KR100921812B1 - 누에유충 생체에서 직접 외래단백질을 발현하는 재조합베큘로바이러스를 제작하는 기술 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유충 생체에서 외래단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터 및 리포펙틴을 유충 생체에 주입하여, 외래단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 유충 생체에 바이러스 게놈, 외래단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 전이벡터 및 리포펙틴을 직접 동시 주사하여, 재조합바이러스를 높은 농도로 증식시킬 수 있다. 본 발명에 따르면 외래단백질을 높은 수율로 발현시킬 수 있다는 장점이 있으며, 아울러 높은 농도의 재조합바이러스를 증식시킬 수 있다.
유충, 바이러스 게놈, 전이벡터, 베큘로바이러스

Description

누에유충 생체에서 직접 외래단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제작하는 기술 {Technique for Producing Recombinant Baculovirus Directly in Silkworm Larvae}
도 1은 누에유충 생체에서 직접 재조합바이러스 제조(in vivo recombinant virus production) 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a는 누에유충 생체에 직접 누에 핵다각체병 바이러스 게놈(bBmGOZA)과 셀룰라제 유전자가 포함된 전이벡터(pBacPAK9 - AgEGase II) 및 리포펙틴(lipofectin reagent)의 동시 주사에 의한 재조합바이러스 제조에 따른 누에유충의 병징을 나타낸 것이다.
도 2b는 누에유충 생체에 직접 누에 핵다각체병 바이러스 게놈(bBmGOZA)과 셀룰라제 유전자가 포함된 전이벡터(pBacPAK9-AgEGase II) 및 리포펙틴(lipofectin reagent)의 동시 주사에 의한 재조합바이러스 제조에 따른 목적유전자 셀룰라제의 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 2c는 누에유충 생체에 직접 누에 핵다각체병 바이러스 게놈(bBmGOZA)과 셀룰라제 유전자가 포함된 전이벡터(pBacPAK9-AgEGase II) 및 리포펙틴(lipofectin reagent)의 동시 주사에 의해 제조된 재조합바이러스의 게놈(genome)을 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 산물의 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 상을 나타낸 것이다.
도 3a는 누에유충 생체에서 직접 제조된 재조합바이러스를 포함하는 누에체액을 5령 누에에 주사 시 접종량에 따른 셀룰라제 활성을 비교한 결과이다.
도 3b는 누에유충 생체에서 직접 제조된 재조합바이러스를 포함하는 누에체액을 5령 누에에 주사 시 접종량에 따른 셀룰라제 발현수준을 웨스턴 블랏(Western blot) 분석한 결과이다.
도 3c는 누에유충 생체에서 직접 제조된 재조합바이러스를 포함하는 누에체액을 5령 누에에 주사 시 접종량에 따른 바이러스 증식 농도를 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명의 재조합 바이러스를 Sf9 곤충세포주에 감염시킨 경우와 누에 유충 생체에 감염시킨 경우 외래단백질의 생산효율을 비교한 그래프이다.
본 발명은 유충 생체에서 외래단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터 및 리포펙틴을 유충 생체에 주입하여, 외래단백질을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
베큘로바이러스 발현벡터 시스템(Baculovirus Expression Vector System)은 곤충세포주 또는 곤충생체에서 재조합단백질을 효과적으로 생산할 수 있는 시스템으로, 대부분 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus; BmNPV)를 이용하고 있다 (Kitts and Possee, BioTechniques, 14:810, 1993; Luckow et al., J. Virol., 67:4566, 1993; Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575, 2001; Je et al., Biotechnol. Lett., 23:1809, 2001; Motohashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 326:564, 2005). 특히, BmNPV를 기초로 한 발현 벡터는 누에 생체를 이용하여 외래단백질을 저비용으로 안전하고 용이하게 대량으로 생산할 수 있다는 장점이 있다 (Maeda, Annu. Rev. Entomol., 34:351, 1989).
베큘로바이러스 발현벡터 시스템에서 가장 중요한 단계로 목적유전자를 발현하는 재조합바이러스 제조를 들 수 있다. 일반적으로 재조합바이러스 제조는 곤충세포주에 DNA를 도입을 기초로 하고 있다. 이러한 곤충세포주를 이용한 재조합바이러스 제조법은 고비용의 곤충세포배양이 우선되어야 하며, 또한 곤충세포주에서 재조합바이러스 제조와 증식과정이 필요하기 때문에 충분한 시간이 요구된다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위한 한 방법으로 bacmid 시스템이 개발되었는데, bacmid는 대장균(E. coli)에서 증식할 수 있는 큰 플라스미드(plasmid)로 대장균에서 부위 특이적인 전이(site-specific transposition)에 의해 재조합바이러스 게놈을 생산할 수 있다 (Luckow et al., J. Virol., 67:4566, 1993).
그러나, 상기 방법은 재조합바이러스를 효과적으로 분리 증식할 수 있는 장점이 있지만 여전히 최종적으로 목적유전자를 발현하는 재조합바이러스를 제조하기 위하여 bacmid는 곤충세포주에 트랜스펙숀(transfection) 과정을 거쳐야 한다는 문제점이 있다.
따라서, 당업계에서는 재조합바이러스의 제조시, 곤충세포주에 트랜스펙숀 과정이 필요 없이, 직접 재조합바이러스 제조와 아울러 목적유전자를 발현시킬 수 있는 용이한 방법이 요구되되고 있다.
상기와 같은 문제점을 개선하기 위해서는 곤충생체를 이용하여 생체에서 직접 재조합바이러스 제조와 아울러 목적유전자를 발현시킬 수 있는 용이한 방법이 요구되어진다.
이에 본 발명자들은 재조합바이러스의 제조시, 곤충세포주에 트랜스펙숀 과정이 필요 없어, 재조합바이러스 및 외래단백질을 경제적이고 간편하게 제조할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유한 전이벡터 및 리포펙틴을 유충 생체에 주입하는 경우, 외래단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 고 농도로 제조할 수 있고, 외래단백질을 고효율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 주된 목적은 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유한 전이벡터 및 리포펙틴을 유충 생체에 주입하여, 외래단백질을 발현하는 재조합 바이 러스의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유한 전이벡터 및 리포펙틴을 유충 생체에 동시 주입한 다음, 유충 생체에서 누에 체액을 채취하여, 외래단백질을 분리 및 추출하는 단계를 포함하는 유충 생체에서 외래단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베큘로바이러스 다각체단백질 프로모터와 상기 프로모터에 의해 조절되는 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터, 베큘로바이러스 게놈 및 리포펙틴을 유충 생체에 직접 주입하는 것을 특징으로 하는 외래단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 베큘로바이러스는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus; BmNPV) 또는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유충은 누에 유충인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 베큘로바이러스 다각체단백질 프로모터와 상기 프로모터에 의해 조절되는 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터, 베큘로바이러스 게놈 및 리포펙틴을 유충 생체에 동시 주입하여 재조합 바이러스를 생성시키는 단계; (b) 상기 재조합 바이러스가 생성된 유충 생체에서 유충 체액을 채취하여, 이를 유충 생체 주입시킨 다음, 외래단백질을 발현시키는 단계; 및 (c) 상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 유충 생체에서 외래단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus; BmNPV) 또는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유충은 누에 유충인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
베큘로바이러스 발현벡터 시스템을 이용하여 재조합바이러스 및 외래단백질을 제조하는 방법은 도 1에 나타난 바와 같다. 즉, 도 1은 곤충세포주를 이용한 재조합바이러스를 제조(in vitro recombinant virus production) 과정과, 누에생체에서 직접 재조합바이러스를 제조(in vivo recombinant virus production)하는 과 정을 비교한 모식도이다.
도 1의 왼쪽은 종래 베큘로바이러스를 이용한 재조합 바이러스 및 외래단백질을 제조하는 방법에 대한 그림으로, 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터 및 리포펙틴을 숙주세포에 cotransfection시켜, 증폭시킨 다음, 재조합 바이러스를 곤충세포에 주입시켜 이로부터 외래단백질을 제조하였다.
그러나 본 발명의 유충 생체에서 외래단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 제조방법은 도 1의 오른쪽에 나타난 바와 같다. 즉, 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터 및 리포펙틴을 유충 생체에 직접 주입하여, 5일간 방치한 다음, 유충 체액에서 재조합 바이러스를 수득하고, 상기 유충 체액을 상기 바이러스 게놈, 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터 및 리포펙틴이 투입된 유충 생체에 다시 투입하고, 5일간 방치시켜 외래단백질을 발현시키는 것이다.
즉, 본 발명에 따르면, 곤충세포주에 DNA 도입 단계를 생략할 수 있어, 곤충세포배양에 필요한 무균실 등을 제작할 필요가 없어, 경제적이고, 간편한 방법으로 재조합 바이러스를 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 하기 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 누에유충 생체에서 직접 재조합바이러스의 제조
누에 핵다각체병 바이러스 게놈으로 비비엠고자(bBmGOZA) 바이러스 DNA(Je et al., Biotechnol. Lett., 23:1809, 2001)(서울대학교, 한국)와 한국산 BmNPV의 다각체단백질 프로모터 조절 하에 뽕나무하늘소 유래 셀룰라제 유전자(Lee et al., Comp. Biochem. Physiol. B, 140:551, 2005)가 도입된 전이벡터(pBacPAK9-AgEGase II)(동아대학교, 한국)를 이용하였다. 상기 전이벡터 pBacPAK9-AgEGase II 500ng과, 상기 bBmGOZA 바이러스 DNA 100ng을 혼합하고, 용액량을 멸균수를 첨가하여 50㎕로 조정하였다.
한편, 멸균수 ㎖ 당 100ng의 lipofectin(Clonetech사, 미국)을 준비하여, 상기 전이벡터 pBacPAK9-AgEGase II 500ng과, 상기 bBmGOZA 바이러스 DNA 용액 50㎕와 동일량인 50㎕를 혼합하여 30분간 실온에 둔 다음, lipofectin과 DNA 혼합액을 5령 1일 누에 유충의 체강에 미세주사기(microsyringe)를 이용하여 주사하여 재조합바이러스를 제조하였다. 누에 유충에 주사는 주사용액의 손실을 최소화하기 위하여 얼음에 누에 유충을 기절시킨 다음 체강에 주사하였다.
실시예 2: 누에유충 생체에서 재조합바이러스 생산과 발현 분석
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 누에생체 내에서 직접 재조합바이러스 제조(in vivo recombinant virus production) 과정을 통해 목적유전자를 발현하는 재조합바이러스 생산여부를 확인하기 위하여, 우선 상기 실시예 1에서 bBmGOZA 바이 러스 DNA와 전이벡터 pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 주사하고 계속 사육하면서 증상을 조사하였다(도 2a).
도 2a의 1은 Mock은 아무것도 주사하지 않은 음성 대조구이고, 2는 bBmGOZA를 단일 주사한 것이며, 3은 bBmBOZA 및 pBacPAK9-AgEGase II를 동시 주사한 것이고, 4는 PBS 및lipofectin을 주사한 것이며, 5는 bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및lipofectin을 주사한 것이고, 6은 야생형 바이러스 wtBmNPV를 주사한 것으로 양성 대조구이다.
그 결과, 도 2a에서 보이는 것처럼 bBmGOZA 단일 주사한 경우, bBmGOZA와 pBacPAK9-AgEGase II 동시 주사한 경우 및 lipofectin만 주사한 경우, 아무것도 주사하지 않은 음성 대조구인 1의 Mock과 같이, 대조구처럼 정상적으로 용화되었다.
반면, bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사 하였을 경우에는 재조합바이러스 증식에 의해 야생주 BmNPV를 주사한 경우과 같이, 전형적인 바이러스 감염의 병징을 보였다.
또한, 재조합바이러스 제조 및 증식에 의한 외래단백질 발현 여부 분석은 셀룰라제 효소 활성으로 조사하였다. 셀룰라제 효소 활성은 bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사한 다음, 5일째 채취된 체액을 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose; CMC) 플레이트(plate) [1%(w/v) CMC, 1.5%(w/v) agarose, 50 mM acetate buffer(pH 5.0)] 위에 10㎕ 가하고 27℃에서 10 시간 동안 방치한 다음, 0.1% Congo red(Sigma, 미국)로 염색하여 옐로우 할로 존(yellow halo zone) 방법(Lee et al., Comp. Biochem. Physiol. B, 140: 551, 2005)에 의해 활성을 조사하였다(도 2b). 그 결과, 도 2b에 나타난 바와같이, bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사한 체액에서만 셀룰라제 효소활성을 보여, 목적유전자 셀룰라제를 발현하는 재조합바이러스의 생산을 확인할 수 있었다(도 2b).
마지막으로, 재조합바이러스 생산 여부를 확인하기 위하여, 셀룰라제 유전자 특이 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고, 그 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분석하였다(도 2c). 이때 사용한 PCR 프라이머는 셀룰라제 유전자(Lee et al., Comp. Biochem. Physiol. B, 140: 551, 2005)에 근거하여 서열번호 1의 5'-ATGAAGGTATTGTTGGCAGTC-3'의 전방 프라이머와 서열번호 2의 5＇-TTATGAATAATTGCATCCGGAAG-3'의 후방 프라이머를 이용하였다.
PCR 템플레이트(template)로 사용한 바이러스 DNA는 감염된 누에유충의 지방체세포로부터 게놈분리키트(Promega사, 미국)를 이용하여 분리하였다. PCR은 94℃에서 1분, 48℃에서 1분 및 72℃에서 3분 수행하였다. 그 결과, 도 2c 위쪽 파넬의 경우와 같이, AgEGase II는 bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사 하였을 경우에만 재조합바이러스가 생산되고 이로 인해 PCR 산물이 존재함을 알 수 있었다.
또한, 재조합바이러스와 야생주 바이러스와 구별하기 위하여 다각체단백질 유전자의 특이 PCR 프라이머인 서열번호 3의 5'-ATGTATACTCGTTACAGCTAT-3'의 전방 프라이머와 서열번호 4의 5'-TTAGTACGCGGGTCCGTTGTA-3'의 후방 프라이머(Je et al., Biotechnol. Lett., 23: 1809, 2001)를 이용하여, 상기의 방법과 같이, PCR 증폭을 수행하고, 그 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동 분석한 결과, 도 2c의 아래쪽 파넬의 화살표 polh에 나타난 바와 같이 PCR 산물은 야생주 바이러스에서만 관찰되어 재조합바이러스와 구분되었다.
상기 결과를 통해, 누에 유충생체에 bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사하고, 5일이 경과한 다음 수거한 체액에는 외래단백질을 발현하는 단백질을 발현하는 재조합바이러스가 생산되는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 재조합바이러스를 포함하는 체액의 주사에 의해 누에유충 생체에서 외래단백질 생산
상기 실시예 2에서 제조된 재조합바이러스가 포함되어 있는 체액을 직접 접종액으로 사용하여 외래단백질 생산 효율을 분석하였다. 즉, 누에유충 생체에 bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사하고, 5일이 경과한 다음 수거한 체액 10㎕, 20㎕ 및 30㎕ 각각을 5령 1일 누에의 체강에 주사하고, 주사 후 5일째 누에 체액을 채취하여 체액 내 발현된 셀룰라제의 효소 활성을 조사하여 발현효율을 비교하였다. 효소 활성은 채취된 체액에 0.1M 아세테이트 pH 6.0의 완충액에 2%(w/v)의 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose)가 포함된 기질 용액을 섞어 50℃에서 1시간 동안 처리한 다음, 디니트로살리실릭 리에이전트(dinitrosalicylic reagent) 방법(Miller, Anal. Chem., 31:426, 1959)에 의해 활성을 조사하였다. 그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 20㎕와 30㎕ 주사 시 각 각 체액 ㎖ 당 2414 유니트(U)와 2618 U의 높은 발현량을 보였다(도 3a).
도 3b는 주사 후 5일째 누에 체액에서 발현된 셀룰라제의 웨스턴 블랏(Western blot) 분석 결과이다. 웨스턴 블랏 분석을 위해 주사 후 5일째 채취된 체액 0.5㎕를 Laemmli 방법(Laemmli, Nature, 227:680, 1970)에 따라 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행한 다음, Towbin 등(Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350, 1979)의 방법에 따라 겔로부터 단백질 시료를 20% 메탄올에 25mM의 트리스와 192mM의 글리신이 포함된 pH 8.3의 전이 완충용액을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 전이시키고, 1% BSA 용액에서 2시간 동안 처리한 다음, 생쥐에서 제조된 셀룰라제 항체(Lee et al., Comp. Biochem. Physiol. B, 140: 551, 2005)를 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 그 후 2차 항체(anti-mouse IgG horseradish peroxidase(HRP) conjugated)와 에이치알피-스트렙타비딘 복합체(HRP-streptavidin complex)를 결합시키고, 이시엘(ECL) 검출 시약(Amersham Pharmacia Biotech사, 미국) 처리 후, 엑스레리 필름(X-ray film)에 조사하였다(도 3b). 그 결과는 도 3b에 나타난 바와 같이, 도 3a의 셀룰라제 활성의 증가와 유사하게, 20㎕와 30㎕ 주사 시에 발현된 셀룰라제가 누에 체액에 분비되어 증가함을 웨스턴 블랏 분석에서 단백질 밴드(band)의 시그날(signal) 증대로 확인되었다(도 3b).
또한, 주사 후 5일 경과된 체액 내에 증식된 재조합바이러스의 역가를 플라크 어세이(O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors-A laboratory manual, W.H Freeman and Company, New York, 1992)에 의해 분석하고, 바이러스 농도를 p.f.u.(plaque forming unit)로 결정하였다 (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors-A laboratory manual, W.H Freeman and Company, New York, 1992). 그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 접종량을 30㎕ 주사한 경우, 5일째 체액 ㎖ 당 약 5 × 109 p.f.u의 높은 바이러스 농도를 확인할 수 있었다(도 3c).
상기와 같은 결과로 볼 때, 누에 유충생체에 bBmGOZA, pBacPAK9-AgEGase II 및 lipofectin을 동시 주사한 다음, 5일째에 수거한 체액을 바로 접종액으로 사용하여 5령 누에유충 생체에 주사하였을 경우, 주사 5일째 체액 내에 높은 수율의 외래단백질 발현을 확인할 수 있었고, 아울러 재조합바이러스의 높은 증식을 확인할 수 있었다. 이는 단기간 내에 외래단백질의 발현뿐만 아니라 대량생산을 위한 충분한 양의 접종액 확보가 용이함을 나타낸다.
비교예 1: 외래단백질의 생산 효율 비교
실시예 1에서 제조한 재조합 바이러스 1 × 105 p.f.u.를 누에 유충 생체와 Sf9 곤충세포주에 감염시키고, 5일이 경과한 다음, 각각의 체액을 채취하여 체액 내 발현된 셀룰라제의 효소 활성을 조사하여 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여 발현 효율을 비교하였다(도 4). 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 기존의 베큘로 바이러스 시스템인 Sf9 곤충세포주를 이용한 경우인 15.25 유니트(U)의 낮은 발현 효율에 비해서, 누에 유충 생체를 이용한 경우의 3439 유니트(U)의 높은 발현 효율을 보였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에 따르면, 유충 생체에 바이러스 게놈, 외래단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 전이벡터 및 리포펙틴을 직접 동시 주사하여, 재조합바이러스를 높은 농도로 증식시킬 수 있고, 아울러, 외래단백질을 높은 수율로 발현시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따르면, 별도의 곤충세포주에서의 재조합바이러스 제작 및 증식과정이 필요 없으므로, 매우 경제적이고 간편하게, 유충 생체를 이용하여 재조합바이러스와 외래단백질을 단기간에 대량생산이 가능하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> Method for Producing Recombinant Baculovirus Directly in Silkworm Larvae <130> P06-B243 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgaaggtat tgttggcagt c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ttatgaataa ttgcatccgg aag 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgtatactc gttacagcta t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttagtacgcg ggtccgttgt a 21

Claims (10)

  1. 베큘로바이러스 다각체단백질 프로모터와 상기 프로모터에 의해 조절되는 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터, 베큘로바이러스 게놈 및 리포펙틴을 유충 생체에 직접 주입하는 것을 특징으로 하는 외래단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 베큘로바이러스는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus; BmNPV) 또는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 유충은 누에 유충인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 다음 단계를 포함하는 유충 생체에서 외래단백질을 제조하는 방법;
    (a) 베큘로바이러스 다각체단백질 프로모터와 상기 프로모터에 의해 조절되는 외래단백질 유전자를 함유하는 전이벡터, 베큘로바이러스 게놈 및 리포펙틴을 유충 생체에 동시 주입하여 재조합 바이러스를 생성시키는 단계;
    (b) 상기 재조합 바이러스가 생성된 유충 생체에서 유충 체액을 채취하여, 이를 유충 생체 주입시킨 다음, 외래단백질을 발현시키는 단계; 및
    (c) 상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 베큘로바이러스는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus; BmNPV) 또는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 상기 유충은 누에 유충인 것을 특징으로 하는 방법.
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