KR102070940B1 - 당단백질 호르몬 생산용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 항생제 저항성 유전자, 및 당단백질 호르몬 유전자를 포함하는 백미드, 및 상기 바이러스의 숙주를 포함하는 당단백질 호르몬 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

당단백질 호르몬 생산용 조성물 {Composition for producing glycoprotein hormones protein}

본 발명은 베큘로 바이러스 유전자, 및 당단백질 호르몬을 암호화하는 유전자를 포함하는 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드, 및 상기 백미드가 도입된 숙주를 포함하는 당단백질 호르몬 생산용 조성물에 관한 것이다.

척추동물의 당단백질 호르몬 (Glycoprotein hormones; GPH)은 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid-stimulating hormone; thyrotropin; TSH), 여포 자극 호르몬 (Follicle-stimulating hormone; follitropin; FSH), 황체 형성 호르몬 (Luteinizing hormone; lutropin; LH), 또는 융모막 성선 자극 호르몬 (chorionic gonadotropin, CG)이며, 이들은 두 개의 서로 다른 서브유닛(subunit) 알파 (-α)와 베타 (-β)로 구성된다. 상기 척추동물의 당단백질 호르몬들의 알파 서브유닛은 동일 종들은 동일한 아미노산 서열을 가지고 있지만, 베타 서브유닛은 각 호르몬 별로 특이적인 아미노산 서열을 가지고 있으며, 베타 서브유닛의 각 호르몬 별로 상이한 특이적인 서열에 의해서 각 호르몬의 특이적 활성 및 종 특이성(species specificity)을 나타낸다. 알파와 베타 서브유닛은 다른 유전자에 의해 서로 다른 단백질로 형성되며, 생물학적 활성이 있는 호르몬 분자를 형성하기 위해 상기 알파 서브유닛과 베타 서브유닛은 비공유 결합(non-covalent bonding)에 의해 연결된다.

척추동물의 성선 자극 호르몬 (Gonadotropin hormones; GTHs)에는 황체 형성 호르몬과 여포 자극 호르몬이 포함되고, 이들은 생식 기능에 주요 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있어 포유류의 다양한 종에서 발현되는 성선 자극 호르몬들은 유전 공학적 방법을 이용한 재조합 단백질 발현기술을 이용하여 재조합 단백질로 생산되고 있다.

반면, 갑상선 자극 호르몬은 생식 기능에 직접적 역할을 담당하지 않은 것으로 알려져 있어, 상기 성선 자극 호르몬에 비해서 개발이 되어 있지 않은 실정이다.

다만, 최근 연구에 의하면 갑상선 자극 호르몬은 발달 (development), 성장(growth), 신진대사(metabolism), 행동(behavior), 생식(reproduction) 등의 다양한 부분에서 그 역할이 보고 되고 있고, 소하성(anadromous)의 연어류 (salmonids)에서는 바닷물 적응과 이주, 이동에 관여된 행동 및 유충기 (juvenile)의 은빛 체색 변태 (body silvering) 과정에 영향하는 것으로 알려져 있으며, 연어류와 반대로 산란을 위해 바다로 이주하는 장어류에서는 갑상선 자극 호르몬의 변화에 대한 자세한 정보는 없지만 유충 은뱀 장어 (silvering eel) 시기 동안 뇌하수체와 갑상선의 변화가 관찰된바 있다.

현재, 재조합 단백질을 생산하기 위한 시스템은 박테리아, 효모, 형질전환 식물, 곤충, 및 포유류 세포 등이 개발되어 사용되고 있다. 이들 중 당쇄형 단백질을 생산 할 수 있는 것은 효모, 식물, 포유류 세포, 곤충 등이 있고 이들 중 대량생산, 분리의 간편함, 낮은 가격 등의 이유로 인해 곤충 시스템이 당쇄형 단백질의 생산에 유리한 것으로 알려져 있으며, 상기 곤충 시스템은 사육 가능한 가잠 (Bombyx mori, silkworm)의 유충과 번데기를 사용하고 있다.

베큘로 바이러스 벡터계는 진핵생물을 숙주로 하여 벡터에 존재하는 유전자를 발현하는 시스템으로, 포유류 생물에서 단백질 번역 후 수식되는 것과 유사한 N- 또는 O-형 당사슬 (sugar chain) 수식 반응이 일어나기 때문에, 의약, 수의약용 당단백질 생산에 유리한 것으로 알려져 있다.

지금까지 개발되어 있는 베큘로 바이러스 벡터계에서 사용되는 베큘로 바이러스에는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV; invitrogen, USA)가 있으나, 상기 벡터는 곤충 세포 (주로 거염 벌레 (fall armyworm))에서 유래한 Spodoptera frugiperda 세포 (Sf9, Sf21 세포 등)에 주로 활용되어 단백질의 대량 생산 및 누에에 활용이 적합하지 않은 문제점이 있었다.

따라서, 현재까지는 베큘로 바이러스를 이용하여 성 성숙 당단백질 호르몬 유전자를 높은 형질전활율로 형질전환하여 성 성숙 당단백질 호르몬을 제조하는 기술에 대해서는 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 누에 베큘로 바이러스에 기반한 당단백질 호르몬 (Glycoprotein hormones; GPH) 단백질을 생산하기 위한 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 백미드를 제공하는 것이다. 발명의 백미드는 성 성숙 당단배질 호르몬 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백미드가 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 항생제 저항성 유전자, 및 성 성숙 당단백질 호르몬 유전자를 포함하는 백미드가 도입된 숙주를 포함하는 당단백질 호르몬 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자 및 당단백질 호르몬 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 단계;

상기 유전자가 도입된 세포에서 당단백질 호르몬의 발현용 백미드를 분리하는 단계;

상기 분리한 백미드를 숙주에 도입하는 단계를 포함하는 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 누에 핵다각체 C2 바이러스 (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis C2 Virus, BmC2NPV)를 분리해내고, 상기 BmC2NPV 유전자에 복제 개시점 (replication origin), 항생제 선택 마커, Tn7 transposase 서열을 삽입하여, BmC2Bac (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus C2 Baculovirus) 백미드를 제작하고, 상기 BmC2Bac 백미드에 당단백질 호르몬 유전자를 삽입하여 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드를 제작하였다. 또한, 본 발명자들은 당단백질 호르몬 유전자를 삽입하여 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드를 숙주에 도입하여, 상기 숙주를 이용하여 당단백질 호르몬을 생산하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일예는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항정 유전자를 포함하는 백미드에 관한 것이다.

본 발명의 백미드는 당단백질 호르몬 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일예는 상기 백미드가 형질전환된 세포에 관한 것이다.

본 발명의 일예는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 항생제 저항성 유전자, 및 성 성숙 당단백질 호르몬 유전자를 포함하는 백미드가 도입된 숙주를 포함하는 당단백질 호르몬 생산용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일예는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 백미드 및 당단백질 호르몬 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 도입하고 상동 재조합시키는 단계;

상기 세포에서 상동 재조합되어 당단백질 호르몬 유전자 발현용 백미드를 분리하는 단계;

상기 분리한 백미드를 숙주에 도입하는 단계를 포함하는 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명에서 제작한 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드를 활용하여 이종 당단백질을 생산할 경우 척추동물에서 일어나는 것과 유사한 당쇄 수식이 가능할 뿐만 아니라 안전하고 경제적으로 이종 당단백질을 대량생산할 수 있다. 베큘로 바이러스 전달 벡터는 비교적 큰 크기의 외래유전자를 삽입할 수 있다는 점과 고등 진핵 세포인 곤충 세포를 이용하기 때문에 해독 후 변형 과정(post-translational processing)이 일어나, 원핵생물인 대장균에서 생성된 단백질과는 달리 발현된 재조합 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 원래의 단백질과 같은 효과를 나타낸다는 중요한 장점을 지니고 있다. 이 외에도 베큘로바이러스는 동물세포 내에서는 복제가 불가능하고 세포독성을 일으키지 않기 때문에, 생물학적으로 안전한 바이러스로 알려져 있다

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자, 및 항생제 저항정 유전자를 포함하는 백미드에 관한 것이다.

본 발명에 따른 일예는, 베큘로 바이러스(BmC2NPV)의 게놈 DNA를 포함하는 백미드에 관한 것으로서, 구체적으로 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자, 세포의 복제 개시점, 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열 유전자를 포함하는 백미드에 관한 것으로서, 추가적으로 상기 백미드는 숙주로 전달하기 위한 목적 단백질의 암호화 유전자를 포함하며, 예를 들면, 성 성숙 당단백질 호르몬을 암호화하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 백미드에는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스 (BmC2NPV)의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자를 포함하는 베큘로 바이러스 (BmC2NPV)의 게놈 DNA를 포함할 수 있다.

용어 '복제 개시점'은 유전자의 복제가 시작되는 염색체의 특정 영역을 의미하며, 진핵생물과 원핵생물의 복제 개시점의 염기서열의 구성과 복제 개시되는 메커니즘이 서로 차이가 있음이 알려져 있다.

본 발명에 따른 일예에서, 백미드에 대장균의 복제 개시점 유전자를 삽입하여, 세포 주기가 진행됨에 따라서 상기 백미드가 형질전환된 대장균 세포에서 백미드의 유전자가 발현되도록 하였다.

본 발명의 일예에서 백미드는 Tn7 transposase 서열을 포함하고 있고, 상기 Tn7 transposase 서열을 통해서 목적 단백질의 암호화 유전자와 상동 재조합을 통해서 백미드에 목적 단백질 암호화 유전자를 삽입할 수 있었다.

본 발명에 따른 백미드는 누에 핵다각체 C2 바이러스 (BmC2NPV)에서 분리된 게놈 DNA (BmC2Bac)이며, 상기 BmC2Bac의 전체 게놈 염기서열은 Genbank에 NCBI accession no. KF306216로서 등록되어 있다.

본 발명에 따른 백미드를 제조하기 위하여, 상기 복제 개시점 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열을 베큘로바이러스 게놈상의 삽입할 위치는, 베큘로 바이러스 복제에 필수적이지 않은 서열, 예를 들면 핵다각체 단백질을 코딩하고 있는 polyhedrin 유전자 부위에 삽입할 수 있다.

상기 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자, 세포의 복제 개시점 유전자, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항정 유전자를 포함하는 백미드를 제작하기 위해서 사용하는 전이 벡터에 존재하는 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항정 유전자를 상기 백미드에 삽입하기 위한 역할을 할 수 있다.

상기 백미드에 벡터 구성 유전자를 도입하기 위한 전이 벡터의 예는 도 3의 개열지도로 나타나는 벡터(pBSK―C2-3kb-TF)일 수 있다.

상기 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자는 5' 방향과 3' 방향을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 BmC2NPV의 핵다각체 단백질을 코딩하고 있는 polyhedrin 유전자 부위를 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자 부위를 이용한 상동 재조합 (homologous recombination)을 통해서 GFP를 발현하는 유전자로 치환하고 (실시예 2-1), 상기 치환된 GFP 유전자 부위를 homologous recombination을 통해서 세포의 복제 개시점, 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열 유전자를 포함하는 염기서열 부위로 치환하여 GFP를 발현하지 않는 재조합 바이러스를 선별하여 BmC2Bac 백미드를 완성하였다 (실시예 2-4).

상기 상동성 재조합 (Homologous recombination)을 위한 폴리헤드린(polyhedrin flanking) 서열의 정해진 서열 범위는 없으며, 폴리헤드린 (polyhedrin flanking) 서열의 전체를 포함하거나, 일부를 포함하는 것이 가능하고, 상동 재조합의 용이성을 위해 폴리헤드린 측면 (polyhedrin flanking) 서열의 중첩(overlap)하여 사용하는 것이 가능할 수 있다 (실시예 2-2).

본 발명의 일 실시예에서 BmC2NPV의 전체 게놈 염기서열에서 BmC2NPV의 핵다각체 단백질을 코딩하고 있는 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 부위를 상동 재조합 (homologous recombination)을 통해서 GFP를 발현하는 유전자로 치환하는 경우에는 BmC2NPV의 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)을 이용하였고 (실시예 2-1), 상기 BmC2NPV 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)은 서열번호 23 및 24에 기재되어 있다.

또한, 상기 치환된 GFP 유전자 부위를 상동 재조합 (homologous recombination)을 통해서 세포의 복제 개시점, 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열 유전자를 포함하는 염기서열 부위로 치환하는 경우에는 BmC2NPV의 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측을 중첩하여 3 kbp 측면 (flanking) 서열을 이용하였고 (실시예 2-2, 2-4), 상기 BmC2NPV 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측 3 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)은 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)이 중복되어 있고, 상기 서열은 서열번호 25 및 26에 기재되어 있다.

상기 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역은 폴리헤드린 유전자의 5' 방향 1 kbp 크기와 3' 방향 1.5 kbp 크기를 필수적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 백미드는 대장균 또는 효모 등에서 배양되는 베큘로 바이러스 셔틀 벡터 (baculovirus shuttle vector)로서 유전자 카세트를 site-specific transposition 에 의한 방식으로 재조합 바이러스를 얻어 숙주 세포에서 발현하고자 하는 목적 단백질의 유전자를 숙주로 전달하는 기능을 수행할 수 있다. 베큘로 바이러스 유전자를 포함하는 백미드를 제조하기 위하여, 본 발명에 따른 백미드는 베큘로 바이러스 유전자이외에, 셔틀벡터로서 대장균 또는 효모 등에서 복제 및 선별할 수 있는 유전자, 예를 들면 복제 개시점 및 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백미드는 대장균 또는 효모 등에서 복제 및 선별할 수 있는 유전자를 포함하는 전이 벡터(transfection vector)와 베큘로 바이러스 유전자를 사용하여 제조할 수 있다.

예를 들면, 대장균 또는 효모 등에서 복제 및 선별할 수 있는 유전자로서, 복제 개시점은 miniF, OriC 등을 사용할 수 있으며, 구체적으로 miniF origin을 사용할 수 있다. 상기 선별 마커로서 항생제 저항성 유전자는 숙주에 도입하기 전에 대장균 또는 효모에서 증식한 백미드를 선별하기 위한 것으로서, 통상의 항생제 저항성 유전자를 사용할 수 있으며, 구체저으로 kanamycin, gentamicin, ampicillin, tetracycline, 또는 chloramphenicol 저항성 유전자 등을 포함할 수 있다.

상기 복제 개시점 유전자는 세포에 삽입된 백미드가 세포 주기에 따라서 복제가 일어날 수 있도록 하는 역할을 하며, 상기 항생제 저항성 유전자는 백미드가 삽인된 세포만을 특이적으로 선별하도록 역할을 한다.

본 발명에서는, 박테리아 유래인 트랜스포손 Tn7의 트랜스포사제 (Tn7 transposase)를 사용하여 세포외 전이 반응 (In vitro transition)을 수행한다. 상기 트랜스포손의 프로모터는 유도물질에 의해 목적유전자의 발현을 유도하여 목적유전자를 고효율로 발현시킬 수 있는 프로모터라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 T7 프로모터, lac 프로모터, ara 프로모터, trc 프로모터 및 Phce 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 프로모터를 사용할 수 있다. 상기 Tn7 트랜스포사제의 인식부위는 Tn 트랜스포손인 것이 바람직하다.

구체적으로, 당단백질 호르몬 생산을 위한 백미드를 제조하기 위해서는 pDEST8-TSHβ, pDEST8-TSHα, pDEST8-TSHβ/TSHα과 pDEST8-TSHβ/eCG/TSHα 전이 벡터를 BmC2Bac을 발현하는 대장균 또는 효모와 같은 균주에 트랜스포메이션(Transformation)시켜야 하고, 그러고 나서 상기 전이 벡터 및 BmC2Bac에 존재하는 Tn7 transposase 서열에 의한 상동 재조합이 일어나야 한다. 상기 전이 벡터의 예는 도 5의 개열지도로 나타나 있다.

본 발명에서 BmC2Bac 백미드를 제작하는 과정에서 사용한 벡터 구성요소 전달용 전이 벡터의 차이에 따라, ODV 타입(Occlusion derived virus) 백미드 또는 BV (budded virus) 타입 백미드를 제작할 수 있다 (도 1의 A).

ODV 타입(Occlusion derived virus) 백미드는 전이 벡터에 삽입된 polyhedrin의 3' 측면 (flanking) 염기서열 부위에서 single crossover homologous recombination에 의해 벡터 구성요소 (복제 개시점, 항생제 내성 유전자 및 T7 트랜스포사제)가 삽입되며, polyhedrin 단백질이 발현되어 occlusion body를 생성하지만, BV (budded virus) 타입 백미드는 전이 벡터에 삽입된 polyhedrin의 5'및 3' 측면 (flanking) 염기서열 부위에서 double crossover homologous recombination에 의해 벡터 구성요소가 삽입되며, polyhedrin 단백질이 발현되지 않아 occlusion body를 생성하지 못한다 (도 1의 A 및 도 14).

구체적인 일예에서, 상기 ODV 타입 백미드는 ODV-BmC2Bac (Occlusion derived virus-BmC2NPV Bacmid)이고, BV 타입 백미드는 BV―BmC2Bac (Budded virus-BmC2NPV Bacmid)일 수 있다. 세포 배양 환경은 누에의 장내 환경만큼 알칼리성을 띠지 않기 때문에, 누에 세포에서 생산된 대부분의 바이러스는 ODV내에 삽입된 상태로 존재하므로, ODV-BmC2Bac의 경우 2차 감염이 활발히 일어나지 못해서 전반적으로 바이러스 확산속도가 BV의 경우 보다 느리기 때문에 전체적으로 바이러스의 발현수준이 낮아, 세포 배양 시스템에서는 BV―BmC2Bac는 출아 형태이기 때문에 누에에 직접 감염 (주사 등)하여 재조합 단백질을 대량 생산하는데 바람직하다.

본 발명에서 제작한 상기 백미드는 막 단백질 표면에서 돌출된 페파로마 (peparomer) 라고 하는 스파이크 (spike)를 가지는 BV 타입 백미드일 수 있다.

본 발명에서 제작한 백미드는 세포 배양 환경 및 누에 체강에서 재조합 단백질을 생산 가능한 BV 타입 백미드 또는 누에의 섭식으로 재조합 단백질 생산이 가능한 ODV 타입 백미드일 수 있으며, BV 타입 백미드를 제작하는 경우 체강 주사 주입에 의한 감염이 가능할 수 있고, ODV 타입 백미드를 제작하는 경우 섭식에 의한 감염이 가능할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 백미드는 베큘로 바이러스 BV 타입 백미드이므로, 누에 세포, 누에 유충, 또는 번데기에서 단백질을 생산하는데 사용이 가능하고, 또한, 누에 세포에서 단백질 생산률을 현저하게 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 바이러스 확산 속도를 고려하여 막 단백질 표면에서 돌출된 페파로마(peparomer)라고 하는 스파이크 (spike)를 가지는 BV 타입의 백미드를 제작하였다.

본 발명에 따른 백미드는 숙주에 도입하여 생산하기 위한 외래 목적 유전자를 포함할 수 있으며, 대장균 또는 효모 등에서 배양되는 베큘로 바이러스 셔틀 벡터 (baculovirus shuttle vector)로서 유전자 카세트를 site-specific transposition 에 의한 방식으로 재조합 바이러스를 얻어 숙주 세포에서 발현하고자 하는 목적 단백질의 유전자를 숙주로 전달하는 기능을 수행할 수 있다.

상기 목적 유전자는, 백미드를 이용하여 곤충의 유충, 번데기 또는 곤충 세포에 도입하여 생산하고자 하는 목적 유전자인 경우에는 특별한 제한이 없으며, 곤충을 이용할 경우 당단백질의 수식이 갖는 장점이 있으므로, 당단백질인 것이 바람직하다. 상기 목적 유전자의 예는, 당단백질 호르몬의 유전자 일 수 있으며, 상기 당단백질 호르몬 (Glycoprotein hormones; GPH)은 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid-stimulating hormone; thyrotropin; TSH), 여포 자극 호르몬 (Follicle-stimulating hormone; follitropin; FSH), 황체 형성 호르몬 (Luteinizing hormone; lutropin; LH), 또는 융모막 성선 자극 호르몬 (chorionic gonadotropin, CG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 및 황체 형성 호르몬은 모두 당단백질로 알파 서브유닛은 2개가 있고, 베타 서브유닛은 1개가 있으며. 2개의 N-glycosylation 부위가 존재하고, 상기 알파 및 베타 두 서브유닛에는 다수의 O-glycosylation 부위가 존재한다. 또한, 융모막 성선 자극 호르몬은 갑상선 자극 호르몬, 여포 자극 호르몬, 및 황체 형성 호르몬과 유사하게 당단백질로 알파 서브유닛은 2개가 있고, 베타 서브유닛은 1개가 있으며. 2개의 N-glycosylation 부위가 존재하고, 상기 알파 및 베타 두 서브유닛에는 다수의 O-glycosylation 부위가 존재하는 것으로 알려져 있다.

상기 당단백질 호르몬(Glycoprotein hormones, GPHs)의 하나인 민물 장어 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid stimulating hormone; thyrotrophin, 이하 TSH)은 민물 장어의 성장, 발달, 생식과 이주 행동 등에 관여하는 물질로 본 발명에서 제작한 BmC2Bac 벡터를 이용하여 사료 개발, 인공 종묘, 및 회유성 어류의 행동 실험에 필요한 활성형 유효 물질을 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 일 예에서 TSH 유전자는 BmC2Bac 백미드의 Tn7 R과 Tn7 L 사이에 상동 재조합 되며, 전이 벡터인 pDEST 벡터에 존재하는 폴리헤드린 (polyhedron) 프로모터에 의해서 유전자 발현이 조절된다.

본 발명의 일 실시예에서는 민물장어 갑상선 자극 호르몬 (TSH)의 베타와 알파 단체, 알파/베타 및 알파/eCG-CTP/베타를 단일 체인으로 만든, 각각 서열번호 19, 20, 21, 및 22의 염기서열 (대응되는 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3, 및 4)을 포함하는 트랜스퍼 벡터를 제작하였고, 상기 TSH를 포함하는 트랜스퍼 벡터를 상기 제작한 BmC2Bac 백미드에 재조합시킨 후, 세포에 감염하여 TSH 생산을 위한 베큘로 바이러스를 제작하였고, 상기 제작한 베큘로 바이러스를 이용하여 누에 세포, 누에 유충, 및 번데기에서 민물장어 TSH를 생산하였다.

상기 TSH를 포함하는 트랜스퍼 벡터를 상기 제작한 BmC2Bac 백미드에 재조합하여하여 제작한 BmC2Bac-TSHβ, BmC2Bac-TSHα, BmC2Bac-TSHβ/TSHα, 및 BmC2Bac-TSHβ/eCG/TSHα의 개열지도는 도 15에 나타나 있다.

상기 서열번호 1은 BmC2Bac를 이용하여 생산 된 민물장어 갑상선 자극 호르몬 TSHβ 아미노산 서열, Tobacco Etch Virus(TEV) protease 아미노산 서열, 및 His 항체 아미노산 서열이 합쳐진 아미노산 서열이다. 상기 서열번호 2는 BmC2Bac를 이용하여 생산 된 민물장어 갑상선 자극 호르몬 꿀벌의 mellitin 시그널 펩타이드를 가진 TSHα 아미노산 서열, TEV protease 아미노산 서열, 및 His 항체 아미노산 서열이 합쳐진 아미노산 서열이다. 상기 서열번호 3은 BmC2Bac를 이용하여 생산 된 민물장어 갑상선 자극 호르몬 TSHβ/TSHα 아미노산 서열, TEV protease 아미노산 서열, 및 His 항체 아미노산 서열이 합쳐진 아미노산 서열이다. 상기 서열번호 4는　BmC2Bac를 이용하여 생산 된 민물장어 갑상선 자극 호르몬 TSHβ/eCG/TSHα 아미노산 서열, TEV protease 아미노산 서열, 및 His 항체 아미노산 서열이 합쳐진 아미노산 서열이다.

본 발명에서 제작한 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드를 활용하여 생산한 당단백질 호르몬은 당쇄 수식(Glycosylation)이 된 것일 수 있으며, 상기 당쇄 수식은 척추동물에서 일어나는 것과 유사한 당쇄 수식이 가능할 수 있다.

본 발명은 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 백미드 및 당단백질 호르몬 유전자를 포함하는 벡터를 세포에 도입하는 단계;

상기 유전자가 도입된 세포에서 당단백질 호르몬을 생산하는 백미드를 분리하는 단계;

상기 분리한 백미드를 숙주에 도입하는 단계를 포함하는 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

상기 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 재조합 백미드를 제작하기 위한 백본이 되는 벡터를 제조하기 위해서, 본 발명의 일실시예에서는 BmC2Bac 백미드를 제작하였다.

상기 BmC2Bac 백미드는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 백미드를 포함하는 벡터를 세포에 공동-형질전환하고, 세포내에서 상동 재조합하여 제작할 수 있다.

상기 BmC2Bac 백미드를 제작하는 과정에서 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 백미드를 포함하는 벡터를 세포에 동시 또는 이시에 형질전환할 수 있다.

상기 BmC2Bac 백미드는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 전이 벡터를 상동재조합하여 제작할 수 있다.

본 발명의 일예는, 베큘로바이러스(BmC2NPV)의 게놈 DNA를 포함하는 백미드의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 베큘로바이러스(BmC2NPV)의 게놈 DNA, 복제 개시점, 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열을 포함하는 백미드의 제조방법으로서, 추가적으로 상기 백미드는 숙주로 전달하기 위한 목적 단백질의 암호화 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 일예에 따라, 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자를 포함하는 베큘로 바이러스(BmC2NPV)의 게놈 DNA와, 복제 개시점, 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열을 포함하는 전이 벡터를 균주에 함께 형질전환시켜 제조할 수 있다.

본 발명에서 BmC2Bac 백미드를 제작하는 과정에서 사용한 전이 벡터는 두가지 형태가 있다. 첫째는 전이벡터의 3'위치의 측면 (flanking) 염기서열 부위에서 single crossover 상동 재조합 (homologous recombination)에 의해 삽입된　백미드 (bacmid)이며, 상기 백미드 의 경우 정상적으로 polyhedrin 단백질이 발현되기 때문에 ODV 형태의 바이러스가 생성되는 문제가 있다. 둘째는 전이 벡터 상의 5’또는 3’위치의 측면 (flanking) 염기서열에서 BmNPV polyhedrin 유전자 양쪽 측면 (flanking) 염기서열에서 double crossover homologous recombination된 백미드로 이 경우에는 polyhedrin 유전자가 결핍되어 occlusion body를 생성하지 못하기 때문에 budded virus 형태로 바이러스를 생산한다.

첫번째 백미드를 ODV-BmC2Bac (Occlusion derived virus-BmC2NPV Bacmid)로 명명하였고, 후자를 BV―BmC2Bac (Budded virus-BmC2NPV Bacmid)로 명명하고 이를 BmC2Bac 벡터계로 사용하였다. 세포 배양 환경은 누에의 장내 환경만큼 알칼리성을 띠지 않기 때문에, 누에 세포에서 생산된 대부분의 바이러스는 ODV내에 삽입된 상태로 존재하므로, ODV-BmC2Bac의 경우 2차 감염이 활발히 일어나지 못해서 전반적으로 바이러스 확산속도가 BV의 경우 보다 느리기 때문에 전체적으로 바이러스의 발현수준이 낮아, 세포 배양 시스템에서는 ODV-BmC2Bac가 불리할 수 있으며, BV―BmC2Bac는 출아 형태이기 때문에 누에에 직접 감염 (주사 등)하여 재조합 단백질을 대량 생산하는데 유리하다 (도 1).

본 발명은 BmC2NPV를 기반으로 구축한 BV 계열의 BmC2Bac 백미드를 이용하여, 상기 BmC2Bac 백미드와 외래 유전자를 도입하기 위한 전이 벡터가 인비트로 트랜스포지션(in vitro transposition)하여 BmC2Bac 백미드에 외래 유전자가 도입된 균주를 선별하여 1차 재조합 바이러스를 선발하고, 상기 재조합 바이러스에 대하여 PCR을 통해 외래 유전자 도입을 2차 확인하여 목적하는 외래 유전자가 확실히 도입된 재조합 바이러스만을 숙주 세포에 형질전환하는 특징이 있다.

또한, 본 발명의 백미드 제조방법은, 게놈 DNA 선형화를 위해 CRISPER/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 함께 형질감염할 수 있다. 비교적 큰 크기를 갖는 벡터 구성요소(복제 개시점, 항생제 내성 유전자 및 트랜스포사제)을 베큘로바이러스 게놈 DNA에 삽입하기 위해서는, 높은 효율로 상동성 재조합이 일어나야 한다. 이를 위해, 바이러스 게놈 DNA를 원형에서 선형 DNA로 변경하여 상동 재조합 효율을 높높이는 것이 바람직하며, 게놈 DNA 선형화를 위해 CRISPER/Cas9 시스템을 포함하는 벡터를 함께 형질감염할 수 있다.

본 발명에서 백미드를 제조하기 위해서 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 유전자 서열을 이용한 상동성 재조합을 수행할 수 있으며, 이를 위해서 제작하는 복제 개시점, 항생제 저항성 유전자 및 Tn7 transposase 서열 유전자를 포함하는 전이 벡터는 베클로 바이러스의 폴리헤드린을 발현하는 유전자 염기서열의 전부를 포함 (ODV 타입)하거나, 폴리헤드린을 발현하는 유전자 염기서열을 전부 포함하지 않는 (BD 타입)것일 수 있다 (도 3).

본 발명에 있어서 BmC2NPV 유전자 또는 BmC2Bac 백미드에 외래유전자를 도입하기 위해 사용하는 각각의 전이 벡터 (transfer vector)는 BmNPV의 후후기 발현 유전자 (late late gene)인 다각체단백질 (polyhedrin, Polyh) 프로모터 조절 하에 민물장어 갑상선 자극 호르몬 유전자가 도입된 Tn7 transposase 서열을 가진 pDEST인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 BmC2NPV 유전자에서 각 유전자의 발현은 BmNPV의 후후기발현유전자 (late late gene)인 다각체단백질(polyhedrin, Polyh)의 프로모터, P10 프로모터, 또는 초기발현유전자 (immediate early gene)인 ie1, ie2 등의 프로모터 조절하에서 가능할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드가 형질전환된 세포에 관한 것이다.

본 발명은 상기 방법을 사용하여 제조한 당단백질 호르몬 생산을 위한 베큘로 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 상기 당단백질 호르몬 생산을 위한 베큘로 바이러스가 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 상기 당단백질 호르몬 생산을 위한 베큘로 바이러스, 및 상기 바이러스의 숙주를 포함하는 성 성숙 당단백질 호르몬 생산용 조성물의 제공에 관한 것이다.

상기 세포는 대장균 또는 효모일 수 있으며, 상기 대장균은 Top 10, DH 5α 등의 컴피턴트 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 숙주는 곤충, 곤충 세포, 곤충의 유충 또는 곤충의 번데기 일 수 있으며, 상기 곤충은 누에일 수 있으며, 사용 가능한 누에의 품종은 제한이 없으나, 바람직하게는 백옥잠, 대성잠, 금옥잠 등일 수 있다.

곤충 유충 또는 번데기에서 단백질을 발현시키는 것은 곤충 생체 내에서의 빠른 바이러스 감염 및 숙주의 성장과 더불어 발현하는 단백질을 통해 단백질을 대량생산 할 수 있으므로, 한정 된 세포 수에서 단백질을 발현하는 곤충 세포를 이용하여 단백질 생산하는 것보다 단백질 수득 효율이 높으므로, 곤충 세포를 이용한 단백질 생산에 비해, 곤충 유충 또는 번데기에서 발현시키는 것이 수득 효율이 높아 바람직한다.

종래의 AcNPV 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 목적 단백질을 생산할 경우, 곤충 유충 또는 번데기에서 상기 바이러스가 증식하지 못하는 문제점이 있었고, 곤충 세포에서 단백질의 발현이 현저하게 낮은 문제점이 있었다.

반면, 본 발명에 따른 백미드를 곤충 유충과 번데기에 주사로 감염하여도 곤충 생체 내에서도 외래 목적 유전자가 코딩하는 단백질 생산이 가능하므로, 본 발명의 기술은 세포와 곤충 생체내 모두에서 특정 단백질을 생산가능한 장점이 있다. 본 발명의 상기와 같은 특징을 이용하여 민물 장어 TSH를 누에 세포, 누에 유충, 및 번데기에서의 지속적, 반복적으로 대량 발현 후, 이를 순수 분리한 산물을 이용하여 민물장어 양식에 활용할 수 있다.

본 발명의 일예에서 민물장어 TSH를 발현시키기 위해 사용되는 숙주는 누에 또는 번데기를 사용할 수 있으며, 예를 들면 대성잠 (잠125x잠126)일 수 있다. 대성잠은 상엽육도 가능할 뿐 아니라 인공사료육에 적합한 계통이며, 강건하여 다량수확에 용이한 것으로 알려져 있는 누에장려품종이다. 용하는 누에는 정해진 것은 아니지만 강건성 또는 바이러스 민감성 등에 따라 단백질 발현의 차이는 있을 수 있다. 누에 유충은 24-25℃에서 상엽(뽕나무잎) 또는 인공사료로 1일 2 -3 회 급여하여 4-5일간 사육하고, 누에 번데기는 24-25℃ 실내에 4-5일간 자연방치하면 각 생체내에서 바이러스가 증폭하여 단백질을 얻을 수 있다. 본 발명에서 단백질 발현 숙주 누에 또는 번데기로 대성잠을 사용하였으나 경제적으로 재조합 단백질을 제조할 수 있는 계통이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

당단백질의 경우 시그널 펩타이드(signal peptide)가 있어 세포 외(누에 세포의 경우는 배양액, 유충과 번데기의 경우는 혈액)로 분비되므로, 세포 외로 분비 된 단백질을 분리해야 당수식이 완료 된 형태의 단백질을 얻을 수 있다. 그러나, 누에 베큘로 바이러스 시스템의 경우는 누에 세포, 유충과 번데기의 지방체 (또는 전제 wholebody 가능)에서 단백질을 분리 정제한 경우도 혈액에서 얻어진 것과 유사한 형태, 활성을 가진 당단백질을 얻을 수 있으므로, 누에 베큘로 바이러스 시스템을 이용하는 경우 대량으로 당수식된 당백질을 분리 및 정제할 수 있는 장점이 있다.

종래의 곤충에서 단백질 발현 시스템에서 발현 및 분리된 단백질은 시알산 수식이 되지 않는 것으로 알려져 있었으나, 본 발명의 일 실시예에서는 BmC2Bac 벡터를 이용한 누에 세포, 누에 유충, 또는 번데기에서 단백질 발현 기술에서 발현 및 분리된 단백질은 시알산 수식이 되었음을 확인 할 수 있었다 (도 13).

본 발명의 백미드를 이용한 곤충 숙주 또는 숙주 세포에서 생산한 단백질을 분리하기 위해서, 단백질의 분리에 일반적으로 사용되는 원심분리, 여과, 염석 또는 크로마트그래피법 등이 사용될 수 있다.　일 예로,　누에 세포 (BmN), 누에 유충 또는 번데기의 배양액(세포의 경우)과 혈액에서 상기 단백질을 분리, 정제한다.

본 발명의 방법으로 분리한 재조합 폴리펩타이드는 His-tag 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 역상 HPLC 중 1종 이상의 방법으로 정제 할 수 있고, His tag 이외의 일반적으로 사용하는 affinity tag 종류인 GST, MBP, FLAG, Strep II, 또는 CBP 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 transposase 서열, 항생제 저항성 유전자, 및 당단백질 호르몬을 포함하는 당단백질 호르몬을 생산하기 위한 백미드, 및 상기 바이러스의 숙주를 포함하는 당단백질 호르몬 생산용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 당단백질 호르몬 단백질 생산용 조성물을 이용하여 당단백질 호르몬 단백질을 생산하면 시간적, 경제적, 노동력 절약과 대량생산이 가능한 효과가 있다.

도 1은 BmC2Bac (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus C2 Baculovirus vector)를 구축하는 과정에서 Budded virus형인 BV-BmBacmid의 상동 재조합 과정 (A), 삽입된 염기서열의 genomic DNA 상에서의 배열과 제작된 Bacmid의 HindIII RFLP 예상 패턴 및 실재 패턴 비교 (B), Occluded virus의 누에 장내에서 감염 과정 (C), 세포 배양 환경에서 ODV-BmBacmid와 BV-Bacmid에서 바이러스 생산 형태 및 2차 감염 과정 (D)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라서 핵다각체병에 감염 된 누에에서 분리 된 BmC2NPV 게놈 내에 GFP (Green Fluorscence Protein, 형광 단백질) 유전자를 형질전환하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라서 상동 재조합(homologous recombination) 효율을 높이기 위해 polyhedrin 유전자의 5'-, 3'- 서열 영역을 각각 3 kbp 확장한 pBSK-C2-3kb-TF 트랜스퍼 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따라서 Cas9 단백질을 target 부위로 유도하는 crRNA (CRISPER RNA)와 tracrRNA (sequence-invariant trans-activating crRNA)의 필수적인 부위만을 연결하여 구축 된 single guide RNA (sgRNA), Cas9 단백질을 동시에 발현하는 all-in-one 벡터 및 pBac-ED1-GFP-T1 또는 T2를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 새로운 집누에 핵다각체병 바이러스 유래 외래 단백질 생산 시스템 구축을 위한 BmC2Bac를 제작하는 전체적 과정 (A) 및 신규 제작된 BmC2Bac 벡터를 이용하여 민물 장어 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 유전자 TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα의 구조, 트랜스퍼 벡터 내 클로닝, BmC2Bac에 대한 형질전환 (B) 및 단백질 생산 과정(C)을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라서 pDEST8 트랜스퍼 벡터에 삽입 된 TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα 유전자를 BmC2Bac 또는 AcNPV (DH10Bac, Invitrogen)에 형질전환하고 형질전환 여부를 PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라서 pDEST8 트랜스퍼 벡터에 삽입 된 TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα 유전자를 BmC2Bac 또는 AcNPV (DH10Bac, Invitrogen)에 형질전환하고 그 형질전환율을 그래프로 도식화한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라서 누에 세포, 누에 유충, 및 누에 번데기에서 발현 된 민물 장어 TSH 단백질을 SDS-PAGE한 후에 CBB 염색한 결과를 나타낸다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라서 누에 세포, 누에 유충, 및 누에 번데기에서 발현 된 민물 장어 TSH 단백질을 항-His 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따라서 TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα가 상동 재조합된 BmC2Bac를 누에 세포, 누에 유충, 누에 번데기에 감염하여 얻은 단백질 양을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라서 번데기에서 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질 (TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα, 및 TSHβ/eCG/TSHα)에 대하여 당쇄 절단 효소, PHGaseF 또는 EndoH를 처리한 결과를 나타낸다.
도 12은 본 발명의 일 실시예에 따라서 번데기에서 발현 및 분리한 민물 장어 TSH (TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα, 및 TSHβ/eCG/TSHα)에 대하여 당쇄 절단 효소, PHGaseF 또는 EndoH를 처리한 후, 항-His 항체를 이용하여 면역 블롯팅한 결과를 나타낸다.
도 13는 본 발명의 일 실시예에 따라서 번데기에서 발현 및 분리한 민물 장어 TSH (TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα, 및 TSHβ/eCG/TSHα)에 대하여 시알산을 인식하는 항체인 SSA 렉틴을 처리한 결과를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BV 및 ODV 타입의 BmC2Bac 백미드의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라서 재작한 BmC2Bac-TSHβ, BmC2Bac-TSHα, BmC2Bac-TSHβ/TSHα, 및 BmC2Bac-TSHβ/eCG/TSHα의 개열지도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. BmC2NPV의 게놈 DNA 준비

누에 베큘로 바이러스 게놈 DNA (BmC2NPV)의 준비과정은 다음과 같다.

강원도 농산물 원종장으로부터 Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus (이하 BmNPV) 감염으로 인한 핵 다각체병이 의심되는 누에 유충을 제공받았다. 감염된 누에 혈액을 0.2 um filter로 여과한 후, 누에 세포 (BmN) (ATCC CRL, USA, 8910)에 감염시켜 계대 배양하였다. 이때 BmN 세포는 10% (v/v) FBS를 포함하는 TNM-FH (WelGene, Korea) 곤충세포 배지를 이용하여 세포배양용 플라스크 (SPL T-25cm2, Korea)상에 25℃의 온도에서 3-4일 동안 배양하였다. 상기 감염시킨 누에 세포는 바이러스 감염으로 인한 세포사멸 및 occlusion body 형성 등의 세포 병변 효과를 관찰할 수 있었고, PCR 및 면역 블롯팅을 통하여 BmNPV 바이러스가 감염되었음을 확인하였다.

BmNPV 바이러스가 감염된 누에 세포를 이용하여 BmNPV의 게놈을 genomic DNA purification Kit (Promega, USA)를 사용해서 분리하고, 상기 분리된 BmNPV 게놈은 BmC2NPV로 명명하고, 상기 BmC2NPV의 전체 게놈 염기서열은 Genbank에 등록하였다 (NCBI accession no. KF306216). 상기 분리된 누에 베큘로 바이러스 게놈 DNA (BmC2NPV)를 이후 벡터 제작에 이용하였다.

실시예 2. BmNPV 게놈 벡터화( 백미드 제조)

BmC2Bac 백미드를 제작하기 위해서, 실시예 2-1에서 BmNPV-C2-GFP 게놈, 실시예 2-2에서 백미드 구성 유전자로서 E.coli miniF replication origin, LacZ marker, Tn7 transposase 서열 및 Kanamycin resistant marker 포함하는 전이 벡터 (pBSK-C2-3kb-TF), 및 실시예 2-3에서 BmNPV-C2-GFP 게놈의 선형화를 위한 GFP targeting sgRNA/Cas9 발현 벡터 (pBac-ED1-GFP-T1 또는 T2)를 제조하고, 상기 3가지 벡터을 BmN 세포에 함께 형질감염(co-transfection)하였다. 이하 자세한 실험과정을 설명하고자 한다.

실시예 1에서 분리한 베큘로바이러스 게놈 DNA (BmC2NPV)을 벡터화하기 위해서, 일차적으로 대장균의 복제 개시점 및 항생제 저항성 유전자를 베큘로바이러스 게놈 DNA에 삽입할 필요가 있다. 복제 개시점 및 항생제 저항성 유전자를 베큘로바이러스 게놈 DNA에 삽입할 위치는, 베큘로 바이러스 복제에 필수적이지 않은 핵다각체 단백질를 암호화하는 polyhedrin 유전자 부위로 정하였다. 또한, 추후 상동 재조합 (homologous recombination)으로 특정 서열이 삽입된 재조합 바이러스(백미드)의 용이하게 선별하기 위해 polyhedrin 유전자를 GFP로 치환한 재조합 바이러스를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.

2-1. ( BmC2NPV - GFP ) DNA 게놈 제조

실시예 1에서 분리한 BmC2NPV를 누에 세포 (BmN)에서 대량 배양하여 바이러스를 증식시킨 후 바이러스 유전자를 Wizard genomic DNA purification Kit (Promega, USA, A1620)를 사용하여 분리 정제하였다.

상기 분리 정제한 베큘로 바이러스 게놈 DNA에 GFP 유전자를 삽입하기 위하여, pEGFP-N1 (Invitrogen, USA)의 Enhanced GFP (EGFP) 유전자 서열 양 말단에 BmC2NPV의 polyhedrin 유전자 양측 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)을 포함하는 구조를 갖는 GFP 삽입용 벡터 (pBSK-C2-5F-GFP-3F)를 제작하였다. GFP 삽입용 벡터 (pBSK-C2-5F-GFP-3F)의 개열지도는 도 2에 나타나 있고, BmC2NPV 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)은 서열번호 23 및 24에 기재되어 있다.

BmN 세포주에, 실시예 1에서 분리한 베큘로바이러스 게놈 DNA와 상기 GFP 삽입용 전이 벡터(pBSK-C2-5F-GFP-3F 전이 벡터)를 Cellfectin II (Thermo Fisher Scientific, USA) transfection reagent로 트랜스펙션하고, GFP를 발현하는 BmN 세포에서 Wizard genomic DNA purification Kit (Promega, USA, A1620)를 사용하여 재조합 바이러스를 분리 정제하여 재조합 바이러스 게놈(BmC2NPV-GFP)을 얻었다 (도 2). 상기 바이러스 게놈 (BmC2NPV-GFP)을 Cellfectin II (Thermo Fisher Scientific, USA)로 BmN 세포 내에 트랜스펙션하여 형광현미경 (TS100F, Nicon)상에서 관찰하여 세포내 감염을 확인하였다.

2-2. 벡터구성 유전자 도입을 위한 벡터제조

( pBSK -C2- 3kb - TF 벡터 제조)

실시예 2-1에서 제작한 BmC2NPV-GFP 게놈에서 GFP 유전자를, E.coli miniF replication origin, LacZ marker, Tn7 transposase 서열 및 Kanamycin resistant marker로 치환하기 위해서, BmC2NPV-GFP 유전자에 E.coli miniF origin-LacZ-Tn7-KanR (8,393 bp)를 전달하기 위한 벡터인 pBSK-C2-3kb-TF를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.

구체적으로, E.coli miniF origin-LacZ-Tn7-KanR (8,393 bp) 염기서열은 베큘로 바이러스 AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) bacmid (DH10Bac, Invigrogen, USA)로부터 하기 표 1에 기재되어 있는 센스 프라이머(miniF 5') 과 안티센스 프라이머인(kana 3’) 및 Ex taq polymerase (TAKARA, Japan)를 사용한 PCR을 수행하여 증폭하였다.

상기 증폭한 miniF origin-LacZ-Tn7-KanR 양말단에 상동 재조합 과정에 필요한 BmC2NPV의 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측 3 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)이 존재하는 벡터를 제작하기 위해서, 실시예 2-1에서 제작한 pBSK-C2-5F-GFP-3F를 백본, 및 하기 표 1에 기재된 센스 프라이머와 안티센스 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 pBSK-C2-3kb-TF를 제작하였다. 상기 과정을 통해서 제작된 pBSK―C2-3kb-TF 트랜스퍼 벡터의 개열지도는 도 3에 나타나 있고, BmC2NPV 폴리헤드린 (polyhedron) 유전자 양측 3 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)은 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)이 중복되어 있고, 상기 서열은 서열번호 25 및 26에 기재되어 있다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호
miniF 5'	GGATCCATACGAAACGGGAATGCGGTAATTACGCTTTGTTTTTATAAGTCA	5
Kana 3'	TAAATGTACTAATAACAATGTATAGTGTTTTAATCTAGCCTAGCTTTTGCT	6
5F 5'	CGTTGTACATCCTCGTTTTTAATCATGCCGTCG	27
5F 5'3'	CCGGTCTGGTAAGCACAACGTTGTACATCCTCGTT	28
5F 3'5'	AACGAGGATGTACAACGTTGTGCTTACCAGACCGG	29
5F 3'	ATTTATTTGCGAGATGGTTATTATTTCCATTTA	30
3F 5'	ATTAAAACACTATACATTGTTATTAGTACATTTATT	31
3F 5'3'	TGTATAGTGTTTTAATTAAATATTTTAAAGT	32
3F 3'5'	ACTTTAAAATATTTAATTAAAACACTATACA	33
3F 3'	GTACGTCGACGACAGCGAAGTGTCTCGCTACTACAA	34

2-3. BmNPV -C2- GFP 바이러스 게놈 선형화를 위한 벡터 제조

( pBac -ED1- GFP -T1 또는 T2의 제작)

실시예 2-1에서 제조한 BmC2NPV-GFP 바이러스 게놈에, 실시예 2-2에서 제조한 벡터 pBSK-C2-3kb-TF상에 위치하는 miniF origin부터 kanR까지의 약 8.4 kbp 서열을 상에 삽입하기 위해서는 높은 효율로 상동성 재조합이 일어나야 한다. 일반적으로 원형 DNA보다 선형 DNA 상에서 상동 재조합 효율이 높은 것으로 밝혀져 있으므로, CRISPER/Cas9를 사용하여 실시예 2-1에서 제작한 BmC2NPV-GFP 바이러스 게놈을 선형화하는데 필요한 pBac-ED1-GFP-T1 또는 T2를 하기와 같은 방법으로 제작하였다. 하기 실험 방법은 도 4 에 모식화되어 있고 상기 제작한 pBac-ED1-GFP-T1 또는 T2의 개열지도는 도 4에 나타나 있다.

구체적으로, CRISPR/Cas9 system을 이용하고자, 곤충 세포에서 sgRNA와 Cas9 단백질을 동시에 발현하는 all-in-one 벡터로 제작하기 위해서, sgRNA는 U6 promoter와 terminator 사이에서 발현되도록 고안하였다. 우선, PCR 및 유전자 합성으로 제작된 U6 promoter-sgRNA cloning site-tracrRNA-U6 terminator 염기서열 (addgene USA, 48962)을 pDEST8 벡터 (Invitrogen, USA, 11804010)의 PH promoter의 upstream에 삽입하여 pDEST8-Tracr를 제작하였다. Cas9 유전자의 양말단에 nuclear localizing signal (NLS)를 붙여 pENTR-Topo 벡터 (Invitrogen USA, k2400-20)에 클로닝하여 pENTR-Cas9를 제적하였다. 그리고 나서 Cas9 유전자는 gateway LR 반응으로 sgRNA 발현 cassette가 클로닝되어 있는 pDEST8-Tracr 벡터에 subcloning하하여 pBac-ED1을 제작하였다.

상기 제작한 pBac-ED1는 베큘로 바이러스 게놈을 수정할 수 있는 CRISPR/Cas9 all-in-one 벡터로서, 상기 pBac-ED1 벡터에 GFP를 목적화할 수 있는 guide RNA sequence T1 또는 T2 (하기 표 2 참조)를 클로닝을 통해 삽입하여 각각 pBac-ED1-GFP-T1 또는 T2를 제작하였다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호
T1	GGTGAACCGCATCGAGCTGA	7
T2	GGTCAGGGTGGTCACGAGGG	8

2-4. 상동 재조합을 통한 백미드의 형성

BmC2Bac를 최종적으로 제작하기 위해서, 실시예 2-1에서 제작한 BmC2NPV-GFP 게놈을 BmN 세포에 실시예 2-2에서 제작한 전이 벡터 (pBSK-C2-3kb-TF), 및 실시예 2-3에서 GFP targeting sgRNA/Cas9 발현 벡터 (pBac-ED1-GFP-T1 또는 T2)의 3가지 벡터를 Cellfectin II (Thermo Fisher Scientific, USA) 를 사용하여 공동 트랜스펙션 (co-transfection)하였다.

그런 후에, 상동 재조합으로 인해 GFP 부위가 miniF origin-KanR로 치환되어 형광을 발현하지 않는 재조합 바이러스를, 항생제 (kanamycin, gentamicin, ampicillin, Thermo Fisher, USA)를 사용하여 플라크 분석을 수행한 후에, 형광현미경 (TS100F, Nicon)을 이용하여 분리하였다.

상기 분리한 상동 재조합 바이러스를 계대배양하여 증식시킨 후, PEG 침전 방법을 사용하여 바이러스를 농축하고, Wizard genomic DNA purification Kit (Promega, USA, A1620)를 사용하여 베큘로 바이러스 게놈 DNA를 분리하였다.

상기 분리한 베큘로바이러스 게놈 DNA를 DH10B E. coli (Invitrogen USA, 18297010)에 형질전환하고, 카나마이신 저항성 클론을 선별하였다.

선별된 백미드 BmC2Bac를 발현하는 대장균 클론으로부터 Wizard genomic DNA purification Kit (Promega, USA, A1620)로 게놈 DNA를 분리한 후에, 제한효소 HindIII (TAKARA, Japan, 1060A)를 처리하여 얻은 RFLP 패턴을, 예상한 결과 패턴과 비교하여, 정확히 온전한 게놈을 가지고 있음을 확인하였다 (도 1의 B).

상기 제작한 BmC2Bac 백미드의 개열지도는 도 14의 상단 (BV 타입)에 나타나 있다. 상기 제작한 BmC2Bac 백미드에서 polyhedrin 유전자 양측 1.5 kbp 측면 (flanking) 서열 (5F, 3F)사이에는 E.coli miniF replication origin, LacZ marker, Tn7 transposase 서열 및 Kanamycin resistant marker 유전자가 포함되어 있다.

상기 BmC2Bac 백미드가 트랜스포메이션 (Transformation)된 E.coli DH10B에 Tn7 transposase 서열을 발현하는 헬퍼 벡터 (helper vector, pMON7124, tetracyclin resistance)를 트랜스포메이션하여 최종적으로 누에 핵 다각체 C2 베큘로 바이러스 벡터 (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus C2 Baculovirus vector, BmC2Bac)를 발현하는 E. coli를 제작하였다. 상기 과정은 도 5 왼쪽에 모식화되어 있다.

상기 제작한 BmC2Bac을 발현하는 E. coli는 민물 장어 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 단백질 생산을 위해 사용하였다.

실시예 3. 민물장어 TSH 생산을 위한 백미드 제작

3-1: 민물장어 TSH 유전자의 준비

민물장어 TSH 유전자를 제공하는 pDEST8-TSHβ, pDEST8-TSHα, pDEST8-TSHβ/TSHα과 pDEST8-TSHβ/eCG/TSHα 벡터를 제조하였다.

구체적으로, 국립수산과학원에서 제공한　민물장어에서 제조사가제공한 방법에 따라서 Trizol (Thermofisher, USA, 15596018)를 사용하여 전체 RNA를 분리하고 하고 이를 주형으로 하여 oligo-d(T)18 프라이머와 ReverTra Ace qPCR RT Master mix kit (Toyobo, Japan, F0921K)를 이용하여 37℃에서 5분간 처리하여 게놈 DNA를 제거 한 후, 37℃에서 15분 동안 합성하고 98℃ 5분간 처리하여 역전사효소를 불활성화하여 cDNA를 합성하였다.

TSH (갑상선 자극 호르몬)의 베타 유전자 또는 알파 유전자를 증폭하기 위해서, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 하고 하기 표 3에 기재된 프라이머를 이용하여 KOD -plus- polymerase (Toyobo, Japan)로 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃에서 30초 변성, 57℃에서 30초 어닐링, 68℃에서 1분 연장 반응 과정을 30 사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 각각 약 441 bp와 279 bp 임을 1% (w/v) 아가로스 겔의 전기영동으로 확인하였다.

TSH의 베타 유전자와 알파 유전자가 융합된 유전자 서열을 증폭하기 위해서, 상기 합성한 TSH의 베타 유전자 및 알파 유전자를 주형으로, 하기 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여 상기와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물은 약 720 bp 임을 1% (w/v) 아가로스 겔의 전기영동으로 확인하였다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호	Tm ()	Cycle
TSH-beta 센스 프라이머	ATGAGAGTGGTCCTGTTGGCC	9	57	30
TSH-beta 안티센스 프라이머	GCGGCCGCGAGGGTCTGGATGTGGTTGCT	10	57	30
TSH-alpha 센스 프라이머	TATCCCAACAACGAAATG	11	57	30
TSH-alpha 안티센스 프라이머	GCACCTGCTACTACCACAAATTTGCGGCCGC	12	57	30
TSH beta/TSH-alpha 센스 프라이머	ATGAGAGTGGTCCTGTTGGCC	13	57	30
eCG CTP 안티센스 프라이머 (1차)	AGGTTGGGATGGGAGGGTCTGGAT	14	57	30
eCG CTP 센스 프라이머 (2차)	ATCCAGACCCTCCCATCCCAACC	15	57	30
트랜스포메이션확인 프라이머 #1	GCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGC	16	57	30
트랜스포메이션확인 프라이머 #2	TCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC	17	57	30
트랜스포메이션확인 프라이머 #3	CAGGAAACAGCTATGACCATGTAATACGA	18	57	30

또한, TSH의 베타 유전자와 알파 유전자 사이에 말의 생식선 호르몬 베타의 C 말단서열 (equine chorionic gonadotropin C-terminal peptide; 이하 eCG CTP) 영역에서 신장 된 서열인 81개의 염기서열을 삽입하기 위해서, 상기 표 3에 기재된 프라이머를 베타 유전자의 센스 프라이머와 eCG CTP 서열을 포함하는 안티센스 프라이머 (1차)를 사용하여 상기와 같은 조건으로 1차 PCR을 수행하고, 상기 1차 PCR 산물에 대하여 eCG CTP 센스 프라이머 (2차) 및 TSH 알파 유전자는 안티센스 프라이머를 사용하여 상기와 같은 조건으로 2차 PCR을 수행하고, 상기 2차 PCR 산물에 대하여 TSH 베타-알파 센스 프라이머 및 TSH 알파 유전자는 안티센스 프라이머로 상기와 같은 조건으로 3차 PCR을 수행하여 TSHβ/eCG/TSHα 산물을 얻었다.상기 PCR 산물은 약 800 bp 임을 1% (w/v) 아가로스 겔의 전기영동으로 확인하였다.

상기 방법으로 얻은 4개의 TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα 산물은 6X-His 표지가 있는 pENTR 벡터 (Invitrogen, USA)에 클로닝하고,　이어서 상기 4개의 TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα 산물 및 6X-His 표지를 포함하는 유전자를 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라서 pDEST8 벡터 (Invitrogen, USA)에 LR clonase II plus(Invitrogen, USA, 12538120)를 사용하여 삽입하여 전이 벡터를 제작하였다.

3-2: 민물장어 TSH 유전자를 벡미드에 도입

실시예 3-1에서 제작한 각각의 pDEST8-TSHβ, pDEST8-TSHα, pDEST8-TSHβ/TSHα과 pDEST8-TSHβ/eCG/TSHα 벡터를, 실시예 2-4에서 제작한 BmC2Bac을 발현하는 E. coli에, Micropulser (BioRad, USA)를 사용한 전기충격 (Electroporation)으로 트랜스포메이션(Transformation)시키고, 상기 E. coli에 트랜스포메이션된 상기 pDEST8-TSHβ, pDEST8-TSHα, pDEST8-TSHβ/TSHα과 pDEST8-TSHβ/eCG/TSHα 벡터는 E. coli에서 발현하는 BmC2Bac의 Tn7 transposase 서열을 인식하여 상동 재조합이 일어났다.

상기 TSH 유전자가 BmC2Bac에 상동 재조합된 E. coli 콜로니를 항생제 (kanamycin, gentamicin, ampicillin, Thermo Fisher, USA)를 이용하여 선별하고 하기와 같은 방법으로 프라이머를 이용하여 상동 재조합이 정상적으로 되었는지 여부 (트랜스퍼 벡터가 삽입)를 확인였다.

상기 선별한 콜로니로서 BmC2Bac-TSHβ, BmC2Bac-TSHα, BmC2Bac-TSHβ/TSHα, 및 BmC2Bac-TSHβ/eCG/TSHα는 LB 액체배지에서 37℃에서 약 18시간 진탕배양한 후 3,000 rpm에서 원심분리하여 세포만을 모아서, 상기 세포에서 백미드 (baculovirus plasmid, Bacmid)를 알칼리 용균법 (alkali lysis mathod)으로 분리하였다.

상기 제작한 BmC2Bac-TSHβ, BmC2Bac-TSHα, BmC2Bac-TSHβ/TSHα, 및 BmC2Bac-TSHβ/eCG/TSHα의 개열지도는 도 15에 나타나 있다.

3-3: 백미드에 형질전환 확인

해당 유전자가 상기 선별한 E. coli에 트랜스포메이션이 정상적을 되었는지 여부를 확인하기 위해서, 표 3에 기재된 세 가지 프라이머 (트랜스포메이션 확인 프라이머 #1, 내지 3)로 PCR을 수행하고 증폭산물에 대해 전기영동을 수행하여 도 6에 나타냈다.

도 6 에 나타난 것과 같이, PCR 산물은 양성을 나타낸 경우 1.2 kb, 음성을 나타낼 경우 0.3 kb의 밴드가 나타나므로, 선별한 콜로니 E. coli에 각각의 벡터가 트랜스포메이션 되었음을 확인할 수 있었다 (대조군으로는 BmC2Bac를 사용하여 음성일 경우 0.3 kb 밴드가 확인 되었음, 데이터 생략). 트랜스포메이션 확인 벡터 프라이머 #2와 # 3의 경우 BmC2Bac 벡터의 프라이머로 원하는 유전자 (pDEST8 트랜스퍼 벡터)가 삽입되지 않을 경우 0.3 kb의 밴드가 확인되며, 트랜스퍼 벡터 즉 pDEST8의 겐타마이신 영역에 해당하는 프라이머인 트랜스포메이션 확인 벡터 프라이머 #1에 의해 1.2 kb의 밴드가 확인되어 원하는 트랜스포메이션이 있었음을 확인하였다.

상기 확인한 TSHβ은 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, TSHα은 서열번호 20의 염기서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며, TSHβ/TSHα는 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며, TSHβ/eCG/TSHα은 서열번호 22의 염기서열과 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었다.

3-4: 벡미드의 형질전환율 확인

상기 실험에서 형질전환율의 정도를 확인하기 위해서, 대조군으로 AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 유래의 DH10Bac 벡터 (Invitrogen, USA)를 사용하여 전체 콜로니 중에서 양성을 나타낸 콜로니의 개수를 도 6에 나타냈다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 실시예 3-2의 방법을 수행하여 얻은 콜로니의 형질전환율을 69%였고, 대조군의 경우는 72%를 나타냈다. 본 발명에 따른 민물 장어 TSH 생산을 위한 백미드는 50% 이상의 형질전환율을 가지고 있어, 발현 벡터로서 유효함을 확인할 수 있었다.

3-5: 벡미드의 누에 세포에 형질전환

실시예 3-2에서 얻어진 BmC2Bac-TSHβ, BmC2Bac-TSHα, BmC2Bac-TSHβ/TSHα, 및 BmC2Bac-TSHβ/eCG/TSHα 재조합 백미드 4종류를, 누에 세포 (BmN) (ATCC CRL, USA, 8910)에 FuGene (Promega, USA)에 형질감염하고 25℃, 4일간 배양을 3회 반복하여 바이러스 수를 5 x 10⁷ ~ 10 x 10⁷개/mL로 높인 후에, 상기 각각의 재조합 백미드가 형질감염된 누에 세포 (BmN)는 단백질을 분리하는데 사용하거나 4℃에 보관했다. 상기 보관한 누에 세포는 추후 곤충 세포, 누에 유충, 누에 번데기 재감염 시 사용할 수 있다.

구체적인 누에 세포 형질감염방법으로서, 실시예 3-2에서 얻어진 백미드 (5 ug)을 1,2-dimyristyloxypropyl-3dimethyl-hydroxy ethyl ammonium bromid (DMRIE)-C reagent (invitrogen, USA) 5 uL와 혼합하여, 누에 유충 또는 번데기 (1일째) 체강내에 주사하고, 상기 누에 유충 또는 번데기에서 재조합 바이러스를 얻을 수 있었다. 상기 체강내 주사는 3회 반복하여 수행하며, 바이러스 수는 5 x 107 ~ 10 x 107개/mL 이상이 되도록 하며, 상기 누에 유충 또는 번데기는 추후 단백질 분리하는데 사용하거나 4℃에 보관했다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 선별한 콜로니 E. coli에 각각의 벡터가 형질전환이 되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 누에 세포내에서 민물장어 TSH 단백질의 발현 및 분리

실시예 3-2의 방법으로 제작한 TSH 유전자를 생산하는 백미드를 알칼리 용균법으로 분리하고, 상기 분리한 TSH 유전자를 포함하는 백미드를 Fugene (Promega, USA)로 누에 세포 (BmN)에 형질전환 시킨 후, 4일간 배양하여 각각의 TSH 베타, 알파, 베타/알파, 베타/eCG/알파를 생산하는 누에 세포 (곤충세포)를 제작하였다.

구체적으로, BmN 세포는 SPL (T-75, Korea) 플라스크에서 10% (v/v) FBS를 포함하는 TNM-FH (WelGene, Korea) 곤충세포 배지상에서 24-25℃에서 배양하였다. 플라스크의 표면적의 70% 정도 곤충세포가 자랐을 때, FuGENE HD (transfection regent, Promega, USA)를 이용하여 실시예 2의 방법으로 제작한 TSH를 생산하는 백미드를 곤충세포에 형질전환 시킨 후, 이를 4일간 TNM-FH (WelGene, Korea) 곤충세포 배지에서 배양하여 민물장어 TSH 및 eCG, 또는 민물장어 TSH이 발현된 세포 배양액을 확보하였다. 상기 형질전환 된 곤충세포에서 배양된 바이러스를 포함하는 용액을 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 그 상등액을 MILLEX-AA 컬럼 (Merck Millipore USA, SLAA033SB)에 적용하여 정제하고, 4℃에 보관하였다.

정제과정에서 단백질의 생물학적 기능에 손상이 없고, 세포를 마쇄하여 세포용출물을 추출 하는 동안 단백질이 안정하게 존재할 수 있도록 중성 (pH 7-8), 20-50 mM의 인산 버퍼 (Phosphate acid buffer)를 기본으로 해서 PMSF (Phenylmethane sulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), AEBSF(4-2-aminoethyl-benzenesulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), Leupeptin (세린, 시스테인 프로테아제 저해제), Pepstatin (산성프로테아제 저해제), Chymostatin (카이모트립신 저해제) 등을 포함하는 protease inhibitor cocktail (Roche, Germany), 산화방지를 위한 환원제; 2-merchaptoethanol, DTT (Dithiothreitol), 금속 프로테아제 저해를 위해 대표적으로 사용하는 EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 및 0.1 mM EDTA를 완충액을 사용하였다.

세포를 마쇄하기 위해 폴리트론 호모게나이저 (polytron homogenizer)를 이용하여 28-30 pulse로 5초간 마쇄하고 5초간 휴지하는 것을 5분간 지속하였다. 또한, 마쇄에 의한 열발생으로 인한 단백질의 변성을 막기 위해서, 단백질의 발현 및 분리의 모든 과정은 저온에서 수행하였다. 세포 마쇄가 완료되면 13,000 rpm에서 20분간 원심분리를 수행하여 침전물을 제거하였다. 이 과정을 두 번 반복하여 진행한 후 MILLEX-AA 컬럼 (Merck Millipore USA, SLAA033SB)을 이용하여 불순물을 제거하였다.

또한, 세포배양액에는 PMSF, Protease inhibitor cocktail, 0.1 mM EDTA를 첨가하였다. 불순물 제거를 위해 MILLEX-AA 컬럼 (Merck Millipore USA, SLAA033SB )을 이용하여 1차 정제 후, 분비형 단백질만을 얻기 위해 His-Trap FF column으로 FPLC (AKTA Fast Protein Liquid Chromatography, GE Health, USA)를 이용하여 고순도 정제를 수행하였다. 상기 FPLC는 유체속도 1 mL/min, 샘플 부피는 100 mL로 조절하여 정제를 수행하였다.

실시예 5. 누에 유충 및 번데기에서 민물장어 TSH의 발현 및 분리

실시예 4와 같은 방법으로, 형질전환된 누에 세포로부터 민물장어 TSH의 발현 하도록 재조합된 베큘로 바이러스를 각 TSH 바이러스를 포함함는 상등액을 얻은 즉시 또는 상기 상등액을 냉장 보관 후, 이를 누에 유충 또는 번데기 생체에 주입하여 외래 단백질을 하기와 같은 방법으로 발현시켰다.

본 발명에서 민물장어 TSH를 발현시키기 위해 사용되는 숙주 누에 또는 번데기는 대성잠 (잠125x잠126)을 이용하였다. 누에 유충은 24-25℃에서 상엽(뽕나무잎) 또는 인공사료로 1일 2 -3 회 급여하여 4-5일간 사육하고, 누에 번데기는 24-25℃ 실내에 4-5일간 자연방치하면 각 생체내에서 바이러스가 증폭하여 단백질을 얻을 수 있었다.

상기 누에 유충 또는 번데기의 체액 또는 세포로부터 서열번호 1과 2의 아미노산 서열로 이루어진 민물장어 TSH를 하기와 같은 방법으로 분리, 정제하였다. 상기 체액에서 얻은 단백질은 유효한 당쇄 수식이 존재하고, 세포 마쇄액에서 얻은 단백질도 유효한 당쇄 수식이 존재한다. TSHβ은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, TSHα은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다.

TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα와 TSHβ/eCG/TSHα를 포함하는 백미드를 0.5 x 105 PFU (Plaque for min unit, 플라크 형성 단위)를 포함하는 누에 세포(BmN)의 배양액 (TNM-FH, WelGene, Korea) 20 uL을, 5령 누에유충 또는 1일 번데기(번데기 탈피 후 1일)에 주사기 (Hamilton, USA)로 주사하여 24-25℃에서 효소 발현의 최대치가 되는 72시간까지 배양하였다.

단백질을 분리하기 위해서 누에 유충 또는 번데기의 혈액을 수집하고 또 지방체세포 (또는 wholebody를 사용해도 무방하나 이물질 분리에 소비 되는 시간 및 노력을 줄이고자 지방체만을 분리하여 사용하였음)를 호모게나이저로 마쇄하였고, 누에 유충 또는 번데기의 혈액과 지방체 마쇄액은 13,000 rpm에서 20분간 2회 원심분리하여 그 상등액을 모았다.

누에 유충 또는 번데기의 세포는 실시예 4의 방법과 동일한 방법을 사용하여 세포를 마쇄하고, 이어서 MILLEX-AA 컬럼 (Merck Millipore USA, SLAA033SB)을 이용하여 불순물을 제거하였다.

정제과정에서 단백질의 생물학적 기능에 손상이 없고 마쇄하여 추출 하는 동안 단백질이 안정하게 존재할 수 있도록 중성 (pH 7-8), 20-50 mM의 인산완충액(Phosphate acid buffer)을 기본으로 해서 PMSF (Phenylmethane sulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), AEBSF(4-2-aminoethyl-benzenesulfonyl fluoride, 세린프로테아제 저해제), Leupeptin (세린, 시스테인 프로테아제 저해제), Pepstatin (산성프로테아제 저해제), Chymostatin (카이모트립신 저해제) 등을 포함하는 protease inhibitor cocktail(Roche, Germany), 산화방지를 위한 환원제; 2-merchaptoethanol, DTT(Dithiothreitol), 금속 프로테아제 저해를 위해 대표적으로 사용하는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 및 0.1 mM EDTA를 완충액을 사용하였다.

또한, 누에 5령 유충 또는 번데기의 세포 배양액 및 누에 유충 또는 번데기의 혈액의 경우, 원심분리하여 얻은 상등액에 PMSF, Protease inhibitor cocktail, 0.1 mM EDTA를 첨가하였다. 불순물 제거를 위해 MILLEX-AA 컬럼 (Merck Millipore USA, SLAA033SB)을 이용하여 1차 정제 후, 분비형 단백질만을 얻기 위해 His-Trap FF column으로 FPLC (AKTA Fast Protein Liquid Chromatography, GE Health, USA)를 이용하여 고순도 정제를 수행하였다. 상기 FPLC는 유체속도 1 mL/min, 샘플 부피는 100 mL로 조절하여 정제를 수행하였다.

실시예 6. 발현된 민물장어 TSH 단백질의 확인

6-1. Coomassie Brilliant Blue를 이용한 확인

실시예 4 및 5에 따라 발현 및 분리한 민물장어 TSH 단백질을 확인하기 위해서, 12% (v/v) SDS-PAGE겔에 전기영동하고 제조사가 제공하는 방법으로 Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBBR-250, BioRad. USA 161-0436)로 염색하였다.

도 8 에서 확인할 수 있는 것과 같이, 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 아미노산 서열의 전기영동상의 예상되는 크기인 16.0, 13.3, 27.7, 또는 30.3 kDa (His 및 TEV 서열을 합하면 18.9, 16.1, 29.8, 32.4 kDa) 보다 약 1.2-5 kDa이 큰 위치인 약 19, 18, 31과 35 kDa에서 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.

6-2. 면역 블롯팅을 이용한 확인

실시예 4 및 5에 따라 발현 및 분리한 민물장어 TSH 단백질 (베타, 알파, 베타/알파, 베타/eCG/알파)을 정확히 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 His 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 4 및 5에서 분리한 민물장어 TSH 단백질을 확인하기 위해서 12% (v/v) SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 상기 전기영동 한 겔을 Polyvinylidene difluoride(PVDF, Merck Millipore, USA. IPFL00010)에 전이하고 TSH 단백질에 특이적으로 결합하는 HRP conjugated 6 x His 항체 (Abcam, USA, ab1187)를 이용하여 면역 블로팅(웨스턴 블로팅)을 수행하였다.

도 9 에서 확인할 수 있는 것과 같이, 실시예 6-1의 CBB로 염색하여 확인한 것과 동일한 크기인 약 17, 17, 31과 35 kDa에서 밴드를 확인할 수 있었다.

6-3. 민물 장어 TSH 단백질의 농도 확인

15개의 세포 배양 플라스크(75cm2) 에 존재하는 누에 세포 (BmN)에서 실시예 4과 같은 방법으로 민물 장어 TSH 단백질을 분리하고, 누에 유충 또는 번데기 100마리에서 실시예 5와 같은 방법으로 민물 장어 TSH 단백질을 분리하여 동결건조하고 -70℃에 보관하였다.

상기 누에 세포에서 동결 건조한 민물 장어 TSH 단백질의 최종 분말의 무게는 3-5 mg이었고, 상기 누에 유충 또는 번데기에서 동결건조한 민물 장어 TSH 단백질의 최종 분말의 무게는 7~9.8g였다. 상기 동결건조한 민물 장어 TSH 단백질의 최종 분말을 PBS 또는 NaCl 버퍼에 녹여 BCA 법에 의해 단백질 농도를 확인하였다.

도 10 에 나타난 것과 같이, 누에 세포의 경우 (BmN) 민물 장어 TSH 단백질의 농도는 0.01~0.02 mg/mL이었고, 누에 유충의 경우 (Larvae) 민물 장어 TSH 단백질의 농도는 4.3~6.1 mg/mL이었으며, 번데기의 경우 (Pupae) 민물 장어 TSH 단백질의 농도는 3.5~7.12 mg/mL이었다.

누에 세포를 이용한 민물 장어 TSH 단백질 생산에 비해, 누에 유충 또는 번데기에서 발현시키는 것이 TSH 단백질의 수득 효율이 높음을 확인할 수 있었다,

실시예 7: 발현된 민물장어 TSH 단백질의 당쇄 수식 확인

7-1. 당단백질을 특이적으로 인식하는 효소를 이용하여 당쇄 수식 확인

실시예 4 및 5에 따라 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질에 대하여 N-glycan을 가수분해하는 PNGaseF (NEB, Japan, P0704S) 효소 및 EndoH (NEB, Japan, P0702S) 효소를 제조사가 제공하는 방법을 사용하여 단백질의 당쇄 수식 여부를 확인 하였다.

N-연결 당이 수식되는 당단백질의 N-연결 당이 수식되는 위치의 아미노산 서열은 아스파라긴산(asparagine acid, Asn) 및 프롤린산 (proline acid, Pro)을 제외한 모든 아미노산 서열과 이어지고, 그 다음에 세린 (serine) 또는 트레오닌 (threonine) 이 이어져 있는 것으로 알려져 있다 (Asn-X-S/T). PNGaseF 효소는 아스파라긴산과 N-acetylglucosamine 사이의 사슬을 자르며, complex, hybrid, high-mannose 타입의 모든 유형의 당단백질과 아스파라긴산 사이의 사슬을 자르는 것으로 알려져 있다. EndoH 효소는 아스파라긴산과 N-acetylglucosamine 다음의 사슬을 자르며 이는 아스파라긴산과 hybrid, high-mannose 타입의 당단백질 다음의 사슬을 자르는 것으로 알려져 있다.

실시예 4 및 5에 따라 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질을 PNGaseF 효소및 EndoH 효소를 처리하고 실시예 6-1과 같은 방법으로 Coomassie Brilliant Blue 염색 결과를 도 11에 나타냈다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 실시예 5의 방법으로 번데기에서 발현 및 분리한 모든 민물 장어 TSH 단백질 (TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα 및 TSHβ/eCG/TSHα)는 PNGaseF효소에 의해서 절단됨이(PF) 확인되었고, EndoH 효소에 의해서는 잘리지 않는 것 (EH)을 확인할 수 있었다. ND는 EndoH 또는 PNGase F 효소를 처리하지 않은 대조군이다. 이에, 실시예 4의 방법으로 발현 및 분리한 모든 TSH 단백질(TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα 및 키메라 형태인 TSHβ/eCG/TSHα 단백질)의 당쇄는 복합 타입의 당단백질임을 확인할 수 있었다.

실시예 4 및 5에 따라 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질을 PNGaseF 효소및 EndoH 효소를 처리하고 실시예 6-2과 같은 방법으로 면역 블롯팅을 수행하여 도 12에 결과를 나타냈다.

도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 5의 방법으로 번데기에서 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질 TSHβ는 다른 단백질 (TSHα, TSHβ/TSHα 및 TSHβ/eCG/TSHα)에 비해서 효소 처리 후 밴드의 변화가 적었지만, 효소 처리에 의해서 당쇄가 잘려진 것은 확실히 확인할 수 있었다.

7-2. 렉틴을 이용한 당쇄구조의 예측

실시예 7-1에서 확인한 실시예 4 또는 5의 방법을 이용하여 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질의 당쇄 수식의 구조를 예측하기 위해서, 특이 당쇄에 반응하는 렉틴 (lectin)을 이용하여 당쇄 구조를 예측하는 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 5의 방법을 이용하여 번데기에서 발현 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질 (TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα 및 TSHβ/eCG/TSHα)를 시알산(sialic acid) 특이 당쇄에 반응하는 렉틴 Maackia amurenisis (MAM,J-oil Inc, Japan), Sambucus sieboldiana (SSA, J-oil Inc, Japan)을 사용하여 면역 항원항체 반응을 수행하였다. 구체척 방법으로 발현 및 분리한 민물장어 TSH 단백질을 확인하기 위해서 12% (v/v) SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 상기 전기영동 겔을 Polyvinylidene difluoride (PVDF, Merck Millipore, USA. IPFL00010)에 전이하고 TSH 의 시알산에 특이적으로 결합하는 MAM과 SSA 항체 (J-oil Inc, Japan)를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하고 결과를 도 13에 나타냈다.

도 13 에서 확인할 수 있는 것과 같이, 실시예 5의 방법을 이용하여 발명 및 분리한 민물 장어 TSH 단백질 (TSHβ, TSHα, TSHβ/TSHα 및 TSHβ/eCG/TSHα) 모두는 N-glycan 시알산에 반응하는 MAM과 N-과 O-glycan 시알산 (sialic acid)에 반응하는 SSA에 반응하는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Gyeongbuk Institute for Marine Bioindustry <120> Composition for producing glycoprotein hormones protein <130> DPP20170614KR <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSHbeta amino acid <400> 1 Met Arg Val Val Leu Leu Ala Ser Gly Val Leu Cys Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gln Val Leu Ser Ile Cys Ser Pro Val Asp Tyr Thr Leu Tyr Val Glu 20 25 30 Lys Pro Glu Cys Asp Phe Cys Val Ala Ile Asn Thr Thr Ile Cys Met 35 40 45 Gly Phe Cys Tyr Ser Leu Asp Pro Asn Val Val Gly Pro Ala Val Lys 50 55 60 Arg Leu Ala Val Gln Arg Gly Cys Thr Tyr Gln Ala Val Glu Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Ala Glu Leu Pro Gly Cys Pro Pro His Val Asp Pro Arg Phe Ser 85 90 95 Tyr Pro Val Ala Leu His Cys Thr Cys Arg Ala Cys Asp Pro Ala Arg 100 105 110 Asp Glu Cys Thr His Arg Ala Ser Ala Asp Gly Asp Arg Cys Ser Lys 115 120 125 Pro Leu Leu Leu His Met His Ala Tyr Pro Gly Gln Ser Asn His Ile 130 135 140 Gln Thr Leu Ala Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Gly Glu Asn Leu Tyr 145 150 155 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7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T1 <400> 7 ggtgaaccgc atcgagctga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2 <400> 8 ggtcagggtg gtcacgaggg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSH-beta sense primer <400> 9 atgagagtgg tcctgttggc c 21 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSH-beta antisense primer <400> 10 gcggccgcga gggtctggat gtggttgct 29 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSH-alpha sense primer <400> 11 tatcccaaca acgaaatg 18 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSH-alpha antisense primer <400> 12 gcacctgcta ctaccacaaa tttgcggccg c 31 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSH beta/TSH-alpha sense primer <400> 13 atgagagtgg tcctgttggc c 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eCG CTP antisense primer (#1) <400> 14 aggttgggat gggagggtct ggat 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eCG CTP sense primer (#2) <400> 15 atccagaccc tcccatccca acc 23 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transformation primer #1 <400> 16 gccaggacag aaatgcctcg acttcgctgc 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transformation primer #2 <400> 17 tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 30 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transformation primer #3 <400> 18 caggaaacag ctatgaccat gtaatacga 29 <210> 19 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSHbeta nucleotide <400> 19 atgagagtgg tcctgttggc cagcggcgtc ctctgtctgt tagcaggaca ggttctctcc 60 atctgcagtc ctgtggacta cacgctgtac gtggagaaac cagagtgtga cttctgcgtg 120 gccatcaaca ccaccatctg catgggcttc tgctattccc tggaccccaa tgtggtgggc 180 ccggcggtga agcgcctggc agtccagcgg gggtgcacgt accaggcggt ggagtaccgg 240 acggcggagc tcccggggtg ccccccgcac gtggaccccc gcttctcgta ccccgtggcc 300 ctccactgca cctgccgggc ctgcgatccg gcgcgggacg agtgcacgca cagggccagc 360 gccgacgggg accgctgctc caagcccctc ctcctgcaca tgcacgccta cccgggacag 420 agcaaccaca tccagaccct cgcggccgcc accgcctcga gtgcaggcga aaacctgtac 480 ttccagggaa gctccagcca ccaccatcac catcatcatc actag 525 <210> 20 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSHalpha nucleotide <400> 20 atgaagttcc tcgtaaacgt agcactggta ttcatggtag tctacataag ttacatatat 60 gctgatatct atcccaacaa cgaaatggca cgaggtggct gcgatgaatg tcgactccag 120 gagaataaga tcttctccaa gcccagcgct ccaatcttcc agtgcgttgg ttgctgtttc 180 tccagggcgt acccaacacc actgcggtcc aagaagacca tgctggtgcc aaagaacatt 240 acatctgagg caacgtgctg cgtggccagg gaggtgacaa ggctggataa catgaaactg 300 gagaaccaca cagactgcca ctgcagcacc tgctactacc acaaatttgc ggccgccacc 360 gcctcgagtg caggcgaaaa cctgtacttc cagggaagct ccagccacca ccatcaccat 420 catcatcact ag 432 <210> 21 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSHbeta/TSHalpha nucleotide <400> 21 atgagagtgg tcctgttggc cagcggcgtc ctctgtctgt tagcaggaca 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caggcacgag ttttgattgt aacaagtttc tacgcagcga tgacatgacc cccgtagtga 1860 caacgatcac gcccaaaaga actgccgact acaaaattac cgagtacgtc agtgacgtta 1920 aaactattaa gccatccaat cgaccgttag tcgaatcggg accgctggtg caagaagccg 1980 cgaaatatgg cagatgcacc gtataacgtg tggagtcctc tcattagcgc gtcatgttta 2040 gacaagaaag ctacatattt aattgatccc gatgatttta ttgataaatt gaccctaact 2100 ccatacacgg tattctacaa tggcggggtt ttggttaaaa tttccggact gcgattgtac 2160 atgctgttaa cggctccgcc cactattaat gcaattaaaa attccaattt taaaaaacgc 2220 agcaaaagaa acatttgtat gaaagaatgc gtagaaggaa aaaataatgt cgtcgacatg 2280 ctgaacagca agatcaatat gcctccgtgc atacaaaaaa tattgggcga tttgaaaaaa 2340 aacaatgtac cgcgcggcgg tatgtacagg aagaggttta tactaaactg ttacattgca 2400 aacgtggttt cgtgtaccaa atgtgaaaac cgatgtttga tcaaggctct gacacatttt 2460 tacaattacg actccaagtg tgtgggtgaa gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat 2520 gtgtataaac caccaaactg ccaaaaaatg aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct 2580 ggcaactgca agggcctcaa tcctatttgt aattattgaa caataaaaca attataaatg 2640 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gtgtacaatt 420 gactcgacgt aaacacgtta aataaagctt ggacatattt aacatcgggc gcgttaggcc 480 gattattgcc gccgtcgtcc caaccctcgt cgttagaagt tgcttccgaa gacgattttg 540 ccatagccac acgacgccta ttaattgtgt cgactaacac gtccgcgatc aaatttttag 600 ttgttgagtt tttcggaatt atttctgatt gcggacgttt ttgtgcgggt ttcaatctaa 660 ctgtgcccga ttttaattca gacaacacgt tagaaagcga tggtgcaggc ggtggtaaca 720 tttcagccgg caaatctact aatggcggct gtaatggagc tgatgataaa tctatcattg 780 gtggaggcgc aggcggggct ggcggcggag gtggtggcgg cggtgatgca gacggcggtt 840 tgggctcttt aggcaacaca gtcgtcggca cctcaattat tgtattggtt tcgggcgccg 900 tttttggttt gaccggtctg agacgagtgc gatttttttc gtttctaata gcttccaaca 960 attgttgtct gtcgtctaaa ggtgcagcgg gttgaggttt agtcggcatt ggtggagcgg 1020 gcggcaattc agacatcgat gatggcggtg gtggtggtgg aggtggaggc gctggaatgt 1080 taggcacgga agaaggtggt ggcggtgccg ccggtattat aatttgttct ggtttagttt 1140 gttcgtgcac gattgtgggc accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc 1200 tgcttcgagg cagcgcttgg ggtggtggcg gcggcaattc aatattataa ttggaataca 1260 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ttgttgagtt tttcggaatt atttctgatt gcggacgttt ttgtgcgggt ttcaatctaa 2160 ctgtgcccga ttttaattca gacaacacgt tagaaagcga tggtgcaggc ggtggtaaca 2220 tttcagccgg caaatctact aatggcggct gtaatggagc tgatgataaa tctatcattg 2280 gtggaggcgc aggcggggct ggcggcggag gtggtggcgg cggtgatgca gacggcggtt 2340 tgggctcttt aggcaacaca gtcgtcggca cctcaattat tgtattggtt tcgggcgccg 2400 tttttggttt gaccggtctg agacgagtgc gatttttttc gtttctaata gcttccaaca 2460 attgttgtct gtcgtctaaa ggtgcagcgg gttgaggttt agtcggcatt ggtggagcgg 2520 gcggcaattc agacatcgat gatggcggtg gtggtggtgg aggtggaggc gctggaatgt 2580 taggcacgga agaaggtggt ggcggtgccg ccggtattat aatttgttct ggtttagttt 2640 gttcgtgcac gattgtgggc accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc 2700 tgcttcgagg cagcgcttgg ggtggtggcg gcggcaattc aatattataa ttggaataca 2760 aatcgtaaaa atctgctata agcattgtaa tttcgctatc gtttaccgtg ccgatattta 2820 acaatcgctc aatgtaagca attgtattgt agagggattg tctcaagctc ggatcccgca 2880 cgttgatgac aagccttttc atttttacca cagcattgta gtagcgagac acttcgctgt 2940 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3F 3' <400> 34 gtacgtcgac gacagcgaag tgtctcgcta ctacaa 36

Claims (20)

1. 곤충의 유충 또는 번데기에서 증식이 가능한 백미드를 포함하는, 곤충의 유충 또는 번데기에서 갑상선 자극 호르몬을 생산하기 위한 조성물로서,
   상기 백미드는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 트랜스포사제 (Tn7 transposase) 서열, 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid-stimulating hormone; thyrotropin; TSH) 유전자, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하며,
   상기 백미드는 출아 바이러스 (budded virus; BV) 타입 또는 교합체 유래 바이러스 (Occlusion derived virus; ODV) 타입이며,
   상기 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역은, 5' 측면이 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이고, 3' 측면이 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드인,
   곤충의 유충 또는 번데기에서 갑상선 자극 호르몬을 생산하기 위한 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 갑상선 자극 호르몬은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 조성물.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 곤충은 누에인, 조성물.
9. 삭제
10. 제8항에 있어서, 상기 갑상선 자극 호르몬 생산용 조성물은, 상기 백미드가 도입된 누에 유충 또는 번데기를 더 포함하는 것인, 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 갑상선자극호르몬은 당쇄 수식(Glycosylation)이 된 것인, 조성물.
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 곤충의 유충 또는 번데기에서 증식이 가능한 백미드를, 숙주로서 곤충의 유충 또는 번데기에 도입하는 단계; 및 상기 숙주에서 갑상선 자극 호르몬(TSH)을 생산하는 단계;를 포함하는, 곤충의 유충 또는 번데기에서 갑상선 자극 호르몬을 생산하는 방법으로서,
    상기 백미드는 상동 재조합을 위한 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역, 세포의 복제 개시점, Tn7 트랜스포사제(Tn7 transposase) 서열, 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid-stimulating hormone; thyrotropin; TSH) 유전자, 및 항생제 저항성 유전자를 포함하며,
    상기 백미드는 출아 바이러스(budded virus; BV) 타입 또는 교합체 유래 바이러스(Occlusion derived virus; ODV) 타입이며,
    상기 베큘로 바이러스의 폴리헤드린 측면 (Polyhedrin flanking) 영역은, 5' 측면이 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이고, 3' 측면이 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드인,
    곤충의 유충 또는 번데기에서 갑상선 자극 호르몬을 생산하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 곤충의 유충 또는 번데기에 백미드를 도입하는 단계는, 숙주의 체강 주사 주입에 의한 감염에 의해 수행되는 것인, 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 곤충은 누에인 것인,방법.
18. 삭제
19. 삭제
20. 제15항에 있어서, 상기 갑상선 자극 호르몬은 당쇄 수식(Glycosylation)이 된 것인, 방법.

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