CN114957485A - 一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝及其制备方法，得到的蚕丝含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白MaSp‑g和MaSp‑c。现有技术通过家蚕转基因的方法将蜘蛛丝蛋白基因导入家蚕基因组，须经过较复杂的程序进行转基因家蚕的筛选鉴定，进一步通过杂交筛选获得转基因纯系，历时近2年，且多为表达一种蜘蛛丝蛋白基因；本发明可以在较短的时间获取重组病毒，并通过该病毒接种5龄家蚕能在一周左右获得含有多种蜘蛛丝蛋白的嵌合蚕丝，其断裂强度达到1116.55MPa，丝长达到纯蚕丝丝长的65%，既解决了现有技术仅能用于实用性差的多化性品种的问题，又克服了现有技术复合丝长较纯蚕丝丝长明显下降的缺陷。

Description

一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种含多种金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的改性蚕丝及其制备方法。
背景技术
蜘蛛丝蛋白和蚕丝蛋白各具独特的特点，人们希望通过生物学的方法获取蜘蛛丝蛋白和蚕丝蛋白的混合体，以满足制备各种材料对丝蛋白的多样性的需求。现有技术公开了一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法，蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的碱基为由花园银蛛梨状腺丝重复片段单元、络新妇蛛梨状腺丝重复片段单元构成的重复序列，具有改良家蚕丝性能等应用；构建家蚕合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的载体，再利用显微注射将带有蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用转座子使荧光蛋白基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的转基因家蚕。现有技术公开了一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法，蜘蛛聚状腺丝蛋白基因为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的载体pBac-ASG质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和聚状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛聚状腺丝蛋白的转基因家蚕。很长时间以来，人们一直希望利用家蚕高效合成丝蛋白的能力以及天然的纺丝习性生产蜘蛛丝或蚕丝与蜘蛛丝的嵌合丝，甚至希望根据医用生物材料对多样性丝蛋白的需求，通过丝蛋白分子的从头设计实现个性化定制。目前，将合成的络新妇蛛（Nephilaclavipes）、大腹园蛛(Araneusventricosus)主壶腹腺丝蛋白基因的重复模序经过多次重复后，通过piggyBac介导的转基因已实现了非完整蛛丝蛋白基因在家蚕中的表达，并通过家蚕天然的纺丝能力获得含有蛛丝蛋白成份的嵌合蚕丝，在一定程度上改善了丝纤维的机械性能，但该嵌合丝纤维中蜘蛛丝蛋白的比例非常有限；最近，随着基因编辑技术的发展和完善，通过TALEN介导的同源末端重组已实现了用蜘蛛主壶腹腺丝蛋白基因替代家蚕丝蛋白重链基因，遗传修饰家蚕所生产的嵌合蚕丝中的蛛丝蛋白水平达到了35.2%，但嵌合蚕丝的断裂应力（breakingstress）为371.3Mpa，比野生蚕的449.5Mpa低17.4%，嵌合蚕丝和野生蚕丝的断裂应变（breaking strain）分别为32.2%和22.5%，即嵌合蚕丝的延伸性增加但强度下降。人们通过CRISPR/Cas9介导将与天然蜘蛛丝蛋白基因大小相仿的人工合成的蜘蛛基因重复区域整合进家蚕的重链基因的内含子区域，获得了与天然蜘蛛机械性能相似的嵌合丝。另外，由于受到将外源基因导入家蚕的技术限制，通过显微注射通常只能将基因导入多化性品种蚕所产的卵，作为常识，生产上的实用品种均为二化性，因此通过遗传转化所获的转基因家蚕大多局限于无实用生产价值的多化性家蚕，人们仍希望通过一些新的策略和技术利用家蚕生产含有蛛丝蛋白的嵌合蚕丝。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种含多种金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的改性蚕丝及其制备方法，其断裂强度达到1116.55MPa。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝，所述多种蜘蛛腺丝蛋白为两种及两种以上不同的蜘蛛腺丝蛋白，优选的，所述蜘蛛腺丝蛋白为蜘蛛大壶状腺丝蛋白；所述蜘蛛为金丝织网蜘蛛。
本发明公开了一种生产上述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的家蚕，将多种表达蜘蛛腺丝蛋白的序列克隆入质粒，再转化重组，然后转染培养细胞，得到重组病毒粒子；将所述重组病毒粒子接种家蚕幼虫，喂养至熟蚕，得到生产所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的家蚕。家蚕幼虫没有经过基因改造。
本发明公开了利用上述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝制备的丝素溶液。还公开了所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝在制备丝制品中的应用。
本发明所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的制备方法为，将多种表达蜘蛛腺丝蛋白的序列克隆入质粒，再转化重组，然后转染培养细胞，得到重组病毒粒子；将所述重组病毒粒子接种家蚕幼虫，喂养至熟蚕，然后上蔟、采茧、缫丝，得到含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝；具体的，多种表达蜘蛛腺丝蛋白的序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
本发明中，采用含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌转化，培养后挑取白色菌落，提取重组DNA；将转化得到的重组DNA转染草地夜蛾Sf9培养细胞，得到重组病毒粒子。
本发明中，采用含有抗生素的桑叶喂养接种后的家蚕一天，然后采用未处理桑叶喂养至熟蚕，再用蜕皮激素处理一次，然后上蔟。
本发明家蚕的品种包括丝茧育实用家蚕品种、家蚕原种。与现有技术制备蜘蛛蛋白复合蚕丝的方法相比，本发明首次适用二化性蚕种，解决了现有技术难以用于二化性品种的问题。作为常识，生产上的实用品种均为二化性，所产卵为越年卵，往往须通过较长时间的低温刺激（冷藏）或即时浸酸（盐酸）处理或冷藏与浸酸组合使用才可以解除滞育，促使胚胎发育。卵显微注射的最佳时期为产下后几小时，而即时浸酸处理通常在卵产下后24小时前后。显微注射后的蚕卵会因浸酸处理而死亡，因此现有技术只能选择不需要浸酸处理多化性品种；而且现有技术采用蜘蛛丝蛋白改性蚕丝时，丝长明显下降，都不到单纯蚕丝丝长的42%。
本发明合成家蚕丝素蛋白轻链（FibL）基因启动子控制的5’端带有编码信号肽序列、3’端带有加尾信号的金丝织网蜘蛛（Trichonephilaclavipes）的大壶状腺丝蛋白（major ampullatespidroin, MaSp）c基因表达盒FibL-MaSp-c-polyAFibL，其序列如SEQ IDNO: 1；合成家蚕丝素蛋白重链（FibH）基因启动子控制的5’端带有编码信号肽序列、3’端带有加尾信号的金丝织网蜘蛛（Trichonephilaclavipes）的大壶状腺丝蛋白（majorampullatespidroin, MaSp）g基因表达盒FibH-MaSp-g-polyAFibH，其序列如SEQ ID NO: 2；将FibL-MaSp-c-polyAFibL和FibH-MaSp-g-polyAFibH片段分别克隆进pFAST-BacTm-Dual的XhoI/SphI位点和NotI/PstI位点构建质粒pFAST-FibH/L-MaSp-g/c。
进一步的，上述质粒pFAST-FibH/L-MaSp-g/c转化含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌，后涂布于分别含有10 µg/ml、50 µg/ml、7 µg/ml、40µg/ml和100 µg/ml的四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal的LB 琼脂培养基平板上，于37℃培养，再挑取白色菌落，提取重组AcBacmid-FibH/L-MaSp-g/c DNA；将重组AcBacmid-FibH/L-MaSp-g/c DNA转染草地夜蛾Sf9培养细胞，于26～27℃培养至细胞发病，然后取细胞培养上清再次接种培养细胞，细胞发病后，收集细胞培养上清，离心纯化得到重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒粒子AcNPV-FibH/L-MaSp-g/c。
最后，上述重组病毒AcNPV-FibH/L-MaSp-g/c接种5龄家蚕幼虫，用浸渍或喷洒过抗生素药液的凉干后的新鲜桑叶于24℃左右饲养1天，后用新鲜桑叶饲养至见熟蚕；再用浸渍或喷洒过蜕皮激素药液的新鲜桑叶饲喂蚕1次或直接用蜕皮激素药液体喷家蚕1次；将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧；蚕茧烘干后，经过缫丝获含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白g和c的蚕丝，为含两种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝。
本发明构建FibL-MaSp-c-polyAFibL和FibH-MaSp-g-polyAFibH表达盒的优选方案是根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列采用全化学合成的方法；也可以家蚕基因组为模板通过PCR的方法分别获得家蚕丝素蛋白轻链（FibL）、重链（FibH）基因启动子以及相应的3’端带有加尾信号区域polyAFibL和polyAFibH；以家蚕丝腺组织总RNA、金丝织网蜘蛛主壶腹腺总RNA为模板，通过RT-PCR分别获得丝素蛋白轻链、重链基因的信号肽编码序列和金丝织网蜘蛛丝大壶状腺丝蛋白g、c基因的编码序列，然后通过搭桥的方法合成表达盒，也可以通过PCR扩增与化学合成相结合的方法制备表达盒。FibL-MaSp-c-polyAFibL和FibH-MaSp-g-polyAFibH片段分别克隆进pFAST-BacTm-Dual（Invitrogen公司产品）的XhoI/SphI位点和NotI/PstI位点可以采用酶切连接的方法，也可以通过无缝克隆的方法。优化的方案是，通过超速离心从发病细胞培养上清中纯化病毒粒子。重组病毒AcNPV-FibH/L-MaSp-g/c接种的家蚕品种优选丝茧育实用家蚕品种，如中2016×日2016，也可以选用家蚕原种；优选的接种的5龄家蚕幼虫的发育时期为5龄蜕皮后1-3天。接种病毒时可以用4号昆虫针醮取收集的细胞培养上清或离心纯化的病毒穿刺接种家蚕幼虫，优化的方案是按106拷贝/蚕注射重组病毒AcNPV-FibH/L-MaSp-g/c。
为了减少接种病毒时因接种伤口污染细菌而引起细菌性败血病的发生，本发明优选的抗生素为环丙沙星或氟哌酸或氟苯尼考。使用蜕皮激素的方法根据气候条件而定，当湿度较大时，浸渍或喷洒过蜕皮激素药液的新鲜桑叶凉干后饲喂蚕，当气候较干燥时，可直接用蜕皮激素药液体喷家蚕。
杆状病毒是昆虫的病原，重组杆状病毒已广泛用于研发生物杀虫剂、表达外源蛋白和基因传递至脊椎动物细胞。杆状病毒种类繁多，且宿主域、感染性、致病性各不相同。金丝织网蜘蛛(Trichonephilaclavipes)大壶状腺丝蛋白基因有2种，即MaSp-g和MaSp-c，二者间的序列和分子量存在显著差异，MaSp-g由2466氨基酸残基构成，分子量巨大，MaSp-c的分子量不大，由658个氨基酸残基构成。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒是杆状病毒的模式种，本发明通过重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒介导在家蚕后部丝腺同时表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白g和c，利用家蚕天然的纺丝习性，从而获取含有蛛丝蛋白g和c的嵌合蚕丝，相关技术方案没有见报道。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．通过大肠杆菌、酵母、动物细胞或转基因动植物能够表达出蜘蛛丝蛋白，要进一步获得蛛丝纤维，需要通过繁琐步骤纯化重组蛋白，再进一步通过人工纺丝实现，该过程不仅耗时费钱，而且目前的技术水平难以规模化生产，所制备的丝纤维的机械性仍大大低于天然蛛丝。利用本发明的技术，可以直接利用家蚕丝腺组织高效合成蛋白的能力和家蚕吐丝结茧的天然本领，大规模获得含有金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白g和c的嵌合蚕丝，且所获得的嵌合丝可聚集蚕丝和蛛丝优势。
2. 通过家蚕转基因的方法将蜘蛛丝蛋白基因导入家蚕基因组，须经过较复杂的程序进行转基因家蚕的筛选鉴定，进一步通过杂交筛选获得转基因纯系，历时1-2年时间，且多为表达一种蜘蛛丝蛋白基因；通过本发明的技术可以在较短的时间获取重组病毒，并通过该病毒接种5龄家蚕能在一周左右获得含有2种蜘蛛丝蛋白的嵌合蚕丝，其断裂强度达到1116.55MPa，丝长达到纯蚕丝丝长的65%，既解决了现有技术仅能用于实用性差的多化性品种的问题，又克服了现有技术复合丝长不到纯蚕丝丝长42%的缺陷。
附图说明
图1为实施例一中重组病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c的PCR鉴定。
图2为实施例一中PCR检测AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染家蚕丝腺中病毒基因的表达。
图3为实施例一中Western blot检测后部丝腺（中2016×日2016）中AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c表达的MaSp-g和MaSp-c。
图4为实施例一中AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染蚕所产茧的性状。
图5为实施例一中AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染蚕所产茧丝的红外光谱特性。
图6为实施例二中的Western blot 检测丝腺中的MaSp-g/c。
图7为实施例二中免疫组化检测AcNPV- FHP/FLP-MaSp-g/c感染丝腺中MaSp-g/c的分泌。
图8为实施例二中的Western blot 检测蚕丝中的MaSp-g/c。
图9为实施例二中的AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c感染蚕的茧丝机械性能。
图10为实施例二中蚕丝红外光谱特征以及基于红外光谱特征的丝蛋白二级结构分析。
具体实施方式
通过piggyBac介导的家蚕转基因技术可获得含有蛛丝蛋白成份的嵌合蚕丝，且在一定程度上改善了丝纤维的机械性能，但该嵌合蚕丝中蛛丝蛋白的含量非常有限；通过TALEN介导的同源末端重组已实现了用蜘蛛主壶腹腺丝蛋白基因经多次加倍的重复单元替代家蚕丝蛋白重链基因，这种方法获得的遗传修饰家蚕所生产的嵌合蚕丝中的蛛丝蛋白水平提高明显，尽管这种嵌合蚕丝的延伸性增加，但强度下降。此外由于受到通过显微注射将基因导入蚕卵的技术限制，目前对家蚕的遗传修饰基本上局限于无实用生产价值的多化性家蚕。利用本发明的技术可以利用实用家蚕品种高生产性能的优势获取具有蚕丝和蛛丝优秀性能的嵌合蚕丝。丝蛋白材料已广泛用于各个领域。蛛丝蛋白基因的重复单元经多次加倍后，利用基因工程技术已在大肠杆菌、酵母、动物细胞或转基因动植物中实现表达，但由于蛛丝蛋白氨基酸序列高度重复，往往表达水平极低，且表达产物的分子量低于天然。因此纯化重组蛛丝蛋白的成本很大，难以量产；本发明通过重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒介导在家蚕后部丝腺同时表达金丝织网(Trichonephila clavipes)蜘蛛大壶状腺丝蛋白g和c，并可以使重组蛋白通过吐丝进入茧层形成嵌合蚕丝，由此制备丝蛋白材料无需复杂的纯化步骤，便于量产。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，本发明涉及的具体操作以及养蚕方法与表征，都为常规技术。委托商业公司进行化学合成，合成的序列如SEQ ID NO: 1，在序列的二侧分别有XhoI和SphI位点。委托商业公司进行化学合成，合成的序列如SEQ IDNO: 2，在序列的二侧分别有NotI和PstI位点。
实施例一中2016×日2016品种家蚕
（1）重组质粒pFast-FH/LP-MaSp-g/c的构建：将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列分别克隆进pFAST-BacTm-Dual（Invitrogen公司产品）XhoI和SphI位点、NotI和PstI位点之间制备重组质粒pFAST-FH/LP-MaSp-g/c。
（2）重组Bacmid AcBacmid-FH/LP-MaSp-g/c的筛选：将pFast-FH/LP-MaSp-g/c转化含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌，后涂布于分别含有10 µg/ml、50 µg/ml、7 µg/ml、40µg/ml和100 µg/ml的四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal的LB 琼脂培养基平板上，于37℃培养12小时后，挑取白色菌落，接种在含有10 µg/ml、50 µg/ml和7 µg/ml的四环素、卡那霉素、庆大霉素LB培养基中，振荡培养8小时，提取重组AcBacmid-pFast-FH/LP-MaSp-g/cDNA。
（3）重组病毒AcNPV- FH/LP-MaSp-g/c构建与鉴定：将重组AcBacmid- FH/LP-MaSp-g/c DNA 2μg与脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）混合，转染草地夜蛾Sf9培养细胞，于27℃培养4天，然后取细胞培养上清再次接种培养细胞，细胞发病后，收集细胞和细胞培养上清，以提高病毒的滴度。提取细胞总DNA，分别用引物对 lightF （SEQ IDNO: 3）和lightR （SEQ ID NO:4）、引物对heavyF (SEQ ID NO: 5)和heavy R (SEQ ID NO:6) PCR鉴测MaSp-c和MaSp-g基因，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，可从AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c DNA中分别扩增出代表MaSp-c（图1中A）和MaSp-g（图1中B）的基因片段，说明重组AcNPV-FibH-MaSp-g/c的DNA中含有MaSp-c和MaSp-g基因。
AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c病毒粒子的纯化与病毒拷贝数的测定：上述细胞培养上清，在4 °C条件下，8,000转/分钟离心10分钟，反复2次；取上清，以30,000转/分钟离心30分钟，取沉淀，用磷酸缓冲液溶解沉淀获重组病毒的贮备液，-20°C保存备用。取病毒的贮备液，提取病毒DNA，用P4-F（SEQ ID NO:7）和P4-R （SEQ ID NO:8）通过定量PCR测定病毒的拷贝数。
（4）重组病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c（贮备液）接种家蚕：“中2016×日2016”品种家蚕饲育至5龄起蚕，按每条蚕接种106拷贝的病毒。以103、104、105为对比。
（5）接种病毒的蚕添食抗生素环丙沙星：配制500mg/L的环丙沙星溶液，按6L溶液/100公斤桑叶均匀喷洒于桑叶叶面，喷洒环丙沙星溶液的新鲜桑叶凉干后喂养上述接种家蚕1天，尔后用新鲜桑叶在24℃左右饲养至见熟蚕。
PCR检测病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c在家蚕中的增殖：AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c接种家蚕后，按感染后24、48、72和96小时取蚕的血液200μl和100mg后部丝腺，提取DNA，用P4-F（SEQ ID NO:7）和P4-R （SEQ ID NO:8）通过定量PCR检测病毒的拷贝数。检测结果如图2所示。随着病毒的感染，后部丝腺组织中病毒的拷贝数呈增加趋势。
Western blot检测丝腺组织中的重组蛋白MaSp-g/c：AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染5龄家蚕96小时后，取不同蚕的后部丝腺，经过SDS-PAGE分离后，用MaSp-g/c抗体进行Western blot检测，如图3所示，在病毒感染的丝腺组织中可检测到代表MaSp-c （55 kDa）和 MaSp-g（>170 kDa）的信号条带，说明MaSp-c和MaSp-g基因已翻译成蛋白。
（6）家蚕添食蜕皮激素：配制22.5mg/L的蜕皮激素药液，按5L溶液/100千克桑叶喷洒新鲜桑叶，凉干后，饲喂上述见熟蚕1次；将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧。
蚕茧的外形和茧质调查：5龄起蚕分别接种103、104、105和106拷贝/条蚕病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c ，各个处理区的蚕茧烘干后，观察茧形，没有发现接种病毒引起明显的茧形变化，调查接种106拷贝病毒的蚕的干茧重、茧壳重以及丝的长度，与没有接种病毒的对照相比，参见图4。
（7）制备含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白MaSp-g/c的嵌合蚕丝：蚕茧烘干后贮藏。缫丝前，贮藏干茧脱胶后，经过缫丝获得含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白MaSp-g/c的嵌合蚕丝。
MaSp-g/c的嵌合蚕丝性能检测结果如表1所示。其中对照为未注射病毒蚕的丝；MaSp-g/c为接种106病毒的蚕的丝。蚕丝的断裂应力Breaking stress、杨氏模量Youngmodulus、断裂能Breaking energy明显增加，截面积Average areas下降明显，断裂应变Breaking strain略有减少。
Figure 558605DEST_PATH_IMAGE001
MaSp-g/c的嵌合蚕丝蛋白的二级结构检测：AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染蚕所产茧经脱胶缫丝后，进行红外光谱分析。根据红外光谱的特征，计算丝蛋白中二级结构的比例，参见图5。与未注射病毒的对照蚕的丝相比，感染病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c蚕的丝蛋白的二级结构中β-折叠的含量增加15.8%，而α-螺旋的比例基本不变。
图1为上述重组病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c的PCR鉴定。提取AcBacmid-FH/LP-MaSp-g/c转染后发病细胞的总DNA，用引物对lightF（SEQ ID NO:3）和lightR（SEQ ID NO:4）PCR检测MaSp-c基因，引物对heavyF（SEQ ID NO: 5），引物heavyR（SEQ ID NO:6）PCR检测MaSp-g。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。图1中A，MaSp-c基因检测结果。泳道M，标准分子量DNA；泳道con，重组质粒pFast-FH/LP-MaSp-g/c；泳道1、2和3，重组病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c。图1中B，MaSp-g基因检测结果。泳道M，标准分子量DNA；泳道con，野生病毒；泳道1、2和3，重组病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c。
图2为上述PCR检测AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染家蚕丝腺中病毒基因的表达。106拷贝的AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c接种“中2016×日2016”5龄家蚕后，按感染后24、48、72和96小时取蚕的后部丝腺，提取DNA，用引物P4-F和P4-R通过qPCR检测重组病毒中庆大霉素基因片段，随着病毒的感染，后部丝腺中的病毒拷贝数增加。
图3为上述Western blot检测后部丝腺（中2016×日2016）中AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c表达的MaSp-g和MaSp-c。泳道M，标准分子量DNA；泳道2，未感染病毒对照；泳道3-5，分别为感染病毒96小时的不同家蚕的丝腺。一抗为抗MaSp-g/c抗体。
图4为上述AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染蚕所产茧的性状。A, 蚕茧的外形，103、104、105和106，接种病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c的滴度分别为103、104、105和106拷贝/条蚕；B,干茧重；C, 茧壳重；D，茧丝长。con，对照；MaSp-g/c，接种病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c。
图5为上述AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c感染蚕所产茧丝的红外光谱特性。A，蚕丝的红外光谱。con，未感染病毒的蚕的丝；13-1，感染106拷贝病毒的蚕的丝。B，基于红外光谱特征的丝蛋白的二级结构分析。Negative control, 未感染病毒的蚕的丝；10^6，感染106拷贝病毒的蚕的丝。
实施例二 7532品种家蚕
（1）重组病毒AcNPV-FH/LP-MaSp-g/c为实施实例一步骤（3）的细胞培养上清。
（2）重组病毒AcNPV-FibH-MaSp-g接种家蚕：“7532”品种家蚕饲育至5龄起蚕，按每条蚕接种106拷贝的病毒。以103、104、105为对比。
（3）接种病毒的蚕添食抗生素氟苯尼考：配制500mg/L的氟苯尼考溶液，按6L溶液/100公斤桑叶均匀喷洒于桑叶叶面，喷洒氟苯尼考溶液的新鲜桑叶凉干后喂养家蚕1天，尔后用新鲜桑叶在24℃左右饲养至见熟蚕。
Western blotting检测丝腺组织中的重组蛋白MaSp-g/c：取感染103、104、105、106拷贝的病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c感染72小时的家蚕后部丝腺，用MaSp-g/c的抗体进行Western blotting检测，同时以微管蛋白作为内参。检测结果如图6。在感染病毒的后部丝腺中可检测到代表MaSp-g（>170 kDa）和MaSp-c（55kDa）的信号条带，说明MaSp-g和MaSp-c基因已翻译成蛋白。
组织免疫荧光检测重组MaSp-g/c在丝腺细胞中的分泌： 106拷贝的重组病毒AcNPV- FHP/FLP-MaSp-g/c感染5龄家蚕48、72、96小时后，取丝腺组织制作石蜡切片，用MaSp-g/c抗体通过组织免疫学的方法检测丝腺细胞表达的重组蛛丝蛋白的分泌，结果如图7所示。感染AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c的丝腺腔中可观察到代表MaSp-g/c的棕色信号，且随着病毒的感染，腺腔中的信号强度增加，说明重组MaSp-g/c分泌进入腺腔并积累。
（4）家蚕体喷蜕皮激素：配制22.5mg/L的蜕皮激素药液，体喷步骤3的蚕，以蚕体表湿润为宜；将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧，蚕茧烘干后贮藏。缫丝前，贮藏干茧脱胶后，经过缫丝获得含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白MaSp-g和MaSp-c的嵌合蚕丝，丝长达到对照蚕（未感染病毒，即纯蚕丝）丝长的63%。
Western blotting 检测蚕丝中的MaSp-g/c：取上述嵌合蚕丝，用常规溴化锂溶液溶解蚕丝。溴化锂溶解后的蛋白溶液加入到透析膜中，透析72小时后进行用MaSp-g/c抗体进行Western blot检测。如图8所示，在病毒AcNPV- FHP/FLP-MaSp-g/c感染5龄家蚕的丝样本中可检测到代表MaSp-g（>170 kDa）和MaSp-c（55kDa）的信号条带，说明制备的丝中含有MaSp-g和MaSp-c。
AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c感染蚕的嵌合丝的性能检测：测定接种103、104、105和106拷贝的病毒组的丝的应力-应变曲线（图9），进一步计算丝的机械性能，结果显示，接种病毒组的蚕丝的断裂应力Breaking stress、杨氏模量Young modulus、明显高于未接种病毒对照组，且具有接种病毒拷贝数依赖性；丝的截面积Average areas明显低于未接种病毒对照组，断裂应变Breaking strain与对照相比略有减少，但断裂能Breaking energy低于对照组，且有接种病毒拷贝数依赖性（表2）。红外光谱检测结果如图10所示，根据红外光谱检测结果，计算丝蛋白中二级的比例，接种病毒组的丝蛋白中的β-折叠的比例高于对照组，且随接种病毒拷贝数增加，丝蛋白中β-折叠的比例增加，具有剂量依赖性。
Figure 6904DEST_PATH_IMAGE002
图6为上述Western blot 检测丝腺中的MaSp-g/c。103、104、105、106拷贝的病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c感染5龄家蚕，72小时后取丝腺组织，用MaSp-g/c抗体进行Western blot检测。泳道M，标准分子量蛋白; 泳道con，未感染病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c蚕的丝腺；泳道103、104、105和106，感染103、104、105、106拷贝的病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c蚕的丝腺。一抗为抗MaSp-g/c。内参为微管蛋白，检测抗体为抗微管蛋白抗体。
图7为上述免疫组化检测AcNPV- FHP/FLP-MaSp-g/c感染丝腺中MaSp-g/c的分泌。A，对照蚕的丝腺；B、C和D，5龄蚕感染病毒AcNPV- FHP/FLP-MaSp-g/c 48、72和96小时的丝腺。一抗为抗MaSp-g/c抗体。
图8为上述Western blot 检测蚕丝中的MaSp-g/c。泳道M，标准分子量蛋白; 泳道con，未感染病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c对照；泳道1、2和3，5龄家蚕接种106拷贝的病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c蚕的丝。一抗为抗MaSp-g/c。
图9为上述AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c感染蚕的茧丝机械性能。A，5龄起蚕接种不同滴度病毒AcNPV-FHP/FLP-MaSp-g/c蚕的茧丝的机械性能。Con，未接种病毒组丝的应力-应变曲线；103、104、105和106，分别接种103、104、105和106拷贝的病毒组的应力-应变曲线。
图10为上述蚕丝红外光谱特征以及基于红外光谱特征的丝蛋白二级结构分析；Con，未接种病毒组丝红外光谱图；1、2、3和4分别接种103、104、105和106拷贝的病毒组的丝红外光谱图； Negative control, 未感染病毒的蚕的丝；10^3、10^4、10^5、10^6，分别接种103、104、105和106拷贝的病毒组的蚕的丝。
随着DNA测序技术的进步，人们已解明了多种蜘蛛丝蛋白基因的序列。十多年以来，人们试图通过基因工程技术大量表达蜘蛛丝蛋白，进一步通过纺丝工程技术机械制备蜘蛛丝，并取得了较多的进展。目前已能够在细菌、酵母、哺乳类动物细胞、昆虫等表达系统中表达多种蜘蛛丝蛋白全长基因或重复区域的重复片段，甚至也能够通过转基因动植物表达蛛丝蛋白。在自然界，蜘蛛通过丝蛋白的自主装配和蜘蛛与世俱来的纺丝习性，将丝蛋白纺成丝纤维。由于基因工程表达的重组蜘蛛丝蛋白不能够自主装配，必须进一步通过人工纺丝才能加工成纤维。但目前通过人工纺丝还不能大量获取机械性与天然蜘蛛丝相当的纤维。蜘蛛丝蛋白组成独特，特别是主壶腹腺丝蛋白，分子量巨大。研究表明，当外源蛋白的分子量高于60kDa时，表达水平呈现明显的下降，当用大肠杆菌表达蜘蛛牵引丝蛋白基因片段超过3kb时不仅基因表达效率降低，且有表达提前终止现象。另外，蜘蛛丝蛋白通常有4种通用的氨基酸模块：（1) GPGXX，(2) GGx，(3)An/ (GA)n和(4）间隔区（spacer）。蜘蛛丝蛋白且多为这些模块有规律的高度重复。因此，当用异源系统表达时往往重组蜘蛛丝蛋白分子量低于自然状态，且表达水平极低。由于重组蜘蛛丝蛋白的分子量低于自然状态，加上人们还没有能完全模仿蜘蛛的吐丝过程，因此人工纺丝所获得的丝的机械性能与低于天然蜘蛛丝。家蚕是唯一能室内规模饲养大量提供丝纤维的昆虫。蚕丝蛋白主要由丝胶蛋白和丝素蛋白组成，而丝纤维主要由不溶于水的丝素蛋白重链（350kDa）、丝素蛋白轻链（25.8kDa）以及P25蛋白(25.7kDa)按6:6:1的摩尔比装配而成，蚕丝蛋白的机械性能主要由丝素蛋白重链的高分子量和氨基酸序列的高度重复决定。近年来，蚕丝纤维或蚕丝蛋白已广泛用于医用生物材料研发。通过家蚕转基因的方法将蜘蛛丝蛋白基因导入家蚕基因组，须经过较复杂的程序进行转基因家蚕的筛选鉴定，进一步通过杂交筛选获得转基因纯系，历时1-2年时间，且多为表达一种蜘蛛丝蛋白基因；通过本发明的技术可以在较短的时间获取重组病毒，并通过该病毒接种5龄家蚕能在一周左右获得含有2种蜘蛛丝蛋白的嵌合蚕丝，其断裂强度达到1116.55MPa，丝长达到现有技术的65%，既解决了现有技术仅能用于实用性差的多化性品种的问题，又克服了现有技术蜘蛛蛋白复合蚕丝丝长不到纯蚕丝丝长42%的缺陷。
SEQ ID NO: 1
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SEQ ID NO: 2
GCGGCCGCTCAAAGCCTCATCCCAATTTGGAGTCACTCAAGACATCCTTGATTAAGGCAGCTGCCGATATTGACATGGACCTCGTTCGTGCTGCGATAGACGACTGGCCGCGCAGATTGAAGGCCTGTATTCAAAATCACGGAGGTCATTTTGAATAAACTTTAGTGTCATAAGAATCTATGTTTTGTTAAGTTCATTTTGGTATATGAATGGTTACATAATGAATAAACTTGTTTCAATTATTTTACATTAAACATGTGACAGAATTTATGACCTGACTAGGTAGGTACAAACAGCCTTTTTGATATTAGAAAACTAAGTAAAATAGCCTACGGTCACATCTCTTTCCGTGGGTGTCGTTAAAGGGCGACTTAGAGAACCACCAAGAACGTAGCAGAATCCTCAGAGTGTCATACCAGCATACAGCCATCGCTAACTGCTATTTACTGGTAATAGGGCACATTGTAATCTCACTTAACCATACTGTCGGGCCACCATCTAGCCTATTTCTGCCACGAATCAATCGTGAGTGATGGACATAGAGAAACTATTAGTTGAGAAGAAAACAAGAGCACTAAAGGTTTGATATTGACAAAAATCTACTTCGCCGTCACTCCATAGGTTTATTGTCTCTCATTAGTCCAGAACAGCAGTTACAGACGTAAGCTTTTACGCACAAACTACAGGGTTGCTCTTTATTGTATCGAAAATATGGGACCTGAATAAGGGCGATTTTGACGCGTCCTGCCCGCCCATTCCCGATCCTACGGACAGAATGGCAAGCAGTCGACGTCGCCCCAAACACGTCATTTCGGATCCTCACGATCCACTAACGGTGCTTTAGGTACCTCAAGCACCGGTCATCGTTCTCGTCGGACCCGTCGCTTGCGACGAAGGGCTCGACGAGCAAATTAACCCTCAGACACAGCCCACTGAGTTTCTCGCCGGATCTTCTCAGCGGGTCGCGTTTCCGATCCGGTGGTAGATTCTGCGAAGCACGGCTCTTGCTAGGATTCGTGTTAGCAACGTCGTCAGGTTTGAGCCCCGTGAGCTCACTTACTAGTTAAGGTTACGCTGAAATAGCCTCTCAAGGCTCTCAGCTAGGTAGGAAACAAAAAAAAAAGTCCTGCCCTTAACACCGTTGCGATGGCTTGTCTTTGCAGAAAGATGTTTTGTACGGAAAGTTTGAATAAGTGCTTAATTGCAAGTAACGTAACAATGTTTTAGGGTTCGGTCCTCAATAAATTCGACCAATAAACCATATATGTCGTGCTAATTACTGGACACATTGTATAACAGTTCCACTGTATTGACAATAATAAAACCTCTTCATTGACTTGAGAATGTCTGGACAGATTTGGCTTTGTATTTTTGATTTACAAATGTTTTTTTGGTGATTTACCCATCCAAGGCATTCTCCAGGATGGTTGTGGCATCACGCCGATTGGCAAACAAAAACTAAAATGAAACTAAAAAGAAACAGTTTCCGCTGTCCCGTTCCTCTAGTGGGAGAAAGCATGAAGTAAGTTCTTTAAATATTACAAAAAAATTGAACGATATTATAAAATTCTTTAAAATATTAAAAGTAAGAACAATAAGATCAATTAAATCATAATTAATCACATTGTTCATGATCACAATTTAATTTACTTCATACGTTGTATTGTTATGTTAAATAAAAAGATTAATTTCTATGTAATTGTATCTGTACAATACAATGTGTAGATGTTTATTCTATCGAAAGTAAATACGTCAAAACTCGAAAATTTTCAGTATAAAAAGGTTCAACTTTTTCAAATCAGCATCAGTTCGGTTCCAACTCTCAAGATGAGAGTCAAAACCTTCGTGATCTTGTGCTGTGCTCTCCAATACGTGGCCTACACAAACGCTCCATGGAGCGACACCGCTACAGCCGATGCTTTCATTCAAAATTTCCTCGGTGCCGTCTCCGGATCTGGTGCTTTCACCCCTGACCAGCTGGACGATATGGCTACTGTGGGAGACACCATTATGTCCGCCATCGATAAGATGGCTAGAAACAATAAGTCATCTAAGAGTAAGCTCCAGTCACTGAAAATGGCCTTCGCTTCATCAATCGCTGGTATTGCTGCCGTTGAACAAGGTGGACAGTCGATGGACATCAAGACCAACGCCATTGCTAATGCCTTGGATTCGGCTTTCTACATGACAACTGGAAGTACAAACCAACAGTTCGTCAATGAAATGAGAAGTCTCATATCAATGATCTCTGCTGCCAGCGCCAACGAAGCTAGCTACGGCGGTGGAGCTTCCGCTGCCGCTGCCACAGCTGGCGGTTACGGTCAAGGAGCTTCCGGTTACGATCCTGGACTGTCCCCAGCTTCGGCTGCCGCTCCTAGTGGCTACGGTCCATCAAAGAGAGAACCTTCAGGTATTGGTGCCGCTGCCGCTGCCCCATCTGAATACGGTTCGAGTCAACAGGGCCCGAGTGGTACAAAAGCTGCCACTATCGCTGCCGCTAAGAGAGGCCCCACTAGCTACGGTCCTAGACAACAACGCCCTGGTGGTTCTGGAGCTCCTGCCGCTACCGCTGGTAGAGGACCGGGTGGATACGGACCCGAACAACAAGGACCTAGAGGCTCAGGAGCCGCTGCCGACGAAGCTGGACCAGGACAACAGGAACCGGGTGCTGATGCTGCCGCTGCCTTCGGTAGTGGATCAGGCGAACAGGGTCCAGGAAGATTCGACGCTGCCGCTGCCACTGCTAAATCGAGAGGCAATGGTCCTGGACAACAGGGCTCTGGTGTCGCTTCAGCTGCTGCTGCTGGTAGTGAACCCAGAGGATACGGCCCTGGTCAACAAGCTCACAGAGGACACGGCGCTGCCGCTGCCGCTACTGGAAGCGGCGGTTACGAACCAGGACAACAAGGACCTGGTGGTCCTTCCGCCGCTGCCGCTGGTTTGGGACCAGGTGGATACGGTCCGAGAAAACAAGGACAAAGAAGACCCGCCGCTACCGCCGCTGCCGCTGAAACAGGCGGTTACGGTCCTAGAATACAGGGAACAGGAGCCGCTGCCGCTGCCGCTACCGGAAGAGGACCCGGAGGCTACGGTCCTGGACAACAGGTTCCAGGTGGATCTGGAGCTGTCAAGGCCGCTGATGGACCTGAAAGTTTCGGACCTGGTCAGCCTGGCGGTCCTGGAGCCGCTGCCACAGCTGGCGCCAGAAGAGGACCGGGAGGCTACGGACCTGGACAACAAGAACCTGGAAGACCATCTGTGGCTGCCGCTAGTGCTGGCTCAGGTGGATACGGTCCTAGACAACAGGGACCAGGCGGTTACGCTCCGGGACAACAGGGTCCTGGAGTTCCTGGTGCTACTGGAGCCGCTGCCGCTGGCAGAGGTTCAGGATACGCTAATGGCAAAAAGGTCCCGGGAGGCCCTGGCGCCGCTGCCGCTGCCGCTACTGGGTCTACACCTGGAGCTTACGGCCCTGGTCAACAGGGACCAGGTGGAGACGATCCGAAACAACAGGCTCCCGCCTCATCTAGCGCTACAGAAGCCGCTGCCGGACCTAGAGGATACGGCCCAGGTAAACAAGGTCCTGGTGCTGCCGTCGCTGTTGCTGCCGGTTCTGGACCCGGCGGTTACGGCCCTCGTCAGCAGGGTCCTGGAGGCCCAGCTATAGGCCCAGGTGTTTACGGACCGGGCCAACAGGGTAAAAGAGTCTACGGTCCCGGTCAGCAAGGACCTGGTGGATTCGGTGCTGCCGCTGCCACTGCTGCCGGCCCTGGTGACTACGGTCCTGATAAGAGAGGACCGGGCGGTCCTGGAGTTGCTGCCGCTGGAAGAGGCAGCGGTAGACCAGGATCCGCCGCTGACGCTACAGCCGGATCTGGTCCCGGAGGCTACGGTCCAGGACAACAAGGACCAGGAGCCGCTGCCACTGCTGCCTCTGGATCTGGACCGGGTGTTTACAGACCCAGACAATCTGGTGGACCAGGTGCTGCCGTCGGAGCTGCTACTAGAAGAGGATACGGCTACGGACCAGGACAACAGGGTCCTGAGGGACCAGGAGCTGTTGCTGCCGCTGCCGCTGGATCTGAACCTGGCGGTTACGGACCAGGCCAACAGGGCAAGGAAGGTTACGTCAGTGGTGAACAGGAGCCAGGAGATTCTGGATCGGCCGCTGCCGCTTTCGGTCCTGGAGTGTCTGGACCCAAACAACAGGGCCCTGGTGAAAAGGCCGCTGCCGCTAGTGGATCAGGCACAAGAGGTTATGGTCCAGGCCAACAAGGTCCGGGAGGCCCTGGTGCCGCTGCCGCTACTGAAGCTGGTAGAGGATCAGGTGGATACGGCCCAGGTCAACAGGGTCCGGAAGGATCTGGCGTTGCCGCTGCCGCTGCCGCTCGTCCCGGCGGTTACGGTCTCGGACAAGAAGGCCCAGGTTCGGCCGCTGCCACAGCTGCCGGAAGAGGAATAGAAGGTCACGGACCTGGCCAACAAGGACCTGGAGGCCCAGGTGCTGCCGCTGCCGCTGCCACCGGTAGAGGACAAGGTGGATACAAACCCGGTCAGAAGGGACCTGGCGGTTACGGAACAAGACAACAAGGACCTGAAGAACCTGGTTCTGATGCTGCCGCTACTAATGGCACCGGTCTCGGACAGGAAGGACCTGGAGGCCCTGTTACTGCCGCTGTCGCCGCTGGCTCTGGTCAACAGAAGTTGAGTGCCGCTGCCGCTGCCACCGCTGGAAGAGGATTGGGTGGATATGGACCAGGACAACAAGGTCCGGCTGCCACTGCTACCACAGCTGGCCGCGGTCTGGGCGGTACTGGAGCTGCCGCTGAAGCCGCTGCCGGACGTGGTCCCGGAGGCTATGGACCTGGACAACAGGAAGCTGGCGTGTCGGGTGAAGCTGCCGAAGCTGCCGGCCCTGGTCCTCCACCGCAAGGACCTGGCACTGCTGCCATCGCTGCCGCTGGTAGTGTGCCAGGTGGATACGTTCCTGGACAGAGAGGTACCGGCGGTCCAGCCGCTGCCGCTGCCACTGGTCTCGGAGGCTACAAACCCGGTCAACAGGGACCTGGTGGATACGCTCCAGGCCAAAAGGGTCTGGAAGCTACCGCTGCCGGTAGAGGAAGCGGCTACGGTCCCGCTAAACAGGTGCCGGGCGGTCCTGGAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGAACCTGGACCCCCTGGCGAATACGGTACAGAAAAAAGAGGACCGAAAGGAGACGGACCAAAACAGCAAGCTGCCGCTGGATCCTCGGCCGCTGCCGCTGCCGGCAGTTCAGCTGCCGCTGCCGCTACAGGTCCTCAAGGTTATGGTCCTGGACAACAAGGTCCTGGAGCTACTGCCTCGGCCGCTGCCGGAAGTAGACCCGTCAGATACGGACCTGGTCAAAAGGGACCTGGTGCAGGACCCGGAGGCTACGAACCTGGTCAGCAAGGTCCTGGTGGACCTGGAAGCGCTGCCGCTGGCCCAGGCGGTTACGGTCCGGCTCAACAAGGACCTGGTGTGCCATCCGCCGCTGCCGGCAGAAGAGGTTTGGGATACGGCCCCGGTAAACATGGACCTAGCGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGAAGCGGCCCTGGTGGTTACGGTCCGGGACAACAGGGTAAAGGTGGATATGGTCCCGGTAAACAAGAACCTGGTAACTTCGGGGCCGCTGCCGCTGCCTCGGGACCAGGCGGTTACGGACCGGGCAAAGAAGGTCCCGGAAGTGCTGATGCTGCCGCTGCCAGAAGAGGACCTGGAGGCTACGGCCCAAAACAAAAAGGTGCTGCCGCTATGGCCGCTGCCGCTGCCGGTTCAATCCCTGAAGGCTACGGTCCCGTCCAACAAGGACCTGGCGTGTCAGGAGCTGCCGCTGCCACTACCTCTGAACCGGTGGGTTACGGAGCTGGCCAAGAAGGTCACGGAGCAGTCGCTGCCGCTACAGCTGGCAGAGGTCCAGGTGGATACAGACCGGGCCTGTACGGTCCCGGCGGTTCTGGTAGCGCCGCTGAAGCCGCTGGACCTGGAGGCTATGGTTCAAAACAACAGGGTACAATTTCTACTGCCGCTGCCGCTGCCGGATCAGAACCTGGTGGATACGGACCTGGTCAGCAAGGACCGGGCGGTTCTGGAGTTGCTGCCGCTACCGAAGAAAGAAGAGAACCCGGAGGCTACAAGCCTGGTCAGCAAGGCCCTGGTGGACCATCTGTGGCCGCTGCCTCTGCTGGCCTCGGCGGTTACGGTCCAGGACAGCAAGGTCCGGGAGGCCCAAATGGACCTGGTCAACAGGGTCCTGGTGGATCAGGTGTTGCTGCCGCTACTGAAGAAAGAAGAGAACCAGGCGGTTACAAGCCGGGTCAACAAGGTCCTGGTGGTCCTTCTGTGGCCGCTGCCTCCGCTGGACTGGGTGGATACGGCCCTGGACAACAAGGACCCGGCGGTCCTTCTGTTGCTGCCGCTAGTGCTGAATTGGGAGGCTACGGCCCCAGACAGCAAGGCCCTGGTGGATACGCTCCTGGTCAGCAGGGTCCGGGCGGTTACGCTCCAGGTAGACAAGGTCCAGGAGTTCCTTGTGCTGCTACAGCCGCTGGCGCTGGTTCTGGTTATGGTCCTGGCCAACAGGTCCCCGGAGGCCCAGGAACAACTGCCGCTGCCGCTGCCGGAAGCACTTCTGTCGAATACGGACCTGGCCAACAGGGTAGAAAAGGTGACGGACCTAAGCAACAGGCTCCAGCCGGATCTAGCGATGCTGCCGCTGCCGCTGGCCCGAGAGGCTATGGCCCTGGACAACAGGGACCTGTTGCCGCTGCCTTGGCTGCCGCTGGCTCTGGTCCAGTGGGTTATGGACCTGGTCAAAGAGGACCTGGTGCCGCTGTGGCTGCTTCTGCTGGTAGCGGACCTCTCGGCTACGGTCCAAGACAACAGGGTCAAGTGGGACACGGCAGAGCCGCTACTGCTGAAGCCGGTAGAGGACCGGGCGTTTACGAGCCTGGAGAACAAGGTCCAGGTGGACCTGGTTCAGCCGCTGCCGCTGCCGGTCCTAGAGGATACAGACCACGTCAGCAAGGTCCTGGAGTTCACGGAGCTGCTACCGCTAGAAGAGGCTCTGGATACGGACCAGGCCAACAAGGACCTGAAGCTCCAGGTGCTGCCGCTGCCACAGCTGCCGGTTCTGGTCCCGGCGGTTACGGACCTGGTAAACAGGGTAAAGGTGGTTACGTCCCAGGACAACAGGAGCCTGGCGACTTTGGAGCTGCCGCTGCCGCTAGTGGTTCAGGTGGATACGGACCTGGAAGCGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGTAGAGGACCCGGCGGTTACGGTCCTAAACAACAGGGCGCTGGTGCTATGGCTTCAACCGCCGCTGGATCTATCCCTGGTGGTTACGGACCTGGACAGCAAGGTCCTGGTCAGCAAGGACCAGGTGACTTCGGTGCCGCTGCCGCTGAAGCTGCTTCCGGACCAGGTGGATATGGTCCTGGACAGGAAGTTCCTGTTCCTGTGGCTGTTGCCGCTGCCGGTAGAGGACCAGGCGGTTACAGATCAGGACAACAAGGACCGGGAGGCTTCGGATCTACTGCTGCCGCTGCCGGTCCCGGTGGATATGGTCCTGGTCAACAAGGTCCCGGAACAGTTGCTGTGGCTGCCGCTGAATCTGGTCCTGGCGGTTACGGTACTGGTCAACAAGGCCCTGGTGGTCCTAGCGCCGCTGCCGCTTCCGCTGGTCCGGGTGGATATGGCCCTGGTCAGCAAGGACCTGGAGTGCCTGGAGCTGTTGCTACCGCCGCTGCCGTGAGAGGTTCTGGATACGGCGCTGGTCAACAAGTTCCAGGCGGTCCTGGTGCTGCCGCTGCCACCGTCACCGGTAGAAGACCTGGAGGCTATGGCCCAGGCCAACAAGGTCCTGGAAGATTGGATGCTGCCAGCGCTGCCGCTGGCCCTGGTTCCTACGGTCCTGAACAACAGGGACCAGTTGCTAGTGCCGCTGGAAGAGGCCCCGGTAGATACGGTACTGAACAACAGGGACCTGGCAGATACGGTACCGGTCAACAGGGCCCCGGTAGACCTGTCACAGCCGCTGTGGATTCTGGCAGCGAACAACAGGGTCTGTCGGCCGCTGCCGCTGCCGCTGCCGGACGTGGCAACGGTGGATACTTGCCTGGTCAACAAGGACCCGCTGTGGCTGCCGCTGCCGCTGGTCGTGGACTGGGCGGTTACGGCCCGGGTCAACAGGAACCTGGTGGTCCGGGAGCCGCTTTGGCCAATGCTGGCCCTGAAGGTTATGGTCCTGGTCAACAGGGTACTGACGCCGCTGCCGCTACCGCTATTGTTTCAGGACCAGGCGCCGCTACATCCACTGGAAGATCGCCGGAATGCTACGGATCTGAGCAGCAAGGACCCGCTGGTCCTGGAGCTGCCACTGCCGCTGCCGCTGGCAGGGGTCCTGGTGGATACAGATCAGGTGAGCAAGGTCCAGAGGGACCTGGTGCCGCTGCCGCTACTGTGGCTGGTATTGGACCTGGCGGTTACGGTAGCAGACAGGAAGGACCCGGAGGCCCTGTTGCCGCTGCCGATGCTTCCGGCCCAGGTGGATATAGACCAGGACAGCCGGGCGGTCCTGTGGCTACCGCTGCCACAGCTGGCCAGGGTCCGAGAGGTTACGTGCCCGGACAACAGGGCCCTGTGGGAGCTGCCGCTGCCACTTCCAGATCGGGACCTGGTGGTTATGGTCCGGGCAAACAAGGACCTGGAGCTGCCTCCGCTGCCTCGGGACCTGGTGGATACGGTCCAGAACAACAAGGACCTGGTGCTGCCCTCGCTGCCGCTGCCGGATCAGGTCCTGGCGGTTATGGTCCAGGACCTCAGGCTAGTGCTGCCAGATCTAGACTGGCTTTCCCAGACAGTAGATCAAGAGTCTCCTCGGCTGCCTCGAACTTGGTGGCTAGTGGTCCGACAAATTCTGCTGCCCTCAGCAACGCTATTTCCAATACTGTGTCGGAAATAGGAGCTTCATACCCAGGACTGTCTGGCTGTGATGTTCTGGTCCAAGCTTTGATGGAAATTGTTAGCGCCCTCGTCGCTATACTGAGTTCATCTAGCATCGGACAGGTTAACTACGTGGCCGTTTCTCAAAGCGCTCAGGTGGTTTCCCAATCGCTGTTGCAGGCTTTGTACTAATTTTTAATATAAAATAACCCTTGTTTCTTACTTCGTCCTGGATACATCTATGTTTTTTTTTTCGTTAATAAATGAGAGCATTTAAGTTATTGTTTTTAATTACTTTTTTTTAGAAAACAGATTTCGGATTTTTTGTATGCATTTTATTTGAATGTACTAATATAATCAATTAATCAATGAATTCATTTATTTAAGGGATAACAATAATCCATGAATTCACATGCACATTTAAAACAAAACTAAATTACAATAGGTTCATATAAAAACAACAAGTATGCCTTCTCAACTAAGAATACTATACTGCAG
SEQ ID NO: 3
ATGAAACCTATCTTCCTCGT
SEQ ID NO: 4
TTATCCTAAAGCCTGGTAGA
SEQ ID NO: 5
ATGAGAGTCAAAACCTTCGTG
SEQ ID NO: 6
GCTTTGAGAAACGGCCACGTA
SEQ ID NO: 7
TATATTCGCGGCGTTGTGAC
SEQ ID NO: 8
AAGTTGGGCATACGGGAAGA
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝及其制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2999
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgaggtac ggttcgtaaa gttcacctgc ggctatattc cgactcgcca agttacgtca 60
gtcgtattgt aatgagcgat ttagtgggca acttcattct gttaattttg tgtcacggtg 120
cgcgcgcatc gtaaaacttc actctcatag atttttcata acgcgcctaa agaagtataa 180
cttcaataat ttaaatttaa aaaaaaacat gcatagaata attatatgaa ttatttaaaa 240
tgtcatttac cgacattgac ataacagacg acgttaacac tacaaaacat tttaattcca 300
cattgttaca tattcaacag ttaaatttgc gttaattctc gatgcgaaca aatataagaa 360
caatcggatc aattagatcg ctttgtttcg aacaacactt agtttaacta gaggcgtaca 420
cctcaagaaa tcatcttcat tagaaactaa accttaaaat cgcaataata aagcatagtc 480
aattttaact gaaatgcaaa gtcttttgaa cgttagatgc tgtcagcgtt cgttggtaca 540
gttgtttgat atttatttta attgtctttt tatatataaa tagtggaaca ttaatcacgg 600
aatcctgtat agtatatacc gattggtcac ataacagacc actaaaatga aacctatctt 660
cctcgttctg ctggtggcta catctgccta tgccgcccca tggtcttcga cggagttggc 720
cgacgctttt atcaacgctt tcctcaatga agccggaaga actggcgctt tcaccgccga 780
ccaactcgac gatatgtcta ccattggtga caccctgaaa acagctatgg ataagatggc 840
cagatccaac aaatcatctc aatcgaagct ccaggctctg aatatggctt tcgcttcatc 900
aatggctgaa atcgctgccg tggaacaagg tggattgagc gttgctgaaa aaacaaacgc 960
tattgccgat tccctcaatt cggctttcta ccaaacaact ggagccgtta acgtccagtt 1020
cgtcaatgaa ataagaagtc tcatctcaat gttcgctcag gccagcgcta acgaagctag 1080
ctacggcggt ggatacggcg gtggacaagg cggtcaatct gctggtgctg ccgctgccgc 1140
tggtgctgga caaggtggtt acggtggact gggcggtcaa ggtgctggta gtgccgctgc 1200
cgctgccgct tcaggagcag gtcaaggtgg ttatggtgga gtgggaaacc agggtgctgg 1260
aagaggcgcc ggagccgctg ccgctgccgc tggcggtgct ggtcaaggtg gttacaatgg 1320
tggacaagga ccttctgccg ctgccgctgc cgctgccagc ggagctggcc agggcggtta 1380
cggaggccct ggttcccaag gtgctggaca aggagctgga gctgccgctg ccgctgccgg 1440
tggagctgga caaggcggtt acggaggctt gggtggacag ggagctggaa gaggcggtgc 1500
tgccgctgcc gctgccgctg ccggtgtggc tggacaaggt ggtctgggtt cgcagggtgc 1560
tggaagaggt ggactcggcg gtcagggtgc aggcgctgcc gctgccgctg gaggcgccgg 1620
acagggtgga tacggtggtc tgggacaagg tgctggtcaa ggagctggag tcgccgctgc 1680
cgctgccgct ggaggcgctg gccaaggtgg atacggcggt ttcggttccc agggagcagg 1740
aagaggtggt caaggtggac aaggttcggc cgctgccgct ggcggtgctg ggcaaagagg 1800
ttacggaggc cagggtgctg gtcagggtgg attgggcggt ggagaacagg gagctggcga 1860
agaaggttct ggtgccagcg ctggcgctgg tgccgctgcc ggaagaggcg ctggcggtgg 1920
aggcaagggt ggactgggcg gtcaaggtgg tagtgctgcc gctgccgctg ccggtggagc 1980
tgggcaaggc ggtttgggag gctcaagagg tgctggacaa ggtgctggag ctgccgctgc 2040
cgctgccggt ggagctggtc agggcggtta tggaggcctg ggctcacaag gagctggtag 2100
aggtggacaa ggcgctggtg ctgccgctgc cgctgccggc ggtgctggcc aaggtggtta 2160
cggtggactg ggcggtcagg gcgttggtag aggtggtctg ggtggtcaag gtgcaggtgc 2220
tgccgctgcc gtcggtgctg gacagggcgg ttacggaggc gtgggatctg gtgcttcggc 2280
tgccagtgct gccagatcta gattgtcgag tcctcaagct tcatctagag tgagctccgc 2340
tgtttcgaac ctcgtcgcca gtggtccaac aaattcagct gccctgtcga gtactatttc 2400
aaacgtggtt tctcaaatag gagcttctaa tcctggactg agcggctgcg acgttttgat 2460
acaggctctg ttggaagtcg tgtcagcctt gatccaaatt ctcggttcat ctagcatcgg 2520
acaggtcaat tacggctcag cgggacaggc tacgcaaata gtgggacagt cagtctacca 2580
ggctttagga taaataagaa ctgtaaataa tgtatatata taattatata aaagatatat 2640
ataaccatat acaaacatat atatcattat aagacaatct acctatataa aaacagacta 2700
aaattaataa ttatgtatac tttaattgtg tttaggacat tttatgcaaa ttgtgtttgc 2760
gttaggattt tttttggaag ttttttagat tatttatgaa tatataaata aatatacgtt 2820
aatataatat atattatata aatcaacgac acggcttttc attttggtga tgatcaatct 2880
tattgttctt ctaattgatt tttttgtaca ataaagatgt atccagtttt ccagataaag 2940
aatttagttt gttatttctg gccccattaa aataagtacg gtattcgaca atagcatgc 2999
<210> 2
<211> 9516
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccgctc aaagcctcat cccaatttgg agtcactcaa gacatccttg attaaggcag 60
ctgccgatat tgacatggac ctcgttcgtg ctgcgataga cgactggccg cgcagattga 120
aggcctgtat tcaaaatcac ggaggtcatt ttgaataaac tttagtgtca taagaatcta 180
tgttttgtta agttcatttt ggtatatgaa tggttacata atgaataaac ttgtttcaat 240
tattttacat taaacatgtg acagaattta tgacctgact aggtaggtac aaacagcctt 300
tttgatatta gaaaactaag taaaatagcc tacggtcaca tctctttccg tgggtgtcgt 360
taaagggcga cttagagaac caccaagaac gtagcagaat cctcagagtg tcataccagc 420
atacagccat cgctaactgc tatttactgg taatagggca cattgtaatc tcacttaacc 480
atactgtcgg gccaccatct agcctatttc tgccacgaat caatcgtgag tgatggacat 540
agagaaacta ttagttgaga agaaaacaag agcactaaag gtttgatatt gacaaaaatc 600
tacttcgccg tcactccata ggtttattgt ctctcattag tccagaacag cagttacaga 660
cgtaagcttt tacgcacaaa ctacagggtt gctctttatt gtatcgaaaa tatgggacct 720
gaataagggc gattttgacg cgtcctgccc gcccattccc gatcctacgg acagaatggc 780
aagcagtcga cgtcgcccca aacacgtcat ttcggatcct cacgatccac taacggtgct 840
ttaggtacct caagcaccgg tcatcgttct cgtcggaccc gtcgcttgcg acgaagggct 900
cgacgagcaa attaaccctc agacacagcc cactgagttt ctcgccggat cttctcagcg 960
ggtcgcgttt ccgatccggt ggtagattct gcgaagcacg gctcttgcta ggattcgtgt 1020
tagcaacgtc gtcaggtttg agccccgtga gctcacttac tagttaaggt tacgctgaaa 1080
tagcctctca aggctctcag ctaggtagga aacaaaaaaa aaagtcctgc ccttaacacc 1140
gttgcgatgg cttgtctttg cagaaagatg ttttgtacgg aaagtttgaa taagtgctta 1200
attgcaagta acgtaacaat gttttagggt tcggtcctca ataaattcga ccaataaacc 1260
atatatgtcg tgctaattac tggacacatt gtataacagt tccactgtat tgacaataat 1320
aaaacctctt cattgacttg agaatgtctg gacagatttg gctttgtatt tttgatttac 1380
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ccgattggca aacaaaaact aaaatgaaac taaaaagaaa cagtttccgc tgtcccgttc 1500
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gctctccaat acgtggccta cacaaacgct ccatggagcg acaccgctac agccgatgct 1920
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ggtattgctg ccgttgaaca aggtggacag tcgatggaca tcaagaccaa cgccattgct 2160
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gaaatgagaa gtctcatatc aatgatctct gctgccagcg ccaacgaagc tagctacggc 2280
ggtggagctt ccgctgccgc tgccacagct ggcggttacg gtcaaggagc ttccggttac 2340
gatcctggac tgtccccagc ttcggctgcc gctcctagtg gctacggtcc atcaaagaga 2400
gaaccttcag gtattggtgc cgctgccgct gccccatctg aatacggttc gagtcaacag 2460
ggcccgagtg gtacaaaagc tgccactatc gctgccgcta agagaggccc cactagctac 2520
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ggcgaacagg gtccaggaag attcgacgct gccgctgcca ctgctaaatc gagaggcaat 2760
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agcggcggtt acgaaccagg acaacaagga cctggtggtc cttccgccgc tgccgctggt 2940
ttgggaccag gtggatacgg tccgagaaaa caaggacaaa gaagacccgc cgctaccgcc 3000
gctgccgctg aaacaggcgg ttacggtcct agaatacagg gaacaggagc cgctgccgct 3060
gccgctaccg gaagaggacc cggaggctac ggtcctggac aacaggttcc aggtggatct 3120
ggagctgtca aggccgctga tggacctgaa agtttcggac ctggtcagcc tggcggtcct 3180
ggagccgctg ccacagctgg cgccagaaga ggaccgggag gctacggacc tggacaacaa 3240
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caacagggac caggcggtta cgctccggga caacagggtc ctggagttcc tggtgctact 3360
ggagccgctg ccgctggcag aggttcagga tacgctaatg gcaaaaaggt cccgggaggc 3420
cctggcgccg ctgccgctgc cgctactggg tctacacctg gagcttacgg ccctggtcaa 3480
cagggaccag gtggagacga tccgaaacaa caggctcccg cctcatctag cgctacagaa 3540
gccgctgccg gacctagagg atacggccca ggtaaacaag gtcctggtgc tgccgtcgct 3600
gttgctgccg gttctggacc cggcggttac ggccctcgtc agcagggtcc tggaggccca 3660
gctataggcc caggtgttta cggaccgggc caacagggta aaagagtcta cggtcccggt 3720
cagcaaggac ctggtggatt cggtgctgcc gctgccactg ctgccggccc tggtgactac 3780
ggtcctgata agagaggacc gggcggtcct ggagttgctg ccgctggaag aggcagcggt 3840
agaccaggat ccgccgctga cgctacagcc ggatctggtc ccggaggcta cggtccagga 3900
caacaaggac caggagccgc tgccactgct gcctctggat ctggaccggg tgtttacaga 3960
cccagacaat ctggtggacc aggtgctgcc gtcggagctg ctactagaag aggatacggc 4020
tacggaccag gacaacaggg tcctgaggga ccaggagctg ttgctgccgc tgccgctgga 4080
tctgaacctg gcggttacgg accaggccaa cagggcaagg aaggttacgt cagtggtgaa 4140
caggagccag gagattctgg atcggccgct gccgctttcg gtcctggagt gtctggaccc 4200
aaacaacagg gccctggtga aaaggccgct gccgctagtg gatcaggcac aagaggttat 4260
ggtccaggcc aacaaggtcc gggaggccct ggtgccgctg ccgctactga agctggtaga 4320
ggatcaggtg gatacggccc aggtcaacag ggtccggaag gatctggcgt tgccgctgcc 4380
gctgccgctc gtcccggcgg ttacggtctc ggacaagaag gcccaggttc ggccgctgcc 4440
acagctgccg gaagaggaat agaaggtcac ggacctggcc aacaaggacc tggaggccca 4500
ggtgctgccg ctgccgctgc caccggtaga ggacaaggtg gatacaaacc cggtcagaag 4560
ggacctggcg gttacggaac aagacaacaa ggacctgaag aacctggttc tgatgctgcc 4620
gctactaatg gcaccggtct cggacaggaa ggacctggag gccctgttac tgccgctgtc 4680
gccgctggct ctggtcaaca gaagttgagt gccgctgccg ctgccaccgc tggaagagga 4740
ttgggtggat atggaccagg acaacaaggt ccggctgcca ctgctaccac agctggccgc 4800
ggtctgggcg gtactggagc tgccgctgaa gccgctgccg gacgtggtcc cggaggctat 4860
ggacctggac aacaggaagc tggcgtgtcg ggtgaagctg ccgaagctgc cggccctggt 4920
cctccaccgc aaggacctgg cactgctgcc atcgctgccg ctggtagtgt gccaggtgga 4980
tacgttcctg gacagagagg taccggcggt ccagccgctg ccgctgccac tggtctcgga 5040
ggctacaaac ccggtcaaca gggacctggt ggatacgctc caggccaaaa gggtctggaa 5100
gctaccgctg ccggtagagg aagcggctac ggtcccgcta aacaggtgcc gggcggtcct 5160
ggagctgccg ctgccgctgc cgaacctgga ccccctggcg aatacggtac agaaaaaaga 5220
ggaccgaaag gagacggacc aaaacagcaa gctgccgctg gatcctcggc cgctgccgct 5280
gccggcagtt cagctgccgc tgccgctaca ggtcctcaag gttatggtcc tggacaacaa 5340
ggtcctggag ctactgcctc ggccgctgcc ggaagtagac ccgtcagata cggacctggt 5400
caaaagggac ctggtgcagg acccggaggc tacgaacctg gtcagcaagg tcctggtgga 5460
cctggaagcg ctgccgctgg cccaggcggt tacggtccgg ctcaacaagg acctggtgtg 5520
ccatccgccg ctgccggcag aagaggtttg ggatacggcc ccggtaaaca tggacctagc 5580
gctgccgctg ccgctgccgc tggaagcggc cctggtggtt acggtccggg acaacagggt 5640
aaaggtggat atggtcccgg taaacaagaa cctggtaact tcggggccgc tgccgctgcc 5700
tcgggaccag gcggttacgg accgggcaaa gaaggtcccg gaagtgctga tgctgccgct 5760
gccagaagag gacctggagg ctacggccca aaacaaaaag gtgctgccgc tatggccgct 5820
gccgctgccg gttcaatccc tgaaggctac ggtcccgtcc aacaaggacc tggcgtgtca 5880
ggagctgccg ctgccactac ctctgaaccg gtgggttacg gagctggcca agaaggtcac 5940
ggagcagtcg ctgccgctac agctggcaga ggtccaggtg gatacagacc gggcctgtac 6000
ggtcccggcg gttctggtag cgccgctgaa gccgctggac ctggaggcta tggttcaaaa 6060
caacagggta caatttctac tgccgctgcc gctgccggat cagaacctgg tggatacgga 6120
cctggtcagc aaggaccggg cggttctgga gttgctgccg ctaccgaaga aagaagagaa 6180
cccggaggct acaagcctgg tcagcaaggc cctggtggac catctgtggc cgctgcctct 6240
gctggcctcg gcggttacgg tccaggacag caaggtccgg gaggcccaaa tggacctggt 6300
caacagggtc ctggtggatc aggtgttgct gccgctactg aagaaagaag agaaccaggc 6360
ggttacaagc cgggtcaaca aggtcctggt ggtccttctg tggccgctgc ctccgctgga 6420
ctgggtggat acggccctgg acaacaagga cccggcggtc cttctgttgc tgccgctagt 6480
gctgaattgg gaggctacgg ccccagacag caaggccctg gtggatacgc tcctggtcag 6540
cagggtccgg gcggttacgc tccaggtaga caaggtccag gagttccttg tgctgctaca 6600
gccgctggcg ctggttctgg ttatggtcct ggccaacagg tccccggagg cccaggaaca 6660
actgccgctg ccgctgccgg aagcacttct gtcgaatacg gacctggcca acagggtaga 6720
aaaggtgacg gacctaagca acaggctcca gccggatcta gcgatgctgc cgctgccgct 6780
ggcccgagag gctatggccc tggacaacag ggacctgttg ccgctgcctt ggctgccgct 6840
ggctctggtc cagtgggtta tggacctggt caaagaggac ctggtgccgc tgtggctgct 6900
tctgctggta gcggacctct cggctacggt ccaagacaac agggtcaagt gggacacggc 6960
agagccgcta ctgctgaagc cggtagagga ccgggcgttt acgagcctgg agaacaaggt 7020
ccaggtggac ctggttcagc cgctgccgct gccggtccta gaggatacag accacgtcag 7080
caaggtcctg gagttcacgg agctgctacc gctagaagag gctctggata cggaccaggc 7140
caacaaggac ctgaagctcc aggtgctgcc gctgccacag ctgccggttc tggtcccggc 7200
ggttacggac ctggtaaaca gggtaaaggt ggttacgtcc caggacaaca ggagcctggc 7260
gactttggag ctgccgctgc cgctagtggt tcaggtggat acggacctgg aagcgccgct 7320
gccgctgccg ctggtagagg acccggcggt tacggtccta aacaacaggg cgctggtgct 7380
atggcttcaa ccgccgctgg atctatccct ggtggttacg gacctggaca gcaaggtcct 7440
ggtcagcaag gaccaggtga cttcggtgcc gctgccgctg aagctgcttc cggaccaggt 7500
ggatatggtc ctggacagga agttcctgtt cctgtggctg ttgccgctgc cggtagagga 7560
ccaggcggtt acagatcagg acaacaagga ccgggaggct tcggatctac tgctgccgct 7620
gccggtcccg gtggatatgg tcctggtcaa caaggtcccg gaacagttgc tgtggctgcc 7680
gctgaatctg gtcctggcgg ttacggtact ggtcaacaag gccctggtgg tcctagcgcc 7740
gctgccgctt ccgctggtcc gggtggatat ggccctggtc agcaaggacc tggagtgcct 7800
ggagctgttg ctaccgccgc tgccgtgaga ggttctggat acggcgctgg tcaacaagtt 7860
ccaggcggtc ctggtgctgc cgctgccacc gtcaccggta gaagacctgg aggctatggc 7920
ccaggccaac aaggtcctgg aagattggat gctgccagcg ctgccgctgg ccctggttcc 7980
tacggtcctg aacaacaggg accagttgct agtgccgctg gaagaggccc cggtagatac 8040
ggtactgaac aacagggacc tggcagatac ggtaccggtc aacagggccc cggtagacct 8100
gtcacagccg ctgtggattc tggcagcgaa caacagggtc tgtcggccgc tgccgctgcc 8160
gctgccggac gtggcaacgg tggatacttg cctggtcaac aaggacccgc tgtggctgcc 8220
gctgccgctg gtcgtggact gggcggttac ggcccgggtc aacaggaacc tggtggtccg 8280
ggagccgctt tggccaatgc tggccctgaa ggttatggtc ctggtcaaca gggtactgac 8340
gccgctgccg ctaccgctat tgtttcagga ccaggcgccg ctacatccac tggaagatcg 8400
ccggaatgct acggatctga gcagcaagga cccgctggtc ctggagctgc cactgccgct 8460
gccgctggca ggggtcctgg tggatacaga tcaggtgagc aaggtccaga gggacctggt 8520
gccgctgccg ctactgtggc tggtattgga cctggcggtt acggtagcag acaggaagga 8580
cccggaggcc ctgttgccgc tgccgatgct tccggcccag gtggatatag accaggacag 8640
ccgggcggtc ctgtggctac cgctgccaca gctggccagg gtccgagagg ttacgtgccc 8700
ggacaacagg gccctgtggg agctgccgct gccacttcca gatcgggacc tggtggttat 8760
ggtccgggca aacaaggacc tggagctgcc tccgctgcct cgggacctgg tggatacggt 8820
ccagaacaac aaggacctgg tgctgccctc gctgccgctg ccggatcagg tcctggcggt 8880
tatggtccag gacctcaggc tagtgctgcc agatctagac tggctttccc agacagtaga 8940
tcaagagtct cctcggctgc ctcgaacttg gtggctagtg gtccgacaaa ttctgctgcc 9000
ctcagcaacg ctatttccaa tactgtgtcg gaaataggag cttcataccc aggactgtct 9060
ggctgtgatg ttctggtcca agctttgatg gaaattgtta gcgccctcgt cgctatactg 9120
agttcatcta gcatcggaca ggttaactac gtggccgttt ctcaaagcgc tcaggtggtt 9180
tcccaatcgc tgttgcaggc tttgtactaa tttttaatat aaaataaccc ttgtttctta 9240
cttcgtcctg gatacatcta tgtttttttt ttcgttaata aatgagagca tttaagttat 9300
tgtttttaat tacttttttt tagaaaacag atttcggatt ttttgtatgc attttatttg 9360
aatgtactaa tataatcaat taatcaatga attcatttat ttaagggata acaataatcc 9420
atgaattcac atgcacattt aaaacaaaac taaattacaa taggttcata taaaaacaac 9480
aagtatgcct tctcaactaa gaatactata ctgcag 9516
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaaccta tcttcctcgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttatcctaaa gcctggtaga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagagtca aaaccttcgt g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctttgagaa acggccacgt a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatattcgcg gcgttgtgac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagttgggca tacgggaaga 20

Claims (10)

1.一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝，其特征在于，所述多种蜘蛛腺丝蛋白为两种及两种以上不同的蜘蛛腺丝蛋白。
2.根据权利要求1所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝，其特征在于，所述蜘蛛腺丝蛋白为蜘蛛大壶状腺丝蛋白。
3.根据权利要求1所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝，其特征在于，所述蜘蛛为金丝织网蜘蛛。
4.一种生产权利要求1所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的家蚕，其特征在于，将多种表达蜘蛛腺丝蛋白的序列克隆入质粒，再转化重组，然后转染培养细胞，得到重组病毒粒子；将所述重组病毒粒子接种家蚕幼虫，喂养至熟蚕，得到生产所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的家蚕。
5.权利要求1所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的制备方法，其特征在于，将多种表达蜘蛛腺丝蛋白的序列克隆入质粒，再转化重组，然后转染培养细胞，得到重组病毒粒子；将所述重组病毒粒子接种家蚕幼虫，喂养至熟蚕，然后上蔟、采茧、缫丝，得到含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝。
6.根据权利要求5所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的制备方法，其特征在于，多种表达蜘蛛腺丝蛋白的序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2。
7.根据权利要求5所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的制备方法，其特征在于，采用含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌转化，培养后挑取白色菌落，提取重组DNA；将转化得到的重组DNA转染草地夜蛾Sf9培养细胞，得到重组病毒粒子。
8.根据权利要求5所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的制备方法，其特征在于，采用含有抗生素的桑叶喂养接种后的家蚕一天，然后采用未处理桑叶喂养至熟蚕，再用蜕皮激素处理一次，然后上蔟。
9.根据权利要求5所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝的制备方法，其特征在于，家蚕的品种包括丝茧育实用家蚕品种、家蚕原种。
10.权利要求1所述含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝在制备丝制品中的应用。
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