CN1161458C - 重组杆状病毒及其构建方法，以及含该病毒的杀虫组合物 - Google Patents

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Abstract

一种重组杆状病毒，它产生一种由杆状病毒多角体蛋白(PH)、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白(CP)和多管水母aequorea victoria绿色荧光蛋白(GFP)构成的重组多角体，该病毒的构建通过：将携带编码融合蛋白(其中PH、CP和GFP依次直接从N-末端到C-末端相连)的融合基因的转移载体和野生型杆状病毒同时引入昆虫细胞，并培育该细胞。该杆状病毒转移载体pColorBtrus通过下列步骤构建：用聚合酶链式反应合成来自质粒pGFP的编码GFP的DNA片段、来自野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的PH基因、以及来自携带有苏云金芽胞杆菌CrylAc基因的质粒pPN6.6的CrylAc基因；首先将编码GFP的DNA片段和PH基因，以编码GFP的DNA片段的5’末端和PH基因的3’末端连接的方式，插入杆状病毒表达载体pAcUW31，以及然后将CrylAc基因插入PH基因和编码GFP的DNA片段之间。重组病毒能高致病性的在短时间内杀死有害昆虫并且配备一种监测被感染昆虫的装置，从而能防止过度使用。

Description

重组杆状病毒及其构建方法，以及含该病毒的杀虫组合物
技术领域
本发明涉及新颖重组杆状病毒，其具有迅速和强大的杀虫作用，该病毒的构建方法和含有该病毒的杀虫组合物。
背景技术
杆状病毒对昆虫是致病性的，因此它们可通过增殖杀死宿主。另外，杆状病毒对脊椎动物不致病，而且能在野外长期保有其活性。由于这些优点，已开发了多达20种病毒作为商业可利用的杀虫剂。然而，杆状病毒的宿主范围有限，而且杀虫作用相对较慢。这些缺点已限制了它们作为昆虫害虫控制剂的使用。
近来，积极的研究已开始并继续针对杆状病毒作为特异性害虫控制剂的可用性的改进。在这方面，基因工程技术提供了有用的方法。事实上，已进行了一系列尝试，通过将不同外源基因引入杆状病毒来产生杀虫速度改进的杆状病毒。为了该目的，外源基因包含编码：钳蝎Buthus eupeus昆虫毒素-1(Carbonell等，基因，73，409-418(1988))，莫德珂属(Manduca Sexta)利尿激素(Maeda，生物化学与生物物理研究通讯， 165，1177-1183(1989))，烟芽夜蛾(Heliothis virescens)保幼激素酯酶(Hammock等，自然， 344，458-461(1990)；Bonning等，昆虫生物化学分子生物学， 22，453-458(1992))，小麦蒲螨(Pyemotes tritici)TxP-I毒素(Tomalski和Miller，自然， 352，82-85(1991))，Androctonus australis AalT毒素(Stewart等，自然，1991：352，85-88)和昆虫特异性蜘蛛毒素(Hughes等，无脊椎动物病理学杂志， 69，112-118(1997))的基因。其中仅编码蝎毒素的基因能使重组杆状病毒显示增强的致病性。然而，杀虫速度即使在携带该基因的杆状病毒中也仍然是缓慢的。
苏云金芽胞杆菌(一种革兰氏阳性细菌，在本文后面被称为“Bt”)的δ内毒素是一种当Bt形成芽胞时大量累积的昆虫特异性毒素，由于其强大的杀虫作用和对人和家禽无毒的优点已被证明是防治害虫群的有效工具(Feitelson等，生物/技术， 10，271-275(1992))。至于内毒素的杀虫机制，是从酶切割开始的。当内毒素被易感昆虫吸收，它在肠中的碱性环境中溶解，并通过存在于肠液中的蛋白酶作用切割成较小的活化蛋白。活化蛋白和肠上皮细胞结合，导致肠破裂。当由于消化液和体液的pH改变而显示出瘫痪症状时，该易感昆虫不再进食，并最终在24-48小时内被杀死。例如鳞翅目特异性晶体蛋白(Cry”，(一种Bt内毒素)，全长为130-140kDa，但当该蛋白被蛋白酶切割成大约60-70kDa的高度活化片段(对应于该蛋白N-末端的半段)时，它的毒性大大增强(Aronson等，微生物综述， 50，1-24(1986))。
对通过将Bt内毒素蛋白表达于杆状病毒内来改良病毒杀虫作用，有值得注意的研究(Bonning和Hammock，昆虫学年度综述， 41，191-210(1996))。然而观察到，虽然该杆状病毒在昆虫的血液淋巴中产生大量Bt内毒素蛋白，但重组杆状病毒的致病性却不增强。这是由于未考虑到Bt内毒素的杀虫机制是由肠中蛋白酶和上皮细胞的存在而实现的。即，在血液淋巴的启动子Ppol控制下表达的单一Bt内毒素蛋白不像在肠中一样被活化。
发明内容
牢记着杆状病毒多角体蛋白在昆虫肠内碱性环境中被蛋白酶活化的概念，本发明者重复进行了全面而刻苦的、以开发能在短期内高致病性杀死有害昆虫的新颖杆状病毒为目标的研究，并最终导致发现：苏云金芽胞杆菌晶体蛋白和杆状病毒多角体蛋白的融合能显著提高致病性和缩短杀死时间。
因此，本发明的一个目的是克服上述现有技术遇到的问题和提供能在短期内显示致病性的新颖重组杆状病毒。
本发明的另一个目的是提供一种配有感染昆虫的监测装置的新颖杆状病毒。
本发明的另一个目的是提供一种该重组杆状病毒的构建方法。
本发明还有一个目的是提供一种构建用于重组杆状病毒的转移载体的方法。
本发明还有一个目的是提供一种杀虫组合物，它具有强大杀虫作用，是速效的，并能防止过度使用。
本发明的还有一个目的是提供蛋白的简便纯化方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种重组杆状病毒，它产生由杆状病毒多角体蛋白(PH)，苏云金芽胞杆菌晶体蛋白(CP)和多管水母Aequoreavictoria绿色荧光蛋白(GFP)构成的重组多角体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种杆状病毒转移载体pColorBtrus的构建方法，包括步骤：用聚合酶链式反应从质粒pGFP合成编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA片段；用聚合酶链式反应合成来自野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体蛋白(PH)基因，以编码绿色荧光蛋白的DNA片段的5’末端和多角体蛋白基因的3’末端连接的方式，将编码绿色荧光蛋白的DNA片段和多角体蛋白基因插入杆状病毒表达载体pAcUW31，来得到杆状病毒转移载体pColorPol，用聚合酶链式反应从携带有杆状病毒CrylAc基因的质粒pPN6.6合成CrylAc基因，以及将CrylAc基因插入多角体蛋白基因和编码绿色荧光蛋白的DNA片段之间。
根据本发明的另一个方面，提供了一种构建杆状病毒的方法，包括步骤：将携带编码融合蛋白的融合基因的转移载体和野生型杆状病毒同时引入昆虫细胞，其中在该融合蛋白中杆状病毒多角体蛋白、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白和多管水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白从N-末端到C-末端依次连接，以及培育所述细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了包括重组病毒的杀虫组合物。
根据本发明的还有一个方面，提供了使用该转移载体系统的蛋白纯化方法。
附图说明
图1a，1b和1c分别是pAcG，pColorPol和pColorBtrus的杆状病毒转移载体图谱。
图2a和2b分别是光学和荧光显微照片，显示被对照(野生型)AcNPV感染的sf9细胞。
图2c和2d分别是光学和荧光显微照片，显示被重组杆状病毒AcG感染的sf9细胞。
图2e和2f分别是光学和荧光显微照片，显示被重组杆状病毒ColorPol感染的sf9细胞。
图2g和2h分别是光学和荧光显微照片，显示被重组杆状病毒ColorBtrus感染的sf9细胞。
图3a，3b，和3c显示了分别使用抗-GFP抗体，抗-PH抗体和抗-CrylAc抗体对重组多角体进行的蛋白质印迹。
图4a和4b是透射电子显微照片，分别显示了免疫金标记的野生型AcNPV的多角体和重组pColorBtrus多角体。
图5显示了用抗-CrylAc抗体对重组多角体进行的蛋白质印迹。
图6是显示重组杆状病毒pColorBtrus针对P.xylostella幼虫的累积杀虫作用的图。
图7a是显示被pColorBtrus重组多角体三日前感染的P.xylostella幼虫的照片，而图7b是显示被pColorBtrus六日前感染的死亡幼虫脂肪体的荧光显微照片。
图8a和8b是显微照片，显示了在中国甘蓝叶上，被pColorBtrus感染的P.xylostella幼虫造成的进食损害的减少，其中用pColorBtrus和野生型AcNPV的多角体分别处理。
具体实施方式
在整篇说明书中，术语“杆状病毒”指包埋在多角体中的病毒粒子。多角体是多面体形状的多角体蛋白(PH)形成的装配体，它在感染晚期表达于被感染昆虫的核中。除非特别指出，术语“重组多角体”指由PH-CP-GFP融合蛋白构成的多角体。
PH-CP-GFP融合蛋白是以PH蛋白C-末端和CP的N-末端连接，而CP的C-末端和GFP的N-末端连接的方式构建。
作为结构蛋白，PH本身无致病性，并保护病毒颗粒抵抗环境。当被昆虫摄入时，PH溶于肠的碱性环境中，并被蛋白酶切开以释放病毒颗粒。
CP是Bt内毒素，它的例子包括CrylAc，CrylAb，Cry I E，和具有其病原性的蛋白片段。优选的是含有1-613号氨基酸序列的CrylAc蛋白片段。如同PH，CP在肠碱性条件下可溶解，并被蛋白酶切割成活化病原性片段。例如，CrylAc的病原性片段是27到607号的氨基酸序列。
因此，组成杆状病毒重组多角体的本发明的融合蛋白，在肠碱性环境中通过蛋白酶作用分解。即，分解融合的PH来释放病毒，而CP被切割成活化的病原性片段，然后该片段和肠上皮细胞结合，使肠破裂。结果，摄入了本发明融合蛋白的昆虫不再进食，并由于消化液和体液pH的改变显示瘫痪症状，最终在24-48小时内死亡。
本发明使用的GFP来自多管水母Aequorea victoria，是一种紫外线激发时发绿光的非常稳定的蛋白。GFP是为了控制有害昆虫的目的而被引入的(Chao等，自然， 380，369-397，1996)。在本发明中，GFP用来促进检测和监测被重组杆状病毒感染的幼虫及其在生态系统中的分布，从而防止该杀虫剂被不谨慎的滥用。
在本发明中，开发了新颖重组杆状病毒ColorBtrus，它产生由融合蛋白(在该融合蛋白中衍生自AcNPV的PH，1到613号氨基酸序列的CrylAc蛋白片段和GFP依次连接)构成的重组多角体。杆状病毒ColorBtrus于1998年3月10日保藏在韩国生物科学和生物技术研究院的韩国典型培养物保藏中心，并得到了保藏号No.KCTC 0444BP。
一种开发该新颖重组杆状病毒ColorBtrus的可能途径是构建携带编码PH-CP-GFP蛋白的融合基因的杆状病毒转移载体。对于融合基因，三条碱基序列片段(分别编码PH，CP，和GFP)被依次连接。可利用的编码PH的基因是那些衍生自AcNPV，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)NPV或家蚕(Bombix mori)NPV的基因，优选是AcNPV的PH基因。编码CP的碱基序列的例子包含编码CrylAc(Adang，M.J.等，基因，1985：36，289-300，91985))，CrylAb，CrylE，或具有其病原性质的蛋白片段。优选为对应1到613号氨基酸序列的CrylAc蛋白的碱基序列。对于编码GFP的碱基序列，优选含有衍生自多管水母Aequoreavictoria的GFP基因。这些碱基序列可通过PCR或酶切从携带相应基因的载体获得，或通过化学合成获得。
这些序列的连接方式是，使编码PH的碱基序列5’末端和编码GFP碱基序列的3’末端成为所形成的碱基序列的相对末端。将该融合序列插入已知的杆状病毒转移载体，例如pAcUW31(GeneBank登录号U02452)，来得到携带编码PH-CP-GFP融合蛋白的融合基因的新颖杆状病毒转移载体。
详细说，GFP基因和PH基因可分别从质粒pGFP(Clontech)和野生型AcNPV，通过PCR进行扩增。将GFP基因的5’端和PH基因的3’端连接，而且将连接后的序列插入杆状病毒表达载体pAcUW31(Clontech)来构建杆状病毒转移载体pColorPol(图1b)。CrylAc基因是用PCR从质粒pPN6.6(获自Dr.Adang)扩增得到，并插入pColorPol上PH基因和GFP基因之间，从而得到质粒pColorBtrus(图1c)。在pColorBtrus中，分别编码PH，CrylAc和GFP的三个基因被依次融合。需要在相同细胞中一起表达天然多角体蛋白和融合蛋白，以稳定产生重组多角体。为此，一种策略是建立具有两个启动子(p10和多角体蛋白基因启动子，它们分别引发天然多角体蛋白和融合蛋白的转录，如见图1b和1c)的重组病毒。这两个独立转录单元是反向的。在这些载体系统中，将天然PH基因和融合蛋白分别引入启动子Pp10和PPH的下游。
将这样获得的重组杆状病毒转移载体的DNA溶液和在20mM HEPES缓冲液中的野生型杆状病毒基因组DNA，与LipofectinTM(Gibco)混合，放置在室温。然后，将该Lipofectin-DNA混合物溶液滴加到接种有Sf9细胞(InVitrogen)的细胞培养皿中，并培养以产生重组杆状病毒。对于转染，也能用Sf21和Tn5作为宿主细胞。但优选的是Sf9。可用反向相差显微镜观察多角体。在预定的时间后，离心培养物，并从上清液获得重组病毒ColorBtrus。
本发明的重组杆状病毒表现出杀虫作用为野生型AcNPV的100倍，和杀虫时间为野生型AcNPV的三倍。为了用作杀虫剂，重组杆状病毒可配制成颗粒，粉末，液相剂和水溶液，优选为水溶液。例如水溶液包括2×1010个重组杆状病毒颗粒，100克白碳，100克蔗糖，50克聚乙烯醇，10毫升Triton X-100和10克膨润土，用水加到最终体积为10升。
本发明配制的杀虫组合物可施用到植物表面，例如大葱，卷心菜，桑叶，果树，花卉，果蔬等，以及施用到植物生长的土壤中。另外，在运输和储藏中，收获的植物也可用杀虫组合物处理。
在本发明杀虫目标中，包括了鳞翅目昆虫，例如菜蛾(Plutellaxylostella)，甜菜夜蛾(Sopdoptera exigua)，和美国白蛾(Hyphantria Cunea)等。
根据下列实施例可更好地理解本发明，这些实施例用来说明，但不限制本
发明的范围。
实施例I：杆状病毒转移载体的构建
(1)转移载体pAcG的构建
衍生自多管水母Aequorea victoria的GFP基因，是使用下列两种引物，通过PCR从pGFP(Clontech)扩增出：
[序列1]
5’-AAGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’
[序列2]
5’-AACTGCAGCTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’
用BamHI和PstI消化扩增的基因产物，并插入pBacPAK8(Clontech)的BamHI-PstI位点以得到转移载体pAcG。在该载体中，GFP基因位于多角体蛋白启动子(PPH)下游，如图1a中所见。
(2)转移载体pColorPol的构建
通过PCR，从野生型杆状病毒AcNPV的基因组DNA扩增出PH基因，其中使用以下两种引物：
[序列3]
5’-AGTTGCT GATATCATGG-3’
[序列4]
5’-AACTCGAGATACGCCGGACCAGTG-3’
在序列3中，下划线部分代表EcoRV的识别位点。
用EcoRV和XhoI消化扩增的基因产物，并插入pBacPAK6的EcoRV-XhoI位点以得到转移载体pPol。
独立地，通过PCR从pGFP合成出GFP基因，其中使用下列两种引物：
[序列5]
5’-AA CTCGAGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’
[序列6]
5’-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’
在序列5中，下划线部分代表XhoI的识别位点。
用XhoI和SnaBI消化该GFP基因，并插入质粒pPol的XhoI-SnaBI位点以得到转移质粒pPolGFP。用SnaB1和BamHI消化后，将获自pPolGFP的PH-GFP融合基因插入含有独立双启动子的表达载体pAcUW31(U02452)的SnaB1-BamH1位点，而野生型AcNPV PH基因被插入该表达载体的EcoRI-BglII位点以得到转移载体pColorPol。在该载体中，GFP-PH融合基因和AcNPV PH基因位于PH启动子(PPH)和p10启动子(Pp10)下游，如图1b所见。
(3)转移载体pColorBtrus的构建
通过PCR，从含有Bt.CrylAc基因的质粒pPN6.6(Adang，M.J.等，基因，36，289-300(1985))合成出CrylAc DNA片段，其中使用下列两种引物：
[序列7]
5’-AA CTCGAGATGGATAACAATCCGAAC-3’
[序列8]
5’-AA CTCGAGTGTTGCAGTAACTGG-3’
在序列7和8中，下划线部分是XhoI的识别位点。
用XhoI消化了该CrylAc DNA片段，然后将其插入pColorPol的XhoI位点，以得到转移载体pColorBtrus。因此，PH-CrylAc-GFP融合基因在pColorBtrus中位于启动子PPH下游，如在图1c中所见。
实施例II：重组AcNPV的构建
接种于各细胞培养皿中的1-1.5×106个草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf细胞(InVitrogen，目录号B825-01)，在27℃培育直到细胞附着于皿上。同时，在1微克野生型AcNPV基因组DNA(BacPAK6，Clontech，目录号6144-1)与20mM HEPES缓冲液中的5微克转移载体pAcG，pColorPol或pColorBtrus DNA所构成的DNA溶液(其体积用无菌水调整到最终体积50微升)中，加入等体积的LipofectinTM(Gibco)。随后，室温培育混合物15分钟。用2毫升无血清TC-100培养液(Sigma)洗涤细胞两次。在各皿中加入TC-100(1.5ml)。将Lipofectin-DNA复合物滴加到盖过细胞的培养液中，同时温和旋摇培养皿。27℃培养细胞6小时后，在各皿中加入补充了10％FBS(Gibco BRL)和抗生素的1.5ml TC-100，继续27℃培养。转染4或5天后，提取上清液，7,000g离心5分钟，以获得重组的杆状病毒AcG，ColorPol或ColorBtrus。离心前，优选先用反向相差显微镜(×100)观察上清液以确认多角体。
实施例III：重组多角体的显微观察
以2.0×106个病毒/60mm×15mm平板，接种重组的AcG，ColorPol或ColorBtrus，放置1小时，然后转染Sf9细胞。关于转染，优选为大约每个Sf9细胞5个病毒。要分析重组多角体蛋白或融合蛋白表达的特性，于转染后4日，用光学显微镜和荧光显微镜(Axiophot Universal Microscope，Zeiss，x1,000)观察感染了重组杆状病毒的细胞。作为对照，使用了野生型杆状病毒AcNPV(Clontech，目录号K1601-D)。
结果显示于图2a到2h。图2a和2b分别是感染了野生型AcNPV的Sf9细胞的光学显微照片和荧光显微照片，图2c和2d是感染了AcG的Sf9细胞，图2e和2f是感染了ColorPol的Sf9细胞，而图2g和2h是感染了ColorBtrus的Sf9细胞。
如图2e到2h所见，ColorPol和ColorBtrus的融合蛋白具有正常多角体形状，在紫外光下发绿光。因此，感染了重组杆状病毒ColorPol和ColorBtrus细胞的该显微观察揭示了，具有荧光作用的GFP融合在多角体内。相反的，野生型杆状病毒AcNPV产生的多角体具有正常外观，但在紫外光下不发绿光。对于AcG，产生的GFP的亮光在整个细胞中清晰的出现。
实施例IV：重组多角体的蛋白质印迹分析
用重组杆状病毒AcG，ColorPol和ColorBtrus，以实施例III的相同方式感染Sf9细胞。27℃培养后，在感染3日后通过4000xg离心5分钟收集细胞。用PBS洗涤并用5x样品缓冲液[0.6ml 1M Tris-HCl(pH6.8)，5ml 50％甘油，2ml 10％SDS，0.5ml β-巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml水]混合后，将细胞在100℃沸水浴5分钟，室温下放置片刻，然后在7,000xg离心5分钟而变澄清。在含SDS的3％聚集胶和10％聚丙烯酰胺分离胶上电泳细胞裂解物的上清液。将凝胶上泳出的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在印迹后，膜与抗-GFP抗体(Clontech，目录号8363-2)，抗-AcNPV PH抗体(汉城国立大学，应用生物和化学系，昆虫病理学和基因工程实验室所有)或抗Bt CrylAc抗体(汉城国立大学，应用生物和化学系，昆虫病理学和基因工程实验室所有)结合，然后与山羊抗-兔IgG碱性磷酸酶偶联物(Sigma)一起在室温下培育。
用抗-GFP抗体，抗-PH抗体和抗CrylAc抗体获得的蛋白质印迹，分别如图3a，3b和3c所示。如图所示，重组杆状病毒ColorPol和ColorBtrus产生的多角体是分别由分子量为60kDa的PH-GFP融合蛋白和PH-CrylAc-GFP构成的。
实施例V：电镜观察免疫金标记的重组多角体
通过在40-65％的蔗糖梯度中超离心如实施例III中的同样重组杆状病毒ColorBtrus和野生型AcNPV培养物，并分离56％区域处的AcNPV多角体和ColorBtrus多角体，从而制备样品。将样品固定在含有1％(w/v)仲甲醛的0.1M PBS(pH7.5)中，用0.1M甘氨酸(pH7.5)漂洗，脱水，然后包埋在Lowicryl K4M(polysciences)中。在镍载网上，用抗-GFP抗体，抗-CrylAc抗体和抗-PH抗体处理包埋多角体的超薄切片。将这些切片暴露于第二抗体，例如胶态金偶联的山羊抗-兔抗体(Biocell)中，用0.2％柠檬酸铅和2％乙酸铀酰染色，然后用透射电子显微镜(Hitachi M-600)观察。
参见图4，有显示免疫金标记的重组多角体的透射电子显微照片。野生型AcNPV多角体显示于图4a而重组ColorBtrus多角体显示于图4b。在照片中，分别用30nm，20nm和10nm直径的金颗粒区分GFP，CrylAc和PH。如所见，在ColorBtrus的重组多角体中同时观察到了具有抗-PH、CrylAc和GFP抗体的金颗粒，而在图4a中仅显示了具有抗-PH抗体的金颗粒。因此，该透射电子显微观察揭示了，ColorBtrus的重组多角体是PH、CrylAc和GFP的融合蛋白。
实施例VI：对用蚕肠道液处理的重组多角体进行蛋白印迹分析
将来自用电流休克的五龄蚕呕吐出的肠道液，等体积地加到野生型AcNPV多角体、重组ColorBtrus多角体和Bt CrylAc蛋白中，并在室温下放置5分钟。将这些样品进行10％SDS-PAGE，然后使用抗-Bt CrylAc抗体如实施例IV中同样方式进行蛋白质印迹分析。对于模拟感染，使用了水。
在图5中显示了蛋白质印迹。在ColorBtrus泳道中，检测到大约65kDa的条带，它和切割后的CrylAc活化蛋白相同。因此，数据显示，被昆虫摄入的ColorBtrus的重组多角体在肠道液的碱性环境中立即溶解，并通过肠中存在的蛋白酶作用而切割成活化毒素。
实施例VII：重组病毒的昆虫生物试验
以野生型AcNPV作为对照，测定了重组病毒ColorBtrus对菜蛾(Plutella xylostella)的毒性。为了测定致死剂量中值(LD50)，用8种2倍系列稀释的病毒液(5120，1280，640，320，160，80，40和20个多角体/幼虫)喂养在中国卷心菜叶上的50条二龄幼虫。将24小时内吸收了该剂量的幼虫转移到新鲜中国卷心菜叶上，并每天测试。记录预定时间内的杀死数以确定LD50。将方法重复了三次。
为了测定存活时间中值ST50，用细菌悬液(1500个多角体/幼虫)在中国卷心菜叶上喂养50条二龄幼虫。
下表1给出了结果。
                      表1
    病毒     LD50(多角体数/幼虫)     ST50(小时)
    野生型AcNPV     3,000     153.6
    ColorBtrus     29.6     31.8
致死剂量中值(LD50)和存活时间中值(SD50)的减少，都显示了ColorBtrus重组多角体的更好的杀虫作用。对于P.Xylostella幼虫，与野生型AcNPV病毒比较，重组病毒ColorBtrus显示了增强100倍的杀虫作用和缩短5倍的杀死时间。因此，本发明的重组病毒，即使以很少剂量使用，也能在短时间内杀死有害昆虫。
参见图6，显示了重组杆状病毒ColorBtrus对P.Xylostella幼虫的累积杀虫作用。当用5120(实心圆)和1280(空心圆)重组多角体喂养每条P.Xylostella幼虫时，死亡率分别在三日内达到大约100％和90％。对后者而言，死亡幼虫数从处理6日后又开始增加，最终死亡率达到了94％。
图7a显示了三日前感染了ColorBtrus重组多角体的P.Xylostella幼虫，而图7b是显示六日前感染了ColorBtrus的死亡幼虫的脂肪体的荧光显微照片。感染后三日被杀死的幼虫展现出Bt CrylAc(a)引起的典型症状，而ColorBtrus感染六日后的死亡幼虫脂肪体(b)证实了ColorBtrus产生重组多角体。这些数据揭示，重组杆状病毒ColorBtrus感染后3日具有晶体蛋白赋予的杀伤力，而感染6日后通过病毒复制杀死幼虫。
根据图8，显示了感染ColorBtrus的P.Xylostella幼虫进食破坏的减少。将ColorBtrus(图8a)和野生型AcNPV的(图8b)多角体在中国卷心菜叶上进行处理。如所见，用ColorBtrus的重组多角体处理的P.Xylostella幼虫比感染了野生型AcNPV的幼虫对叶子造成了小得多的破坏。
根据本发明的另一个方面，能将外源蛋白引入野生型AcNPV的多角体，从而构建新颖杆状病毒表达载体系统，正如重组杆状病毒ColorBtrus中明确所示，该系统可表达许多外源蛋白并协助它们的分离。因为几乎所有在传统表达载体中表达的蛋白是可溶性形式，因此它们难于纯化，在纯化中需要昂贵的仪器设备。相反的，携带多角体基因的新颖杆状病毒表达系统所表达的引入的外源蛋白处于纯化(例如仅通过离心)的形式。因此，能在时间和花费上获得显著的经济利益。能用本发明的杆状病毒表达载体系统表达的蛋白例子包括兽医学药物，如猫和狗用干扰素，人用药物例如抗癌剂、胰岛素和干扰素、抗生素等。
另外，本发明的重组多角体可应用于疫苗研发。如果将用作疫苗的编码外源蛋白的基因与杆状病毒表达载体系统中编码多角体蛋白的基因融合，那么能产生晶体形式的外源蛋白和对身体无害的多角体蛋白，因此该蛋白不需佐剂的帮助就可保有它的疫苗功能。
工业应用性
如以上所述，本发明的重组杆状病毒ColorBtrus表达由PH-CP-GFP融合蛋白构成的多角体，其CP分子在昆虫肠道液的碱性环境中是可溶的，并当病毒粒子被释放时，被蛋白酶切割成活化形式。因此，ColorBtrus重组多角体的杆状病毒杀虫剂对昆虫施加Bt晶体蛋白和AcNPV病毒复制双重作用，从而改进了它的致病性和宿主范围。另外，因为重组多角体在紫外光下发绿光，因此能将它用于在野外监测和/或检测受感染的昆虫。另外，该监视装置能防止杀虫剂的过度使用。
已用说明性方式描述了本发明，并可理解使用的术语是描述性的，而不是限制性的。
根据上面的教导，可对本发明进行多种改动和修改。因此，可以理解本发明可在权利要求的范围内实施，除非特别说明。

Claims (10)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该病毒含有两个独立转录单元：
(a)一个转录单元，含有编码与启动子连接的杆状病毒多角体蛋白的核苷酸序列；
(b)一个转录单元，含有编码与多角体蛋白启动子连接的融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白中杆状病毒多角体蛋白、苏云金芽孢杆菌晶体蛋白和多管水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白依次从N-末端到C-末端连接；
其中该杆状病毒产生重组多角体，所述重组多角体由杆状病毒多角体蛋白、苏云金芽孢杆菌晶体蛋白和多管水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白组成。
2.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述(b)中的杆状病毒多角体蛋白是来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，所述苏云金芽胞杆菌晶体蛋白是含有编号1-613的氨基酸序列的CrylAc蛋白片段。
3.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述病毒具有保藏号KCTC 0444BP。
4.一种转移载体，其特征在于，该转移载体含有两个独立转录单元：
(a)一个转录单元，含有编码与启动子连接的杆状病毒多角体蛋白的核苷酸序列；
(b)一个转录单元，含有编码与多角体蛋白启动子连接的融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白中杆状病毒多角体、苏云金芽孢杆菌晶体蛋白和多管水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白依次从N-末端到C-末端连接。
5.如权利要求4所述的转移载体，其特征在于，所述载体是质粒pColorBtrus。
6.一种杆状病毒转移载体pColorBtrus的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
用聚合酶链式反应从质粒pGFP合成编码绿色荧光蛋白GFP的DNA片段；
用聚合酶链式反应合成来自野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的多角体蛋白基因；
以编码绿色荧光蛋白的DNA片段的5’末端和多角体蛋白基因的3’末端连接的方式，将编码绿色荧光蛋白的DNA片段和多角体蛋白基因插入杆状病毒表达载体pAcUW31，来得到杆状病毒转移载体pColorPol；
用聚合酶链式反应合成来自携带有杆状病毒CrylAc基因的质粒pPN6.6的CrylAc基因；以及
将CrylAc基因插入多角体蛋白基因和编码绿色荧光蛋白的DNA片段之间。
7.一种构建如权利要求1所述的重组杆状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
将携带编码融合蛋白中杆状病毒多角体蛋白、苏云金芽孢杆菌晶体蛋白和多管水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白从N-末端到C-末端依次连接的融合基因的转移载体和野生型杆状病毒同时引入昆虫细胞；
以及培育所述细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转移载体是pColorBtrus。
9.一种杀虫组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的重组杆状病毒。
10.一种蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法使用权利要求4所述的转移载体。
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