CN111518832A - 蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法。蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的碱基为由花园银蛛梨状腺丝重复片段单元、络新妇蛛梨状腺丝重复片段单元构成的重复序列，具有改良家蚕丝性能等应用；构建家蚕合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的载体，再利用显微注射将带有蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用转座子使荧光蛋白基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的转基因家蚕。本发明发现了一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法，显著提高了蚕丝的机械性能。

Description

蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的 方法
技术领域
本发明涉及了一种基因的应用及其作用方法，尤其是涉及了一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)的应用及其改良家蚕丝性能的方法。
背景技术
蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌形成的蛋白聚合物，是一种多样化的材料家族，具有非凡的力学性能，如高拉伸强度和延展性。在自然界中，蜘蛛需要利用蛛丝来行使各种各样的功能，包括形成保护壳，支撑蛛网结构、繁殖后代和捕捉食物等。后纺亚目蜘蛛，又被称为圆网蜘蛛，这种蜘蛛占现存蜘蛛种类的93.9％，是最多样化的蜘蛛群，拥有七种分化形态的丝腺，包括大壶状腺、小壶状腺、鞭状腺、聚状腺、葡状腺、管状腺、梨状腺，每种腺体内可表达一种或多种独特的蛛丝蛋白基因，进而形成具有特定结构的蛛丝纤维或胶状物。
梨状腺丝(Pyriform silk)由梨状腺分泌而来，通常和梨状腺分泌的另一种胶质物混合形成复合材料，成为附着盘(attachmentdisc)，这种结构在整个蛛网中是唯一一种由丝纤维和胶状物质组成的特殊形态，起到锚定蛛网、稳固巢穴的作用。对比已发现的梨状腺丝基因，如花园银蛛(Argiope argentata)、络新妇蛛(Nephila clavipes)、三带金蛛(Argiope trifasciata)和大腹圆蛛(Araneus ventricosus)等梨状腺丝基因，发现与其他种类蛛丝蛋白基因组成明显不同，梨状腺丝蛋白的基序为PXPXPX和QQSSX，而大、小壶状丝、鞭状丝的基序是GPGGX、An、GA、GGX。有研究报道，在光滑的玻璃表面上，一只体重0.6-0.8g的成年圆蛛(Nephila senegalensis)的附着盘可以承挂其体重4-6倍的重物，而所用材料仅2-10μg(占蜘蛛重量的0.001％)。并且即使在表面自由能很强的材质上，如聚四氟乙烯(Teflon)，梨状腺丝也能表现出很强的粘性，并在不到一秒时间内发挥作用，稳定使用数年，即便在-140℃液氮下做冷冻压裂处理，梨状腺丝也能保持柔韧并且极难破碎。
梨状腺丝蛋白基因的特点是分子中含有大量重复片段(repeat)，如花园银蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp，Genebank ID：KY398016)是由21个完全一样的重复片段DNA序列连接组成，每个重复片段含有234个氨基酸。
但是由于蜘蛛具有异嗜行为，无法直接大规模获取天然蜘蛛丝，使得蜘蛛丝的广泛应用受到很大的限制。蚕丝是一种很有前途的生物降解材料，具有抗拉强度高、可生物降解性等特点，随着纺织领域和高新科技对蚕丝需求的增加，其应用层面不断扩大，促使研究人员致力于改变蚕丝纤维的性质，以期开发一种方便、可靠、具有较高强度和显著延展性的丝纤维材料。相比于在桑叶表面喷涂矿物质、强迫吐丝等费时费力的技术来说，家蚕生活周期短，饲养方便，丝蛋白产量高，个体小，易饲养，易加工，特别是基于piggyBac的转基因家蚕技术发展越来越成熟，且家蚕吐丝特征与蜘蛛有很大的共通之处，这些优点使其非常有利于作为生物反应器来生产蛛丝蛋白。此外，家蚕饲养在我国有悠久的历史，技术非常深厚，发展和应用家蚕生物反应器生产有价值的蜘蛛丝非常符合我国国情。
现有技术中缺少了针对提高蚕丝性能的有效的转基因和处理方法和有效作用基因的发现。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于利用转基因家蚕技术将蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，提供一种利用家蚕丝腺合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白、开发出能合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的家蚕，通过家蚕丝腺细胞合成的梨状腺丝蛋白分泌到茧层中，直接获得蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料，提高了蚕丝力学性能。
本发明发现并将重要应用价值的蛛丝基因导入家蚕基因组，利用丝腺器官具有高效合成蛋白质的能力，育成一批能够高效率大规模生产蛛丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系，大幅度提升蚕丝应用价值，开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
一、一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用：
所述蜘蛛梨状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的碱基序列为由花园银蛛梨状腺丝基因1个重复片段碱基序列单元、络新妇蛛梨状腺丝基因1个重复片段碱基序列单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。
花园银蛛梨状腺丝基因(PySp)1个重复片段碱基序列单元和络新妇蛛梨状腺丝基因(PySp)1个重复片段碱基序列单元分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，花园银蛛梨状腺丝基因(PySp)1个重复片段碱基序列单元和络新妇蛛梨状腺丝基因(PySp)1个重复片段碱基序列单元均分别是从完整的花园银蛛梨状腺丝基因(PySp)序列和络新妇蛛梨状腺丝基因(PySp)序列人工合成获得。
所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。
二、一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛梨状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够高效率大规模生产蜘蛛梨状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)采用权利要求1所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)。
所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的质粒pBac-PySp，质粒pBac-PySp包含有作为外源基因的梨状腺丝蛋白基因和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-PySp质粒及能够提供piggy Bac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，依靠piggyBac转座子将梨状腺丝蛋白基因插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜筛选表达荧光标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再交配制种续代成为G2代；
(4)G2代家蚕采用单蛾饲育，荧光体视显微镜下筛选荧光标记基因高表达的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区荧光标记基因高表达的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(6)从G4代开始选择荧光表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经连续3代同样方法的选择、交配，育成荧光基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白的转基因家蚕；
(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧而获得蚕丝。
由此获得能够高效率大规模生产蜘蛛梨状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系。
所述的质粒pBac-PySp是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-PySp包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛梨状腺丝蛋白基因和家蚕丝蛋白polyA基因的表达框。
所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase-SV40。
所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下，分泌到丝腺腺腔，并进入前部丝腺，直到蚕茧。
所述的荧光蛋白基因包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。
所述的家蚕丝蛋白包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因和丝胶蛋白1基因。
方法是构建家蚕合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的载体，再利用显微注射将带有蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用转座子使荧光蛋白基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的转基因家蚕。
本发明的有益效果是：
本发明是先构建家蚕合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的载体pBac-PySp，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和梨状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕丝腺细胞特异性合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的转基因家蚕。
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白，达到改良蚕丝机械性能的目的，提高蚕丝业的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
采用由花园银蛛梨状腺丝蛋白基因1个重复片段碱基序列单元以4倍连续重复构成的基因序列为目的序列，按照家蚕丝素蛋白密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，以包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框和丝素蛋白轻链基因启动子启动的表达框的质粒为基础，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，琼脂糖电泳后回收目的片段进行连接，获得最终质粒pBac-PySp-4L-EGFP。
将pBac-PySp4L-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的质粒pHA3PIG按浓度比1：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后2小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，交配得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察，筛选获得表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在蚁蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选EGFP标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使梨状腺丝蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增PySp基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示外源基因插入位点在家蚕第26条染色体。结果证明蜘蛛丝基因序列已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状丝胶蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕梨状腺丝蛋白基因的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带，证明家蚕丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧。
转基因家蚕的蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例1转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486171720000051
研究结果证明花园银蛛梨状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种的基因组第26号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌梨状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效改善家蚕蜘蛛仿生丝的机械性能。
实施例2：
采用由花园银蛛梨状腺丝基因1个重复片段碱基序列单元以2倍连续重复构成的基因序列为目的序列，以红色荧光为标志基因(DsRed)，以丝胶蛋白1基因启动子为目的基因启动子，构建pBac-PySp-2S-DsRed转基因质粒。
将2倍重复片段的pBac-PySp2S-DsRed质粒及能够提供piggyBac转座酶的质粒pHA3PIG按浓度比2：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后8小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，交配传代得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因阳性蚕1区，将其饲养至成虫交配传代，是为G2代，育成绿色荧光蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白的转基因家蚕新品种。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增PySp基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点在第20条染色体，证明蜘蛛丝基因序列已经插入到家蚕基因组内。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家梨状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带，证明家蚕丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧。
对转基因家蚕蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例2转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486171720000061
上述研究结果证明花园银蛛梨状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第20号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌梨状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效改善家蚕蜘蛛仿生丝的机械性能。
实施例3：
采用由络新妇蛛梨状腺丝1个碱基重复片段单元构成的4倍重复片段为目的序列，按照家蚕重链密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，以IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框为标志基因，以丝素蛋白重链基因启动子启动4倍重复片段目的基因，构建成最终质粒pBac-PySp-4H-EGFP。
将质粒pBac-PySp-4H-EGFP及能够提供piggyBac转座酶的质粒pHA3PIG按浓度比1.5：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后8小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选EGFP标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使梨状腺丝蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕后部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增PySp基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点上在第2条染色体，证明蛛丝序列已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌络新妇蛛梨状腺丝蛋白的转基因家蚕新品种。
提取家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家梨状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例3转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486171720000071
Figure BDA0002486171720000081
研究结果证明络新妇蛛梨状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第2号染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，重组蚕丝机械性能有明显改善。
实施例4：
采用由络新妇蛛梨状腺丝8个碱基重复单元构成基因片段为目的序列，按照家蚕重链密码子偏好性进行优化，构建转基因质粒，该质粒包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝素P25蛋白基因启动子启动的目的基因序列表达框。命名为pBac-PySp8P-EGFP。
将质粒pBac-PySp8-EGFP及能够提供piggyBac转座酶的质粒pHA3PIG按浓度比2：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后6小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕一区，将其饲养至成虫，与野生型Lan10杂交传代，是为G2代，自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使络新妇蛛梨状腺丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕后部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增PySp基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点上在第4条染色体处，证明蛛丝序列已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌花园银蛛梨状腺丝蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家梨状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著改善。
实施例4转基因家蚕茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486171720000091
研究结果证明络新妇蛛梨状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第4号染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌梨状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，重组蚕丝机械性能有明显改善。
综合上述4个实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕丝腺细胞高效合成蜘蛛梨状腺丝蛋白，梨状腺丝蛋白可以像丝素蛋白一样由丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而分泌到蚕茧中，且性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产蜘蛛梨状腺丝蛋白-蚕丝仿生丝材料，降低生产成本，提高蚕丝性能，提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：花园银蛛梨状丝基因1个重复片段的碱基序列
来源：人工合成
CAGTCATCAGTTGCTCAGCAATCAGCAGTTGCCCAACAATCCTCAGTTTCTCAACAATCCTCAGCTGCTCAACAGTCATCAGTTGCTCAATCGCAACAAACATCTTACTCTGCAGCAACAAATGCCGGTTCGAGTGTCTCGCAGTCTCAAGCTATTGTCTCAAGTGCCCCTGTGTACTTCAACTCGCAAACTTTGACAAACAACTTGGCTTCCTCTCTGCAATCACTGAATGCTCTTAATTACGTATCGAATGGTCAATTGAGTTCCTCGGATGTCGCTTCCACTGTTGCTAGAGCTGTAGCCCAGTCCCTCGGATTGTCACAAGGGTCAGTTCAAAATATAATGAGCCAACAATTGAGCAGCATAGGCTCTGGAGCTTCCACATCATCCCTCTCCCAGGCGATAGCAAATGCCGTATCTTCCGCAGTTCAAGGATCACAGGCAGCAGCTCCAGGACAGGAACAATCTATTGCACAAAGAGTAAATTCAGCCATTTCCTCCGCTTTCGCACAATTGATTTCCCAGAGAACCGCACCGGCTCCGGCCCCGAGACCCAGACCAGCTCCATTGCCTGCTCCAGCTCCAAGGCCCAGACCAGCACCTGCTCCACGACCAGCACCAGTTTATGCACCAGCGCCAGTTGCTTCGCAATTTCAGGCGTCTGCTTCCAGTCAATCTTCGGCTCAAGAGAATTCCTTCACT
SEQ ID NO.2：络新妇蛛梨状丝基因1个重复片段的碱基序列
来源：人工合成
GTAGTTTCTCAAGTACAGCAGGCATCCATTCAACAGGCACAGTCATCTTTTGCTCAGTCCCGACAATCGTCCGCTGCTCAGCAAGCCTCCGTCTCTCAATCCCAGCAGGCTTCGGTATCCCAATCACAGCAGTCCTCAAATGCATATTCCGCTGCGTCTAATGCCGCATCCAGCGTATCTCAAGCATCAAGCTCTTCAAGTTACTTTAACTCGCAAGTAGTACAGAGCACACTCTCATCGTCCTTGCAATCTTCTAGTGCTCTCAGTTCCATTAGCTACGGTCAGACCACAGCCAATATCAACGACGTAGCAGCAGCGGTCGCTAGAAGCGTTTCACAATCCCTTGGAGTTTCCCAACAAGTCGCACAAAGTGTTATCAGCCAACAACTTGCAAGTGCAGGATCGGGAGCATCGGCTCAAACATTGGCGCAATTGATATCCAGCGCAGTGTCTTCCTTGGTTCAACAATCTGGAACGGTGTCTGCCGGACAAGAACAGAGTATTTCACAAGCCCTTTCTAGTTCAATCTTGTCTTCTCTCAGTCAAGTAGTTGCCCAGAGACCTCTACCAGCTCCACGACCAGCACCTGCTCCTCGTCCACTCCCAGCTCCTTTGCCCGCTCCTCGTCCAATCCCAGCTCCTTTGCCCGCTCCTCGTCCAATCCCAGCTCCTTTTCCCCGCCCAGCACCC
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法
<120> 浙江大学
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagtcatcag ttgctcagca atcagcagtt gcccaacaat cctcagtttc tcaacaatcc 60
tcagctgctc aacagtcatc agttgctcaa tcgcaacaaa catcttactc tgcagcaaca 120
aatgccggtt cgagtgtctc gcagtctcaa gctattgtct caagtgcccc tgtgtacttc 180
aactcgcaaa ctttgacaaa caacttggct tcctctctgc aatcactgaa tgctcttaat 240
tacgtatcga atggtcaatt gagttcctcg gatgtcgctt ccactgttgc tagagctgta 300
gcccagtccc tcggattgtc acaagggtca gttcaaaata taatgagcca acaattgagc 360
agcataggct ctggagcttc cacatcatcc ctctcccagg cgatagcaaa tgccgtatct 420
tccgcagttc aaggatcaca ggcagcagct ccaggacagg aacaatctat tgcacaaaga 480
gtaaattcag ccatttcctc cgctttcgca caattgattt cccagagaac cgcaccggct 540
ccggccccga gacccagacc agctccattg cctgctccag ctccaaggcc cagaccagca 600
cctgctccac gaccagcacc agtttatgca ccagcgccag ttgcttcgca atttcaggcg 660
tctgcttcca gtcaatcttc ggctcaagag aattccttca ct 702
<210> 2
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtagtttctc aagtacagca ggcatccatt caacaggcac agtcatcttt tgctcagtcc 60
cgacaatcgt ccgctgctca gcaagcctcc gtctctcaat cccagcaggc ttcggtatcc 120
caatcacagc agtcctcaaa tgcatattcc gctgcgtcta atgccgcatc cagcgtatct 180
caagcatcaa gctcttcaag ttactttaac tcgcaagtag tacagagcac actctcatcg 240
tccttgcaat cttctagtgc tctcagttcc attagctacg gtcagaccac agccaatatc 300
aacgacgtag cagcagcggt cgctagaagc gtttcacaat cccttggagt ttcccaacaa 360
gtcgcacaaa gtgttatcag ccaacaactt gcaagtgcag gatcgggagc atcggctcaa 420
acattggcgc aattgatatc cagcgcagtg tcttccttgg ttcaacaatc tggaacggtg 480
tctgccggac aagaacagag tatttcacaa gccctttcta gttcaatctt gtcttctctc 540
agtcaagtag ttgcccagag acctctacca gctccacgac cagcacctgc tcctcgtcca 600
ctcccagctc ctttgcccgc tcctcgtcca atcccagctc ctttgcccgc tcctcgtcca 660
atcccagctc cttttccccg cccagcaccc 690

Claims (9)

1.一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：
所述蜘蛛梨状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因的碱基序列为由花园银蛛梨状腺丝基因1个重复片段碱基序列单元/络新妇蛛梨状腺丝基因1个重复片段碱基序列单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。
2.根据权利要求1所述的一种蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。
3.一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛梨状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够生产蜘蛛梨状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)采用权利要求1所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因(PySp)。
4.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白的质粒pBac-PySp，质粒pBac-PySp包含有作为外源基因的梨状腺丝蛋白基因和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-PySp质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，依靠piggyBac转座子将梨状腺丝蛋白基因插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜筛选表达荧光标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再交配制种续代成为G2代；
(4)G2代家蚕采用单蛾饲育，荧光体视显微镜下筛选荧光标记基因高表达的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区荧光标记基因高表达的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(6)从G4代开始选择荧光表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经连续3代同样方法的选择、交配，育成荧光基因和蜘蛛梨状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌梨状腺丝蛋白的转基因家蚕；
(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌蜘蛛梨状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧而获得蚕丝。
5.根据权利要求4所述的一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的质粒pBac-PySp是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-PySp包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛梨状腺丝蛋白基因和家蚕丝蛋白polyA基因的表达框。
6.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase-SV40。
7.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的蜘蛛梨状腺丝蛋白基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下，分泌到丝腺腺腔，并进入前部丝腺，直到蚕茧。
8.根据权利要求4所述的一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的荧光蛋白基因包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。
9.根据权利要求3所述的一种利用蜘蛛梨状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的家蚕丝蛋白包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因和丝胶蛋白1基因。
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