CN114685687A - 一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，将重组病毒接种5龄家蚕幼虫，桑叶添食后收集蚕丝，得到含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝；所述重组病毒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列；重组病毒AcNPV‑FibH‑MaSp‑g接种5龄家蚕幼虫，用浸渍或喷洒过抗生素药液的凉干后的新鲜桑叶饲养，后用新鲜桑叶饲养至熟蚕；用浸渍或喷洒过蜕皮激素药液的新鲜桑叶饲喂熟蚕；或直接用蜕皮激素药液体喷熟蚕，将熟蚕移至簇具，营茧，采茧，经过缫丝获含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合丝。利用本发明可获取含有金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的蚕丝，以满足制备各种生物材料对丝蛋白的多样性的需求。

Description

一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种通过家蚕生产含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝。

背景技术

近年来，人们已可以通过基因工程技术在细菌、酵母、哺乳类动物培养细胞、昆虫细胞甚至通过转基因动物和植物表达蛛丝蛋白，但这些表达的蛋白不能自主装配成丝纤维，须通过人工纺丝的技术进一步加工成丝纤维，但目前通过这种技术还难以大量获取机械性优异的蛛丝纤维。另外由于主壶腹腺丝蛋白的分子量巨大，且高度重复，当用异源系统表达时往往重组蛛丝蛋白分子量低于自然状态，且表达水平低下，而人工纺丝所获得的丝的机械性与丝蛋白的分子量有正相关性。几千年来，饲养家蚕是丝绸工业的基础，家蚕是唯一能室内规模饲养大量提供丝纤维的昆虫。蚕丝蛋白主要由丝胶蛋白和丝素蛋白组成，而丝纤维主要由不溶于水的丝素蛋白重链（350kDa）、丝素蛋白轻链（25.8kDa）以及P25蛋白(25.7kDa)按6:6:1的摩尔比装配而成，蚕丝蛋白的机械性能主要由丝素蛋白重链的高分子量和氨基酸序列的高度重复决定。很长时间以来，人们一直希望利用家蚕高效合成丝蛋白以及天然的纺丝能力生产蛛丝。目前，将合成的络新妇蛛（Nephila clavipes）、大腹园蛛(Araneus ventricosus)主壶腹腺丝蛋白基因的重复模序经过多次重复后，通过piggyBac介导的转基因已实现了非完整蛛丝蛋白基因在家蚕中的表达，并通过家蚕天然的纺丝能力获得含有蛛丝蛋白成份的嵌合蚕丝，在一定程度上改善了丝纤维的机械性能，但该丝纤维中蛛丝蛋白的含量非常有限；现有技术公开了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法，蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因为黑寡妇蜘蛛葡萄状腺丝或者园蛛葡萄状腺丝1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌葡萄状腺丝蛋白的载体pBac-ACSP质粒，将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和葡萄状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛葡萄状腺丝蛋白的转基因家蚕，其发现了一种蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法。现有技术采用将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内的方法耗时长，且不适用二化性实用品种的蚕卵，而饲养这些蚕卵孵化的蚕才可以得到高性能优质蚕丝。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种通过家蚕生产含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合蚕丝的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组病毒接种5龄家蚕幼虫，桑叶添食后收集蚕丝，得到含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝；所述重组病毒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列，重组病毒接种5龄家蚕幼虫的量为10⁴～10⁸拷贝/蚕。

本发明中，将重组DNA转染培养细胞，然后培养至细胞发病，取细胞培养上清再次接种培养细胞，然后培养至细胞发病，收集细胞培养上清，得到重组病毒；所述重组DNA含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。进一步的，将重组质粒转化DH10Ac大肠杆菌，后涂布于LB琼脂培养基平板上，然后培养，再挑取白色菌落，提取重组DNA；所述DH10Ac大肠杆菌含有AcBacmid；所述重组质粒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列，优选的，所述LB琼脂培养基含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X-gal，四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal的浓度分别为10 µg/ml、50 µg/ml、7 µg/ml、40µg/ml和100 µg/ml。

本发明中，将含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白序列的DNA片段克隆入质粒，得到重组质粒；所述含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白序列的DNA片段的序列为SEQID NO: 1；所述质粒为pFAST-Bac-Dual。合成SEQ ID NO: 1所示FibH-MaSp-g-polyA_Fib表达盒的优选方案是采用全化学合成的方法；也可以家蚕基因组为模板通过PCR获得带有编码信号肽序列的启动子序列和加尾信号序列，以金丝织网蜘蛛大壶状腺的RNA为模板通过RT-PCR的方法获得MaSp-g序列，然后通过拼接获得FibH-MaSp-g-polyA_Fib表达盒；也可以通过PCR扩增与化学合成相结合的方法制备FibH-MaSp-g-polyA_Fib表达盒。克隆可以采用酶切连接的方法，也可以通过无缝克隆的方法。

本发明，桑叶添食时添加抗生素、蜕皮激素，具体的，将重组病毒接种5龄家蚕幼虫后，添食含有抗生素的桑叶一天，然后添食常规桑叶，至熟蚕，然后添食含有蜕皮激素的桑叶一次或者喷洒蜕皮激素一次，再进行收集蚕丝；其中收集蚕丝为常规技术，包括上蔟、营茧、采茧、缫丝。

本发明接种的家蚕品种优选丝茧育实用家蚕品种，如菁松×皓月、中2016×日2016，也可以选用家蚕原种，如J14-花，本发明方法具有普适性，成功解决了现有方法不适用二化性蚕种的技术缺陷。优选的接种的5龄家蚕幼虫的发育时期为5龄蜕皮后1-3天。接种病毒时可以用4号昆虫针醮取收集的细胞培养上清或离心纯化的病毒穿刺接种家蚕幼虫，优选的，重组病毒接种5龄家蚕幼虫的量为10⁵～10⁷拷贝/蚕。本发明首先合成家蚕丝素蛋白重链基因启动子控制的5’端带有编码信号肽序列、3’端带有加尾信号的金丝织网蜘蛛的大壶状腺丝蛋白基因表达盒FibH-MaSp-g-polyA_FibH，其序列如SEQ ID NO: 1；再将其克隆进pFAST-Bac^Tm-Dual的多克隆位点构建质粒pFAST-FibH-MaSp-g；然后将质粒转化含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌，后涂布于含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal的LB琼脂培养基平板上，常规培养，再挑取白色菌落，提取重组AcBacmid-FibH-MaSp-g DNA；然后将重组AcBacmid-FibH-MaSp-g DNA转染草地夜蛾Sf9培养细胞，常规培养至细胞发病，然后取细胞培养上清再次接种草地夜蛾Sf9培养细胞，常规培养至细胞发病后，收集细胞培养上清，离心纯化得到重组病毒粒子AcNPV-FibH-MaSp-g；然后将重组病毒AcNPV-FibH-MaSp-g接种5龄家蚕幼虫，用浸渍或喷洒过抗生素药液的凉干后的新鲜桑叶饲养1天，后用新鲜桑叶饲养至熟蚕；再用浸渍或喷洒过蜕皮激素药液的新鲜桑叶饲喂蚕1次或直接用蜕皮激素药液体喷家蚕1次；然后将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧；蚕茧烘干后，经过缫丝获含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合丝。接种的5龄家蚕幼虫的发育时期为5龄蜕皮后1～3天；抗生素药液为环丙沙星或氟哌酸或氟苯尼考药液；蜕皮激素药液的浓度为20～25mg/L。

丝蛋白已广泛用于新型材料，蜘蛛丝蛋白和蚕丝蛋白各具独特的特点，人们希望通过生物学的方法获取蜘蛛丝蛋白和蚕丝蛋白的混合体，以满足制备各种材料对丝蛋白的多样性的需求。通过piggyBac介导的家蚕转基因技术可获得含有蛛丝蛋白成份的嵌合蚕丝，且在一定程度上改善了丝纤维的机械性能，但该嵌合蚕丝中蛛丝蛋白的含量非常有限；通过TALEN介导的同源末端重组已实现了用蜘蛛主壶腹腺丝蛋白基因经多次加倍的重复单元替代家蚕丝蛋白重链基因，这种方法获得的遗传修饰家蚕所生产的嵌合蚕丝中的蛛丝蛋白水平提高明显，尽管这种嵌合蚕丝的延伸性增加，但强度下降。此外由于受到通过显微注射将基因导入蚕卵的技术限制，目前对家蚕的遗传修饰基本上局限于无实用生产价值的多化性家蚕。杆状病毒是众多昆虫的病原，重组杆状病毒已广泛用于研发生物杀虫剂、表达外源蛋白和基因传递至脊椎动物细胞。杆状病毒种类繁多，且宿主域、感染性、致病率各不相同，本发明通过重组苜蓿银纹夜蛾核型多角病毒介导在家蚕后部丝腺表达金丝织网蜘蛛腺丝蛋白，从获取含有蛛丝蛋白的复合蚕丝，相关技术方案没有见报道。通过直接饲养蜘蛛难大量获得蜘蛛丝，利用本发明技术可以大量获得含有金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合蚕丝，利用本发明的技术可以利用实用家蚕品种高生产性能的优势获取具有蚕丝和蛛丝优秀性能的嵌合蚕丝。

附图说明

图1为实施例一中重组AcBacmid-FibH-MaSp-g的鉴定。

图2为实施例一中重组病毒AcNPV-FibH-MaSp-g的PCR鉴定。

图3 为实施例二中PCR检测AcNPV-FibH-MaSp-g感染家蚕血液、丝腺中的拷贝数。

图4为实施例二中Western blot检测后部丝腺中AcNPV-FibH-MaSp-g表达的MaSp-g。

图5 为实施例二中的Western blot 检测茧丝中的MaSp-g。

图 6 为实施例三中的RT-PCR检测感染AcNPV-FHP-MaSp-g蚕丝腺中的MaSp-g的转录。

图7为实施例三中的qRT-PCR检测感染AcNPV-FHP-MaSp-g蚕丝腺中不同时相的MaSp-g的转录。

图8为实施例三中Western blot检测注射不同滴度病毒后的家蚕丝腺组织。

图9 实施例四中的RT-PCR检测丝腺中MaSp-g基因的表达。

图10实施例四中的Western blot检测丝腺中MaSp-g基因的表达。

具体实施方式

本发明涉及的具体制备操作以及家蚕培养、测试表征都为常规技术，下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，家蚕为春蚕：

实施例一

委托商业公司进行化学合成，合成的序列如SEQ ID NO: 1，为含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列，命名为FibH-MaSp-g-polyA_FibH，序列的二侧分别添加NotI和PstI位点。

将FibH-MaSp-g-polyA_FibH克隆进pFAST-Bac^Tm-Dual（Invitrogen公司产品）的NotI/PstI位点构建质粒pFAST-FibH-MaSp-g。将质粒pFAST-FibH-MaSp-g转化含有AcBacmid DH10Ac大肠杆菌，后涂布于分别含有10 µg/ml、50 µg/ml、7 µg/ml、40µg/ml和100 µg/ml的四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG 和X-gal的LB 琼脂培养基平板上，于37℃培养12小时后，挑取白色菌落，接种在含有10 µg/ml、50 µg/ml和7 µg/ml的四环素、卡那霉素、庆大霉素LB培养基中，振荡培养8小时，提取重组AcBacmid-FibH-MaSp-g DNA，用引物M13-F （SEQ ID NO:2）和HC-left-R：（SEQ ID NO:3）进行PCR鉴定，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，从AcBacmid-FibH-MaSp-g DNA中可扩增5kb的特异性条带，而野生性AcBacmid用引物M13-F（SEQ ID NO:2）和M13-R（SEQ ID NO: 4）可扩增出300bp左右的产物，表明重组Bacmid构建成功。图1中，提取重组AcBacmid-FibH-MaSp-g DNA，用引物M13-F和HC-left-R进行PCR鉴定；野生型AcBacmid用M13-F和M13-R引物进行PCR鉴定，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，M，DNA标准分子量；泳道1，野性Bacmid；泳道2，重组AcBacmid-FibH-MaSp-g。

将重组AcBacmid-FibH-MaSp-g DNA 2μg与脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）混合，转染草地夜蛾Sf9培养细胞，于26℃培养4天，然后取细胞培养上清再次接种培养细胞，细胞发病后，收集细胞和细胞培养上清。提取细胞总DNA，用引物EcoRI-FG-F（SEQ ID NO:5）和XhoI-FG-R（SEQ ID NO:6）进行PCR鉴定，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。从感染病毒的细胞总DNA可扩增约8kb的特异性条带，表明AcNPV-FibH-MaSp-g构建成功。图2中，提取AcBacmid-FibH-MaSp-g转染后发病细胞的总DNA，用引物EcoRI-FG-F和XhoI-FG-R进行PCR鉴定，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，泳道M，标准分子量DNA；泳道1和2，重组病毒AcNPV-FibH-MaSp-g。

取上述细胞培养上清，在4 °C条件下，8,000转/分钟离心10分钟，反复2次；取上清，以30,000转/分钟离心30分钟，取沉淀，用磷酸缓冲液溶解沉淀获重组病毒的贮备液，-20°C保存备用，用于以下实施例。取病毒的贮备液，提取病毒DNA，用P4-F（SEQ ID NO:7）和P4-R （SEQ ID NO:8）通过定量PCR测定病毒的拷贝数。

配制500mg/L的环丙沙星溶液，按10L/100Kg均匀喷洒于桑叶叶面，晾干备用。配制500mg/L的氟苯尼考溶液，按10L/100Kg均匀喷洒于桑叶叶面，晾干备用。配制500mg/L的氟哌酸溶液，按10L/100Kg均匀喷洒于桑叶叶面，晾干备用。配制22.5mg/L的蜕皮激素药液，按8L/100Kg均匀喷洒于桑叶叶面，晾干备用。

实施例二

“中2016×日2016”品种家蚕饲育至5龄起蚕，按每条蚕接种10⁶拷贝的病毒（AcNPV-FibH-MaSp-g重组病毒的贮备液），然后添食喷洒环丙沙星溶液的新鲜桑叶1天，尔后用新鲜桑叶在24℃饲养至熟蚕。

AcNPV-FibH-MaSp-g接种家蚕后，按感染后24、48、72和96小时取蚕的血液200μl和100mg后部丝腺，提取DNA，用P4-F（SEQ ID NO:7）和P4-R （SEQ ID NO:8）通过定量PCR检测病毒的拷贝数。检测结果如图3所示，接种病毒24-72小时，血液、丝腺中病毒的拷贝数增加不明显，至接种病毒96小时，病毒的拷贝数急速增加，血液中病毒的拷贝数高于丝腺组织。

取病毒感染不同时相的后部丝腺组织，经过SDS-PAGE分离后，用MaSp-g抗体进行Western blot检测，同时，用微管蛋白（Tubulin）抗体检测内参基因表达的蛋白如图4所示，在感染24-120小时的丝腺中均能检测到MaSp-g的特异性条带，说明已经表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白，M，标准分子量DNA；泳道1，大肠杆菌表达的重组MaSp-g；泳道2,未感染病毒对照；泳道3-7，分别为感染病毒24、48、72、96和120小时的丝腺。一抗为抗MaSp-g抗体和抗微管蛋白抗体。

取蜕皮激素药液喷洒的桑叶，凉干后，饲喂上述熟蚕1次，再将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧，鲜茧烘干后贮藏，缫丝前，贮藏干茧脱胶后，经过缫丝获得含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合丝。

蚕丝中MaSp-g的检测：取上述复合丝，用常规溴化锂溶液溶解后的蛋白溶液加入到透析膜中，透析72小时后进行Western blot检测，结果如图5所示，可观察到Masp-g信号，说明茧丝中含有MaSp-g，泳道M，标准分子量DNA; 泳道con，未感染病毒AcNPV-FHP-MaSp-g蚕的丝；泳道1-3，感染AcNPV-FHP-MaSp-g蚕的丝。一抗为抗MaSp-g。

实施例三

1. 重组病毒AcNPV-FibH-MaSp-g接种家蚕：“J14-花”品种家蚕饲育至5龄起蚕，按每条蚕接种10⁴、10⁵、10⁶拷贝的病毒。

2. 用喷洒氟苯尼考溶液的新鲜桑叶凉干后添食接种家蚕1天，尔后用新鲜桑叶在24℃左右饲养至熟蚕。

PCR检测病毒AcNPV-FibH-MaSp-g在丝腺中的增殖：取病毒感染不同时相的丝腺组织，提取RNA，反转录成cDNA后，用引物MaSP-g-F（SEQ ID NO: 9）和引物MaSP-g-R （SEQ IDNO:10）进行PCR扩增，PCR产物的电泳结果如图6所示，各个检测组均可扩增出特异条带，说明AcNPV-FibH -MaSp-g进入家蚕后部丝腺，并转录MaSp-g；泳道M，标准分子量DNA; 泳道1和2，pFAST-FibH-MaSp-g阳性对照；泳道3，接种10⁴拷贝的病毒感染72小时的丝腺；泳道4，接种10⁵拷贝的病毒感染72小时的丝腺；泳道5、6和7，为接种10⁶拷贝的病毒分别感染24、72、48小时的丝腺。取接种10⁶拷贝病毒24、48和72小时蚕的后部丝腺，提取RNA，反转录成cDNA后，用引物MaSP-g-F（SEQ ID NO:9）和引物MaSP-g-R （SEQ ID NO:10）进行qRT-PCR检测,并同时用引物eIF4-1 （SEQ ID NO: 11）和引物 eIF4-2（SEQ ID NO: 12）检测内参基因真核细胞起始因子4A的表达，计算相对表达水平，结果如图7所示，随着病毒感染进程，MaSp-g的转录水平增加。

Western blotting检测丝腺组织中的重组蛋白MaSp-g：取病毒感染72小时的家蚕丝腺，用MaSp-g的抗体进行Western blotting检测，检测结果如图8。在感染病毒的样本中可检测到代表MaSp-g的信号条带，说明MaSp-g基因已翻译成蛋白，泳道con，未注射病毒AcNPV-FibH-MaSp-g对照；泳道1和2，注射10⁴、10⁵拷贝的病毒感染72小时的后部丝腺。

3. 用喷洒蜕皮激素药液的新鲜桑叶凉干后，饲喂步骤2的熟蚕1次，再将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧，鲜茧烘干后贮藏，缫丝前，贮藏干茧脱胶后，经过缫丝获得含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合丝。

实施例四

“菁松×皓月”品种家蚕饲育至5龄第2天，用4号昆虫针醮取实施例一收集的AcNPV-FibH-MaSp-g病毒感染培养细胞上清穿刺接种，再用喷洒氟哌酸溶液的新鲜桑叶凉干后添食家蚕1天，尔后用新鲜桑叶在24℃左右饲养至熟蚕。

①RT-PCR检测接种病毒家蚕丝腺中的MaSp-g的转录：取接种病毒72小时蚕的后部丝腺，提取总RNA，反转录成cDNA后，用引物MaSP-g-F（SEQ ID NO:9）和引物MaSP-g-R （SEQID NO:10）进行PCR扩增，PCR产物的电泳结果如图9所示，在检测的样本中均可观察到代表MaSp-g表达的特异性条带，说明AcNPV-FibH-MaSp-g进入家蚕后部丝腺并表达MaSp-g，泳道M，标准分子量DNA；泳道FHP，pFAST-FibH-MaSp-g阳性对照；泳道H1-H3:接种病毒AcNPV-FHP-MaSp-g 72小时的家蚕后部丝腺。

②Western blotting检测丝腺组织中的重组蛋白MaSp-g：取病毒感染72小时的家蚕后部丝腺，用MaSp-g的抗体进行Western blotting检测，检测结果如图10。在感染病毒的样本中可检测到代表MaSp-g的信号条带，说明MaSp-g基因已翻译成蛋白，泳道con，未接种病毒AcNPV-FHP-MaSp-g蚕的后部丝腺；泳道H1-H3，接种病毒AcNPV-FHP-MaSp-g 72小时的家蚕后部丝腺。

用喷洒蜕皮激素药液新鲜桑叶凉干后，饲喂上述熟蚕1次，再将熟蚕移至簇具，在25℃环境下营茧，7天后采茧，鲜茧烘干后贮藏，缫丝前，贮藏干茧脱胶后，经过缫丝获得含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的复合丝。

③嵌合蚕丝的特征检测:蚕茧单粒茧缫丝，测定丝长，对照蚕（未感染病毒）茧丝长为964米，丝平均半径为6.5μm，横截面为132.75μm²；感染AcNPV-FibH-MaSp-g蚕的茧丝长677米，丝平均半径为5μm，横截面为78.5μm²。常规蚕丝（未感染病毒）平均断裂强力为666.04MPa，平均伸长率为11.81%；本发明复合丝分别为：平均拉力8.18 N，平均断裂强力1042.08 MPa，平均伸长率6.9%。50个样本平均。可以看出，本发明方法制备的复合丝丝长达到未感染蚕丝长的70%，现有蜘蛛蛋白改性蚕丝仅为未改性蚕丝丝长40%左右，甚至更低，本发明不仅提升了蚕丝的力学强度，而且显著提升现有复合丝的丝长。

现有技术通过大肠杆菌、酵母、动物细胞或转基因动植物能够表达出蜘蛛丝蛋白，要进一步获得蛛丝纤维，需要通过繁琐步骤纯化重组蛋白，再进一步通过人工纺丝实现，该过程不仅耗时费钱，而且目前的技术水平难以规模化生产，所制备的丝纤维的机械性仍大大低于天然蛛丝。利用本发明的技术，可以直接利用家蚕丝腺组织高效合成蛋白的能力和家蚕吐丝结茧的天然本领，大规模获得含有金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的嵌合蚕丝，且所获得的嵌合丝可聚集蚕丝和蛛丝优势。丝蛋白材料已广泛用于各个领域。蛛丝蛋白基因的重复单元经多次加倍后，利用基因工程技术已在大肠杆菌、酵母、动物细胞或转基因动植物中实现表达，但由于蛛丝蛋白氨基酸序列高度重复，往往表达水平极低，且表达产物的分子量低于天然。因此纯化重组蛛丝蛋白的成本很大，难以量产；本发明通过重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒介导在家蚕后部丝腺表达金丝织网(Trichonephila clavipes)蜘蛛大壶状腺丝蛋白，并可以使重组蛋白通过吐丝进入茧层形成嵌合蚕丝，由此制备丝蛋白材料无需复杂的纯化步骤，便于量产。

SEQ ID NO: 1

GCGGCCGCTCAAAGCCTCATCCCAATTTGGAGTCACTCAAGACATCCTTGATTAAGGCAGCTGCCGATATTGACATGGACCTCGTTCGTGCTGCGATAGACGACTGGCCGCGCAGATTGAAGGCCTGTATTCAAAATCACGGAGGTCATTTTGAATAAACTTTAGTGTCATAAGAATCTATGTTTTGTTAAGTTCATTTTGGTATATGAATGGTTACATAATGAATAAACTTGTTTCAATTATTTTACATTAAACATGTGACAGAATTTATGACCTGACTAGGTAGGTACAAACAGCCTTTTTGATATTAGAAAACTAAGTAAAATAGCCTACGGTCACATCTCTTTCCGTGGGTGTCGTTAAAGGGCGACTTAGAGAACCACCAAGAACGTAGCAGAATCCTCAGAGTGTCATACCAGCATACAGCCATCGCTAACTGCTATTTACTGGTAATAGGGCACATTGTAATCTCACTTAACCATACTGTCGGGCCACCATCTAGCCTATTTCTGCCACGAATCAATCGTGAGTGATGGACATAGAGAAACTATTAGTTGAGAAGAAAACAAGAGCACTAAAGGTTTGATATTGACAAAAATCTACTTCGCCGTCACTCCATAGGTTTATTGTCTCTCATTAGTCCAGAACAGCAGTTACAGACGTAAGCTTTTACGCACAAACTACAGGGTTGCTCTTTATTGTATCGAAAATATGGGACCTGAATAAGGGCGATTTTGACGCGTCCTGCCCGCCCATTCCCGATCCTACGGACAGAATGGCAAGCAGTCGACGTCGCCCCAAACACGTCATTTCGGATCCTCACGATCCACTAACGGTGCTTTAGGTACCTCAAGCACCGGTCATCGTTCTCGTCGGACCCGTCGCTTGCGACGAAGGGCTCGACGAGCAAATTAACCCTCAGACACAGCCCACTGAGTTTCTCGCCGGATCTTCTCAGCGGGTCGCGTTTCCGATCCGGTGGTAGATTCTGCGAAGCACGGCTCTTGCTAGGATTCGTGTTAGCAACGTCGTCAGGTTTGAGCCCCGTGAGCTCACTTACTAGTTAAGGTTACGCTGAAATAGCCTCTCAAGGCTCTCAGCTAGGTAGGAAACAAAAAAAAAAGTCCTGCCCTTAACACCGTTGCGATGGCTTGTCTTTGCAGAAAGATGTTTTGTACGGAAAGTTTGAATAAGTGCTTAATTGCAAGTAACGTAACAATGTTTTAGGGTTCGGTCCTCAATAAATTCGACCAATAAACCATATATGTCGTGCTAATTACTGGACACATTGTATAACAGTTCCACTGTATTGACAATAATAAAACCTCTTCATTGACTTGAGAATGTCTGGACAGATTTGGCTTTGTATTTTTGATTTACAAATGTTTTTTTGGTGATTTACCCATCCAAGGCATTCTCCAGGATGGTTGTGGCATCACGCCGATTGGCAAACAAAAACTAAAATGAAACTAAAAAGAAACAGTTTCCGCTGTCCCGTTCCTCTAGTGGGAGAAAGCATGAAGTAAGTTCTTTAAATATTACAAAAAAATTGAACGATATTATAAAATTCTTTAAAATATTAAAAGTAAGAACAATAAGATCAATTAAATCATAATTAATCACATTGTTCATGATCACAATTTAATTTACTTCATACGTTGTATTGTTATGTTAAATAAAAAGATTAATTTCTATGTAATTGTATCTGTACAATACAATGTGTAGATGTTTATTCTATCGAAAGTAAATACGTCAAAACTCGAAAATTTTCAGTATAAAAAGGTTCAACTTTTTCAAATCAGCATCAGTTCGGTTCCAACTCTCAAGATGAGAGTCAAAACCTTCGTGATCTTGTGCTGTGCTCTCCAATACGTGGCCTACACAAACGCTCCATGGAGCGACACCGCTACAGCCGATGCTTTCATTCAAAATTTCCTCGGTGCCGTCTCCGGATCTGGTGCTTTCACCCCTGACCAGCTGGACGATATGGCTACTGTGGGAGACACCATTATGTCCGCCATCGATAAGATGGCTAGAAACAATAAGTCATCTAAGAGTAAGCTCCAGTCACTGAAAATGGCCTTCGCTTCATCAATCGCTGGTATTGCTGCCGTTGAACAAGGTGGACAGTCGATGGACATCAAGACCAACGCCATTGCTAATGCCTTGGATTCGGCTTTCTACATGACAACTGGAAGTACAAACCAACAGTTCGTCAATGAAATGAGAAGTCTCATATCAATGATCTCTGCTGCCAGCGCCAACGAAGCTAGCTACGGCGGTGGAGCTTCCGCTGCCGCTGCCACAGCTGGCGGTTACGGTCAAGGAGCTTCCGGTTACGATCCTGGACTGTCCCCAGCTTCGGCTGCCGCTCCTAGTGGCTACGGTCCATCAAAGAGAGAACCTTCAGGTATTGGTGCCGCTGCCGCTGCCCCATCTGAATACGGTTCGAGTCAACAGGGCCCGAGTGGTACAAAAGCTGCCACTATCGCTGCCGCTAAGAGAGGCCCCACTAGCTACGGTCCTAGACAACAACGCCCTGGTGGTTCTGGAGCTCCTGCCGCTACCGCTGGTAGAGGACCGGGTGGATACGGACCCGAACAACAAGGACCTAGAGGCTCAGGAGCCGCTGCCGACGAAGCTGGACCAGGACAACAGGAACCGGGTGCTGATGCTGCCGCTGCCTTCGGTAGTGGATCAGGCGAACAGGGTCCAGGAAGATTCGACGCTGCCGCTGCCACTGCTAAATCGAGAGGCAATGGTCCTGGACAACAGGGCTCTGGTGTCGCTTCAGCTGCTGCTGCTGGTAGTGAACCCAGAGGATACGGCCCTGGTCAACAAGCTCACAGAGGACACGGCGCTGCCGCTGCCGCTACTGGAAGCGGCGGTTACGAACCAGGACAACAAGGACCTGGTGGTCCTTCCGCCGCTGCCGCTGGTTTGGGACCAGGTGGATACGGTCCGAGAAAACAAGGACAAAGAAGACCCGCCGCTACCGCCGCTGCCGCTGAAACAGGCGGTTACGGTCCTAGAATACAGGGAACAGGAGCCGCTGCCGCTGCCGCTACCGGAAGAGGACCCGGAGGCTACGGTCCTGGACAACAGGTTCCAGGTGGATCTGGAGCTGTCAAGGCCGCTGATGGACCTGAAAGTTTCGGACCTGGTCAGCCTGGCGGTCCTGGAGCCGCTGCCACAGCTGGCGCCAGAAGAGGACCGGGAGGCTACGGACCTGGACAACAAGAACCTGGAAGACCATCTGTGGCTGCCGCTAGTGCTGGCTCAGGTGGATACGGTCCTAGACAACAGGGACCAGGCGGTTACGCTCCGGGACAACAGGGTCCTGGAGTTCCTGGTGCTACTGGAGCCGCTGCCGCTGGCAGAGGTTCAGGATACGCTAATGGCAAAAAGGTCCCGGGAGGCCCTGGCGCCGCTGCCGCTGCCGCTACTGGGTCTACACCTGGAGCTTACGGCCCTGGTCAACAGGGACCAGGTGGAGACGATCCGAAACAACAGGCTCCCGCCTCATCTAGCGCTACAGAAGCCGCTGCCGGACCTAGAGGATACGGCCCAGGTAAACAAGGTCCTGGTGCTGCCGTCGCTGTTGCTGCCGGTTCTGGACCCGGCGGTTACGGCCCTCGTCAGCAGGGTCCTGGAGGCCCAGCTATAGGCCCAGGTGTTTACGGACCGGGCCAACAGGGTAAAAGAGTCTACGGTCCCGGTCAGCAAGGACCTGGTGGATTCGGTGCTGCCGCTGCCACTGCTGCCGGCCCTGGTGACTACGGTCCTGATAAGAGAGGACCGGGCGGTCCTGGAGTTGCTGCCGCTGGAAGAGGCAGCGGTAGACCAGGATCCGCCGCTGACGCTACAGCCGGATCTGGTCCCGGAGGCTACGGTCCAGGACAACAAGGACCAGGAGCCGCTGCCACTGCTGCCTCTGGATCTGGACCGGGTGTTTACAGACCCAGACAATCTGGTGGACCAGGTGCTGCCGTCGGAGCTGCTACTAGAAGAGGATACGGCTACGGACCAGGACAACAGGGTCCTGAGGGACCAGGAGCTGTTGCTGCCGCTGCCGCTGGATCTGAACCTGGCGGTTACGGACCAGGCCAACAGGGCAAGGAAGGTTACGTCAGTGGTGAACAGGAGCCAGGAGATTCTGGATCGGCCGCTGCCGCTTTCGGTCCTGGAGTGTCTGGACCCAAACAACAGGGCCCTGGTGAAAAGGCCGCTGCCGCTAGTGGATCAGGCACAAGAGGTTATGGTCCAGGCCAACAAGGTCCGGGAGGCCCTGGTGCCGCTGCCGCTACTGAAGCTGGTAGAGGATCAGGTGGATACGGCCCAGGTCAACAGGGTCCGGAAGGATCTGGCGTTGCCGCTGCCGCTGCCGCTCGTCCCGGCGGTTACGGTCTCGGACAAGAAGGCCCAGGTTCGGCCGCTGCCACAGCTGCCGGAAGAGGAATAGAAGGTCACGGACCTGGCCAACAAGGACCTGGAGGCCCAGGTGCTGCCGCTGCCGCTGCCACCGGTAGAGGACAAGGTGGATACAAACCCGGTCAGAAGGGACCTGGCGGTTACGGAACAAGACAACAAGGACCTGAAGAACCTGGTTCTGATGCTGCCGCTACTAATGGCACCGGTCTCGGACAGGAAGGACCTGGAGGCCCTGTTACTGCCGCTGTCGCCGCTGGCTCTGGTCAACAGAAGTTGAGTGCCGCTGCCGCTGCCACCGCTGGAAGAGGATTGGGTGGATATGGACCAGGACAACAAGGTCCGGCTGCCACTGCTACCACAGCTGGCCGCGGTCTGGGCGGTACTGGAGCTGCCGCTGAAGCCGCTGCCGGACGTGGTCCCGGAGGCTATGGACCTGGACAACAGGAAGCTGGCGTGTCGGGTGAAGCTGCCGAAGCTGCCGGCCCTGGTCCTCCACCGCAAGGACCTGGCACTGCTGCCATCGCTGCCGCTGGTAGTGTGCCAGGTGGATACGTTCCTGGACAGAGAGGTACCGGCGGTCCAGCCGCTGCCGCTGCCACTGGTCTCGGAGGCTACAAACCCGGTCAACAGGGACCTGGTGGATACGCTCCAGGCCAAAAGGGTCTGGAAGCTACCGCTGCCGGTAGAGGAAGCGGCTACGGTCCCGCTAAACAGGTGCCGGGCGGTCCTGGAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGAACCTGGACCCCCTGGCGAATACGGTACAGAAAAAAGAGGACCGAAAGGAGACGGACCAAAACAGCAAGCTGCCGCTGGATCCTCGGCCGCTGCCGCTGCCGGCAGTTCAGCTGCCGCTGCCGCTACAGGTCCTCAAGGTTATGGTCCTGGACAACAAGGTCCTGGAGCTACTGCCTCGGCCGCTGCCGGAAGTAGACCCGTCAGATACGGACCTGGTCAAAAGGGACCTGGTGCAGGACCCGGAGGCTACGAACCTGGTCAGCAAGGTCCTGGTGGACCTGGAAGCGCTGCCGCTGGCCCAGGCGGTTACGGTCCGGCTCAACAAGGACCTGGTGTGCCATCCGCCGCTGCCGGCAGAAGAGGTTTGGGATACGGCCCCGGTAAACATGGACCTAGCGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGAAGCGGCCCTGGTGGTTACGGTCCGGGACAACAGGGTAAAGGTGGATATGGTCCCGGTAAACAAGAACCTGGTAACTTCGGGGCCGCTGCCGCTGCCTCGGGACCAGGCGGTTACGGACCGGGCAAAGAAGGTCCCGGAAGTGCTGATGCTGCCGCTGCCAGAAGAGGACCTGGAGGCTACGGCCCAAAACAAAAAGGTGCTGCCGCTATGGCCGCTGCCGCTGCCGGTTCAATCCCTGAAGGCTACGGTCCCGTCCAACAAGGACCTGGCGTGTCAGGAGCTGCCGCTGCCACTACCTCTGAACCGGTGGGTTACGGAGCTGGCCAAGAAGGTCACGGAGCAGTCGCTGCCGCTACAGCTGGCAGAGGTCCAGGTGGATACAGACCGGGCCTGTACGGTCCCGGCGGTTCTGGTAGCGCCGCTGAAGCCGCTGGACCTGGAGGCTATGGTTCAAAACAACAGGGTACAATTTCTACTGCCGCTGCCGCTGCCGGATCAGAACCTGGTGGATACGGACCTGGTCAGCAAGGACCGGGCGGTTCTGGAGTTGCTGCCGCTACCGAAGAAAGAAGAGAACCCGGAGGCTACAAGCCTGGTCAGCAAGGCCCTGGTGGACCATCTGTGGCCGCTGCCTCTGCTGGCCTCGGCGGTTACGGTCCAGGACAGCAAGGTCCGGGAGGCCCAAATGGACCTGGTCAACAGGGTCCTGGTGGATCAGGTGTTGCTGCCGCTACTGAAGAAAGAAGAGAACCAGGCGGTTACAAGCCGGGTCAACAAGGTCCTGGTGGTCCTTCTGTGGCCGCTGCCTCCGCTGGACTGGGTGGATACGGCCCTGGACAACAAGGACCCGGCGGTCCTTCTGTTGCTGCCGCTAGTGCTGAATTGGGAGGCTACGGCCCCAGACAGCAAGGCCCTGGTGGATACGCTCCTGGTCAGCAGGGTCCGGGCGGTTACGCTCCAGGTAGACAAGGTCCAGGAGTTCCTTGTGCTGCTACAGCCGCTGGCGCTGGTTCTGGTTATGGTCCTGGCCAACAGGTCCCCGGAGGCCCAGGAACAACTGCCGCTGCCGCTGCCGGAAGCACTTCTGTCGAATACGGACCTGGCCAACAGGGTAGAAAAGGTGACGGACCTAAGCAACAGGCTCCAGCCGGATCTAGCGATGCTGCCGCTGCCGCTGGCCCGAGAGGCTATGGCCCTGGACAACAGGGACCTGTTGCCGCTGCCTTGGCTGCCGCTGGCTCTGGTCCAGTGGGTTATGGACCTGGTCAAAGAGGACCTGGTGCCGCTGTGGCTGCTTCTGCTGGTAGCGGACCTCTCGGCTACGGTCCAAGACAACAGGGTCAAGTGGGACACGGCAGAGCCGCTACTGCTGAAGCCGGTAGAGGACCGGGCGTTTACGAGCCTGGAGAACAAGGTCCAGGTGGACCTGGTTCAGCCGCTGCCGCTGCCGGTCCTAGAGGATACAGACCACGTCAGCAAGGTCCTGGAGTTCACGGAGCTGCTACCGCTAGAAGAGGCTCTGGATACGGACCAGGCCAACAAGGACCTGAAGCTCCAGGTGCTGCCGCTGCCACAGCTGCCGGTTCTGGTCCCGGCGGTTACGGACCTGGTAAACAGGGTAAAGGTGGTTACGTCCCAGGACAACAGGAGCCTGGCGACTTTGGAGCTGCCGCTGCCGCTAGTGGTTCAGGTGGATACGGACCTGGAAGCGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGTAGAGGACCCGGCGGTTACGGTCCTAAACAACAGGGCGCTGGTGCTATGGCTTCAACCGCCGCTGGATCTATCCCTGGTGGTTACGGACCTGGACAGCAAGGTCCTGGTCAGCAAGGACCAGGTGACTTCGGTGCCGCTGCCGCTGAAGCTGCTTCCGGACCAGGTGGATATGGTCCTGGACAGGAAGTTCCTGTTCCTGTGGCTGTTGCCGCTGCCGGTAGAGGACCAGGCGGTTACAGATCAGGACAACAAGGACCGGGAGGCTTCGGATCTACTGCTGCCGCTGCCGGTCCCGGTGGATATGGTCCTGGTCAACAAGGTCCCGGAACAGTTGCTGTGGCTGCCGCTGAATCTGGTCCTGGCGGTTACGGTACTGGTCAACAAGGCCCTGGTGGTCCTAGCGCCGCTGCCGCTTCCGCTGGTCCGGGTGGATATGGCCCTGGTCAGCAAGGACCTGGAGTGCCTGGAGCTGTTGCTACCGCCGCTGCCGTGAGAGGTTCTGGATACGGCGCTGGTCAACAAGTTCCAGGCGGTCCTGGTGCTGCCGCTGCCACCGTCACCGGTAGAAGACCTGGAGGCTATGGCCCAGGCCAACAAGGTCCTGGAAGATTGGATGCTGCCAGCGCTGCCGCTGGCCCTGGTTCCTACGGTCCTGAACAACAGGGACCAGTTGCTAGTGCCGCTGGAAGAGGCCCCGGTAGATACGGTACTGAACAACAGGGACCTGGCAGATACGGTACCGGTCAACAGGGCCCCGGTAGACCTGTCACAGCCGCTGTGGATTCTGGCAGCGAACAACAGGGTCTGTCGGCCGCTGCCGCTGCCGCTGCCGGACGTGGCAACGGTGGATACTTGCCTGGTCAACAAGGACCCGCTGTGGCTGCCGCTGCCGCTGGTCGTGGACTGGGCGGTTACGGCCCGGGTCAACAGGAACCTGGTGGTCCGGGAGCCGCTTTGGCCAATGCTGGCCCTGAAGGTTATGGTCCTGGTCAACAGGGTACTGACGCCGCTGCCGCTACCGCTATTGTTTCAGGACCAGGCGCCGCTACATCCACTGGAAGATCGCCGGAATGCTACGGATCTGAGCAGCAAGGACCCGCTGGTCCTGGAGCTGCCACTGCCGCTGCCGCTGGCAGGGGTCCTGGTGGATACAGATCAGGTGAGCAAGGTCCAGAGGGACCTGGTGCCGCTGCCGCTACTGTGGCTGGTATTGGACCTGGCGGTTACGGTAGCAGACAGGAAGGACCCGGAGGCCCTGTTGCCGCTGCCGATGCTTCCGGCCCAGGTGGATATAGACCAGGACAGCCGGGCGGTCCTGTGGCTACCGCTGCCACAGCTGGCCAGGGTCCGAGAGGTTACGTGCCCGGACAACAGGGCCCTGTGGGAGCTGCCGCTGCCACTTCCAGATCGGGACCTGGTGGTTATGGTCCGGGCAAACAAGGACCTGGAGCTGCCTCCGCTGCCTCGGGACCTGGTGGATACGGTCCAGAACAACAAGGACCTGGTGCTGCCCTCGCTGCCGCTGCCGGATCAGGTCCTGGCGGTTATGGTCCAGGACCTCAGGCTAGTGCTGCCAGATCTAGACTGGCTTTCCCAGACAGTAGATCAAGAGTCTCCTCGGCTGCCTCGAACTTGGTGGCTAGTGGTCCGACAAATTCTGCTGCCCTCAGCAACGCTATTTCCAATACTGTGTCGGAAATAGGAGCTTCATACCCAGGACTGTCTGGCTGTGATGTTCTGGTCCAAGCTTTGATGGAAATTGTTAGCGCCCTCGTCGCTATACTGAGTTCATCTAGCATCGGACAGGTTAACTACGTGGCCGTTTCTCAAAGCGCTCAGGTGGTTTCCCAATCGCTGTTGCAGGCTTTGTACTAATTTTTAATATAAAATAACCCTTGTTTCTTACTTCGTCCTGGATACATCTATGTTTTTTTTTTCGTTAATAAATGAGAGCATTTAAGTTATTGTTTTTAATTACTTTTTTTTAGAAAACAGATTTCGGATTTTTTGTATGCATTTTATTTGAATGTACTAATATAATCAATTAATCAATGAATTCATTTATTTAAGGGATAACAATAATCCATGAATTCACATGCACATTTAAAACAAAACTAAATTACAATAGGTTCATATAAAAACAACAAGTATGCCTTCTCAACTAAGAATACTATACTGCAG

SEQ ID NO: 2 （M13-F）

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

SEQ ID NO: 3 （HC-left-R）

TGCAGAGCGCAGCACAAGATCAC

SEQ ID NO: 4 （M13-R）

ACACAGGAAACAGCTATGAC

SEQ ID NO: 5 EcoRI-FG-F

GGAATTCCATGACAGCCGATGCTTTCATTCAAAATTTCCTCGGTGC

SEQ ID NO: 6 XhoI-FG-R

CCCTCGAGGGGTACAAAGCCTGCAACAGCGATTGGGAAACCACCTGA

SEQ ID NO: 7 P4-F

TATATTCGCGGCGTTGTGAC

SEQ ID NO: 8 P4-R

AAGTTGGGCATACGGGAAGA

SEQ ID NO: 9 MaSP-g-F

TCTTGTGCTGTGCTCTCCAA

SEQ ID NO: 10 MaSP-g-R

TCAGGGGTGAAAGCACCAGA

SEQ ID NO: 11 eIF4-1

GAATGGACCCTGGGACACTT

SEQ ID NO: 12 eIF4-2

CTGACTGGGCTTGAGCGATA

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggccgctc aaagcctcat cccaatttgg agtcactcaa gacatccttg attaaggcag 60

ctgccgatat tgacatggac ctcgttcgtg ctgcgataga cgactggccg cgcagattga 120

aggcctgtat tcaaaatcac ggaggtcatt ttgaataaac tttagtgtca taagaatcta 180

tgttttgtta agttcatttt ggtatatgaa tggttacata atgaataaac ttgtttcaat 240

tattttacat taaacatgtg acagaattta tgacctgact aggtaggtac aaacagcctt 300

tttgatatta gaaaactaag taaaatagcc tacggtcaca tctctttccg tgggtgtcgt 360

taaagggcga cttagagaac caccaagaac gtagcagaat cctcagagtg tcataccagc 420

atacagccat cgctaactgc tatttactgg taatagggca cattgtaatc tcacttaacc 480

atactgtcgg gccaccatct agcctatttc tgccacgaat caatcgtgag tgatggacat 540

agagaaacta ttagttgaga agaaaacaag agcactaaag gtttgatatt gacaaaaatc 600

tacttcgccg tcactccata ggtttattgt ctctcattag tccagaacag cagttacaga 660

cgtaagcttt tacgcacaaa ctacagggtt gctctttatt gtatcgaaaa tatgggacct 720

gaataagggc gattttgacg cgtcctgccc gcccattccc gatcctacgg acagaatggc 780

aagcagtcga cgtcgcccca aacacgtcat ttcggatcct cacgatccac taacggtgct 840

ttaggtacct caagcaccgg tcatcgttct cgtcggaccc gtcgcttgcg acgaagggct 900

cgacgagcaa attaaccctc agacacagcc cactgagttt ctcgccggat cttctcagcg 960

ggtcgcgttt ccgatccggt ggtagattct gcgaagcacg gctcttgcta ggattcgtgt 1020

tagcaacgtc gtcaggtttg agccccgtga gctcacttac tagttaaggt tacgctgaaa 1080

tagcctctca aggctctcag ctaggtagga aacaaaaaaa aaagtcctgc ccttaacacc 1140

gttgcgatgg cttgtctttg cagaaagatg ttttgtacgg aaagtttgaa taagtgctta 1200

attgcaagta acgtaacaat gttttagggt tcggtcctca ataaattcga ccaataaacc 1260

atatatgtcg tgctaattac tggacacatt gtataacagt tccactgtat tgacaataat 1320

aaaacctctt cattgacttg agaatgtctg gacagatttg gctttgtatt tttgatttac 1380

aaatgttttt ttggtgattt acccatccaa ggcattctcc aggatggttg tggcatcacg 1440

ccgattggca aacaaaaact aaaatgaaac taaaaagaaa cagtttccgc tgtcccgttc 1500

ctctagtggg agaaagcatg aagtaagttc tttaaatatt acaaaaaaat tgaacgatat 1560

tataaaattc tttaaaatat taaaagtaag aacaataaga tcaattaaat cataattaat 1620

cacattgttc atgatcacaa tttaatttac ttcatacgtt gtattgttat gttaaataaa 1680

aagattaatt tctatgtaat tgtatctgta caatacaatg tgtagatgtt tattctatcg 1740

aaagtaaata cgtcaaaact cgaaaatttt cagtataaaa aggttcaact ttttcaaatc 1800

agcatcagtt cggttccaac tctcaagatg agagtcaaaa ccttcgtgat cttgtgctgt 1860

gctctccaat acgtggccta cacaaacgct ccatggagcg acaccgctac agccgatgct 1920

ttcattcaaa atttcctcgg tgccgtctcc ggatctggtg ctttcacccc tgaccagctg 1980

gacgatatgg ctactgtggg agacaccatt atgtccgcca tcgataagat ggctagaaac 2040

aataagtcat ctaagagtaa gctccagtca ctgaaaatgg ccttcgcttc atcaatcgct 2100

ggtattgctg ccgttgaaca aggtggacag tcgatggaca tcaagaccaa cgccattgct 2160

aatgccttgg attcggcttt ctacatgaca actggaagta caaaccaaca gttcgtcaat 2220

gaaatgagaa gtctcatatc aatgatctct gctgccagcg ccaacgaagc tagctacggc 2280

ggtggagctt ccgctgccgc tgccacagct ggcggttacg gtcaaggagc ttccggttac 2340

gatcctggac tgtccccagc ttcggctgcc gctcctagtg gctacggtcc atcaaagaga 2400

gaaccttcag gtattggtgc cgctgccgct gccccatctg aatacggttc gagtcaacag 2460

ggcccgagtg gtacaaaagc tgccactatc gctgccgcta agagaggccc cactagctac 2520

ggtcctagac aacaacgccc tggtggttct ggagctcctg ccgctaccgc tggtagagga 2580

ccgggtggat acggacccga acaacaagga cctagaggct caggagccgc tgccgacgaa 2640

gctggaccag gacaacagga accgggtgct gatgctgccg ctgccttcgg tagtggatca 2700

ggcgaacagg gtccaggaag attcgacgct gccgctgcca ctgctaaatc gagaggcaat 2760

ggtcctggac aacagggctc tggtgtcgct tcagctgctg ctgctggtag tgaacccaga 2820

ggatacggcc ctggtcaaca agctcacaga ggacacggcg ctgccgctgc cgctactgga 2880

agcggcggtt acgaaccagg acaacaagga cctggtggtc cttccgccgc tgccgctggt 2940

ttgggaccag gtggatacgg tccgagaaaa caaggacaaa gaagacccgc cgctaccgcc 3000

gctgccgctg aaacaggcgg ttacggtcct agaatacagg gaacaggagc cgctgccgct 3060

gccgctaccg gaagaggacc cggaggctac ggtcctggac aacaggttcc aggtggatct 3120

ggagctgtca aggccgctga tggacctgaa agtttcggac ctggtcagcc tggcggtcct 3180

ggagccgctg ccacagctgg cgccagaaga ggaccgggag gctacggacc tggacaacaa 3240

gaacctggaa gaccatctgt ggctgccgct agtgctggct caggtggata cggtcctaga 3300

caacagggac caggcggtta cgctccggga caacagggtc ctggagttcc tggtgctact 3360

ggagccgctg ccgctggcag aggttcagga tacgctaatg gcaaaaaggt cccgggaggc 3420

cctggcgccg ctgccgctgc cgctactggg tctacacctg gagcttacgg ccctggtcaa 3480

cagggaccag gtggagacga tccgaaacaa caggctcccg cctcatctag cgctacagaa 3540

gccgctgccg gacctagagg atacggccca ggtaaacaag gtcctggtgc tgccgtcgct 3600

gttgctgccg gttctggacc cggcggttac ggccctcgtc agcagggtcc tggaggccca 3660

gctataggcc caggtgttta cggaccgggc caacagggta aaagagtcta cggtcccggt 3720

cagcaaggac ctggtggatt cggtgctgcc gctgccactg ctgccggccc tggtgactac 3780

ggtcctgata agagaggacc gggcggtcct ggagttgctg ccgctggaag aggcagcggt 3840

agaccaggat ccgccgctga cgctacagcc ggatctggtc ccggaggcta cggtccagga 3900

caacaaggac caggagccgc tgccactgct gcctctggat ctggaccggg tgtttacaga 3960

cccagacaat ctggtggacc aggtgctgcc gtcggagctg ctactagaag aggatacggc 4020

tacggaccag gacaacaggg tcctgaggga ccaggagctg ttgctgccgc tgccgctgga 4080

tctgaacctg gcggttacgg accaggccaa cagggcaagg aaggttacgt cagtggtgaa 4140

caggagccag gagattctgg atcggccgct gccgctttcg gtcctggagt gtctggaccc 4200

aaacaacagg gccctggtga aaaggccgct gccgctagtg gatcaggcac aagaggttat 4260

ggtccaggcc aacaaggtcc gggaggccct ggtgccgctg ccgctactga agctggtaga 4320

ggatcaggtg gatacggccc aggtcaacag ggtccggaag gatctggcgt tgccgctgcc 4380

gctgccgctc gtcccggcgg ttacggtctc ggacaagaag gcccaggttc ggccgctgcc 4440

acagctgccg gaagaggaat agaaggtcac ggacctggcc aacaaggacc tggaggccca 4500

ggtgctgccg ctgccgctgc caccggtaga ggacaaggtg gatacaaacc cggtcagaag 4560

ggacctggcg gttacggaac aagacaacaa ggacctgaag aacctggttc tgatgctgcc 4620

gctactaatg gcaccggtct cggacaggaa ggacctggag gccctgttac tgccgctgtc 4680

gccgctggct ctggtcaaca gaagttgagt gccgctgccg ctgccaccgc tggaagagga 4740

ttgggtggat atggaccagg acaacaaggt ccggctgcca ctgctaccac agctggccgc 4800

ggtctgggcg gtactggagc tgccgctgaa gccgctgccg gacgtggtcc cggaggctat 4860

ggacctggac aacaggaagc tggcgtgtcg ggtgaagctg ccgaagctgc cggccctggt 4920

cctccaccgc aaggacctgg cactgctgcc atcgctgccg ctggtagtgt gccaggtgga 4980

tacgttcctg gacagagagg taccggcggt ccagccgctg ccgctgccac tggtctcgga 5040

ggctacaaac ccggtcaaca gggacctggt ggatacgctc caggccaaaa gggtctggaa 5100

gctaccgctg ccggtagagg aagcggctac ggtcccgcta aacaggtgcc gggcggtcct 5160

ggagctgccg ctgccgctgc cgaacctgga ccccctggcg aatacggtac agaaaaaaga 5220

ggaccgaaag gagacggacc aaaacagcaa gctgccgctg gatcctcggc cgctgccgct 5280

gccggcagtt cagctgccgc tgccgctaca ggtcctcaag gttatggtcc tggacaacaa 5340

ggtcctggag ctactgcctc ggccgctgcc ggaagtagac ccgtcagata cggacctggt 5400

caaaagggac ctggtgcagg acccggaggc tacgaacctg gtcagcaagg tcctggtgga 5460

cctggaagcg ctgccgctgg cccaggcggt tacggtccgg ctcaacaagg acctggtgtg 5520

ccatccgccg ctgccggcag aagaggtttg ggatacggcc ccggtaaaca tggacctagc 5580

gctgccgctg ccgctgccgc tggaagcggc cctggtggtt acggtccggg acaacagggt 5640

aaaggtggat atggtcccgg taaacaagaa cctggtaact tcggggccgc tgccgctgcc 5700

tcgggaccag gcggttacgg accgggcaaa gaaggtcccg gaagtgctga tgctgccgct 5760

gccagaagag gacctggagg ctacggccca aaacaaaaag gtgctgccgc tatggccgct 5820

gccgctgccg gttcaatccc tgaaggctac ggtcccgtcc aacaaggacc tggcgtgtca 5880

ggagctgccg ctgccactac ctctgaaccg gtgggttacg gagctggcca agaaggtcac 5940

ggagcagtcg ctgccgctac agctggcaga ggtccaggtg gatacagacc gggcctgtac 6000

ggtcccggcg gttctggtag cgccgctgaa gccgctggac ctggaggcta tggttcaaaa 6060

caacagggta caatttctac tgccgctgcc gctgccggat cagaacctgg tggatacgga 6120

cctggtcagc aaggaccggg cggttctgga gttgctgccg ctaccgaaga aagaagagaa 6180

cccggaggct acaagcctgg tcagcaaggc cctggtggac catctgtggc cgctgcctct 6240

gctggcctcg gcggttacgg tccaggacag caaggtccgg gaggcccaaa tggacctggt 6300

caacagggtc ctggtggatc aggtgttgct gccgctactg aagaaagaag agaaccaggc 6360

ggttacaagc cgggtcaaca aggtcctggt ggtccttctg tggccgctgc ctccgctgga 6420

ctgggtggat acggccctgg acaacaagga cccggcggtc cttctgttgc tgccgctagt 6480

gctgaattgg gaggctacgg ccccagacag caaggccctg gtggatacgc tcctggtcag 6540

cagggtccgg gcggttacgc tccaggtaga caaggtccag gagttccttg tgctgctaca 6600

gccgctggcg ctggttctgg ttatggtcct ggccaacagg tccccggagg cccaggaaca 6660

actgccgctg ccgctgccgg aagcacttct gtcgaatacg gacctggcca acagggtaga 6720

aaaggtgacg gacctaagca acaggctcca gccggatcta gcgatgctgc cgctgccgct 6780

ggcccgagag gctatggccc tggacaacag ggacctgttg ccgctgcctt ggctgccgct 6840

ggctctggtc cagtgggtta tggacctggt caaagaggac ctggtgccgc tgtggctgct 6900

tctgctggta gcggacctct cggctacggt ccaagacaac agggtcaagt gggacacggc 6960

agagccgcta ctgctgaagc cggtagagga ccgggcgttt acgagcctgg agaacaaggt 7020

ccaggtggac ctggttcagc cgctgccgct gccggtccta gaggatacag accacgtcag 7080

caaggtcctg gagttcacgg agctgctacc gctagaagag gctctggata cggaccaggc 7140

caacaaggac ctgaagctcc aggtgctgcc gctgccacag ctgccggttc tggtcccggc 7200

ggttacggac ctggtaaaca gggtaaaggt ggttacgtcc caggacaaca ggagcctggc 7260

gactttggag ctgccgctgc cgctagtggt tcaggtggat acggacctgg aagcgccgct 7320

gccgctgccg ctggtagagg acccggcggt tacggtccta aacaacaggg cgctggtgct 7380

atggcttcaa ccgccgctgg atctatccct ggtggttacg gacctggaca gcaaggtcct 7440

ggtcagcaag gaccaggtga cttcggtgcc gctgccgctg aagctgcttc cggaccaggt 7500

ggatatggtc ctggacagga agttcctgtt cctgtggctg ttgccgctgc cggtagagga 7560

ccaggcggtt acagatcagg acaacaagga ccgggaggct tcggatctac tgctgccgct 7620

gccggtcccg gtggatatgg tcctggtcaa caaggtcccg gaacagttgc tgtggctgcc 7680

gctgaatctg gtcctggcgg ttacggtact ggtcaacaag gccctggtgg tcctagcgcc 7740

gctgccgctt ccgctggtcc gggtggatat ggccctggtc agcaaggacc tggagtgcct 7800

ggagctgttg ctaccgccgc tgccgtgaga ggttctggat acggcgctgg tcaacaagtt 7860

ccaggcggtc ctggtgctgc cgctgccacc gtcaccggta gaagacctgg aggctatggc 7920

ccaggccaac aaggtcctgg aagattggat gctgccagcg ctgccgctgg ccctggttcc 7980

tacggtcctg aacaacaggg accagttgct agtgccgctg gaagaggccc cggtagatac 8040

ggtactgaac aacagggacc tggcagatac ggtaccggtc aacagggccc cggtagacct 8100

gtcacagccg ctgtggattc tggcagcgaa caacagggtc tgtcggccgc tgccgctgcc 8160

gctgccggac gtggcaacgg tggatacttg cctggtcaac aaggacccgc tgtggctgcc 8220

gctgccgctg gtcgtggact gggcggttac ggcccgggtc aacaggaacc tggtggtccg 8280

ggagccgctt tggccaatgc tggccctgaa ggttatggtc ctggtcaaca gggtactgac 8340

gccgctgccg ctaccgctat tgtttcagga ccaggcgccg ctacatccac tggaagatcg 8400

ccggaatgct acggatctga gcagcaagga cccgctggtc ctggagctgc cactgccgct 8460

gccgctggca ggggtcctgg tggatacaga tcaggtgagc aaggtccaga gggacctggt 8520

gccgctgccg ctactgtggc tggtattgga cctggcggtt acggtagcag acaggaagga 8580

cccggaggcc ctgttgccgc tgccgatgct tccggcccag gtggatatag accaggacag 8640

ccgggcggtc ctgtggctac cgctgccaca gctggccagg gtccgagagg ttacgtgccc 8700

ggacaacagg gccctgtggg agctgccgct gccacttcca gatcgggacc tggtggttat 8760

ggtccgggca aacaaggacc tggagctgcc tccgctgcct cgggacctgg tggatacggt 8820

ccagaacaac aaggacctgg tgctgccctc gctgccgctg ccggatcagg tcctggcggt 8880

tatggtccag gacctcaggc tagtgctgcc agatctagac tggctttccc agacagtaga 8940

tcaagagtct cctcggctgc ctcgaacttg gtggctagtg gtccgacaaa ttctgctgcc 9000

ctcagcaacg ctatttccaa tactgtgtcg gaaataggag cttcataccc aggactgtct 9060

ggctgtgatg ttctggtcca agctttgatg gaaattgtta gcgccctcgt cgctatactg 9120

agttcatcta gcatcggaca ggttaactac gtggccgttt ctcaaagcgc tcaggtggtt 9180

tcccaatcgc tgttgcaggc tttgtactaa tttttaatat aaaataaccc ttgtttctta 9240

cttcgtcctg gatacatcta tgtttttttt ttcgttaata aatgagagca tttaagttat 9300

tgtttttaat tacttttttt tagaaaacag atttcggatt ttttgtatgc attttatttg 9360

aatgtactaa tataatcaat taatcaatga attcatttat ttaagggata acaataatcc 9420

atgaattcac atgcacattt aaaacaaaac taaattacaa taggttcata taaaaacaac 9480

aagtatgcct tctcaactaa gaatactata ctgcag 9516

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcagagcgc agcacaagat cac 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacaggaaa cagctatgac 20

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattccat gacagccgat gctttcattc aaaatttcct cggtgc 46

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctcgaggg gtacaaagcc tgcaacagcg attgggaaac cacctga 47

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatattcgcg gcgttgtgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagttgggca tacgggaaga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttgtgctg tgctctccaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaggggtga aagcaccaga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaatggaccc tgggacactt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctgactgggc ttgagcgata 20

Claims (10)

1.一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组病毒接种5龄家蚕幼虫，添食桑叶后收集蚕丝，得到含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝；所述重组病毒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。

2.根据权利要求1所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，添食桑叶时添加抗生素、蜕皮激素。

3.根据权利要求1所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，将重组DNA转染培养细胞，然后培养至细胞发病，取细胞培养上清再次接种培养细胞，然后培养至细胞发病，收集细胞培养上清，得到重组病毒；所述重组DNA含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。

4.根据权利要求3所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，将重组质粒转化DH10Ac大肠杆菌，后涂布于LB琼脂培养基平板上，然后培养，再挑取白色菌落，提取重组DNA；所述DH10Ac大肠杆菌含有AcBacmid；所述重组质粒含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白的序列。

5.根据权利要求4所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，所述LB琼脂培养基含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X-gal。

6.根据权利要求4所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，将含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白序列的DNA片段克隆入质粒，得到重组质粒。

7. 根据权利要求6所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，所述含有表达金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白序列的DNA片段的序列为SEQ ID NO: 1；所述质粒为pFAST-Bac-Dual。

8.根据权利要求1所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法，其特征在于，重组病毒接种5龄家蚕幼虫的量为10⁴～10⁸拷贝/蚕。

9. 如SEQ ID NO: 1所述的DNA片段在制备含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝中的应用。

10.根据权利要求1所述含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法制备的复合丝。

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