

用BsaI酶切IFN-λ1+IFN-β串联转录单位，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(URR1和URR2)和选择性标记质粒(LEU)。用BsaI酶切POT-GPD-(IFN-α)-TU，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(SUR-TU和SUR-TD)和选择性标记质粒(Trp)。参照Dai课题组的实验步骤^[15]，将URRs同源臂、LEU选择性标签、IFN-λ1+IFN-β串联转录单位，按照特异性前后缀序列进行拼接，同样将SURs同源臂、TRP选择性标签、POT-GPD-(IFN-α)-TU转录单位，按照特异性前后缀序列进行拼接T4连接酶16℃过夜连接，拼接产物共同用于酵母转化。

(2)JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])重组酿酒酵母菌株的构建

①菌株活化：挑取JDY52单菌落接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1：50的比例转接到5mL新鲜的YPD培养基中，使其初始OD为0.1～0.2，30℃、220rpm培养至OD600为0.5～0.8。2500rpm离心5min收集5mL菌液的菌体，并用1mL无菌水洗涤细胞，弃去上清。

②酵母转化：向离心后的菌体沉淀中加入100μL 0.1M的醋酸锂，重悬细胞，12000rpm离心20s弃去上清。加入50μL 0.1M醋酸锂，重悬细胞，12000rpm离心20s收集菌体。然后在离心管中依次加入240μL 50％的PEG4000、36μL 1M醋酸锂、100μg鲑鱼精DNA、2μg片段DNA，剧烈震荡至完全混匀。30℃ 200rpm 30min，42℃ 25min，6000rpm离心15s收集菌体，去除转化液，加入1mL的YPD液体培养基于30℃孵育2h，2500rpm离心5min收集菌体，用50μL去离子水重悬细胞，尽可能温和的吹吸混匀，将菌体涂布在SD-leu-Trp固体培养基表面，30℃培养箱生长2～3天，直至形成典型菌落(如图5)。挑取单菌落在SD-leu平板划线纯化，同步接种至3mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜培养，用于基因型验证。

③JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])菌株的基因型验证

选择在SD-leu-Trp培养基中生长的酵母，提取其基因组PCR验证IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因是否成功整合到基因组。酵母基因组的提取方法参照文献进行^[16]。取100μL培养后的菌液6000rpm离心1min弃去上清，用100μL裂解液(200mM LiOAc,1％SDS)重悬细胞，70℃孵育5min.加入300μL无水乙醇混匀，于15000g离心3min收集细胞碎片。70％乙醇清洗后加入50-100μL ddH₂O重悬沉淀。15000g离心15s后吸取上清作为基因组模板进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：

使用以下PCR程序进行扩增：

体系混匀后运行以下程序：

95℃ 5min；

95℃ 30S，58℃30S，72℃2min，运行35×循环；

72℃ 10min；

以基因组DNA为模板进行PCR扩增验证。

实验结果如图6所示，质粒POT-GPD-(IFN-α)-TU、IFN-λ1+IFN-β串联转录单位经酶切、连接后转化酵母细胞，三种基因皆成阳性的转化子概率很高，最后挑选9号和15号为基因型正确的重组酵母菌株JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])并编号为No.9号和No.15号

④JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])菌株的表型验证

由于GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU载体插入片段IFN-α、IFN-β、IFN-λ1的C端带有His标签，利用Western blot抗His抗体检测目的基因IFN-α、IFN-β、IFN-λ1的表达情况。

Western Blot:

挑取划线纯化的单菌落于3mL的YPD中，220rpm 30℃培养12h。

将培养好的菌液按1：50的比例转移到20mL的YPD中，220rpm 30℃培养48h，取1mL菌液于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，留上清。

取酵母菌液上清80μL加入20μL 5×的SDS上样缓冲液，沸水煮10min制样，12000rpm离心1min。

电泳

将配置好的胶置于电泳槽内，加入蛋白Marker以及样品，先用80V恒压30min跑浓缩胶，再用120V恒压60min跑分离胶。SDS-PAGE电泳结束后，通过湿转法将蛋白分离胶转移至与其同等大小的PVDF膜上，转膜条件为300mA 100min；转膜完成后，在室温下，用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜1h；将膜完全浸没在用5％BSA 1:2000稀释的鼠抗His单克隆抗体(HT501,Transgene)中，4℃孵育过夜；回收一抗，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min；用5％BSA 1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗(LK2003,Sungene Biotech)室温孵育1h；TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次；避光向PVDF膜正面滴加化学发光显色底物(34075,ThermoFisher)，通过Bio-rad化学发光成像仪曝光，观察蛋白表达情况。如图7的10号泳道，36h时3种目的蛋白量表达显著。

⑤JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])菌株的生长及蛋白表达规律

取JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])菌株9号转化子单菌落，接种于20mLYPD液体培养基中，起始时间点为0h，间隔12h取样2mL进行OD₆₀₀测定，并以最初时间点菌量最低值为标准，调整菌体量一致，制备24h、36h、48h时间点的蛋白样品，进行Western blot检测。

结果如图8A所示，生长曲线分析，IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白的表达对菌体的生长没有影响，菌体生长趋势与对照组一致，随培养时间的延长菌体量逐渐增加。同时，蛋白的表达量也随培养时间的延长而增加，培养36h时表达量最高(图8B)。

实施例3.分泌表达猪干扰素JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])重组酵母的制备

以JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])No.9号菌株为种子，取单菌落接种20mL YPD液体培养基，30℃培养过夜，再取过夜培养的种子液以1:100稀释接种至新鲜的1LYPD液体培养基中，培养36h后离心去除菌体，收集发酵液上清，用0.45μm的滤膜过滤后，用0.1mol/L PBS(Ph7.2)充分透析。用0.22μm的滤膜过滤除菌，至4℃保存。

实施例4.重组蛋白的生物活性检测及诱导受体能力检测

本发明利用RT-qPCR技术，通过测定经单重组蛋白或复合重组蛋白刺激后的IPEC-J2细胞中ADAR1、MX1、ISG15、CH25H、PKR、OAS1、Viperin和ZAP抗病毒基因的表达情况，以及I、III型干扰素受体表达来比较重组酿酒酵母分泌表达的不同重组蛋白的细胞刺激活性差异，同时设立了空白对照。

具体方法为：

实验组：当IPEC-J2细胞长至铺满6cm细胞培养皿底部时，更换新鲜细胞培养液(3mL)，然后将重组酿酒酵母分泌表达得到的重组蛋白样品(pIFN-λ1+β+α)分别加入不同细胞培养皿中，重组蛋白的加入量为10ug，小心混匀后放入CO2培养箱中继续培养24h后取出，分别抽提细胞总RNA。

空白对照：除细胞培养皿中不加入重组蛋白外，其他与实验组处理一致。

Trizol法提取IPEC-J2细胞总RNA

1)取出细胞培养皿，弃去培养皿中的细胞培养液，加入3mL 1×PBS洗涤培养皿2次，弃净PBS溶液；

2)加入1mL的Trizol，用移液器反复吹打，使细胞从培养皿底部脱落，将裂解液转入1.5mL离心管，继续吹打至无明显沉淀，静置5min；

3)往离心管中加入1/5裂解液体积的氯仿，剧烈震荡15s，充分乳化分相后，静置5min；

4)将离心管置于离心机中，12000r/min、4℃离心15min；

5)小心取出离心管，可看到内部液体分为3层：无色上清，中间白色蛋白层及下层红色有机相，小心将无色上清吸至另一离心管中；

6)加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min后醇沉2h

7)12000r/min、4℃离心10min，离心管管壁或底部通常出现白色胶状沉淀；

8)小心弃净上清，加入1mL75％乙醇溶液，上下颠倒离心管洗涤沉淀，12000r/min、4℃离心5min，弃净上清；

9)打开离心管盖，室温干燥至沉淀变透明，加入适量RNAse-free水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳检测所抽得的RNA质量，超微量分光光度计定量后，置-70℃冰箱保存待用。

RT-qPCR结果分析

RT-qPCR反应结束后，用Bio-Rad CFX Manager 3.0查看结果，待检基因相对表达量＝2-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝ΔCt处理组－ΔCt空白对照，ΔCt处理组＝处理组待检基因Ct－处理组内参基因Ct，ΔCt空白对照＝空白对照待检基因Ct－空白对照内参基因Ct，使用Graphpad prism 8软件对计算结果进行方差和显著性分析。

结合图9A，可知，和空白对照相比，复合重组蛋白样品(pIFN-λ1+β+α)处理组ADAR1、MX1、ISG15、CH25H、PKR、OAS1、Viperin和ZAP的表达水平分别上调了8.8倍、6.8倍、4.5倍、8.5倍、26倍、27倍、54倍、77倍，且诱导水平相对于单重组蛋、双重组蛋白处理具有显著的组合配伍效应，表现出了更强的诱导活性(图9C)；诱导受体IFNAR1、IFNLR1表达水平上调105倍、28倍(图9B)，均与空白对照组差异显著。表明本专利表达得到的复合重组蛋白pIFN-λ1+β+α可显著提高由I、III型IFN调控的下游功能基因的表达，具有良好的活性，并具有配伍效果。

实施例5.重组蛋白诱导下游抗病毒蛋白的抗病毒活性检测

利用RT-qPCR技术，通过测定经重组蛋白刺激后的IPEC-J2细胞、3D4/31细胞分别接毒(VSV\PRRSV)后，病毒mRNA表达情况比较重组酿酒酵母分泌表达的重组蛋白的细胞刺激产生的下游抗病毒蛋白活性差异，同时设立了空白对照。

IPEC-J2细胞、3D4/31细胞经重组蛋白样品(pIFN-λ1+β+α)处理12h后，按1％的比例接入VSV、PRRSV培养24h后取出，分别抽提细胞总RNA，接毒处理组除细胞培养皿中不加入重组蛋白外，其他与实验组处理一致，空白对照组2除细胞培养皿中不加入重组蛋白、毒外，其他与实验组处理一致。

由图10，可知，和空白对照相比，接毒处理组VSV、PRRSV的mRNA表达水平显著上调近80倍，经复合重组蛋白样品(pIFN-λ1+β+α)处理组接毒后与接毒处理组相比，VSV、PRRSV的mRNA表达水平明显下调；且与单重组蛋白、双重组蛋白相比(图10B，C)，有更强的抗病毒趋势。表明本专利表达得到的重组蛋白pIFN-λ1+β+α调控的下游功能基因表达后，产生的下游抗病毒蛋白具有良好的抗病毒活性。表明具有生物学活性的pIFN-λ1+β+α已成功表达并能分泌至发酵液中。

尽管本发明内容是结合上述实施例进行说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,本发明的范围由所附权利要求书限定，其他的任何在限定范围内所作的改变或修饰，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

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序列表

<110> 天津大学

<120> 猪干扰素α、β、λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 189

<212> PRT

<213> Susscrofadomestica

<400> 1

Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val Leu Leu Ser Cys

1 5 10 15

Asn Ala Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu

20 25 30

Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser

35 40 45

Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu

50 55 60

Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val

65 70 75 80

His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser

85 90 95

Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu

100 105 110

Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly

115 120 125

Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

130 135 140

Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser

145 150 155 160

Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser

165 170 175

Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys Glu

180 185

<210> 2

<211> 186

<212> PRT

<213> Susscrofadomestica

<400> 2

Met Ala Asn Lys Cys Ile Leu Gln Ile Ala Leu Leu Met Cys Phe Ser

1 5 10 15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Gln Gln Arg

20 25 30

Ser Ser Asn Leu Ala Cys Gln Lys Leu Leu Glu Gln Leu Pro Gly Thr

35 40 45

Pro Gln Tyr Cys Leu Glu Asp Arg Met Asn Phe Glu Val Pro Glu Glu

50 55 60

Ile Met Gln Pro Pro Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Val Leu Ile Ile

65 70 75 80

His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Gly Ile Leu Arg Arg Asn Phe Ser

85 90 95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Val Ile Lys Thr Ile Leu Val Glu Leu

100 105 110

Asp Gly Gln Met Asp Asp Leu Glu Thr Ile Leu Glu Glu Ile Met Glu

115 120 125

Glu Glu Asn Phe Pro Arg Gly Asp Met Thr Ile Leu His Leu Lys Lys

130 135 140

Tyr Tyr Leu Ser Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Arg Ser

145 150 155 160

Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe

165 170 175

Leu Asn Arg Leu Thr Asp Tyr Leu Arg Asn

180 185

<210> 3

<211> 191

<212> PRT

<213> Susscrofadomestica

<400> 3

Met Ala Thr Ala Trp Ile Val Val Leu Ala Thr Val Met Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ala Arg Ala Gly Pro Val Pro Thr Phe Lys Pro Thr Thr Thr Arg Lys

20 25 30

Gly Cys His Met Gly Gln Phe Gln Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Lys

35 40 45

Gly Phe Lys Lys Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Leu Phe Pro Arg Thr Arg Asp Leu Arg

65 70 75 80

Gln Leu Gln Val Trp Glu Arg Leu Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Asp

85 90 95

Leu Thr Leu Lys Val Leu Arg Ala Ala Ala Asp Ser Ser Leu Gly Val

100 105 110

Thr Leu Asp Gln Pro Leu Arg Thr Leu His His Ile His Val Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Cys Ile Arg Ala Gln Pro Thr Ala Gly Ser Arg Leu Gln Gly

130 135 140

Arg Leu Asn His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Thr Lys Lys Glu

145 150 155 160

Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe His Leu

165 170 175

Leu Val Arg Asp Leu Arg Ser Val Thr Ser Gly Asp Leu His Ile

180 185 190

<210> 4

<211> 255

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaaga 255

<210> 5

<211> 570

<212> DNA

<213> Susscrofadomestica

<400> 5

atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctac tcagctgcaa tgccatctgc 60

tctctgggct gtgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc 120

ctggcacaaa tgaggagaat ctctcccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga 180

tcccctcatg aggcttttgg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg 240

catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg 300

aatgagagcc tcctgcacca gttctgcact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa 360

gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc 420

ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc 480

ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac 540

ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga 570

<210> 6

<211> 561

<212> DNA

<213> Susscrofadomestica

<400> 6

atggctaaca agtgcatcct ccaaatcgct ctcctgatgt gtttctccac cacagctctt 60

tccatgagct atgatgtgct tcgataccaa caaaggagca gcaatttggc atgtcagaag 120

ctcctggaac agttgcctgg gactcctcaa tattgcctcg aagataggat gaacttcgag 180

gtccctgagg agattatgca accaccacaa ttccagaagg aagatgcagt attgattatc 240

cacgagatgc tccagcagat cttcggcatt ctcagaagaa atttctctag cactggctgg 300

aatgaaaccg tcattaagac tatccttgtg gaacttgatg ggcagatgga tgacctggag 360

acaatcctgg aggaaatcat ggaggaggaa aatttcccca ggggagacat gaccattctt 420

cacctgaaga aatattactt gagcattctg cagtacctga agtccaagga gtacagaagc 480

tgtgcctgga cagtcgtcca agtggaaatc ctcaggaact tttctttcct taacagactt 540

acagattacc tccggaactg a 561

<210> 7

<211> 576

<212> DNA

<213> Susscrofadomestica

<400> 7

atggctacag cttggatcgt ggtgctggcg actgtgatgc tggacttggc cagagctggc 60

cctgtcccca ctttcaagcc caccacaacc aggaagggct gccacatggg ccagttccaa 120

tctctgtcac cacaggagct gaagggcttc aagaaagcca aggatgcttt ggaagagtca 180

ctctcactga agaactggag ctgcagctct cccctcttcc ccaggacccg ggacctgagg 240

cagctgcagg tgtgggagcg cctcgtggcc ttagaggctg agctagactt gactctgaag 300

gtcctaaggg ccgcggctga ctcatccctg ggggtcaccc tggaccagcc acttcgcacg 360

ctgcatcaca tccacgtcga acttcaggct tgcatcaggg ctcagcccac ggcaggatcc 420

cggctccagg gccgcctcaa ccactggctg caccggctcc aagaagccac aaagaaagag 480

tcccaaggct gccttgaggc ctctgtgaca ttcaacctct tccacctcct cgtaagggac 540

ctgagaagtg ttaccagtgg agacttgcac atctga 576

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

agcgtgcgtc tcggatgatg agatttcctt caatttttac t 41

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

gtctgaggca ggtcacacat tcttttctcg agagatac 38

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

gtatctctcg agaaaagaat gtgtgacctg cctcagac 38

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

gtgctgcgtc tcagctatca gtggtggtgg tggtggtgct ccttcttcct gagtctgt 58

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 12

cgaagcacat catagctcat tcttttctcg agagatac 38

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 13

gtatctctcg agaaaagaat gagctatgat gtgcttcg 38

<210> 14

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 14

gtgctgcgtc tcagctatca gtggtggtgg tggtggtggt tccggaggta atctgtaagt 60

ct 62

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 15

ttgaaagtgg ggacagggcc cattcttttc tcgagagata c 41

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 16

gtatctctcg agaaaagaat gggccctgtc cccactttca ag 42

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 17

gtgctgcgtc tcagctatca gtggtggtgg tggtggtgga tgtgcaagtc tccactggt 59

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 18

agcgtgggtc tcgaccttca ttatcaatac tgccatttca aagaat 46

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<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 19

gtgctgggtc tcagcctccg gtagaggtgt ggtcaataag agc 43

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 20

agcgtgggtc tcgaggctca ttatcaatac tgccatttca aagaa 45

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<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 21

ggtcagggtc tctctcaccg gtagaggtgt ggtcaataag agc 43

Claims

1.一种表达猪干扰素α、β和λ1蛋白的重组酵母，JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])，其特征在于，其包含IFN-α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN-β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN-λ1蛋白的20位至192位氨基酸。

2.一种猪干扰素α、β和λ1蛋白的截断体组合物，其特征在于，为IFN-α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN-β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN-λ1蛋白的20位至192位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3，为包含除原始信号肽以外的完整功能域。

3.表达权利要求2所述蛋白截断体组合物的基因，其特征在于，包含酿酒酵母α-Factor片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.4以及猪干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白的除原始信号肽以外的完整结构域，即IFN-α蛋白的24位至190位氨基酸、IFN-β蛋白的22位至187位氨基酸、IFN-λ1蛋白的20位至192位氨基酸，即IFN-α蛋白的70位至570位碱基、IFN-β蛋白的64位至561位氨基酸、IFN-λ1蛋白的58位至576位氨基酸，其核苷酸序列为SEQID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7。

4.权利要求1所述重组酵母的质粒GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU和GPD-(IFN-λ1)-TU，序列特征为SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，由权利要求3所述基因片段和POT-RFP、GPD、ADH1片段组成。

5.制备猪IFN-α、IFN-β和IFN-λ1蛋白分泌表达型的重组酵母的方法，其特征在于，将体外构建的猪干扰素α、β、λ1蛋白的截断体完整转录单位GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用酿酒酵母α因子信号肽将猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌至发酵液上清，获得猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌表达型的重组酵母菌株JDY52-(IFN-λ1+IFN-β[IV]/IFN-α[XVI])，并利用所得菌株发酵液上清制备重组干扰素。

6.根据权利要求5所述制备猪IFN-α、IFN-β和IFN-λ1蛋白分泌表达型的重组酵母的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因的PCR扩增：参考猪IFN基因序列NM_214393.1、NM_001003923.1、FJ853390.1设计扩增引物，后续连接至PET28a原核表达载体，序列特征为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7；以PET28a原核表达载体质粒为模板，设计引物扩增IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因用于酵母载体连接；

(2)包含完整转录单位的重组质粒构建：酿酒酵母α-Factor基因与IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白编码基因拼接，overlap方法IFN-α所用引物序列特征为A1：SEQ ID No.8、A2：SEQIDNo.9、B1：SEQ ID No.10、B2：SEQ ID No.11、IFN-β所用引物序列特征为A1：SEQ IDNo.8、A2：SEQ ID No.12、B1：SEQ ID No.13、B2：SEQ ID No.14、IFN-λ1所用引物序列特征为A1：SEQID No.8、A2：SEQ ID No.15、B1：SEQ ID No.16、B2：SEQ ID No.17；通过BsmBI单酶切线性化POT-RFP、GPD、ADH1载体，T4DNALigase拼接IFN-α、IFN-β、IFN-λ1各自基因片段和线性化POT-RFP、GPD、ADH1片段成分泌表达载体；获得重组质粒GPD-(IFN-α)-TU、GPD-(IFN-β)-TU、GPD-(IFN-λ1)-TU；重组质粒转化至E.coli DH5a中，用IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(3)猪IFN-α、IFN-β、IFN-λ1蛋白分泌表达型的重组酵母菌株的构建：以POT1-F/R为引物，序列特征为POT1-F：SEQ ID No.18、POT1-R：SEQ ID No.19，POT-GPD-(IFN-λ1)-TU为模板，扩增IFN-λ1的转录单位，以POT2-F/R为引物，序列特征为POT2-F：SEQ ID No.20、POT2-R：SEQ ID No.21，POT-GPD-(IFN-β)-TU为模板，扩增IFN-β的转录单位，不同的引物在转录单位的两端按加入不同的前后缀序列，使片段进行顺次连接，IFN-λ1在前，IFN-β在后；将IFN-λ1+IFN-β串联转录单位与同源臂质粒URR1和URR2和筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，将POT-GPD-(IFN-α)-TU与同源臂质粒SUR-TU和SUR-TD和筛选标签Trp编码序列进行酶切拼接，获得完整的分别包含IFN-α、IFN-β、IFN-λ1基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot进行蛋白表达水平验证。

7.权利要求1所述重组酵母分泌表达猪IFN-α、IFN-β和IFN-λ1重组蛋白在制备抗病毒制剂的应用。