KR101493957B1 - 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드, 이를 발현하는 재조합 누에 배큘로바이러스 및 이의 제조방법 - Google Patents

민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드, 이를 발현하는 재조합 누에 배큘로바이러스 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 극동산 민물장어의 재조합 황체 형성 호르몬에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 누에유충 및 번데기 발현 시스템에서 누에 핵다각체병 바이러스를 이용하여 극동산 민물장어의 재조합 황체 형성 호르몬을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드, 이를 발현하는 재조합 누에 배큘로바이러스 및 이의 제조방법{Recombinant Lutinizing Hormone Polypeptide of Japanese eel, Anguilla japonica, Recombinated Baculovirus expressing it and Preparation Method Thereof}
본 발명은 극동산 민물장어의 재조합 황체 형성 호르몬에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 누에유충 및 번데기 발현 시스템에서 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 극동산 민물장어의 재조합 황체형성호르몬을 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재까지 여러 동물 및 어류에서 난포 자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)와 황체 형성 호르몬(Leutinizaing hormone: LH)에 관한 유전자가 클로닝 되어져 왔으며, 특히 당단백질 호르몬 중 FSH는 주로 초기 난성숙 과정 때 분비되어 난모세포 성장에 작용하며 LH은 최종 성숙 및 배란에 주로 관여하는 것으로 알려져 있다.
민물 장어(Anguilla japonica)는 인위적인 사육 환경하에서 뇌하수체(pituitary gland)내의 생식선자극호르몬(gonadotropin, GTH) 합성능력이 부족해 생식소 발달이 어려워, 인위적 성성숙 유도를 위한 호르몬제 투여가 필요하므로 GTH의 대량생산이 시급하다.
이러한 민물 장어의 인위적 성성숙 유도에 이용되는 호르몬제는 타종(연어, Oncorhynchus keta) 뇌하수체, 예를들어 연어뇌하수체 추출물(salmon pituitary extracts, SPE)를 고농도 및 반복투여를 통해 성성숙을 유도하고 있지만 염색체 이상, 난질 및 수정률 저하, 기형어 유발 등의 문제가 발생하기 때문에 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 분자생물학적 방법을 이용한 민물장어 GTH의 대량생산 및 호르몬제로의 개선기술이 요구된다.
연어 뇌하수체 추출물(SPE)를 대체할 물질 생산을 위해 다양한 재조합 단백질 발현 시스템들이 이용되고 있으며, 특히 단백질 활성과 밀접한 관련이 있는 당쇄수식, 즉 후기번역이 가능한 진핵세포(eukaryotic system) 시스템이 활용되고 있다.
그러나, 박테리아, 효모, 포유류유래세포(Chinese Hamster Ovary, CHO) 등에서 합성되는 재조합 호르몬은 저효율, 저농도, 고가 등의 문제가 있어 SPE의 효과이상을 기대하기 어렵다.
한편, 누에 발현 시스템(Silkworm Expression System)은 비교적 단시간에 저가, 당쇄수식된 고효율의 단백질을 다량확보가 가능하여 호르몬 관련 단백질 생산에 유리한 점이 있다.
또한, 민물장어의 성성숙 관련 유전자 및 단백질의 확보는 이들의 산업적 응용을 통하여 수입대체효과 및 수산관련 바이오산업의 활성화로 민물장어 양식업의 기반확충과 생산성 향상을 통해 산업경제적인 이익으로 이어질 수 있으므로 그 필요성이 커지고 있다.
대한민국 특허등록 제10-0375671호(단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법)
이에 본 발명자들은 기존에 민물장어의 성성숙 유도에 사용되는 연어뇌하수체 추출물을 대체할 수 있는 재조합 황체 형성 호르몬을 확보를 위해 예의 연구한 결과, 민물장어 황체 형성 호르몬의 알파 단체, 말 성성숙 호르몬의 C-말단 영역과 민물장어 황체 형성 호르몬의 베타 단체가 융합된 재조합 황체 형성 호르몬을 제조하고, 이를 배큘로바이러스를 이용하여 누에유충과 번데기 발현 시스템에서 고효율로 얻을 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 과제는 민물장어 황체 형성 호르몬의 알파 단체, 말 성성숙 호르몬의 C-말단 영역과 황체 형성 호르몬의 베타 단체가 융합된, 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 누에 유충 또는 번데기 발현 시스템에서 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 민물장어 성성숙 유도용 호르몬 조성물을 제공하는 것이다.
이를 위해 본 발명은 민물장어 황체 형성 호르몬의 알파 단체, 말 성성숙 호르몬의 C-말단 영역과 황체 형성 호르몬의 베타 단체가 융합된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 배큘로바이러스 전이 벡터에 클로닝하여 재조합 전이벡터를 제조하는 단계와, 상기 재조합 전이벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 백미드를 제조하는 단계와, 상기 재조합 백미드로 누에 세포를 형질감염시키는 단계와, 상기 형질감염된 누에 세포로부터 재조합 배큘로바이러스를 분리하는 단계와, 상기 분리된 재조합 배큘로바이러스를 유충 또는 번데기 생체에 주입하여 외래 단백질을 발현시키는 단계와, 상기 누에 유충 또는 번데기의 세포 또는 체액으로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 민물 장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 민물장어 성성숙 유도용 호르몬 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 누에유충, 번데기에서 대량 생산이 가능한 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 이용하여 전량 일본으로부터 수입하여 사용하고 있는 민물장어의 성성숙 유도물질인 연어 뇌하수체를 대체하여 민물장어 성성숙 유도에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 누에세포, 유충, 번데기 시스템에서 배큘로바이러스 벡터를 이용하여 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 유전자 염기서열을 포함하는 발현벡터의 구조도이다.
도 3은 벡터에 삽입 된 극동산 민물장어 LH-B와 a 사슬 및 말 유래의 LH-b의 C-말단의 핵산 및 아미노산 서열이다.
도 4는 His column을 이용하여 정제 전, 황체형성호르몬 발현을 확인하기 위해 실시한 누에세포시스템에서의 세포배양액과 용해물, 유충과 번데기의 혈액과 지방체 용해물을 정제 전에 전기영동 후 His 항체로 웨스톤 블롯 한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 유충, 번데기의 혈액과 지방체 용해물에서 His-tag이 포함된 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 His-Trap FF column으로 FPLC(AKTA Fast Protein Liquid Chromatography)로 분리한 분획물을 나타낸 그래프이다.
도 6은 분리, 정제된 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산 서열 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 세포, 유충, 번데기에서 최종 정제한 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드 정제물을 확인하기 위해 실시한 SDS-PAGE 결과이다.
도 8은 최종 정제 후 His-tag를 가진 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드 생산을 확인하기 위해 His 항체를 이용하여 실시한 웨스턴 블롯의 사진이다.
도 9는 각 누에 생산시스템에서 분리한 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 N-글라이코실레이션(N-Glycosylation)을 확인하기 위해 PNGaseF, EndoH 효소처리한 후 웨스턴 블롯으로 확인한 사진이다.
도 10은 분리한 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 수식된 단당류를 확인하기 위해 몇 가지의 렉틴 항체로 확인한 결과이다.
도 11은 LH-receptor가 도입된 CHO 세포에서의 분리한 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 활성을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 민물장어 황체 형성 호르몬 베타 단체를 코딩하는 뉴클레오타이드, 서열번호 3의 민물장어 황체 형성 호르몬 알파 단체를 코딩하는 뉴클레오타이드와 서열번호 4의 말의 성 성숙호르몬 C-말단 영역을 코팅하는 뉴클레오타이드를 포함하여 상기 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 제작되며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
또한 본 발명은 상기 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 포함한다. 바람직하기로 상기 재조합 배큘로바이러스는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상기 배큘로바이러스(baculovirus)는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성이 있는 곤충 병원성 바이러스를 총칭하는 의미이다. 배큘로바이러스는 크게 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus: NPV)와 과립병바이러스(Granulovirus: GV)로 나누어지며, 본 발명에서의 배큘로바이러스는 상기 핵다각체병 바이러스를 의미한다.
상기 재조합 배큘로바이러스는 곤충 세포에서의 목적 단백질, 즉 서열번호 1의 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 대량 발현 및 이의 효과적인 분리 및 정제를 개선하기 위해 제작된 것이다.
본 발명은 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 포함한다.
먼저, 본 발명의 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 배큘로바이러스 전이 벡터에 클로닝하여 재조합 전이벡터를 제조한다. 이렇게 제조한 재조합 전이벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 백미드를 제조한다.
본 발명에서 "배큘로바이러스 전이 벡터(baculovirus transfer vector)"는 다각체 단백질의 일부 또는 이의 변이체와 융합된 발현 목적 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 배큘로바이러스의 DNA 지놈으로 옮겨주는 역할을 수행하는 벡터를 의미하며, 일반적으로 배큘로바이러스의 발현 벡터와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에 따른 재조합 배큘로바이러스는 공지의 시판되는 전이벡터에 유전자를 삽입하고 이를 컨피턴트 세포 등에 형질전환시켜 제조될 수 있다. 상기 전이벡터의 구체적인 제조과정은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 수행하면 충분하며, 이에 따라 얻어지는 재조합 전이벡터는 BmDH10Bac 컨피던트 세포 등에 형질전환시켜 재조합 백미드를 형성하고, 형성된 백미드를 세포로부터 분리한다.
즉, 컨피던트 세포를 본 발명의 발현벡터로 형질전환하면, 발현 벡터와 백미드 사이에 전위가 발생되고, 결국 발현 벡터의 반복 서열 사이에 있는 DNA 서열이 백미드 내의 전위 부위에 삽입되어 재조합 백미드가 형성된다.
이렇게 형성된 세포 내의 재조합 백미드는 통상의 플라스미드 추출법을 이용하여 분리하고, 분리된 재조합 백미드는 이어 곤충세포 내로 형질감염된다. 상기 형질감염법은 당업계의 공지된 방법 등이 가능하다. 바람직하기로 상기 곤충세포는 누에(BmN) 세포를 이용한다.
형질감염된 곤충세포로부터 재조합 배큘로바이러스를 분리하고, 이를 누에 유충 또는 번데기 생체에 주입하여 형절전환하여 외래 단백질을 발현시킨다.
본 발명에서 민물 장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용되는 숙주번데기는 잠업분야에서 1986년에 보급종으로 지정되어 여름과 가을에 보급되어 활용되는 품종인 대성잠(잠125x잠126)을 이용하였다. 대성잠은 상엽육도 가능할 뿐 아니라 인공사료육에 적합한 계통이며, 강건하여 다량수확에 용이한 것으로 알려져 있는 누에장려품종이다. 특히 본 발명에서 발현 누에로 대성잠을 사용하였으나 경제적으로 재조합 단백질을 제조할 수 있는 계통이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
다음으로, 상기 누에 유충 또는 번데기의 세포 또는 체액으로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 민물 장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 분리, 정제한다.
이때 폴리펩타이드를 분리함에 있어서, 단백질의 분리에 일반적으로 사용되는 원심분리, 여과, 염석 또는 크로마트그래피법 등이 사용될 수 있다. 일예로, 누에 유충 또는 번데기의 세포, 지방체의 경우 이를 분쇄하거나, 세포 배양액과 번데기는 혈액을 침전시켜 얻어진 상등액으로부터 단백질을 용출한다.
단백질 용출은 상기 단백질의 생물학적 기능에 손상이 없고 마쇄를 통한 추출동안 단백질이 안정하게 존재할 수 있는 중성(pH 7-8), 20-50 mM정도의 인산(Phosphate acid buffer) 또는 트리스(Tris buffer)를 기본으로 해서 프로테아제 저해제; PMSF(Phenylmethane sulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), AEEBSF(4-2-aminoethyl-benzenesulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), Leupeptin(세린, 시스테인 프로테아제 저해제), Pepstatin(산성프로테아제 저해제), Chymostatin(카이모스립신 저해제) 몇 개의 프로테아제가 혼합되어 시판되는 protease inhibitor cacktail(Roche, Germany), 산화방지를 위한 환원제; 2-merchaptoethanol, DTT(Dithiothreitol), 금속 프로테에아제 저해를 위해 대표적으로 사용하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)에서 대표 PMSF, Protease inhibitor cocktail, 0.1 mM EDTA를 완충액을 사용한다.
분리된 폴리펩타이드는 his-tag 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 역상 HPLC 중 1종 이상의 방법으로 정제 할 수 있다.
이렇게 생산된 민물 장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드는 연산 민물장어의 호르몬에 유사한 Complex type의 N-glycosylation 수식을 가질 수 있으며, 갈락토스(galactose, Gal), N-acetylgalactose(GalNAc)가 수식된 O-glycosylation 수식을 가진 물질일 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명은 상기 서얼번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 민물장어 성성숙 유도용 호르몬 조성물을 제공한다.
본 발명의 민물장어 성성숙 유도용 호로몬 조성물은 종래 수입에만 의존하던 연어 뇌하수체를 대신하여 민물장어의 성성숙 유도에 이용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 민물장어 황체형성호르몬 LH -B, GTH -a, 및 말의 CTP 유전자 합성
극동산 민물장어 성성숙호르몬의 주체로 알려진 황체형성호르몬(LH)과 여포자극호르몬(Follicle Stimulating Hormone, FSH)은 a와 B 사슬로 구성되고 a 사슬은 공통이며 B 사슬이 자체 고유서열을 가지는 것으로 알려져 있다.
LH 재조합 단백질을 생산하기 위해 LH-B와 LH-a 및 말의 성성숙호르몬의 O-glycan 서열이 있는 C-말단(C-terminal sequences, CTS)의 81 서열을 재조합하였다.
목적서열로 선택한 LH-B 서열은 약 147개의 아미노산, LH-a 서열은 94개의 아미노산, 말의 CTS 서열은 27개의 아미노산서열을 가지고 있으며 CTS는 LH-B와 a서열의 중간에 위치하고 있으며, 성 성숙 호르몬 기능과 활성에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 또한 순수단백질 정제와 분리를 위하여 단백질 절단서열(TEV) 7개 아미노산과 His의 8개 아미노산 서열을 가지도록 하였다(도 2 참조).
따라서 목적분자로 LH-B, a, 및 CTP를 재조합 단백질로 발현 및 생산하기 위하여 재조합대장균에 맞는 코돈 형태로 변환하여 유전자 합성을 시도하였고 각각 합성된 각 유전자의 DNA 및 아미노산 서열을 나타내었다(도 3 참조).
실시예 2: 극동산 민물장어 황체형성호르몬 유전자 합성
극동산 민물장어 황체형성호르몬을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 뇌하수체에서 RNA를 분리하고 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 또한 당쇄 수식을 더하기 위해 말의 LH 베타의 C-말단 서열을 증폭하였다. 이미 보고되어 있는 LH유전자의 염기서열 NCBI(National Center for Biotechnological Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)을 참고하여 프라이머를 제작하였다.
극동산 민물장어 뇌하수체에서 분리한 황체형성호르몬 베타, 알파를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 뇌하수체 cDNA를 주형으로 하여 베타의 경우 정방향 5'-ATGTCAGTCTACCCAGAAT-3', 역방향 5'-CGCGGGGAGGCTGGCCCGC-3', 알파의 경우 시그널 펩타이드를 제외한 서열 증폭을 위해 정방향 5'-TTCTTATCCCAACAACGAA-3', 역방향 5'-AAATTTGTGGTAGTAGCAGGTGCGGCCGC-3'을 이용하여 PCR로 증폭하였다.
구체적인 PCR 반응조건은 50 ul로 조정하여 95 ℃에서 5분 처리 후, 95 ℃ 15초, 55 ℃ 15초, 72 ℃ 1분으로 총 31회 반복, 72℃ 5분 처리하여 두 유전자를 증폭하였다. 증폭된 산물은 베타 459 bp, 알파는 283 bp 단편을 얻었다.
또한 당수식을 넣기 위해 SEQ ID NO. 3의 말의 성성숙호르몬의 C 말단(C-Teminal Sequence, CTP)의 O-glycan 정방향, 역방향 프라이머를 이용하여 증폭하여 81 bp 단편을 얻었다(서열번호 4).
세 단편의 연결을 위해 먼저 LH-B와 CTP를 주형으로 하고 LH-B의 5' 서열과 CTP의 3' 서열을 프라이머로 하여 상기의 PCR 법과 동일한 방법으로 증폭하고, 증폭 된 산물과 LH-a를 주형으로 하고 LH-B의 5' 서열과 LH-a의 3' 서열 프라이머를 이용하여 동일한 PCR법으로 LH를 합성하였다. PCR을 수행한 후 아가로스 겔 전기영동을 통해 증폭된 유전자의 804 bp 크기를 확인하였으며 도 3에 나타난 바와 같은 아미노산을 포함한 유전자 LH-b/CTP/LH-a(JaLH) 서열을 완성하였다.
실시예 3: 배 큘로바이러스 재조합 벡터의 제작
PCR 반응을 통해 생산된 민물장어 황체형성호르몬 유전자를 재조합 대장균에 발현시키기 위해 재조합 벡터를 제작하였다.
먼저 JaLH 서열을 포함하는 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 TEV와 His 서열을 가지도록 수정된 pENTR 벡터(Invitrogen, USA)를 NcoI으로 절단 후 blunt를 실시한 후 다시 NotI으로 절단한 것과 JaLH 증폭 산물을 KOD 폴리메라제(ToYoBo, Japan)로 블런트 산물을 NotI으로 절단하여 서브 클로닝(sub-cloning) 하여 타깃유전자를 확보하고, DNA 시컨싱을 통하여(도 3)를 통하여 DNA 서열을 확인하였다.
올바른 DNA 서열이 확인된 pENTR(invitrogen, USA)에 클로닝 된 JaLH/TEV/His는 누에 NPV 후기발현유전자인 polyhedrin 프로모터와 NPV 삽입인식서열 Tn7 트랜스포존 영역을 가진 pDEST8(Invitrogen, USA)에 LR 반응(Invitrogen, 특정효소에 의해 특정염기서열을 인식하여 전위가 가능한 과정)에 의해 발현벡터에 서브클로닝 되었다.
구축된 발현벡터는 BmNPV 벡터(Maeda et al, 1989; Motohashi et al, 2005)에 Tn7 트랜스포존영역 인식에 의해 목적한 서열이 재조합되어 BmNPVD8JaLH/TEV/His 벡터가 구축되었다(도 2). 재조합 백미드를 작성하기 위해 BmDH10Bac(Motohashi et al, 2005) 컨피던트 세포가 사용되었다. 전기충격법에 의한 형질전환을 이용하여 BmNPVD8JaLH/TEV/His벡터가 BmDH10Bac에 삽입되도록 한 후, LB 배지 900 ul를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 진탕 배양 후, 테트라사이클린, 카나마이신, 암피실린 항생제가 함유된 고체 배지에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 타겟 유전자가 들어간 콜로니를 PCR법으로 선발하여 재조합 바이러스 생산에 이용하였다.
실시예 4: 누에 시스템에서의 재조합 황체 호르몬의 발현, 생산 및 정제
BmNPV DNA는 알카리법에 의해 분리되고 누에세포(BmN) 세포에 Fugene(Promega, USA) 도입하여 형질전환시킨 후, 이를 4일간 배양하여 JaLH를 생산하는 곤충세포를 제조하였다.
BmN 세포는 10% FBS를 포함하는 TNM-FH(WelGene, Korea) 곤충세포배지로 SPL(T-75, Korea) 플라스크를 이용하여 24-25 ℃에서 배양하였다. 플라스크의 70%정도에 세포배양이 완성되면 FuGENE HD(transfection regent, Promega, USA)를 이용하여 감염한 후 4일 후, JaLH를 발현하는 세포배양액을 확보하였다. 이와 같이 형질전환 누에세포에서 배양된 바이러스 용액은 8,000 rpm에서 10분간 원심에 의해 세포를 침전시킨 후, MILLEX AA 컬럼을 이용하여 필터과정을 거쳐 누에유충 및 번데기 감염바이러스로 제공하기 위해 4 ℃에 보관하였다.
누에유충 및 번데기에서 JaLH 발현은 재조합바이러스 0.5x105 PFU (Plaqueformingunit, 플라크형성단위)가 포함된 세포배양액 20 ul를 유충 및 번데기 1일에 실린저(Hamilton, USA)를 이용하여 주사하여 24-25 ℃에서 효소발현의 최대치가 되는 72시간까지 방치하였다. 이때 누에유충은 상엽으로 사육하는 반면, 번데기는 섭식을 하지 않는 상태이므로 주사 후 온도처리만으로 쉽게 JaLH를 얻을 수 있다.
단백질 용출은 상기 단백질의 생물학적 기능에 손상이 없고 마쇄를 통한 추출 동안 단백질이 안정하게 존재할 수 있는 중성(pH 7-8), 20-50 mM정도의 인산(Phosphate acid buffer)을 기본으로 해서 프로테아제 저해제; PMSF(Phenylmethane sulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), AEEBSF(4-2-aminoethyl-benzenesulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), Leupeptin(세린, 시스테인 프로테아제 저해제), Pepstatin(산성프로테아제 저해제), Chymostatin(카이모스립신 저해제) 몇 개의 프로테아제가 혼합되어 시판되는 protease inhibitor cacktail(Roche, Germany), 산화방지를 위한 환원제; 2-merchaptoethanol, DTT(Dithiothreitol), 금속 프로테에아제 저해를 위해 대표적으로 사용하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)에서 대표 PMSF, Protease inhibitor cocktail, 0.1 mM EDTA를 완충액을 사용하였다. 세포 및 번데기 지방체 세포의 마쇄를 위해 폴리트론 호모게나이저(polytron homogenizer)를 이용하여 28-30 pulse로 5초간 마쇄 하고 5초간 휴지하는 것을 5분간 지속하였다.
마쇄에 의한 열발생으로부터 단백질안정을 위해 저온에서 진행하였다. 세포 마쇄가 완료되면 13,000rpm에서 20분간 원심 하여 침전물과 지질을 제거하였다. 이 과정을 두 번 반복하여 진행한 후 MILLEX-AA 컬럼을 이용하여 불순물을 제거하였다. 세포배양액과 혈액의 경우, 혈액을 침전시켜 얻어진 상등액에 PMSF, Protease inhibitor cocktail, 0.1 mM EDTA를 첨가하였다.
도 4는 정제 전 세포 배양액과 세포 용출액(75 cm2 SPL T-플라스크 10개) 또 누에유충 및 번데기의 혈액(각 100마리)과 지방체(각 10마리)에서 JaLH을 His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 4를 참조하면, 누에세포시스템에서의 세포배양액(CM)과 용해물(CL), 유충과 번데기의 혈액(H)과 지방체 용해물(Fb)에서 모두 재조합 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다.
불순물 제거를 위한 1차 정제 후, 유충과 번데기의 체액 및 지방체추출물은 His-Trap FF column으로 FPLC(AKTA Fast Protein Liquid Chromatography, GE Health, USA)를 이용하여 고순도 정제를 수행하였다. 액체크로마토그래피의 운전조건은 유체속도 1ml/min, 샘플부피는 100ml로 조절하여 정제를 시도하였다.
도 5에 나타난 바와 같이 유충과 번데기의 각 체액 및 지방체 추출물 샘플분획에서 재조합 단백질을 확인하였으며 최종 유충은 16 mg/ml, 번데기는 8.3 mg/ml로 전체 수율은 130.46 mg, 번데기는 66.9 mg의 농도로 얻었다. 이는 BCA법으로 확인한 결과이다.
실시예 5: 정제된 폴리 펩타이드의 아미노산 서열 분석
정제된 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 서열분석기(모델 473A; Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 자동 에드만 절단방법에 의해 분석되었다. 정제된 단백질 N-말단의 1~5 번째 잔기의 서열분석을 수행한 결과는 다음과 같다:
NH2-SLLL(X)P-OH.
확인된 서열은 시그널펩타이드가 제거된 다음의 아미노산 서열로 시그널펩타이드 절단 후의 아미노산 서열부터의 재조합 단백질을 얻었음을 확인하였다(도 6).
실시예 6: 발현 단백질의 확인
누에유충과 번데기의 혈액과 지방체 추출물에서 분리, 정제한 JaLH는 12% SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 Coomassie Brillaiant Blue(CBB) 염색하여 약 36 kDa 단백질의 밴드를 확인하였다. 이는 예상 된 32.7 kDa의 사이즈보다 약 3 kDa 높았다(도 7).
이 정제된 단백질을 확인하기 위해 전기영동 한 겔을 니트로셀룰로스 종이에 전이하여 재조합 단백질에 특이적으로 반응하는 His 항체를 이용하여 면역 블로팅을 실시하여 특이 밴드를 확인하였다(도 8). CBB와 같은 사이즈인 약 36 kDa에서 확인되었다.
실시예 7: 발현 단백질의 당쇄 수식 확인
누에유충 및 번데기 시스템에서 분리한 단백질의 당쇄 확인을 위해 N-glycan을 가수분해하는 PNaseF와 EndoH 두 개의 효소를 이용하였다(도 9). N-linked 당단백질 염기서열은 아스파라긴산(asparagine acid, Asn)에 프로린산(proline acid, Pro)을 제외한 모든 아미노산과 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine)의 정해진 아미노산서열에 일치한다(Asn-X-S/T). PNaseF는 아스파라긴산과 N-acetylglucosamine 사이의 사슬을 자르며, complex, hybrid , high-mannose 타입의 모든 유형의 당단백질에 반응한다. EndoH는 아스파라긴산과 N-acetylglucosamine 다음의 사슬을 자르며 이는 hybrid, high-mannose 타입의 당단백질에 한해 반응한다.
세포와 유충시스템의 분비형 단백질의 경우 PNaseF에 잘리며 EndoH에는 잘리지 않았으나, 비분비형의 경우 두 효소에 모두 잘려진 것으로 분비형과 비분비형 LH의 유형이 다른 것으로 예측된다. 이에 반해 번데기 시스템에서 분리한 LH는 분비형(혈액)과 비분비형(지방체)의 모두에서 PNaseF에 잘리며 EndoH에는 잘리지 않는 것으로 확인되어 세포와 유충시스템과 다른 양상으로 나타났다. 두 시스템에서 분리된 LH의 당단백질 대해 특이 당쇄에 반응하는 몇 개의 렉틴(lectin)을 이용하여 당쇄구조를 예측하였다(도 9). N-glycan에 반응하는 6개의 렉틴을 이용한 결과 만노스(mannose)에 반응하는 ConA와 N-acetylglucosamine(GlcNAc)에 반응하는 DSA에만 반응하였다. O-glycan의 경우는 4개의 렉틴에 대해 확인한 결과, N-acetylgalactosamine(GalNAc)에 반응하는 ABA와 Fucose(Fuc)에 반응하는 Lotus에 반응하는 것으로 확인되었다.
실시예 8: 발현단백질의 활성 실험
생산된 LH 단백질의 생리활성분석은 쥐의 FSH 수용체가 발현되는 세포를 이용하여 cAMP의 발현량을 측정하여 in vitro에서 간접적으로 생리활성을 분석하였다(도 11).
도 11을 참조하면, 200ng의 농도에서 대조구로 사용된 chorera toxin(Positive control)의 200ng 보다 상위의 값을 보일 만큼 cAMP 농도가 증가하여 누에 시스템에서 생산된 민물장어의 LH 호르몬은 생리활성이 있다고 사료된다.
<110> Republic of Korea(National Fisheries and Development Institute) <120> Recombinant Lutinizing Hormone Polypeptide of Japanese eel, Anguilla japonica, Recombinated Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus expressing it and Preparation Method Thereof <130> DP140218 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Lutinizing Hormone Polypeptide of Japanese eel, Anguilla japonica <400> 1 Met Ser Val Tyr Pro Glu Cys Thr Trp Pro Leu Phe Val Cys Leu Cys 1 5 10 15 His Leu Leu Val Ser Ala Gly Gly Ser Leu Leu Leu Pro Cys Glu Pro 20 25 30 Ile Asn Glu Thr Ile Ser Val Glu Lys Asp Gly Cys Pro Lys Cys Leu 35 40 45 Val Phe Gln Thr Ser Ile Cys Ser Gly His Cys Ile Thr Lys Asp Pro 50 55 60 Ser Tyr Lys Ser Pro Leu Ser Thr Val Tyr Gln Arg Val Cys Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Asp Val Arg Tyr Glu Thr Val Arg Leu Pro Asp Cys Arg Pro Gly 85 90 95 Val Asp Pro His Val Thr Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Asp Cys Asn 100 105 110 Leu Cys Thr Met Asp Thr Ser Asp Cys Ala Ile Gln Ser Leu Arg Pro 115 120 125 Asp Phe Cys Met Ser Gln Arg Ala Ser Leu Pro Ala Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Lys Asp Pro Pro Ser Gln Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro 145 150 155 160 Gly Ala Ser Arg Arg Ser Ser His Pro Pro Pro Ile Lys Thr Ser Tyr 165 170 175 Pro Asn Asn Glu Met Ala Arg Gly Gly Cys Asp Glu Cys Arg Leu Gln 180 185 190 Glu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Pro Ser Ala Pro Ile Phe Gln Cys Val 195 200 205 Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys 210 215 220 Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val 225 230 235 240 Ala Arg Glu Val Thr Arg Leu Asp Asn Met Lys Leu Glu Asn His Thr 245 250 255 Asp Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Phe Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Thr Ala Ser Ser Ala Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Ser 275 280 285 Ser His His His His His His His His 290 295 <210> 2 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Coding Lutinizing Hormone Beta-Unit of Japanese eel, Anguilla japonica <400> 2 atgtcagtct acccagaatg cacctggccc ctctttgtat gcttgtgtca cctccttgtt 60 tctgctggag gctctttact gctgccttgt gaaccaatca atgaaactat ttctgtggag 120 aaagatggat gtccaaaatg tctggtgttc caaacatcca tctgcagtgg tcactgcatc 180 accaaggacc caagctacaa gagcccgctg tccacggtgt accagcgcgt gtgcacgtac 240 cgggacgtcc gctacgagac ggtgcggctg ccagactgcc gccccggcgt ggatccccat 300 gtgactttcc ccgtggctct gagctgcgac tgtaacctgt gcaccatgga cacgtctgac 360 tgcgccatcc agagtctgag gcccgacttc tgcatgagcc agcgggccag cctccccgcg 420 tcctcttcct ctaaggatcc a 441 <210> 3 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Coding Lutinizing Hormone alpha-Unit of Japanese eel, Anguilla japonica <400> 3 ttcttatccc aacaacgaaa tggcacgagg tggctgcgat gaatgtcgac tccaggagaa 60 taagatcttc tccaggccca gcgctccaat cttccagtgc gttggttgct gtttctccag 120 ggcgtaccca acaccactgc ggtccaagaa gaccatgctg gtgccaaaga acattacatc 180 tgaggcaacg tgctgcgtgg ccagggaggt gacaaggctg gataacatga aactggagaa 240 ccacacagac tgccacgcag cacctgctac taccacaaat tt 282 <210> 4 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Equus przewalskii LH-B C-termimal sequence 515-594 nt, Acc no. XM 008523815 <400> 4 ccatcccaac ctctcacatc cacatccacc ccaactcctg gggccagcag acgttcctct 60 catccccccc caataaagac t 81 <210> 5 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucloetide Coding Recombinant Lutinizing Hormone Polypeptide of Japanese eel, Anguilla japonica <400> 5 atgtcagtct acccagaatg cacctggccc ctctttgtat gcttgtgtca cctccttgtt 60 tctgctggag gctctttact gctgccttgt gaaccaatca atgaaactat ttctgtggag 120 aaagatggat gtccaaaatg tctggtgttc caaacatcca tctgcagtgg tcactgcatc 180 accaaggacc caagctacaa gagcccgctg tccacggtgt accagcgcgt gtgcacgtac 240 cgggacgtcc gctacgagac ggtgcggctg ccagactgcc gccccggcgt ggatccccat 300 gtgactttcc ccgtggctct gagctgcgac tgtaacctgt gcaccatgga cacgtctgac 360 tgcgccatcc agagtctgag gcccgacttc tgcatgagcc agcgggccag cctccccgcg 420 tcctcttcct ctaaggatcc accatcccaa cctctcacat ccacatccac cccaactcct 480 ggggccagca gacgttcctc tcatcccccc ccaataaaga cttcttatcc caacaacgaa 540 atggcacgag gtggctgcga tgaatgtcga ctccaggaga ataagatctt ctccaggccc 600 agcgctccaa tcttccagtg cgttggttgc tgtttctcca gggcgtaccc aacaccactg 660 cggtccaaga agaccatgct ggtgccaaag aacattacat ctgaggcaac gtgctgcgtg 720 gccagggagg tgacaaggct ggataacatg aaactggaga accacacaga ctgccactgc 780 agcacctgct actaccacaa atttgcggcc gcggccgcca ccgcctcgag tgcaggcgaa 840 aacctgtact tccagggaag ctccagccac caccatcacc atcatcatca ctag 894

Claims (4)

  1. 민물장어 황체 형성 호르몬의 알파 단체, 말 성성숙 호르몬의 C-말단 영역과 황체 형성 호르몬의 베타 단체가 융합된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 따른 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스.
  3. 제1항에 따른 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 배큘로바이러스 전이 벡터에 클로닝하여 재조합 전이벡터를 제조하는 단계와,
    상기 재조합 전이벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 재조합 백미드를 제조하는 단계와,
    상기 재조합 백미드로 누에 세포를 형질감염시키는 단계와,
    상기 형질감염된 누에 세포로부터 재조합 배큘로바이러스를 분리하는 단계와,
    상기 분리된 재조합 배큘로바이러스를 유충 또는 번데기 생체에 주입하여 외래 단백질을 발현시키는 단계와,
    상기 누에 유충 또는 번데기의 세포 또는 체액으로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 민물 장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 분리하는 단계
    를 포함하는 제1항의 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드의 제조방법.
  4. 제1항에 따른 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드를 유효성분으로 함유하는 민물장어 성성숙 유도용 호르몬 조성물.
KR20140153454A 2014-11-06 2014-11-06 민물장어 재조합 황체 형성 호르몬 폴리펩타이드, 이를 발현하는 재조합 누에 배큘로바이러스 및 이의 제조방법 KR101493957B1 (ko)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190012808A (ko) * 2017-07-28 2019-02-11 재단법인 경북해양바이오산업연구원 당단백질 호르몬 생산용 조성물
KR20190065879A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 재단법인 환동해산업연구원 민물장어의 황체형성 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도
KR20190065878A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 재단법인 환동해산업연구원 민물장어의 여포자극 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100375671B1 (ko) 1999-08-05 2003-03-15 대한민국 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100375671B1 (ko) 1999-08-05 2003-03-15 대한민국 단일체인 소의 황체형성호르몬 및 그 제조방법

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190012808A (ko) * 2017-07-28 2019-02-11 재단법인 경북해양바이오산업연구원 당단백질 호르몬 생산용 조성물
KR102070940B1 (ko) * 2017-07-28 2020-04-01 재단법인 환동해산업연구원 당단백질 호르몬 생산용 조성물
KR20190065879A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 재단법인 환동해산업연구원 민물장어의 황체형성 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도
KR20190065878A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 재단법인 환동해산업연구원 민물장어의 여포자극 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도
KR20190065877A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 재단법인 환동해산업연구원 민물장어의 갑상선 자극 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도

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